CN116445285A - 一种类器官共培养芯片、构建方法及共培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及类器官共培养芯片、构建方法及共培养方法。构建方法包括：选择一基体，在基体上方叠加一层透明材质，在透明材质内部穿孔形成液流入口、液流出口以及免疫细胞和血细胞的培养区；液流入口、液流出口与免疫细胞和血细胞培养区连通；在免疫细胞和血细胞的培养区内部用通透膜构建第一细胞培养区和第二细胞培养区，用基质胶构建共培养通道使第一细胞培养区和第二细胞培养区连通；在通透膜的外侧用基质胶构建血管内皮细胞培养区，血管内皮细胞培养区在通透膜与免疫细胞和血细胞的培养区之间。本发明的类器官共培养芯片能够更好的促进组织培养和生存，每个类器官及共培养通道的周围都存在血管和免疫细胞微环境，给细胞提供生长所需要的微环境。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织工程技术领域，具体涉及一种类器官共培养芯片、构建方法及共培养方法。
背景技术
近年来，干细胞和类器官培养技术的飞速发展使得体外器官模型构建取得了质的飞跃，类器官模型逐渐成为我们研究各种人体器官发育、稳态以及疾病机制的“得力助手”。但是，目前构建的体外器官模型由于缺乏接近体内的多组织之间的相互作用和免疫微环境，都无法完全模拟体内器官的结构和功能。
类器官芯片是一种基于细胞3D培养同时搭配微流控系统的特殊芯片技术，其结合细胞与细胞间相互作用、基质特性以及生物化学和生物力学特性，在芯片上模拟构建出三维的器官生理微系统。研究发现，类器官芯片技术可以更准确和快速地检测药物对人类潜在的毒性和有效性，减少动物实验的时间和经济成本，未来将成为药物筛选的重要手段之一，同时该技术也为研究器官生理结构发育和功能开辟新通道，为体外器官发育培养和脏器移植技术奠定了基础。
中国发明专利CN115466680A公开了一种实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片及其方法，将肿瘤类器官和免疫细胞共培养，从而构建免疫微环境。然而在几乎每个器官中，不同组织类型之间、器官与血管之间的相互作用在器官发育、体内平衡和疾病中都发挥着重要作用，仅通过将肿瘤类器官与免疫细胞共培养并无法真正模拟真实的器官体内微环境以及器官间相互作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种类器官共培养芯片、构建方法及共培养方法。本发明构建的类器官共培养芯片具有体积小、试剂消耗少、易于实现自动化和高通量处理、可以支持多种器官共培养等优点。本发明构建的类器官共培养芯片不仅可以模拟组织间的相互作用，还能够模拟体内组织周围存在的血管和免疫微环境，在每个类器官和共培养通道的周围都存在血管和免疫细胞微环境，培养得到的类器官更加适用于组织发育、药物安全性评价和药物渗透等相关研究。
为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
第一方面，本发明提供一种类器官共培养芯片的构建方法，包括以下步骤：
步骤A1：选择一基体，在基体上方叠加一层透明材质，在透明材质内部穿孔形成液流入口、液流出口以及免疫细胞和血细胞的培养区；所述液流入口、液流出口与免疫细胞和血细胞培养区连通；
步骤A2：在免疫细胞和血细胞的培养区内部用通透膜构建第一细胞培养区和第二细胞培养区，用基质胶构建共培养通道使第一细胞培养区和第二细胞培养区连通；
步骤A3：在通透膜的外侧用基质胶构建血管内皮细胞培养区，所述血管内皮细胞培养区在通透膜与免疫细胞和血细胞的培养区之间。
进一步的，所述基体为载玻片。
进一步的，所述透明材质为PDMS材料。
进一步的，所述第一细胞培养区和第二细胞培养区为圆孔状。
进一步的，所述共培养通道为直线结构。
进一步的，所述直线结构的长度为3-10mm。
进一步的，所述共培养通道为环形结构，所述环形结构环绕第一细胞培养区或第二细胞培养区一圈或多圈。将共培养通道设置为环形结构，可以更好的模拟长距离间的器官/组织连接，在增加器官间作用距离的基础上最大层度减小芯片的体积。
第二方面，本发明提供一种类器官共培养芯片，采用上述构建方法制备而成。
第三方面，本发明提供一种类器官共培养方法，采用上述类器官共培养芯片构建方法制备的类器官共培养芯片培养，包括以下步骤：
步骤B1：将血管内皮细胞加至血管内皮细胞培养区，待细胞贴壁后分别从第一细胞培养区和第二细胞培养区中央加入携带培养基的第一细胞和第二细胞；
步骤B2：从液流入口处加入携带培养基的免疫细胞和血细胞混合物，进行培养。
进一步的，所述第一细胞为肿瘤细胞或正常组织细胞，所述第二细胞为肿瘤细胞或正常组织细胞。
本发明的有益效果为：
1、本发明构建的类器官共培养芯片体积小、试剂消耗少，具有易于实现自动化和高通量培养的优点；所构建的类器官共培养芯片支持多种器官/组织共培养，还可以根据培养类器官的种类，调整芯片以更好模拟短距离或长距离的器官/组织间相互作用。
2、本发明构建的类器官共培养芯片能够更好的促进组织培养和生存，每个类器官和共培养通道的周围都存在血管和免疫细胞微环境，能够给细胞提供生长所需要的微环境；本发明的芯片在每个类器官的周围都存在血管和免疫细胞微环境，培养得到的类器官更加适用于组织发育、药物安全性评价和药物渗透等相关研究。
附图说明
图1为本发明实施例1的类器官共培养芯片结构示意图；
图2为本发明实施例1的类器官共培养芯片的芯片主体的俯视图；
图3为本发明实施例2的类器官共培养芯片结构示意图；
图4为本发明实施例2的类器官共培养芯片的芯片主体的俯视图；
图5为实施例3培养得到的肝类器官形态图；
图6为实施例4培养得到的神经类器官形态图；
图7为实施例5培养至18天得到的肝类器官(左)和胆管类器官(右)形态图；
图8为实施例6培养至40天得到的大脑皮层类器官(左)和脊髓类器官(右)形态图；
图9为对比例1培养得到的肝类器官形态图；
图10为对比例2培养得到的神经类器官形态图。
图中：1-基体，2-芯片主体，2.1-第一细胞培养区，2.2-第二细胞培养区，2.3-血管内皮细胞培养区，2.4-免疫细胞和血细胞培养区，2.5-液流入口，2.6-液流出口，2.7-共培养通道，2.8-通透膜。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种类器官共培养芯片的构建方法，构建的类器官共培养芯片的结构示意图如图1所示，芯片主体俯视图如图2所示；
构建方法包括以下步骤：
步骤A1：选择一基体1，在基体1上方叠加一层透明材质以构建芯片主体2，在透明材质内部穿孔形成液流入口2.5、液流出口2.6以及免疫细胞和血细胞的培养区2.4；所述液流入口2.5、液流出口2.6与免疫细胞和血细胞培养区2.4连通；所述基体1为载玻片；所述透明材质为PDMS材料；
步骤A2：在免疫细胞和血细胞的培养区2.4内部用通透膜2.8构建第一细胞培养区2.1和第二细胞培养区2.2，用基质胶构建共培养通道2.7使第一细胞培养区2.1和第二细胞培养区2.2连通；所述共培养通道2.7为直线结构；
步骤A3：在通透膜2.8的外侧用基质胶构建血管内皮细胞培养区2.3，所述血管内皮细胞培养区2.3在通透膜2.8与免疫细胞和血细胞的培养区2.4之间。
实施例2
一种类器官共培养芯片的构建方法，构建的类器官共培养芯片的结构示意图如图3所示，芯片主体俯视图如图4所示；包括以下步骤：
步步骤A1：选择一基体1，在基体1上方叠加一层透明材质以构建芯片主体2，在透明材质内部穿孔形成液流入口2.5、液流出口2.6以及免疫细胞和血细胞的培养区2.4；所述液流入口2.5、液流出口2.6与免疫细胞和血细胞培养区2.4连通；所述基体1为载玻片；所述透明材质为PDMS材料；
步骤A2：在免疫细胞和血细胞的培养区2.4内部用通透膜2.8构建第一细胞培养区2.1和第二细胞培养区2.2，用基质胶构建共培养通道2.7使第一细胞培养区2.1和第二细胞培养区2.2连通；所述共培养通道2.7为环形结构，所述共培养通道2.7环绕第二细胞培养区2.2一圈；
步骤A3：在通透膜2.8的外侧用基质胶构建血管内皮细胞培养区2.3，所述血管内皮细胞培养区2.3在通透膜2.8与免疫细胞和血细胞的培养区2.4之间。
实施例3
一种类器官共培养方法，采用实施例1类器官共培养芯片培养类器官，包括以下步骤：
步骤B1：将血管内皮细胞加至血管内皮细胞培养区，待细胞贴壁后分别从第一细胞培养区和第二细胞培养区中央加入携带培养基的第一细胞和第二细胞；所述第一细胞和第二细胞均为肝类器官。
步骤B2：从液流入口处加入携带培养基的免疫细胞和血细胞混合物，进行培养。培养18天后，培养得到的肝类器官形态如图5所示。
实施例4
一种类器官共培养方法，采用实施例2构建的类器官共培养芯片培养类器官，包括以下步骤：
步骤B1：将血管内皮细胞加至血管内皮细胞培养区，待细胞贴壁后分别从第一细胞培养区和第二细胞培养区中央加入携带培养基的第一细胞和第二细胞；所述第一细胞和第二细胞均为神经类器官。
步骤B2：从液流入口处加入携带培养基的免疫细胞和血细胞混合物，进行培养。培养40天后，培养得到的神经类器官形态如图6所示。
实施例5
用实施例1构建方法构建的类器官共培养芯片和实施例3的培养方法培养类器官，与实施例3的区别在于所述第一细胞为肝类器官，所述第二细胞为胆管类器官，培养18天后，培养得到的肝类器官和胆管类器官形态如图7所示。
实施例6
用实施例2构建方法构建的类器官共培养芯片和实施例4的培养方法培养类器官，与实施例3的区别在于所述第一细胞为大脑皮层类器官，所述第二细胞为脊髓类器官，培养40天后，培养得到的大脑皮层类器官和脊髓类器官形态如图8所示。
对比例1
与实施例1构建方法构建的类器官共培养芯片的区别在于，用仅含有免疫细胞的培养区替换实施例1中的免疫细胞和血细胞的培养区，然后采用实施例3的培养方法培养类器官。培养18天后，培养得到的肝类器官形态如图9所示。
对比例2
与实施例2构建方法构建的类器官共培养芯片的区别在于，用仅含有免疫细胞的培养区替换实施例2中的免疫细胞和血细胞的培养区，然后采用实施例4的培养方法培养类器官。培养40天后，培养得到的神经类器官形态如图10所示。
本发明实施例1类器官共培养芯片中共培养通道为直线结构，芯片适用于模拟体内短距离间组织/细胞(如正常肝-肝癌，肝-胆管)共培养环境，利用该芯片培养的肝类器官具备良好的类器官囊状形态，能够长时间内稳定形成一定数量和大小的肝类器官(如图5所示)；本发明实施例2类器官共培养芯片中共培养通道为环型结构，芯片对于模拟体内长距离投射的组织/细胞相互作用(如大脑-脊髓)而言，更接近体内生理环境。利用该芯片培养的神经类器官，不仅光滑透亮，而且具备明显的上皮样细胞层结构(如图6所示)。同时，由实施例5和6、图7和图8可知，当第一细胞与第二细胞不同，本发明的类器官芯片培养得到的不同种类类器官均生长良好。
由实施例3和对比例1对比、实施例4和对比例2对比可知，血管内皮细胞和血细胞的存在，明显促进第一细胞和第二细胞的生长、存活、增殖(图5和图9对比，图6和图10对比)。因此，利用本发明的共培养芯片，不仅能够有效模拟不同组织细胞间的相互作用，并且包含免疫/血管微环境，可以明显促进细胞生长增殖，有效提高细胞的生存时间。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种类器官共培养芯片的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A1：选择一基体，在基体上方叠加一层透明材质，在透明材质内部穿孔形成液流入口、液流出口以及免疫细胞和血细胞的培养区；所述液流入口、液流出口与免疫细胞和血细胞培养区连通；
步骤A2：在免疫细胞和血细胞的培养区内部用通透膜构建第一细胞培养区和第二细胞培养区，用基质胶构建共培养通道使第一细胞培养区和第二细胞培养区连通；
步骤A3：在通透膜的外侧用基质胶构建血管内皮细胞培养区，所述血管内皮细胞培养区在通透膜与免疫细胞和血细胞的培养区之间。
2.根据权利要求1所述的类器官共培养芯片的构建方法，其特征在于，所述基体为载玻片。
3.根据权利要求1所述的类器官共培养芯片的构建方法，其特征在于，所述透明材质为PDMS材料。
4.根据权利要求1所述的类器官共培养芯片的构建方法，其特征在于，所述第一细胞培养区和第二细胞培养区为圆孔状。
5.根据权利要求1所述的类器官共培养芯片的构建方法，其特征在于，所述共培养通道为直线结构。
6.根据权利要求5所述的类器官共培养芯片的构建方法，其特征在于，所述直线结构的长度为3-10mm。
7.根据权利要求1所述的类器官共培养芯片的构建方法，其特征在于，所述共培养通道为环形结构，所述环形结构环绕第一细胞培养区或第二细胞培养区一圈或多圈。
8.一种类器官共培养芯片，其特征在于，采用权利要求1～7任意一项所述构建方法制备而成。
9.一种类器官共培养方法，其特征在于，采用权利要求1～7任意一项所述构建方法制备的类器官共培养芯片培养，包括以下步骤：
步骤B1：将血管内皮细胞加至血管内皮细胞培养区，待细胞贴壁后分别从第一细胞培养区和第二细胞培养区中央加入携带培养基的第一细胞和第二细胞；
步骤B2：从液流入口处加入携带培养基的免疫细胞和血细胞混合物，进行培养。
10.根据权利要求9所述的类器官共培养方法，其特征在于，所述第一细胞为肿瘤细胞或正常组织细胞，第二细胞为肿瘤细胞或正常组织细胞。
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