KR102354778B1 - 폐 조직 모사 미세유체 시스템 - Google Patents

폐 조직 모사 미세유체 시스템 Download PDF

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본 발명은 인간의 폐로부터 분리된 폐 상피세포, 폐 섬유아세포 및 상용 혈관내피세포를 포함하고 내부에 미세유체가 관류하는 폐 조직을 모사한 생체모방 시스템, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 미세유체 제어 방법에 관한 것으로, 시스템 내부의 챔버 각각에 기체 및 배양액을 포함하는 유체를 관류시킬 수 있고 유사 호흡운동 모사가 가능하며, 상기 유체 관류 후 일주일 이상이 경과하였을 때도 시스템 내부의 상기 3종의 세포가 모두 생존할 수 있으며, 상기 시스템 내부의 pH 측정 센서 및 기체 분압 측정 센서를 이용하여 챔버 내 pH 및 pO2 모니터링이 가능하므로 시스템 내부의 상기 3종의 세포를 생체 내 폐와 동일한 조건으로 외부 환경 혹은 약물 등에 노출시킬 수 있는 바, 유해 물질에 의한 폐 질환 모델링 및 치료용 약물 효능 테스트를 포함하는 방대한 범위의 연구가 가능하고, 나아가 in vitro 질병 모델링 및 맞춤 의약 처방 등에도 활용 가능하다.

Description

폐 조직 모사 미세유체 시스템{Microfluidic system mimicking lung tissue}
본 명세서에는 인간의 폐로부터 분리된 폐 상피세포, 폐 섬유아세포 및 상용혈관내피세포를 포함하고 내부에 미세유체가 관류하는 폐 조직을 모사한 미세유체 시스템, 이의 제조방법 및 이를 이용한 미세유체 제어 방법이 개시된다.
폐(lung)는 호흡을 담당하는 필수적인 기관으로 공기의 들숨과 날숨을 통해 산소를 얻고 이산화탄소를 배출하는 기관이다. 폐 내에서 가스교환이 이루어지는 폐포(alveoli)의 모세혈관을 지나는 혈액 속 적혈구는 체내에서 생산된 이산화탄소를 운반해 온 후 폐포를 통해 상기 이산화탄소를 밖으로 배출하고 대기로부터 산소를 취하여 온 몸으로 산소를 운반한다. 때문에, 폐는 인체 내 다른 기관과는 달리 기체의 출입이 일어난다.
한편, 폐 질환의 연구를 위한 in vivo 및 in vitro 모델은 폐장의 특성 상 여전히 충분히 개발되어 있지 않다. 예를 들면, 동물 모델은 종종 인간에서 발견되는 기도 및 폐의 병리적 이상(pathological abnormality)이 발생하지 않고, 대부분의 in vitro 모델은 실제 다양하게 분화된 기도 상피세포의 조직 성분 및 구조적 복잡성을 재현할 수 없다. 나아가, 상술한 바와 같이, 폐를 모사하는 in vitro 모델의 경우 연구를 위해서는 산소를 포함한 기체에 필연적으로 노출되어야 하나, 시중에 판매되는 세포들을 이용하여 제작한 in vitro 모델은 기체에 노출 시 예컨대 3일 이내에 세포들이 사멸하게 되어 최소 7일 이상의 시간이 소요되는 모델 제작, 약물 효과 탐색, 약물 독성 스크리닝 등의 일련의 과정을 수행하기에 적절하지 않다.
이에, 본 발명자들은 기체 및 배양액을 포함하는 유체가 관류하는 동안에도 장시간 세포가 생존함에 따라 다양한 폐 질환 모델의 모사 및 치료용 약물 효능 테스트, 기타 유해 물질 테스트, in vitro 진단 및 맞춤의약 처방이 가능한 미세유체 시스템에 대한 연구를 수행하여, 본 발명을 완성하였다.
한국특허출원 공개 제2018-68994호
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 인간의 폐로부터 분리된 폐 상피세포, 폐 섬유아세포 및 상용 혈관내피세포를 포함하고, 시스템 내부에 기체 및 배양액을 포함하는 유체가 관류하며, pH 측정 센서 및 기체 분압 중 산소 분압(pO2) 측정 센서를 포함하는 폐 조직 모사 미세유체 시스템을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템에 미세유체를 관류시키고 pH 및 pO2을 측정하는 단계를 포함하는, 폐 조직 모사 미세유체 시스템 내 세포 배양 환경의 모니터링 방법을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 폐 조직 모사 미세유체 시스템으로서, 제 1 층, 제 2 층 및 제 3 층; 및 상기 제 1 층과 제 2 층 사이에 기체 관류(perfusion)용 제 1 챔버(chamber), 및 상기 제 2 층과 제 3 층 사이에 배양액을 포함하는 유체 관류용 제 2 챔버;를 포함하고, 상기 제 2 층은 다공성 막(membrane)을 포함하고, 상기 다공성 막은 폐 상피세포(epithelial cell), 폐 섬유아세포(fibroblast) 및 상용 혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell)를 포함하고, 상기 폐 상피세포는 상기 제 1 챔버를 향하고, 상기 혈관내피세포는 상기 2 챔버를 향하고, 상기 폐 섬유아세포는 상기 혈관내피세포와 폐 상피세포 사이에 존재하며, 상기 폐 상피세포, 폐 섬유아세포는 인간의 폐로부터 분리된 것이고, 상기 제 1 층 및 제 3 층은 하나 이상의 pH 측정 센서, 및 하나 이상의 pO2 측정 센서를 각각 포함하는, 폐 조직 모사 미세유체 시스템을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조 방법으로, (1) 상기 제 2 층의 다공성 막을 세포 외 기질로 코팅하는 단계; (2) 상기 코팅된 다공성 막에 인간으로부터 분리된 폐 상피세포(epithelial cell)를 파종(seeding)하고 배양하는 단계; 및 (3) 상기 폐 상피세포가 파종된 다공성 막의 반대 면에 인간으로부터 분리된 폐 섬유아세포(fibroblast) 및 상용 혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell)를 파종하고 배양하는 단계;를 포함하는 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템의 상기 제 1 챔버에 기체를 관류시키고, 상기 2 챔버에 배양액을 포함하는 유체를 관류시키는 미세유체 관류 단계; 및 상기 시스템의 pH 측정 센서로 pH를 측정하고, 상기 pO2 측정 센서로 pO2을 측정하는 단계;를 포함하는, 폐 조직 모사 미세유체 시스템 내 세포 배양 환경의 모니터링 방법을 제공한다.
본 발명은, 인간의 폐로부터 직접 분리된 폐 상피세포, 폐 섬유아세포를 포함하는 폐 조직 모사 미세유체 시스템으로서, 시스템 내부의 챔버 각각에 기체, 및 배양액을 포함하는 유체를 관류시킬 수 있고, 상기 기체 및 유체 관류 후 일주일 이상이 경과하였을 때도 시스템 내부의 상기 3종의 세포가 모두 생존할 수 있다. 또한, 상기 시스템 내부의 pH 측정 센서 및 pO2 측정 센서를 이용하여 산소전달 및 pH 모니터링이 가능하므로 시스템 내부의 상기 3종의 세포를 생체 내 폐와 동일한 환경에서 자라고 있는지 확인할 수 있다. 따라서, 인간의 폐, 특히 폐 손상 환자의 폐를 이용한 본 발명의 일 측면에 따른 폐 조직 모사 미세유체 시스템을 통해, 폐 질환 모델 구현 및 치료용 약물 효능 테스트 및 기타 유해 물질 테스트를 포함하는 방대한 범위의 연구가 가능하고, 나아가 in vitro 진단 및 맞춤의약 처방 등도 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 조직 모사 미세유체 시스템을 제조하기 위해 사용된, 일반 폐 조직 샘플 10종 및 폐암 조직 샘플 2종의 사진이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 해리된 일반 폐 조직에서의 폐 상피세포(Normal-Epi) 사진이고, 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 해리된 폐암 조직에서의 폐 암세포(cancer-Epi)의 사진이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 분리된 일반 폐 조직에서의 폐 상피세포(N-Epi-S1)의 FACS 분석 결과를 나타낸 도이고, 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 분리된 폐암 조직에서의 폐 암세포(C-Epi-S1)의 FACS 분석 결과를 나타낸 도이다. 첫 번째 환자샘플에서 얻은 S1의 경우 Epi-S1은 CD326-PE 항체를 이용하여 실험하여 정상과 암 조직 모두에서 세포가 잘 분리된 것을 보여준다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 분리된일반 폐 조직에서의 폐 상피세포(N-Epi-S2), 폐 섬유아세포(N-fibroblast-S2)의 FACS 분석 결과를 나타낸 도이다. 두 번째 환자샘플에서 얻은 S2도 위와 마찬가지로 실험하여 확인하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 분리된 일반 폐 조직에서의 폐 상피세포(N-Epi-S3), 폐 섬유아세포(N-fibroblast-S3)의 FACS 분석 결과를 나타낸 도이다. 세 번째 환자샘플에서 얻은 S3도 위의 방법으로 분석하여 확인하였다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 분리된 일반 폐 조직에서의 폐 상피세포(N-Epi-S5), 폐 섬유아세포(N-fibroblast-S5)의 FACS 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7a 및 도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 분리된 일반 폐 조직에서의 폐 상피세포(N-epi-S1 및 N-epi-S2)의 면역 형광 분석 결과를 나타낸 도이고, 도 7c는 대조군인 상용 소기관지 상피세포(SAEC)의 면역 형광 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 분리된 일반 폐 조직에서의 폐 섬유아세포(N-Fibroblast-S3)의 면역 형광 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 9a 내지 도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조과정 중 시스템의 중간층의 다공성 막에 인간으로부터 분리된 폐 상피세포, 폐 섬유아세포 및 상용 혈관내피세포를 파종(seeding)한 것을 개략적으로 나타낸 도이다. 도 9a는 폐 섬유아세포 및 혈관내피세포를 파종 후 배양한 결과를 개략적으로 나타낸 도이고, 도 9b는 폐 상피세포를 파종 후 배양한 결과를 개략적으로 나타낸 도이며, 도 9c는 상기 3종의 세포를 모두 파종 및 배양 후 중간층의 다공성 막에 부착(attachment)된 결과를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 조직 모사 미세유체 시스템에 유체를 투여한 모습을 개략적으로 나타낸 도이고, 도 10b는 상기 시스템 중 상기 3종의 세포가 포함된 중간층의 다공성 막 부분을 보다 자세히 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 pH 측정 센서 및 pO2 측정 센서를 부착한 폐 조직 모사 미세유체 시스템에서 실제 센서의 값을 읽어내는 과정을 나타낸 도이다.
도 12a 내지 도 12d는 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 조직 모사 미세유체 시스템 내부에 배양액을 포함하는 유체를 관류시킨지 4일이 경과하였을 때의 면역형광 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 12a 내지 도 12d에서, 붉은색(Epi)은 폐 상피세포를, 초록색(Endo)은 혈관내피세포를 나타낸다. 도 12a는 상피세포와 내피세포를 공배양한 후 상피세포는 붉은색, 내피세포는 초록색으로 염색하여 확인한 결과이다. 도 12b는 공배양 후 공초점현미경 Ortho 형식으로 측면의 세포 모양을 관찰한 결과이다. 도 12c는 공초점 현미경으로 찍은 사진을 Imaris 프로그램을 이용, 3차원적으로 재구성한 동영상 중 발췌한 결과로 공배양이 잘 형성되어 있음을 보여준다. 도 12d는 12c의 영상을 측면에서 확인한 사진이다.
도 13a 및 도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 조직 모사 미세유체 시스템 내부에 기체, 및 배양액을 포함하는 유체를 관류시킨지 2일이 경과하였을 때의 면역형광 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 13a 및 도 13b에서, 초록색(Fibroblast)은 폐 섬유아세포를, 붉은색(Epi)은 폐 상피세포를 나타낸다.
도 14a 내지 도 14d는 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 조직 모사 미세유체 시스템 내부에 기체, 및 배양액을 포함하는 유체를 관류시킨지 4일이 경과하였을 때의 면역형광 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 14a 내지 도 14c에서, 붉은색(Epi)은 폐 상피세포를, 초록색(Endo)은 혈관내피세포를 나타낸다. 도 14a는 상피세포(Calu3)와 내피세포(Endo)를 공배양한 후 상피세포는 붉은색, 내피세포는 초록색으로 염색하여 확인한 결과이다. 도 14b는 공배양 후 공초점현미경 Ortho 형식으로 측면의 세포 모양을 관찰한 결과이다. 도 14c는 공초점 현미경으로 찍은 사진을 Imaris 프로그램을 이용, 3차원적으로 재구성한 동영상 중 발췌한 결과로 공배양이 잘 형성되어 있음을 보여준다. 도 14d는 14c의 영상을 측면에서 확인한 사진이다. 도 14e는 실제 기체를 관류시킬 때 호흡운동을 모사하는 모습을 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 조직 모사 미세유체 시스템에서 유체를 관류시킨 후 내부의 pH 측정 센서 및 pO2 측정 센서를 이용하여 pH(도 15a) 및 pO2(도 15b)을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 명세서에서, "미세유체"는 개체 내부에서 관류하는 미세한 유체로서, 구체적으로 인간의 폐에서 관류하는 유체일 수 있고, 보다 구체적으로 인간의 폐에서 관류하는 기체, 예를 들어 산소 또는 이산화탄소일 수 있고, 인간의 폐를 이루는 혈관에서 관류하는 혈액, 림프액 등일 수 있으며, 상기 혈액 등과 같은 기체가 아닌 유체는 in vitro 상에서 배양액을 포함하는 유체로 대체될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 폐 조직 모사 미세유체 시스템으로서, 제 1 층, 제 2 층 및 제 3 층; 및 상기 제 1 층과 제 2 층 사이에 기체 관류(perfusion)용 제 1 챔버(chamber), 및 상기 제 2 층과 제 3 층 사이에 배양액을 포함하는 유체 관류용 제 2 챔버;를 포함하고, 상기 제 2 층은 다공성 막(membrane)을 포함하고, 상기 다공성 막은 폐 상피세포(epithelial cell), 폐 섬유아세포(fibroblast) 및 혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell)를 포함하고, 상기 폐 상피세포는 상기 1 챔버를 향하고, 상기 혈관내피세포는 상기 제 2 챔버를 향하고, 상기 폐 섬유아세포는 상기 혈관내피세포와 폐 상피세포 사이에 존재하며, 상기 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포는 인간의 폐로부터 분리된 것이고, 상기 제 1 층 및 제 3 층은 하나 이상의 pH 측정 센서, 및 하나 이상의 기체 분압 측정 센서를 각각 포함하는, 폐 조직 모사 미세유체 시스템을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템은 제 1 층, 제 2 층 및 제 3 층을 포함할 수 있고, 상기 제 1 층과 제 2 층 사이에 제 1 챔버(chamber)를 포함할 수 있고, 상기 제 2 층과 제 3 층 사이에 제 2 챔버를 포함할 수 있다. 상기 제 1 챔버는 이를 구성하기 위한 추가 구성을 포함하는 것이 아니라, 상기 제 1 층과 제 2 층의 존재에 의해 만들어지는 공간을 의미하며, 상기 제 1 챔버는 기체 관류용이다. 상기 제 2 챔버 역시, 이를 구성하기 위한 추가 구성을 포함하는 것이 아니라, 상기 제 2 층과 제 3 층의 존재에 의해 만들어지는 공간을 의미하며, 상기 제 2 챔버는 배양액을 포함하는 유체 관류용이다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 제 1 층, 제 2 층 및 제 3 층 각각은 규산염(silicate), 붕규산염(borosilicate), 인산염(phosphate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 유리(glass)일 수 있고, 구체적으로, 제 1 층, 제 2 층 및 제 3 층 각각은 붕규산 유리(borosilicate glass)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제 1 층, 제 2 층 및 제 3 층을 이루는 물질은 서로 동일하거나, 상이할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 제 1 층, 제 2 층 및 제 3 층의 두께는 각각 0.1 내지 2 mm일 수 있고, 구체적으로 0.1 mm 이상, 0.2 mm 이상, 0.3 mm 이상, 0.4 mm 이상, 0.5 mm 이상, 0.6 mm 이상, 0.7 mm 이상, 0.8 mm 이상, 0.9 mm 이상, 1.0 mm 이상, 1.1 mm 이상, 1.2 mm 이상, 1.3 mm 이상, 1.4 mm 이상, 1.5 mm 이상, 1.6 mm 이상, 1.7 mm 이상, 1.8 mm 이상 또는 1.9 mm 이상일 수 있고, 2.0 mm 이하, 1.9 mm 이하, 1.8 mm 이하, 1.7 mm 이하, 1.6 mm 이하, 1.5 mm 이하, 1.4 mm 이하, 1.3 mm 이하, 1.2 mm 이하, 1.1 mm 이하, 1.0 mm 이하, 0.9 mm 이하, 0.8 mm 이하, 0.7 mm 이하, 0.6 mm 이하, 0.5 mm 이하, 0.4 mm 이하, 0.3 mm 이하 또는 0.2 mm 이하일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 제 1 층, 제 2 층 및 제 3 층의 두께는 서로 동일하거나, 상이할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 제 2 층은 다공성 막(porous membrane)을 포함할 수 있다. 상기 다공성 막을 이루는 물질은 폴리머(polymer)일 수 있으며, 상기 폴리머는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 폴리카프로락톤(polycarprolactone, PCL), 나노섬유(nanofiber)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 다공성 막의 두께는 3 내지 24 μm일 수 있고, 구체적으로 3 μm 이상, 4 μm 이상, 6 μm 이상, 7 μm 이상, 8 μm 이상, 9 μm 이상, 10 μm 이상, 11 μm 이상, 12 μm 이상, 14 μm 이상, 16 μm 이상, 18 μm 이상, 20 μm 이상 또는 22 μm 이상일 수 있고, 24 μm 이하, 22 μm 이하, 20 μm 이하, 18 μm 이하, 16 μm 이하, 14 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하 또는 4 μm 이하일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 폐 조직 모사 미세유체 시스템, 제 2 층 또는 다공성 막의 크기에 따라 달라질 수 있다. 상기 다공성 막은 공극 크기가 1 내지 16 μm일 수 있고, 구체적으로 1 μm 이상, 2 μm 이상, 3 μm 이상, 4 μm 이상, 5 μm 이상, 6 μm 이상, 7 μm 이상, 8 μm 이상, 9 μm 이상, 10 μm 이상, 11 μm 이상, 12 μm 이상, 13 μm 이상, 14 μm 이상 또는 15 μm 이상일 수 있고, 16 μm 이하, 15 μm 이하, 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하 또는 2 μm 이하일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 폐 조직 모사 미세유체 시스템, 제 2 층 또는 다공성 막의 크기에 따라 달라질 수 있다. 상기 다공성 막은 폐 상피세포, 폐 섬유아세포 또는 혈관내피세포가 다공성 막에 접착(attachment)될 수 있도록 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)로 코팅된 것일 수 있고, 상기 세포외 기질은 라미닌, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 Ⅱ, 콜라겐 타입 Ⅲ, 콜라겐 타입 Ⅳ, 콜라겐 타입 Ⅴ, 콜라겐 타입 Ⅵ, 인테그린, 엔텍틴, 피브로넥틴, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, 폴리-D-라이신, 다당류, 젤라틴 및 마트리젤(matrigel)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 폐 상피세포, 폐 섬유아세포 또는 혈관내피세포가 다공성 막에 접착될 수 있게 하는 것이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 다공성 막은 폐 상피세포(epithelial cell), 폐 섬유아세포(fibroblast) 및 혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell)를 포함할 수 있고, 상기 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포는 인간의 폐로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포는 하기의 분리방법에 의해 얻어지는 것일 수 있다: 인간으로부터 분리된 폐 조직 샘플을 해리하는 단계; 상기 해리된 폐 조직 샘플에 상기 폐 상피세포에 특이적으로 결합하는 마이크로비드(microbead), 상기 폐 섬유아세포에 특이적으로 결합하는 마이크로비드를 첨가하는 단계; 및 상기 첨가된 마이크로비드와 결합된 폐 조직 샘플을 배양하는 단계;를 포함하는 분리방법. 상기 분리방법에서 상기 폐 상피세포에 특이적으로 결합하는 마이크로비드는 분화 클러스터 326 (cluster of differentiation 326, CD326)을 포함할 수 있고, 상기 폐 섬유아세포에 특이적으로 결합하는 마이크로비드는 항-섬유아세포 마이크로비드를 포함할 수 있다. 이 경우, 다양한 종류의 세포가 혼합된 인간의 폐 조직 샘플로부터 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포 각각을 종류별로 분리할 수 있다. 또한, 인간의 폐로부터 분리된 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포 및 혈관내피세포를 포함하는 폐 조직 모사 미세유체 시스템에서 기체, 및 배양액을 포함하는 유체를 관류시키는 경우, 기존에 사용되는 단일세포배양과 달리, 4일, 7일 또는 13일이 경과하여도 상기 세포들이 생존할 수 있는바(실험예 1), 폐 질환 치료용 약물 효능 테스트 및 기타 유해 물질 테스트를 포함하는 방대한 범위의 연구가 가능하고, 나아가 in vitro 진단 및 맞춤의약 처방 등도 가능하다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 폐 상피세포는 상기 1 챔버를 향할 수 있고, 상기 혈관내피세포는 상기 제 2 챔버를 향할 수 있으며, 상기 폐 섬유아세포는 상기 폐 상피세포와 혈관내피세포 사이에 존재할 수 있다. 상기와 같은 폐 상피세포 및 혈관내피세포의 위치에 의해 상기 폐 상피세포는 제 1 챔버에서 관류하는 기체와 소통(connection)할 수 있고, 상기 혈관내피세포는 제 2 챔버에서 관류하는 배양액을 포함하는 유체와 소통할 수 있어, 인간의 실제 폐와 유사한 미세환경에서 존재할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 폐 상피세포는 폐포 상피세포일 수 있고, 상기 폐포 상피세포는 제1형 폐포 상피세포 및 제2형 폐포 상피세포를 포함할 수 있다. 상기 제1형 폐포 상피세포 및 제2형 폐포 상피세포는 7 : 3 내지 9 : 1의 비율일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 제 1 층은 기체가 주입되는 제 1 주입구, 상기 기체가 배출되는 제 1 배출구, 배양액을 포함하는 유체가 주입되는 제 2 주입구 및 상기 유체가 배출되는 제 2 배출구를 포함할 수 있고, 상기 제 2 층은 상기 배양액을 포함하는 유체가 제 1 챔버에서 제 2 챔버로 관류되도록 하는 2 이상의 통로를 포함할 수 있다. 상기 제 1 주입구, 제 1 배출구, 제 2 주입구, 제 2 배출구 각각은 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 제 1 층 및 제 3 층은 하나 이상의 pH 측정 센서, 및 하나 이상의 기체 분압 측정 센서를 각각 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제 1 층은 하나 이상의 pH 측정 센서 또는 하나 이상의 기체 분압 측정 센서를 포함할 수 있고, 상기 제 3 층은 하나 이상의 pH 측정 센서 또는 하나 이상의 기체 분압 측정 센서를 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 제 1 층은 하나 이상의 기체 분압 측정 센서를 포함할 수 있고, 상기 제 3 층은 하나 이상의 pH 측정 센서를 포함할 수 있다. 상기 pH 측정 센서는 상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템 내부의 pH를 측정하는 센서이고, 상기 제 2 주입구로 주입된 배양액을 포함하는 유체가 관류하는 제 2 챔버 내의 pH를 측정하는 센서일 수 있다. 상기 기체 분압 측정 센서는 산소 분압(pO2)을 측정하는 센서일 수 있고, 상기 제 1 주입구로 주입된 기체가 관류하는 제 1 챔버 내의 산소 분압을 측정하는 센서일 수 있다. 상기 상기 pH 측정 센서는 실시간(real-time)으로 pH를 측정하는 센서이고, 상기 기체 분압 측정 센서는 실시간으로 기체 분압을 측정하는 센서일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템을 이용하면 실시간으로 산소 분압 및 pH를 측정할 수 있어, 상기 시스템 내부로 산소를 전달하는 것 및 상기 시스템 내부의 pH를 조절할 수 있다(실험예 3).
다른 측면에서, 본 발명은 상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조 방법으로, (1) 상기 제 2 층의 다공성 막을 세포외 기질로 코팅하는 단계; (2) 상기 코팅된 다공성 막에 인간으로부터 분리된 폐 섬유아세포(fibroblast) 및 혈관내피세포(endothelial cell)를 파종(seeding)하고 배양하는 단계; 및 (3) 상기 폐 섬유아세포 및 혈관내피세포가 파종된 다공성 막의 반대 면에 인간으로부터 분리된 폐 상피세포(epithelial cell)를 파종하고 배양하는 단계;를 포함하는 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조 방법을 제공한다. 상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템, 제 2 층, 다공성 막, 세포외 기질, 폐 상피세포, 폐 섬유아세포, 혈관내피세포에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 (1) 단계의 세포외 기질은 라미닌, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 Ⅱ, 콜라겐 타입 Ⅲ, 콜라겐 타입 Ⅳ, 콜라겐 타입 Ⅴ, 콜라겐 타입 Ⅵ, 인테그린, 엔텍틴, 피브로넥틴, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, 폴리-D-라이신, 다당류, 젤라틴 및 마트리젤(matrigel)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 폐 상피세포, 폐 섬유아세포 또는 혈관내피세포가 다공성 막에 접착될 수 있게 하는 것이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 폐 상피세포, 폐 섬유아세포는 인간의 폐로부터 분리된 것일 수 있고, 구체적으로 하기의 분리방법에 의해 얻어지는 것일 수 있다: 인간으로부터 분리된 폐 조직 샘플을 해리하는 단계; 상기 해리된 폐 조직 샘플에 상기 폐 상피세포에 특이적으로 결합하는 마이크로비드(microbead) 및 상기 폐 섬유아세포에 특이적으로 결합하는 마이크로비드를 첨가하는 단계; 및 상기 첨가된 마이크로비드와 결합된 폐 조직 샘플을 배양하는 단계;를 포함하는 분리방법. 상기 분리방법에서 상기 폐 상피세포에 특이적으로 결합하는 마이크로비드는 분화 클러스터 326 (cluster of differentiation 326, CD326)을 포함할 수 있고, 상기 폐 섬유아세포에 특이적으로 결합하는 마이크로비드는 항-섬유아세포 마이크로비드를 포함할 수 있다. 이 경우, 다양한 종류의 세포가 혼합된 인간의 폐 조직 샘플로부터 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포 각각을 종류별로 분리할 수 있다. 상기 마이크로비드와 결합된 폐 조직 샘플을 배양하는 것은 4 내지 37℃에서 배양하는 것일 수 있고, 구체적으로 4 ℃ 이상, 5 ℃ 이상, 10 ℃ 이상, 15 ℃ 이상, 20 ℃ 이상, 25 ℃ 이상, 30 ℃ 이상 또는 35 ℃ 이상에서 배양하는 것일 수 있고, 37 ℃ 이하, 35 ℃ 이하, 30 ℃ 이하, 25 ℃ 이하, 20 ℃ 이하, 15 ℃ 이하, 10 ℃ 이하, 5 ℃ 이하, 4 ℃ 이하에서 배양하는 것일 수 있으나, 폐 상피세포, 폐 섬유아세포는 각각의 종류에 따라 배양 온도는 달라질 수 있으며, 상기 범위에 제한되지 않는다. 또한, 인간의 폐로부터 분리된 폐 상피세포, 폐 섬유아세포 및 혈관내피세포를 포함하는 폐 조직 모사 미세유체 시스템에서 기체, 및 배양액을 포함하는 유체를 관류시키는 경우, 기존에 사용되는 단일세포배양과 달리, 4일, 7일 또는 13일이 경과하여도 상기 세포들이 생존할 수 있는바(실험예 1), 폐 질환 치료용 약물 효능 테스트 및 기타 유해 물질 테스트를 포함하는 방대한 범위의 연구가 가능하고, 나아가 in vitro 진단 및 맞춤의약 처방 등도 가능하다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 (3) 단계의 폐 섬유아세포 및 혈관내피세포는 1 : 1 내지 25의 비율로 혼합된 것일 수 있고, 구체적으로 1 : 1 이상, 1 : 2 이상, 1 : 3 이상, 1 : 4 이상, 1 : 5 이상, 1 : 6 이상, 1 : 8 이상, 1 : 10 이상, 1 : 15 이상 또는 1 : 20 이상의 비율로 혼합된 것일 수 있고, 1 : 25 이하, 1 : 20 이하, 1 : 15 이하, 1 : 10 이하, 1 : 8 이하, 1 : 6 이하, 1 : 5 이하, 1 : 4 이하, 1 : 3 이하 또는 1 : 2 이하의 비율로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템의 상기 제 1 챔버에 기체를 관류시키고, 상기 2 챔버에 배양액을 포함하는 유체를 관류시키는 미세유체 관류 단계; 및 상기 시스템의 pH 측정 센서로 pH를 측정하고, 상기 기체 분압 측정 센서로 기체 분압을 측정하는 단계;를 포함하는, 폐 조직 모사 미세유체 시스템 내 미세유체 제어 방법을 제공한다. 상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템, 제 1 챔버, 제 2 챔버, 기체, 배양액을 포함하는 유체, pH 측정, 기체 분압 측정에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 제어 방법은 상기 pH 및 기체 분압 측정 단계에서 측정된 pH 또는 기체 분압이 인간의 폐 조직에서의 pH 또는 기체 분압과 다른 경우, 상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템에 주입되는 기체, 및 배양액을 포함하는 유체의 시간 당 주입량을 조절하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 기체 분압은 산소 분압(pO2)일 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 인간의 폐 조직으로부터 폐 상피세포, 폐 섬유아세포 분리
생체 내 폐 조직을 모사한 미세유체 시스템을 제조하기 위해, 인간의 폐 조직으로부터 폐 상피세포, 폐 섬유아세포를 하기와 같은 방법으로 분리하였다.
[ 실시예 1-1] 인간의 폐 조직 해리
수술을 받은 폐암 환자의 절제된 폐 조직 중 정상 폐 조직로부터 수득한 하기 표 1의 0.39 내지 1.37g의 일반 폐 조직 샘플 10종(N-1 내지 N-10) 및 폐암 환자의 절제된 폐 조직 중 암 조직으로부터 수득한 하기 표 1의 총 0.41g의 폐암 조직 샘플 2종(C-1 및 C-2)을 저장 버퍼(Miltenyi Biotec, Tissue Storage Solution)에 1 내지 2 일 동안 4℃에서 보관한 다음, 상기 조직 샘플을 C-tube 당 0.4 내지 0.5 g 씩 나누어 놓았다.
조직 샘플 No. 무게 (g) 조직 샘플 No. 무게 (g)
N-1 0.54 N-7 1.37
N-2 0.52 N-8 0.64
N-3 0.66 N-9 1.00
N-4 0.70 N-10 0.39
N-5 1.02 C-1* 0.28
N-6 1.17 C-2* 0.13
* 폐암 조직 샘플인 C-1 및 C-2를 합하여 총 0.41 g의 폐암 조직 샘플을 이용하여 하기와 같은 방법으로 폐암 조직에서의 폐 암세포를 분리하였다.
그런 다음, 상기 C-tube 각각에 무혈청 배양액인 RPMI 배양액(Welgene, RPMI 1640)을 2.35 ml씩 분주하고, 효소 키트(Miltenyi Biotec, Multi Tissue Dissociation Kit Ⅰ)의 효소들을 설명서에 따라 상기 C-tube 각각에 첨가한 후 세정(washing)하고, 상기 세정된 조직 샘플의 물기를 제거하고 C-tube에 각각 옮겨 넣었다. 그 후, 상기 C-tube 각각 안으로 가위를 넣어 조직을 최대한 잘게 자르고 뚜껑을 덮어 잘 닫은 다음, 각 C-tube를 얼음에 꽂은 상태로 MACS (Magnetically Activated Cell Sorting) 장치(Miltenyi Biotec, GentleMACSTM Octo Dissociator)에 순서대로 꽂고, 프로그램을 실행하였다. 이때, 에러가 발생하면 상기 C-tube를 꺼내서 섞어주고 다시 실행하였으며, 프로그램이 종료되면 상기 C-tube를 얼음에 꽂은 상태로 옮겼다.
거름망을 15 ml 또는 50 ml 튜브에 준비하고, 상기 무혈청 RPMI 배양액을 약 2 ml 정도 상기 거름망에 적신 다음, 프로그램 종료 후 C-tube 각각에 포함된 폐 조직 샘플을 상기 거름망에 붓고, 상기 무혈청 RPMI 배양액 5 ml로 C-tube를 한번 더 세정한 후 상기 거름망에 부었다. 그 후 10 분 동안 300 xg으로 원심분리하여 상층액을 제거하고, 적혈구 용해 버퍼(red blood cell lysis buffer; Lonza, Red blood cell lysis buffer) 1 ml을 첨가한 후, 2 분 정도 그래도 두었다가 상기 무혈청 RPMI 배양액 5 ml로 재현탁시켰다. 그런 다음, 10 분 동안 300 xg으로 원심분리하여 상층액을 제거하고, 세포 배양액(Lonza, EGM-2) 5 내지 10 ml로 재현탁 후 세포를 계수하고, 이를 다시 내피세포 배양액(Lonza, EGM-2) 또는 상피세포 배양액(Lonza, SAGM)이 담긴 T-175 플라스크에 넣고 배양함으로써 인간의 폐 조직을 해리시켰다. 이때, 상기 C-tube 하나 당 T-175 플라스크 하나에 넣고 배양하였다.
해리된 폐 조직에서 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포의 사진을 (각 세포가 배양되어있는 T-175 플라스크를 카메라와 연결되어 있는 광학현미경으로 관찰한 후 촬영하였으며, 그 결과는 도 2a(일반 폐 조직 샘플로부터 해리된 폐 상피세포(Normal-Epi) 및 2b(폐암 조직 샘플로부터 해리된 폐 암세포(cancer-Epi))와 같다.
[ 실시예 1-2] 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포 분리
상기 실시예 1-1에서 해리된 인간의 폐 조직으로부터 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포를 하기와 같은 과정을 통해 분리하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-1의 T-175 플라스크에 담긴 세포의 수를 세어 약 5 X 106 내지 1 X 107의 세포를 준비한 후, 10 분 동안 상온에서 300 xg으로 원심분리를 하여, 3 종의 세포 펠릿 현탁액, 즉 총 300 ul의 폐 상피세포 현탁액 및 총 80 ul의 폐 섬유아세포 현탁액을 준비하였다. 이때, autoMACS 세척(Rinsing) 용액 (Miltenyi Biotec, #130-091-222) 및 MACS BSA 저장(stock) 용액 (Miltenyi Biotec, #130-091-376)을 20 : 1의 부피비로, 즉 47.5 ml의 autoMACS 세척 용액과 2.5 ml의 MACS BSA 저장 용액을 혼합한 PEB 버퍼를 이용하여 상기 3 종의 현탁액을 준비하였다.
그 후, 분리된 세포의 순도(purity)를 높이기 위해 상기 폐 상피세포 현탁액에는 100 ul의 FcR 차단 시약(FcR blocking reagent)(Miltenyi Biotec, #130-059-901)을 첨가하고, 상기 폐 섬유아세포 현탁액에는 FcR 차단 시약을 첨가하지 않았다.
그런 다음, 상기 폐 상피세포 현탁액에는 100 ul의 CD326 마이크로비드(Miltenyi Biotec, #130-061-101)를, 상기 폐 섬유아세포 현탁액에는 20 ul의 항-섬유아세포 마이크로비드(Miltenyi Biotec, #130-050-601)를 각각 첨가한 후, 모두 각각을 볼텍스(vertex)하여 잘 혼합되도록 한 뒤, 상기 CD326 마이크로비드와 폐 상피세포 현탁액의 혼합물을 4 ℃에서 30 분 동안, 상기 항-섬유아세포 마이크로비드와 폐 섬유아세포 현탁액의 혼합물을 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 배양은 각각의 온도가 유지되는 냉장고에서 수행되었다. 상기 배양 이후, 상기 CD326 마이크로비드와 폐 상피세포 현탁액의 혼합물에 1 ml의 PEB 버퍼를 첨가하여 세정한 후 각각을 300 xg으로 10 분 동안 원심분리하였으며, 상기 항-섬유아세포 마이크로비드와 폐 섬유아세포 현탁액의 혼합물에도 1 ml의 PEB 버퍼를 첨가하여 세정한 후 300 xg으로 3 분 동안 원심분리하였다. 그 후, 2 종의 혼합물 각각에 1 ml의 PEB 버퍼를 첨가하여 CD326 마이크로비드-결합 폐 상피세포 현탁액, 및 항-섬유아세포 마이크로비드-결합 폐 섬유아세포 현탁액의 2종의 현탁액을 제조하였다.
상기 현탁액 내에서 마이크로비드의 자성을 이용하여 세포를 분리(magnetic separation)하기 위해, 세포 분리기(Mitenyi Biotec, MidiMACSTM separator)의 자성체에 LS 칼럼(LS column)을 놓고, 3 ml의 PEB 버퍼로 상기 컬럼을 세척하였다. 그런 다음, 상기 컬럼 아래에 15 ml 튜브를 놓은 후 상기 컬럼에 상기 CD326 마이크로비드-결합 폐 상피세포 현탁액을 흘려주어 상기 15 ml 튜브에 표지되지 않은 음성 세포(unlabeled cell, negative cell)를 모으고 얼음 상에서 3 ml의 PEB 버퍼를 상기 컬럼에 넣어 버퍼가 다 빠져나오면 다시 3 ml의 PEB 버퍼를 넣는 과정을 3 번 반복하여 세정하였다. 마이크로비드로 표지된 세포를 모으기 위해, 상기 컬럼을 세포 분리기에서 떼어서, 새로운 15 ml 튜브 위에 놓았다. 그런 다음, 상기 컬럼에 5 ml의 PEB 버퍼를 첨가하고 기포가 나올 때까지 플런저(plunger)를 밀어, 컬럼 아래에 둔 15 ml 튜브에 CD326 마이크로비드가 결합되어 표지된 폐 상피세포(labeled cell, positive cell)을 모았다. 이를 300 xg으로 10 분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 10 ml의 세포 배양액을 재현탁시킨 후, 폐 상피세포를 계수하였으며, 위의 마이크로비드 자성을 이용한 세포 분리 방법으로, 항-섬유아세포 마이크로비드-결합 폐 섬유아세포 현탁액으로부터 표지된 폐 섬유아세포를 각각 모으고 동일 방법으로 각각의 세포를 원심분리, 재현탁 및 계수하였다.
[ 실시예 1-3] FACS 분석을 통한 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포 분리 확인
상기 실시예 1-2에서 분리된 폐 상피세포, 폐 섬유아세포가 종류별로 분리되었는지를 확인하기 위해, 형광 활성 세포 선별기(Fluorescence activated cell sorter, FACS) 분석을 수행하였다.
구체적으로, autoMACS 세척(Rinsing) 용액 (Miltenyi Biotec, #130-091-222) 및 MACS BSA 저장(stock) 용액 (Miltenyi Biotec, #130-091-376)을 20 : 1의 부피비로, 즉 47.5 ml의 autoMACS 세척 용액과 2.5 ml의 MACS BSA 저장 용액을 혼합한 PEB 버퍼를 준비하고, trysin/EDTA(Welgene, LS015-01)로 상기 실시예 1-2에서 분리된 폐 상피세포, 폐 섬유아세포를 환자샘플을 얻은 순서에 따라서 S1(첫 번째), S2(두 번째). 정상세포를 N을 표시하였고, 암세포를 C로 표시하였다. N1~C2는 두 가지 조직을 0.5그램 단위로 잘라서 분류한 숫자이다. 상기 2 종의 세포 각각을 계수하여 각 세포별로 2 X 105이 되도록 하고, 300 xg으로 10 분 동안 원심분리하였다. FACS 분석 결과는 도 3 내지 도 6과 같다.
도 3 내지 6에 나타난 바와 같이, FACS histogram 결과에서 검정색 선은 항체가 붙지 않은 대조군을, 검정색 이외의 색으로 된 선들은 항체가 붙은 실험군 세포의 양을 뜻하고, 대조군 검정색 선과 다르게 많이 차이남을 확인함으로써 분리가 잘 되었음을 확인할 수 있다.
[ 실시예 1-4] 면역 형광 분석( Immuno Fluorescence Assay)을 통한 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포 분리 확인
상기 실시예 1-2에서 분리된 폐 상피세포, 폐 섬유아세포가 종류별로 분리되었는지를 확인하기 위해, 면역 형광 분석(Immuno Fluorescence Assay)을 수행하였다.
(1) 면역 형광 분석을 통한 폐 상피세포 분리 확인
먼저, 상기 실시예 1-2에서 폐 상피세포를 분리한지 3일 후에 N-epi-S1을, 1차 항체로, 상피세포 마커인 마우스 단일클론항체 항-E 카드헤린(mouse mAb anti-E Cadherin) (Santa Cruz, sc-8426)을 1 : 100으로, 다른 상피세포 마커인 마우스 단일클론항체 항-사이토케라틴 8(mouse mAb anti-cytokeratin 8) (Santa Cruz, sc-73480)을 1 : 100으로 하여 반응시키고, 2차 항체로 염소 항-마우스 IgG-Alexa 488 (Goat anti-mouse IgG-Alexa 488) (MP, A111001)을 1 : 100 으로 하여 반응시킨 뒤 공초점 현미경(Carl Zeiss, LSM710)으로 촬영하고, 그 결과를 도 7a에 나타내었다. 또한, 상기 실시예 1-2에서 분리된 폐 상피세포인 N-epi-S2도 위와 동일한 과정으로 면역 형광 분석을 수행하였으며, 다만, 1차 항체로, 상피세포 마커인 마우스 단일클론항체 항-E 카드헤린 (Santa Cruz, sc-8426) 대신 마우스 단일클론항체 항-E 카드헤린 (Abcam, ab1416)을 1 : 50으로 하여 반응시키고, 2차 항체로 염소 항-마우스 IgG-Alexa 488 (MP, A111001) 대신 당나귀 항-마우스 IgG-Alexa 488 (Abcam, ab150105)을 1 : 100 으로 하여 반응시켰으며, 공초점 현미경으로 X 200의 배율로 촬영한 점만 차이가 있다. N-epi-S2의 결과는 도 7b에 나타내었다.
한편, 대조군으로 소기관지 상피세포(Small Airway Epithelial cell, SAEC) (Lonza, CC-2547)를 상기 N-epi-S2의 면역 형광 분석 방법과 동일한 방법으로 면역 형광 분석을 수행하였으며, 대조군 결과는 도 7c에 나타내었다.
도 7a 및 도 7b에 나타난 바와 같이, 대조군(도 7c)의 시중에 판매되는 상피세포가 E-카드헤린 및 사이토케라틴 8을 발현하는 것과 마찬가지로, 상기 실시예 1-2에서 실제 인간에게서 분리한 폐 상피세포도 E-카드헤린 및 사이토케라틴 8을 발현함을 확인하였다.
(2) 면역 형광 분석을 통한 폐 섬유아세포 분리 확인
먼저, 상기 실시예 1-2에서 폐 섬유아세포를 분리한지 3일 후에 N-Fibroblast-S3을, 1차 항체로, 상피세포 마커인 마우스 단일클론항체 항-E 카드헤린(mouse mAb anti-E Cadherin) (Santa Cruz, sc-8426)을 1 : 100으로, 내피세포 마커인 마우스 단일클론항체 항-CD31(mouse mAb anti-CD31) (Santa Cruz, sc-65260)을 1 : 100으로, 섬유아세포 마커인 마우스 단일클론항체 항-α 평활근 액틴(mouse mAb anti-α Smooth Muscle Actin) (Abcam, ab7817)을 1 : 200으로 하여 반응시키고, 2차 항체로 염소 항-마우스 IgG-Alexa 488 (Goat anti-mouse IgG-Alexa 488) (MP, A111001)을 1 : 100 으로 하여 반응시킨 뒤 공초점 현미경(Carl Zeiss, LSM710)으로 촬영하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1-2에서 실제 인간에게서 분리한 폐 섬유아세포가 α 평활근 액틴만 발현함을 확인하였다.
실시예 1-3 및 1-4의 결과로부터 상기 실시예 1-1 및 1-2의 과정을 통해 실제 인간으로부터 폐 상피세포, 폐 섬유아세포를 각각 분리할 수 있음을 확인하였다.
[ 실시예 2] 인간의 폐 조직으로부터 분리된 폐 상피세포, 폐 섬유아세포 및 상용 혈관내피세포를 포함하는 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조
상기 실시예 1로부터 수득한 인간의 폐 조직으로부터 분리된 폐 상피세포, 폐 섬유아세포 및 상용 혈관내피세포를 이용하여 하기와 같은 방법으로 생체 내 폐 조직을 모사한 미세유체 시스템을 제조하였다. 또한, 폐 상피세포로 실시예 1에서 수득한 것 외에 Calu-3(ATCC)를 추가로 사용할 수 있다.
먼저, Organ-on-a-Chip Platform(micronit 사, 네델란드)의 중간층(middle layer)의 다공성 막(공극 크기가 0.45μm일 때 공극 밀도는 2.006 cm2, 공극 크기가 3μm일 때 공극 밀도는 8.005 cm2)을 0.001%의 피브로넥틴(Sigma, F0895, 5mg), 0.03 mg/ml의 콜라겐(Sigma, Collagen TypeⅠ solution, 1VL함량) 및 0.001 mg/ml의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)(Miltenyi Biotec,MACS BSA stock #130-091-376, 75ml)의 혼합물로 4℃에서 하룻밤동안 코팅한 후 건조시켰다. 그런 다음, 상기 실시예 1에서 수득한 인간으로부터 분리된 2 X 105/100μl의 폐 상피세포(N-Epi-S2(p3: 계대배양 3회) 또는 Calu-3)를 37℃에서 상기 다공성 막의 아래 면에 2 시간동안 파종(seeding)한 후, 1일 동안 37℃에서 배양하였다(도 9a). 그 후 2 X 105/50μl의 상용 혈관내피세포(HUVEC(p2), LONZA) 및 상기 실시예 1에서 수득한 인간으로부터 분리된 0.4 X 105/50μl의 폐 섬유아세포(N-Fibroblast-S5(p8))의 혼합물을 상기 다공성 막의 상기 폐 상피세포가 파종된 면의 반대면에 파종하고, 4일 동안 37℃에서 배양하였다(도 9b). 도 9c는 상기 다공성 막에 폐 상피세포, 혈관내피세포 및 폐 섬유아세포가 부착(attachment)된 상태를 개략적으로 나타낸 도이다.
상기 Organ-on-a-Chip Platform의 설명서에 따라, 상기 폐 상피세포, 혈관내피세포 및 폐 섬유아세포가 포함된 중간층을 포함하도록 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조하였으며, 도 10a는 상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템을 개략적으로 나타낸 도이고, 도 10b는 상기 시스템 중 상기 3종의 세포가 포함된 중간층의 다공성 막을 개략적으로 나타낸 도이다.
또한, 상기 시스템의 제 1 층(또는 상층)의 제 1 챔버(기체 관류용 챔버)를 바라보는 면에 기체 분압 측정 센서로서 pO2 센서(Presens, Microox4)를, 제 3 층(또는 하층)의 제 2 챔버(배양액을 포함하는 유체 관류용 챔버)를 바라보는 면에 pH 측정 센서(Presens, pH-1 mini V2)를 부착하였다. 도 11은 상기 센서를 부착한 폐 조직 모사 미세유체 시스템을 개략적으로 나타낸 도이다.
[ 실시예 3] 폐 조직 모사 미세유체 시스템에 유체 관류
상기 실시예 2에서 제조된 폐 조직 모사 미세유체 시스템의 제 1 층(또는 상층)의 제 1 주입구(inlet)에는 에어펌프와 에어센서, 튜빙으로 연결되어서 나오는 공기로써, 실온, 실제 대기 중 공기로 구성되어 있는 기체를 주입하고, 제 2 주입구(inlet)에는 배양액(STEMCELL, PneumaCultTM-ALI #05001, 500ml)을 주입한 후, 5 μl/min의 속도로 4일 동안 관류시켜, 생체 내 폐 조직과 유사한 미세유체 시스템을 제조하였다. 또한 관류된 기체는 프로그램을 통해 분당 10-12회의 주기로 압력의 범위를 조절하여 실제 호흡운동을 모사하였다(도 14e).
[ 실험예 1] 폐 조직 모사 미세유체 시스템에서의 세포 생존 확인
상기 실시예 2에서 제조된 폐 조직 모사 미세유체 시스템에서 상기 실시예 3과 같이 유체 관류시킨 후 수일이 지난 후에도 상기 시스템 내의 폐 상피세포, 폐 섬유아세포, 혈관내피세포가 생존하는지를 확인하였다. 세포배양 후 생존확인을 위한 실험은 LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity kit (Invitrogen, #L3224)를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포들을 37℃에서 30분 동안 각각 염색한 후, 공초점 현미경(Carl Zeiss, LSM710)을 이용하여 확인하였다.
도 12a 내지 도 12d는 유체 관류 4일이 경과하였을 때의 면역형광 분석 결과로, 4일이 경과한 후에도 폐 조직 모사 미세유체 시스템 내의 폐 상피세포, 폐 섬유아세포 및 혈관내피세포가 생존함을 확인하였다.
또한, 도 13a 내지 도 13b는 유체 관류 2일이 경과하였을 때 및 도 14a 내지 도 14d는 유체 관류 4일이 경과하였을 때의 면역형광 분석 결과로, 2일 및 4일이 경과한 후에도 폐 조직 모사 미세유체 시스템 내의 폐 상피세포, 폐 섬유아세포 및 혈관내피세포가 생존함을 확인하였다.
참고로, 이상에서 도 12a 내지 12d, 도 13a 및 13b는 실시예 1로부터 수득한 폐 상피세포를 이용한 경우이고, 도 14a 내지 14d는 Calu-3을 이용한 경우이다.
[ 실험예 2] 폐 조직 모사 미세유체 시스템에서의 산소 전달 및 pH 조절 확인
폐의 가장 중요하고 고유한 기능인 산소 전달 및 pH 조절을 확인하기 위해, 상기 실시예 2에서 제조된 폐 조직 모사 미세유체 시스템에서 상기 실시예 3과 같이 유체 관류시킨 후에 산소 분압 및 pH를 측정하였다. pH 센서 측정과정은 다음과 같다. 위쪽과 아래쪽 유리칩 안쪽에 pH 센서를 부착하고, 세포 배양하는 동안 모니터용 컴퓨터와 연결된 pH-1 mini V2 transmeter의 광섬유 케이블선을 센서와 바깥쪽에서 접촉하여 pH를 실시간 측정하였다. O2 센서 측정과정은 다음과 같다. 위쪽과 아래쪽 유리칩 안쪽에 O2 센서를 부착하고, 세포배양하는 동안 pO2 Microox4 transmeter의 광섬유 케이블선을 센서와 바깥쪽에서 접촉하여 pO2를 실시간 측정하였다.
도 15a 및 도 15b는 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 조직 모사 미세유체 시스템에서 유체를 관류시킨 후 내부의 pH 측정 센서 및 pO2 측정 센서를 이용하여 pH(도 15a) 및 pO2(도 15b)을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 15a 및 도 15b에 나타난 바와 같이, 시스템 내부의 산소 분압은 대기 중 산소 분압에 해당하는 20%임을 확인하였고, pH 역시 주입된 세포 배양액의 pH인 7.0 내지 8.0임을 확인하였다.
즉, 상기 실시예 2에서 제조된 폐 조직 모사 미세유체 시스템을 이용하면 실시간으로 산소 분압 및 pH를 측정할 수 있고, 따라서 상기 시스템 내부로 산소를 전달하는 것 및 상기 시스템 내부의 pH를 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (22)

  1. 폐 조직 모사 미세유체 시스템으로서,
    제 1 층, 제 2 층 및 제 3 층; 및 상기 제 1 층과 제 2 층 사이에 기체 관류(perfusion)용 제 1 챔버(chamber), 및 상기 제 2 층과 제 3 층 사이에 배양액을 포함하는 유체 관류용 제 2 챔버;를 포함하고,
    상기 제 2 층은 다공성 막(membrane)을 포함하고,
    상기 다공성 막의 일측에 폐 상피세포(epithelial cell)가 파종 및 배양되고, 상기 폐 상피세포가 파종 및 배양된 다공성 막의 반대 측에 폐 섬유아세포(fibroblast) 및 혈관내피세포(endothelial cell)가 파종 및 배양되며,
    상기 폐 상피세포는 상기 1 챔버를 향하고, 상기 혈관내피세포는 상기 제 2 챔버를 향하고,
    상기 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포는 인간의 폐로부터 분리된 것이고,
    상기 폐 상피세포는 폐포 상피세포를 포함하며,
    상기 제 1 층 및 제 3 층은 하나 이상의 pH 측정 센서, 및 하나 이상의 기체 분압 측정 센서를 각각 포함하는, 폐 조직 모사 미세유체 시스템.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 폐 상피세포는 제1형 폐포 상피세포 및 제2형 폐포 상피세포를 포함하고, 상기 제1형 폐포 상피세포 및 제2형 폐포 상피세포는 7 : 3 내지 9 : 1의 비율인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 시스템의 적어도 일부는 투명한 것인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제 1 층은 기체가 주입되는 제 1 주입구, 상기 기체가 배출되는 제 1 배출구, 배양액을 포함하는 유체가 주입되는 제 2 주입구 및 상기 유체가 배출되는 제 2 배출구를 포함하고,
    상기 제 2 층은 상기 배양액을 포함하는 유체가 제 1 챔버에서 제 2 챔버로 관류되도록 하는 2 이상의 통로를 포함하는, 폐 조직 모사 미세유체 시스템.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 막은 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)로 코팅된 것인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 세포외 기질은 라미닌, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 Ⅱ, 콜라겐 타입 Ⅲ, 콜라겐 타입 Ⅳ, 콜라겐 타입 Ⅴ, 콜라겐 타입 Ⅵ, 인테그린, 엔텍틴,, 피브로넥틴, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, 폴리-D-라이신, 다당류, 젤라틴 혹은 마트리젤(matrigel)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 막은 공극 크기가 0.45 혹은 3 μm인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 폐 상피세포는 제 1 주입구로 주입된 기체와 소통(connection)하는 것인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 혈관내피세포는 제 2 주입구로 주입된 배양액을 포함하는 유체와 소통(connection)하는 것인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 pH 측정 센서는 pH를 측정하는 센서인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 기체 분압 측정 센서는 산소 분압(pO2)을 측정하는 센서인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 pH 측정 센서는 실시간(real-time)으로 pH를 측정하는 센서이고,
    상기 기체 분압 측정 센서는 실시간으로 기체 분압을 측정하는 센서인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템.
  14. 제1항 및 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조 방법으로,
    (1) 상기 제 2 층의 다공성 막을 세포외 기질로 코팅하는 단계;
    (2) 상기 코팅된 다공성 막에 인간으로부터 분리된 폐 상피세포(epithelial cell)를 파종(seeding)하고 배양하는 단계; 및
    (3) 상기 폐 상피세포가 파종된 다공성 막의 반대 면에 인간으로부터 분리된 폐 섬유아세포(fibroblast) 및 혈관내피세포를 파종하고 배양하는 단계;를 포함하는 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 세포외 기질은 라미닌, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 Ⅱ, 콜라겐 타입 Ⅲ, 콜라겐 타입 Ⅳ, 콜라겐 타입 Ⅴ, 콜라겐 타입 Ⅵ, 인테그린, 엔텍틴,, 피브로넥틴, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, 폴리-D-라이신, 다당류, 젤라틴 혹은 마트리젤(matrigel)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 폐 상피세포, 폐 섬유아세포는,
    인간으로부터 분리된 폐 조직 샘플을 해리하는 단계;
    상기 해리된 폐 조직 샘플에 상기 폐 상피세포에 특이적으로 결합하는 마이크로비드(microbead), 상기 폐 섬유아세포에 특이적으로 결합하는 마이크로비드를 첨가하는 단계; 및
    상기 첨가된 마이크로비드와 결합된 폐 조직 샘플을 배양하는 단계;에 의해 얻어지는, 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 폐 상피세포에 특이적으로 결합하는 마이크로비드는 분화 클러스터 326 (cluster of differentiation 326, CD326)을 포함하고,
    상기 폐 섬유아세포에 특이적으로 결합하는 마이크로비드는 항-섬유아세포 마이크로비드를 포함하는, 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 마이크로비드와 결합된 폐 조직 샘플을 배양하는 것은 4 내지 25℃에서 배양하는 것인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조 방법.
  19. 제14항에 있어서,
    상기 (3) 단계의 폐 섬유아세포 및 혈관내피세포는 1 : 1 내지 5의 비율로 혼합된 것인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템 제조 방법.
  20. 제1항 및 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폐 조직 모사 미세유체 시스템의 상기 제 1 챔버에 기체를 관류시키고, 상기 2 챔버에 배양액을 포함하는 유체를 관류시키는 미세유체 관류 단계;
    호흡운동 모사를 위한 관류 기체의 압력 조절 단계; 및
    상기 시스템의 pH 측정 센서로 pH를 측정하고, 상기 기체 분압 측정 센서로 기체 분압을 측정하는 단계;를 포함하는, 폐 조직 모사 미세유체 시스템 내 미세유체 제어 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 제어 방법은 상기 pH 및 기체 분압 측정 단계에서 측정된 pH 또는 기체 분압이 인간의 폐 조직에서의 pH 또는 기체 분압과 다른 경우,
    상기 폐 조직 모사 미세유체 시스템에 주입되는 기체, 및 배양액을 포함하는 유체의 시간 당 주입량을 조절하는 단계를 추가로 포함하는, 폐 조직 모사 미세유체 시스템 내 미세유체 제어 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 기체 분압은 산소 분압(pO2)인, 폐 조직 모사 미세유체 시스템 내 미세유체 제어 방법.
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