CN101451105B - 一种毛细血管模型的构建方法及其微系统芯片 - Google Patents

Abstract

本发明阐述了一种毛细血管模型的构建方法及其微系统芯片，利用微系统加工技术，设计制作用于毛细血管内皮细胞有序排布和培养的微芯片系统。通过微系统芯片设计和制造、毛细血管内皮细胞的导入、排布、固定和培养、毛细血管模型功能的测定三个主要步骤，构建成具有一定正常生理功能的毛细血管模型。该毛细血管模型可以用于毛细血管内皮细胞的培养和观测，能对内皮细胞分泌的扩血管因子NO的浓度进行实时测定，管壁的通透性可随着外加刺激的不同发生改变，大致模拟正常生理条件下毛细血管功能，可用于心血管药物有效成分的筛选。

Description

一种毛细血管模型的构建方法及其微系统芯片

技术领域

本发明涉及一种毛细血管模型的构建方法及其微系统芯片，此模型基于微系统技术结合细胞生物学技术构建，可用于药物筛选、组织工程、基础细胞生物学等方面，属交叉学科技术领域。

背景技术

毛细血管是血液循环中的末梢，毛细血管管壁主要由一层内皮细胞(endothelial cell)和基膜(Basal Lamina)组成，细的毛细血管横切面由一个内皮细胞围成，较粗的毛细血管由2～3个内皮细胞围成。常规的毛细血管模型一般利用生物可降解材料作为支架来培养血管壁的正常细胞，旋转培养重建和再生形成管状模型。目前已有多种组织工程化血管构建模式正在研究中，并取得一定进展，如采用交联胶原蛋白包埋聚乙胶酯材料(PGA)为血管支架，分层种植入骨髓间充质干细胞来源的血管平滑肌、内皮样细胞，并旋转培养，体外构建组织工程化小口径人工血管模型，应用于临床的血管替代物，以期解决临床上治疗血管狭窄或闭塞导致的缺血性疾病自体血管移植及血管来源有限的问题。

近几年，微系统技术的发展给基于细胞培养及组织工程的研究注入活力，基于微系统技术的细胞构图(Cell Patterning)不仅可以根据不同要求控制细胞的空间分布，还可以更好的模拟细胞生长的外环境(Extracellular Matrix)，增加细胞研究的可靠性，可以集成加热器、微环境参数测定传感器等用于细胞或组织功能的研究，这些在常规的细胞组织培养条件下是难以实现的。

目前，微系统技术应用于细胞水平、分子生物学水平的研究也已有很多的报道，但是主要还是针对单个细胞或多个细胞的培养和相关性质研究。实际上，微系统技术不仅可以对细胞进行操控，也可以根据组织结构的特点构建特殊的物理微结构，将组织细胞按照要求导入微结构，并在片培养，形成具有一定组织功能的模型。目前，与内皮细胞相关的微系统技术已有少量报道，如Fidkowshi C.等在文献(Fidkowski C.，Kaazempur-Mofrad M.R.，Borenstein J.，Vacanti J.P.，Langer R.，Endothelialized Microvasculature Based ona Biodegradeble Elastomer，Tissue Engineering，2005，11，302～311)中利用生物可降解材料通过微加工技术制作微管道网络，成功实现了内皮细胞在微系统中的培养；Song J.W.等在文献(Song J.W.，Gu W.，Futai N.，Warner K.A.，NorJ.E.，Talayama S.，Computer-Controlled Microcirculatory Support System forEndothelial Cell culture and Shearing，Anal.Chem.，2005，77，3993～3999)中也成功地实现了内皮细胞在微系统中的培养，并且观察微系统中液体流动对细胞生长状态的影响。但是，目前的研究只是局限在细胞层面，在实现内皮细胞培养的基础上没有建立类似毛细血管组织的结构，进行更深层次的组织工程学方面的研究。

本发明拟基于微系统加工技术，针对简单组织毛细血管，设计制作用于内皮细胞有序排布和培养的微芯片系统，形成具有简单生理功能的毛细血管模型，并且建立毛细血管功能研究和检测方法。

发明内容

本发明目的是利用微系统加工技术，设计制作用于毛细血管内皮细胞有序排布和培养的微芯片系统，构建成具有一定正常生理功能的毛细血管模型。

本发明的目的是通过微系统芯片设计和制造、毛细血管内皮细胞的导入、排布、固定和培养、毛细血管模型功能的测定三个主要步骤实现的。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

1)根据毛细血管的组织结构结合微系统技术的特点，设计细胞培养芯片，利用微细加工技术制作细胞培养的微系统，该系统包括下列核心单元：细胞培养微通道，给药通道，给养分通道，出入口，NO测定电极等。根据细胞培养要求，调节微系统中的微环境，包括流速控制、压力控制、体积控制、温度控制、溶液混和、液体分配与驱动等。

2)采用微量注射泵将培养液、内皮细胞及其它成分导入微系统中，利用设计的物理微结构及表面特性将细胞分布在特定的区域，利用细胞培养箱的条件进行细胞在片培养。

3)在微芯片管道中设计制作NO微电极，对内皮细胞分泌的扩血管因子NO的浓度进行实时监测；在导入使血管舒张/收缩的药物成分的作用下，检测内皮细胞的形态变化，细胞之间的间距变化，选用特定的指示剂，测定药物作用前后指示剂在管内和管外的浓度改变，判定血管壁通透性的变化。

本发明构建的毛细血管模型可以用于毛细血管内皮细胞的培养和观测，能对内皮细胞分泌的扩血管因子NO的浓度进行实时测定，管壁的通透性可随着外加刺激的不同发生改变，大致模拟正常生理条件下毛细血管功能，该模型可用于心血管药物有效成分的筛选。

本发明不仅阐述了一种基于微系统技术的毛细血管模型的构建方法，还提供一种细胞培养微系统芯片的制作方法，该微系统芯片适合于细胞的导入、排布、固定和在片培养。

附图说明

图1为本发明实施例的毛细血管模型总体结构示意图，其中，1和1′分别为毛细血管内皮细胞及培养基的进口和出口；2和2′分别为毛细血管内基质的进口和出口；3和3′分别为毛细血管外基质的进口和出口。

图2为本发明实施例的细胞培养芯片A-A′截面图，其中，4为聚合物PDMS芯片；5为载波片；6为培养中的毛细血管内皮细胞。

图3为本发明实施例毛细血管模型芯片的俯视图，其中，7为NO测定电极；8为毛细血管外基质；9为单层排列毛细血管内皮细胞；10为毛细血管内基质。

具体实施方式

下面结合附图进一步说明本发明的一种具体实施过程。

在下述实施例中，使用的细胞外基质、细胞内基质指的分别是两排细胞外侧和内侧的溶液环境。

如图2所示，本方面提供的细胞培养微芯片，由聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片和载玻片通过键合形成，该PDMS芯片包括PDMS基底以及位于其上的2对(4个)微坝结构，2对微坝结构间距为100-120um，每对微坝结构包括2个间距为的30-40um的微坝，该微坝与载玻片间间隙高度为3-5um，从而，微坝结构内的空间可用于细胞，如内皮细胞的固定培养，以形成2排(每个微坝结构内可形成1排)单层细胞结构，而培养基及药物可以自由通过。

由于PDMS芯片和载玻片进行了键合，因此，如图1所示，PDMS芯片上的微坝结构将所述细胞培养微芯片隔成5个通过微坝与载玻片间间隙相通的微管道，分别是2对微坝结构之间的细胞内基质微管道(即毛细血管内基质进口2和出口2’间的管道，宽度为100-120um，可用于加入细胞内基质、药物和/或检测标记物)，微坝结构内的内皮细胞培养微管道各1条(即毛细血管内皮细胞及培养基进口1和出口1’间的管道，宽度为30-40um，可用于加入培养基和/或药物)，以及位于2条内皮细胞培养微管道各自外侧的细胞外基质微管道各1条(即毛细血管外基质进口3和出口3’间的管道，宽度为200-500um，可用于加入细胞外基质、药物和/或检测标记物)。

如图3所示，该芯片还可以包括用于测定毛细血管内溶液和/或毛细血管外溶液的物质浓度的检测电极，如NO电极7等。

微芯片选用具有良好透气性和生物相容性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料与常规载波片键合形成细胞培养微通道网络结构。微通道和坝型微结构采用聚合物微加工工艺(Poly-MEMS)制作，制作过程包括SU-8模具制造，PDMS塑性成型及与载玻片键合三个关键步骤，制造过程简单阐述如下：在硅片正面甩涂一层SU-8 2050光刻胶，前烘固化；将第一块掩膜板与基片对准，紫外线曝光，微管道图形转移到第一层SU-8光刻胶上；后烘后，在第一层SU-8表面再甩涂一层SU-8 2005光刻胶，前烘固化；将第二块掩膜板与基片对准，紫外线曝光，将掩膜板上的坝型微结构转移到第二层SU-8光刻胶上；第二层SU-8光刻胶后烘；用SU-8显影液对两层SU-8结构同时显影，异丙醇冲洗，去离子水冲洗，氮气吹干；得到多层SU-8模具。将PDMS前聚体和固化剂混合物倒入SU-8模具中，放入65℃烘箱中，烘焙1小时；将固化后的PDMS芯片4从模具上揭下来，打孔后备用。

电极7采用lift-off技术制作在载玻片5上。制作过程简单阐述如下：首先，将载玻片清洗烘干；甩涂正性光刻胶AZ4620，烘干，曝光，显影；电子束蒸发金属层Pt；最后在丙酮中剥离多余金属形成电极7的图形。在载玻片5上制备电极7后将其烘干备用。

最后，将制备好的PDMS和载玻片5键合形成完整的细胞培养芯片。

在内皮细胞导入之前将制作好的细胞培养微芯片用75％的酒精浸润，然后放入常规细胞培养皿(polystyrene Petri dish)中，用紫外线照射1h，进行消毒。为利于细胞在微通道内贴壁生长，在微通道内导入含血清的培养液浸润过夜，使芯片表面包被蛋白。

细胞培养液为DMEM(Gibco)，加入10％的胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)和100ul/ml的链青霉素(吉诺生物医药技术有限公司，杭州)，消化液为0.25％的胰酶和0.02％的EDTA(吉诺生物医药技术有限公司，杭州)。

由微量注射泵将培养基和内皮细胞导入微芯片，在CO2培养箱中进行培养，每隔48小时更新一次培养液。待芯片内的内皮细胞6分裂、增值、迁移形成紧密的双排单层细胞结构9，如图3所示，建立起类似毛细血管结构的模型，进行毛细血管功能学方面的研究。

图1中的1口为刺激药物的导入口，可分别选用止血类药物，如安络血、维生素K等，能降低毛细血管的通透性，促使毛细血管收缩，或者选用胰激肽原酶等可以引起毛细血管扩张的药物导入微系统中，观察毛细血管模型的反应。在图1中2口处加入荧光标记的壳聚糖大分子物质，通过每隔半小时在荧光显微镜中观察图3中8和10两处的荧光强度比值分析毛细血管模型的通透性，也可在图1中1口导入异硫氰酸荧光黄标记的鬼笔环肽孵育，观察内皮细胞骨架的变化，验证毛细血管模型的功能。同时可利用图3中NO电极7所示的测定电极测试在刺激情况下内皮细胞代谢的NO浓度变化。

本发明提供的微芯片可用于构建毛细血管模型，以进行观测，该模型可以大致模拟正常生理条件下的毛细血管功能，并用于心血管药物有效成分的筛选。

虽然本发明只提供了图2所示的具有2对微坝结构的芯片，但对于本领域的技术人员而言，根据本发明提供的教导和暗示，根据实际需要，可制造具有1对或更多对微坝结构的芯片，是显而易见的，因此，也是本发明所需要保护的内容。所述芯片可用于细胞培养，以形成1排或多排紧密单层细胞结构，构建所需要的模型，然后利用药物进行刺激，以检测所述细胞结构2侧溶液或进行其他的研究。

Claims (8)

1.一种细胞培养微芯片，其特征在于，所述芯片由PDMS芯片和载玻片键合形成，所述PDMS芯片包括PDMS基底以及位于其上的一对或多对微坝结构，所述微坝结构包括两个间距为的30-40μm微坝，所述微坝与载玻片间间隙高度为3-5μm；PDMS为聚二甲基硅氧烷的英文缩写。

2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述芯片包括两对间距为100-120μm的微坝结构。

3.如权利要求2所述的芯片，其特征在于，所述微坝结构将所述细胞培养微芯片隔成5个通过微坝与载玻片间间隙相通的微管道，所述微管道分别为两对微坝结构之间的细胞内基质微管道，微坝结构内的内皮细胞培养微管道各一条，以及位于两条内皮细胞培养微管道各自外侧的细胞外基质微管道各一条。

4.如权利要求3所述的芯片，其特征在于，所述芯片还包括用于测定细胞内基质溶液和/或细胞外基质溶液的物质浓度的检测电极。

5.如权利要求4所述的芯片，其特征在于，所述检测电极为NO检测电极。

6.如权利要求1-5中任一项所述的细胞培养微芯片的制备方法，其特征在于，所述方法包括SU-8模型制备、PDMS塑性成型以及PDMS芯片与载玻片键合的步骤。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

在硅片正面甩涂一层SU-8 2050光刻胶，前烘固化；将第一块掩膜板与基片对准，紫外线曝光，微管道图形转移到第一层SU-8光刻胶上；后烘后，在第一层SU-8表面再甩涂一层SU-8 2005光刻胶，前烘固化；将第二块掩膜板与基片对准，紫外线曝光，将掩膜板上的坝型微结构转移到第二层SU-8光刻胶上；第二层SU-8光刻胶后烘；用SU-8显影液对两层SU-8结构同时显影，异丙醇冲洗，去离子水冲洗，氮气吹干，得到多层SU-8模具；将PDMS前聚体和固化剂混合物倒入SU-8模具中，放入65℃烘箱中，烘焙1小时；将固化后的PDMS芯片从模具上揭下来，打孔后和载玻片键合形成细胞培养芯片。

8.如权利要求1-5中任一项所述的芯片用于细胞培养形成一排或多排紧密单层细胞结构后进行刺激，并检测所述细胞结构两侧溶液的应用。

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