CN115029243A - 肠道-血管-免疫共培养器官芯片制备方法及其制备装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了肠道‑血管‑免疫共培养器官芯片制备方法及其制备装置，该器官芯片核心组件是一种微型化的人工胃肠道，引入仿生的血管腔体实现免疫细胞在血管腔体的共培养，搭建肠道‑血管‑免疫共培养器官芯片。搭建后的肠道‑血管‑免疫共培养器官芯片装置是一个集成的微流体平台，除应用于药物研发领域外，也可用于研究乳制品免疫调节功能的潜力，同时也可以通过监测相关免疫细胞生物标志物的表达，为评价食品质量对健康的影响提供了一个新的选择。

Description

肠道-血管-免疫共培养器官芯片制备方法及其制备装置
技术领域
本发明涉及肠道-血管-免疫共培养器官芯片制备方法及其制备装置，属于微流控芯片技术领域。
背景技术
微流控芯片技术(Microfluidics)作为21世纪重要前沿科学技术之一，为体外模拟人体代谢模型提供了一种重要平台。它主要以微纳加工技术为基础，由微米级通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，可实现生物学与化学实验室的常规功能。因其具有与细胞大小相匹配的微米尺寸构件，可在芯片微通道内进行多种细胞培养与流体刺激，构建与生理环境接近并具有时空分辨特点的三维微环境，已成为组织器官构建、药物筛选、毒理学以及生物医学研究的重要技术。
由微机电系统(MEMS)发展而来的微流控器件(Microfluidic device)为模拟离体细胞/组织/器官的微生理/微物理环境提供了可能，进一步衍生而来的器官芯片(OOC,Organ-on-a-chip)为精确控制多个参数、体外模拟人类单个/多个器官的行为活动、机械特性以及生理反应提供了可能。器官芯片或身体系统芯片是微工程仿生装置，包含由活细胞填充的微流体通道和腔室，它们复制活器官的关键功能单元，以在体外重建病理生理学完整的器官。近年来，由于伦理和科学原因，器官芯片越来越受到关注。基于芯片的具有体外细胞屏障系统模型的开发可用于研究控制渗透性的参数，并在药物发现的早期阶段预测药物穿过这些屏障的转运。器官芯片有潜力提供一种高通量、高成效益和可靠的方法来预测包括运输现象在内的人类药物相互作用。这些细胞培养模型还具有精确控制重要运输参数和实验条件的优点。体外模型还应该包括顶端和基底外侧的隔室，在细胞膜的每一侧含有适当的水性介质成分。
现有的器官芯片通常是实现二维平面细胞培养，只能模拟器官的单一模式功能，不能模拟完整屏障功能，无法针对性研究受到生理屏障保护的器官的疾病。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供肠道-血管-免疫共培养器官芯片制备方法及其制备装置，该器官芯片核心组件是一种微型化的人工胃肠道，引入仿生的血管腔体实现免疫细胞在血管腔体的共培养，搭建肠道-血管-免疫共培养器官芯片。
一种肠道-血管-免疫共培养器官芯片的制备装置，包括：芯片下层结构和芯片上层结构；
所述芯片下层结构包括芯片基底7和微流控通道2；
所述芯片上层结构包括培液入口6、培液出口1、半透膜5和观察窗上盖4。
上述微流控通道2内嵌于芯片基底7中。
上述培液入口6、培液出口1分别与微流控通道2的两端相通。
上述半透膜5覆盖于微流控通道上方，微流控通道中流通的液体可与膜直接接触
上述观察窗上盖4为凹形结构，覆盖于膜5上方，该凹行结构与膜5形成中空的观察窗3。
利用上述制备装置制备肠道-血管-免疫共培养器官芯片的方法，包括如下步骤：
1)将复苏后的CaCo-2、HT-29、HUVEC-RFP细胞分别接种于培养皿中培养，待细胞生长至对数生长期；
2)将Collagen-Ⅰ用HEPES稀释，分别在两个上述肠道-血管-免疫共培养器官芯片的制备装置的培液入口6注入Collagen-Ⅰ溶液，将装置倒扣室温静置2-3h，正置4-6℃过夜；
3)将步骤1)获得的CaCo-2、HT-29消化处理，消化后培养基重悬，备用；
4)取步骤3)制备的CaCo-2细胞液接种到一个上述制备装置的培液入口6中；
5)取等体积的CaCo-2细胞液和HT-29细胞液，混合均匀，接种到肠道-血管-免疫共培养器官芯片制备装置的另一个培液入口6中；
6)分别在两个培液入口中补加培养基，静置培养2-3d，每天更换培养基；
7)将步骤1)获得的HUVEC-RFP消化处理，消化后使用培养基重悬；取HUVEC-RFP细胞液加到制备装置的芯片下层结构的两个培液入口中，两边下层结构方框处的储液漕里多加一点培养基；
8)倒扣静置2-3h，正置2-3h，在培液入口补加培养基，35-37℃培养箱放置过夜；
9)步骤8)处理后更换培养基，摇床培养6-7d以上，取出后即可获得肠道-血管-免疫共培养器官芯片。
进一步的，步骤2)所述的Collagen-Ⅰ溶液稀释后浓度为0.08-0.1mg/ml；注入制备装置中的量为40-50μl。
进一步的，步骤3)中CaCo-2、HT-29消化重悬后的细胞浓度为490-500万/ml。
进一步的，步骤6)中所述的培养基指ADF-12培养基。
进一步的，步骤7)中HUVEC-RFP消化重悬后细胞浓度为490-500万/ml。
有益效果：
(1)本申请制备的肠道-血管-免疫共培养器官芯片中血管内皮细胞和上皮细胞通过形成选择性渗透的细胞屏障分隔顶端(腔内)和基底外侧(腔外)，从而控制运输过程以维持体内平衡，保证屏蔽完整性，从而可以用来检测能够穿过这种完整屏障到达目标组织的药物。
(2)本申请制备的肠道-血管-免疫共培养器官芯片通过引入仿生的血管腔体，实现免疫细胞在血管腔体的共培养，搭建后的肠道-血管-免疫共培养器官芯片装置是一个集成的微流体平台，除应用于药物研发领域外，也可用于研究乳制品免疫调节功能的潜力。
(3)本申请的器官芯片可以通过监测相关免疫细胞生物标志物的表达，为评价食品质量对健康的影响提供了一个新的选择，这反映了食品和营养科学向最先进技术的开放，也是将跨学科知识转化为营养建议的关键一步。
附图说明
图1肠道-血管-免疫共培养器官芯片制备装置的结构示意图。
图2肠道-血管-免疫共培养器官芯片制备装置的结构前视图。
图3制备的两种肠道-血管-免疫共培养器官芯片上CaCo-2(左图)和CaCo-2+HT-29(右图)的铺设情况。
图4荧光显示肠道上皮。
图5荧光显示肠道-血管-免疫细胞立体结构。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。
实施例1肠道-血管-免疫共培养器官芯片制备装置
一种肠道-血管-免疫共培养器官芯片的制备装置，包括：芯片下层结构和芯片上层结构；
所述芯片下层结构包括芯片基底7和微流控通道2；所述芯片上层结构包括培液入口6、培液出口1、膜5和观察窗上盖4。
所述的微流控通道2内嵌于芯片基底7中。
所述的培液入口6、培液出口1分别与微流控通道2的两端相连。
所述的膜5覆盖于微流控通道上方，微流控通道中流通的液体可与膜直接接触
所述的观察窗上盖4为凹形结构，覆盖于膜5上方，该凹行结构与膜5形成中空的观察窗3。
实施例2制备肠道-血管-免疫共培养器官芯片
一、实验材料
细胞：CaCo-2、HT-29、HUVEC-RFP
试剂与耗材：细胞培养专用培养基，Collagen-Ⅰ，HEPES，Transflow chip，培养皿，无菌PBS，离心管，细胞计数板等
实验设备：离心机，培养箱，摇床等
二、培养方案
1、细胞培养：将复苏后的CaCo-2、HT-29、HUVEC-RFP细胞分别接种于培养皿中培养，待细胞生长至实验所需的密度。
2、肠道-血管-免疫共培养器官芯片制备装置上铺设胶原：将Collagen-Ⅰ用HEPES稀释成0.1mg/ml的工作浓度，分别在两个培液入口6注入50μl的0.1mg/ml Collagen-Ⅰ，将制备装置倒扣，室温静置2h，然后再将其正置，4℃过夜。
3、消化细胞：将CaCo-2、HT-29消化处理，培养基重悬并计数，细胞浓度为500万/ml，备用。
4、接种细胞：(1)取30μl的CaCo-2细胞液(15万)接种到一个培液入口6中；(2)各取7.5μl的CaCo-2细胞液和HT-29细胞液，混合均匀，接种到另一个培养入口6中。
5、培养：分别在两个培液入口中补加150μl的培养基，培养箱中静置培养一段时间(2～3天)，每天更换培养基。
6、消化HUVEC：将HUVEC-RFP消化处理，培养基重悬并计数，细胞浓度为500万/ml；分别取15万细胞接种到两个微流控通道中，铺好后，两边储液漕里多加一点培养基，防止通道缺培液出现气泡。
7、放置培养箱中，倒扣静置2h，使细胞附着在通道的上层；然后将装置正置，静置2h，在两边储液槽里补加培养基，35-37℃培养箱中放置过夜。
8、第二天更换新鲜培养基，并将装置放置在摇床(35-37℃)上继续培养，培养7天以上，使用显微镜观察细胞铺设情况，如图3所示获得制备肠道-血管-免疫共培养器官芯片，图3中的左图为CaCo-2，图3中的右图为CaCo-2+HT-29。
实施例3
一、实验方案
利用细胞免疫荧光染色技术，对肠道-血管-免疫共培养器官芯片结果进行观察与分析：
固定液：3.7％多聚甲醛；
渗透缓冲液：0.3％Triton X-100；
封闭液：2％FBS，2％BSA，0.1％Tween20in PBS；
洗涤剂：4％FBS in PBS。
具体操作：
1.吸弃通道和方孔中的液体，添加固定液。
2.室温孵育10-15min。
3.吸弃固定液，PBS清洗2次，每次5min。
4.洗涤剂清洗1次，5min。
5.渗透缓冲液渗透细胞10min。
6.洗涤剂清洗1次，5min。
7.封闭液封闭细胞30-45min。
8.用封闭液稀释一抗ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody(1：200)，VillinPolyclonal Antibody(1：200)。吸弃方孔中的封闭液后，添加一抗。注：ZO-1，Villin只孵育上层方孔里的细胞。
9.室温孵育一抗1-2h。
10.封闭液稀释二抗，Goat Anti-Rabbit IgG H+L(1：200)，IFKineTM GreenDonkey Anti-Rabbit IgG(1：200)。
11.洗涤剂清洗2次，每次3min。
12.向孔中添加二抗。
13.室温避光孵育二抗，30min～1h。
14.洗涤剂清洗2次，每次3min。
15.PBS清洗1次，5min。
16.DAPI染色，上下通道都要染，避光孵育20min。
17.PBS清洗1次，5min。
18.吸弃所有孔中的液体，添加适量体积的PBS。
19.显微镜检测或保存细胞板。
显微镜检测的最佳结果在染色后一周内。
保存细胞板时用封口膜封住细胞板边缘，再用铝箔包裹住整个细胞板。细胞板在室温下最多保存两周。
三.实验结果
图4和图5的免疫荧光照片展示在肠道-血管-免疫微流控装置中共培养肠道上皮和血管内皮细胞，肠道上皮细胞分别由DAPI(细胞核)，Villin(小肠绒毛蛋白)，ZO-1(细胞间隙蛋白)和RFP(血管内皮细胞自表达红色荧光蛋白)表示。在荧光染色后DAPI(细胞核)为蓝色，ZO-1(细胞间隙蛋白)为绿色和RFP(血管内皮细胞自表达红色荧光蛋白)为红色。
图5显示3D重构后的荧光图像展示小肠绒毛立体结构，证明可以建立共培养肠道上皮和血管内皮细胞。

Claims (9)

1.一种肠道-血管-免疫共培养器官芯片的制备装置，其特征在于，包括：芯片下层结构和芯片上层结构；
所述芯片下层结构包括芯片基底7和微流控通道2；
所述芯片上层结构包括培液入口6、培液出口1、半透膜5和观察窗上盖4；
所述的微流控通道2内嵌于芯片基底7中。
2.如权利要求1所述的制备装置，其特征在于，所述的培液入口6、培液出口1分别与微流控通道2的两端相通。
3.如权利要求1所述的制备装置，其特征在于，所述的半透膜5覆盖于微流控通道上方，微流控通道中流通的液体可与膜直接接触。
4.如权利要求1所述的制备装置，其特征在于，所述的观察窗上盖4为凹形结构，覆盖于膜5上方，该凹行结构与膜5形成中空的观察窗3。
5.利用如权利要求1所述的制备装置制备肠道-血管-免疫共培养器官芯片的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将复苏后的CaCo-2、HT-29、HUVEC-RFP细胞分别接种于培养皿中培养，待细胞生长至对数生长期；
2)将Collagen-Ⅰ用HEPES稀释，分别在两个上述肠道-血管-免疫共培养器官芯片的制备装置的培液入口6注入Collagen-Ⅰ溶液，将装置倒扣室温静置2-3h，正置4-6℃过夜；
3)将步骤1)获得的CaCo-2、HT-29消化处理，消化后培养基重悬，备用；
4)取步骤3)制备的CaCo-2细胞液接种到一个上述制备装置的培液入口6中；
5)取等体积的CaCo-2细胞液和HT-29细胞液，混合均匀，接种到肠道-血管-免疫共培养器官芯片制备装置的另一个培液入口6中；
6)分别在两个培液入口中补加培养基，静置培养2-3d，每天更换培养基；
7)将步骤1)获得的HUVEC-RFP消化处理，消化后使用培养基重悬；取HUVEC-RFP细胞液加到制备装置的芯片下层结构的两个培液入口中，两边下层结构方框处的储液漕里多加一点培养基；
8)倒扣静置2-3h，正置2-3h，在培液入口补加培养基，35-37℃培养箱放置过夜；
9)步骤8)处理后更换培养基，摇床培养6-7d以上，取出后即可获得肠道-血管-免疫共培养器官芯片。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的Collagen-Ⅰ溶液稀释后浓度为0.08-0.1mg/ml；注入制备装置中的量为40-50μl。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中CaCo-2、HT-29消化重悬后的细胞浓度为490-500万/ml。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤6)中所述的培养基指ADF-12培养基。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤7)中HUVEC-RFP消化重悬后细胞浓度为490-500万/ml。
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