CN113528338A - 一种用于药物筛选的专用组合模具及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物筛选技术领域，尤其涉及一种用于药物筛选的专用组合模具及其使用方法。其可以得到具有中间大通道和周围许多小通道的具有不同细胞基质层的复杂器官。包括底座模具、外层孔板模具、中间层孔板模具、内层框架模具、两个中央通道模具、多个分支通道模具；内层框架模具、中间层孔板模具、外层孔板模具三者由内置外依次嵌套设置，形成三层结构，且各层彼此不接触，并嵌于同一底座模具内；两个中央通道模具位于内层框架模具内、并嵌入底座模具的凹槽中；外层孔板模具、中间层孔板模具、内层框架模具三者外壁均设置有多个嵌孔，外层孔板模具外壁还设置有嵌槽，多个分支通道模具由嵌孔或嵌槽插入；各模具组合起来用于模拟多通道复杂器官。

Description

一种用于药物筛选的专用组合模具及其使用方法

技术领域

本发明属于药物筛选技术领域，尤其涉及一种用于药物筛选的专用组合模具及其使用方法。

背景技术

目前, 慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘以及肺纤维化（PF）都已成为高死亡率的肺脏疾病。伴随着气候和环境的改变,人类现在面临的肺脏疾病呈明显增长的趋势。近半个世纪以来,随着人们对于肺脏的基础理论研究的不断深入，以及针对一些肺脏疾病发病机理研究所取得的积极进展,氧气疗法、手术治疗和肺脏疾病康复疗法等治疗手段有了长足进步。尽管如此,肺脏移植仍是肺脏疾病晚期的主要治疗手段。然而,由于缺少肺脏器官来源,目前很多患者根本无法得到有效治疗。寻找新的治疗方法和手段也已成为肺脏疾病治疗的当务之急。组织工程技术的不断发展已为肺脏疾病的治疗带来新的希望。组织工程是融合了生命科学、材料科学以及工程科学的原理和方法,旨在再造人体组织器官的新兴交叉学科。近年来,组织工程研究先后在皮肤、软骨、神经、血管及心肌组织再造中取得了突破性进展,并有部分组织工程产品进入临床应用。肺脏中存在有大量丰富的血管、气管等管状网络。血管网络为组成肺脏的各部分组织细胞提供氧气和营养的同时将代谢废物排出体外，保证各种生理功能正常运行。缺乏足够精细的血管网络将很难实现体积较大的组织的构建。肺脏具有通气和换气功能,肺实质为肺内支气管的各级分支和其末端的肺泡。近年来肺脏组织工程研究进展迅速,先后有研究人员成功在体外再造了组织工程化肺泡和支气管粘膜。尽管如此,针对肺脏体外再造,仍存在如何优选细胞支架材料,如何优化细胞-支架复合体体外培育环境以及进一步提高再造肺脏组织质量等一系列问题。

目前，血管、气管网络的构建已成为生物型人工肺脏制造领域的主要研究热点。常用的构建血管、气管网络的方法主要有使用相应的生长因子缓慢促进血管不同组织层形成，多细胞联合培养形成血管结构，利用生物反应器和微流体通道等技术形成血管以及基于先进成型技术的血管化组织直接构建等。

本发明制造的模拟肺脏器官具有多微管通道结构，目前药物昂贵的原因之一是缺乏可以取代昂贵和耗时的动物研究的实验模型系统。尽管在这些类型的研究中，细胞培养模型作为组织和器官的替代品已经取得了相当大的进展，但培养的细胞通常不能维持分化和组织特异性功能的表达。虽然，三维细胞外基质(ECM)凝胶可以促进细胞的生长,但是，这些方法仍然不能重建结构和机械的器官。特别是，现有的模型系统不能在微血管内皮和邻近的实质组织之间重建活跃的组织-组织界面，而这些实质组织是液体、营养物质、免疫细胞和其他调节因子的关键运输发生的地方，它们也不允许应用动态机械力(例如，肺部的呼吸运动、血管的剪切、肠道的蠕动、皮肤的张力等等)，但是这些对生命器官的发育和功能至关重要。多微管通道器官模型使得微制造血管、肌肉、骨骼、呼吸道、肝脏、大脑、肠道和肾脏的模型成为可能。例如，气管系统当细胞生长到融合时，将空气引入上皮腔室，形成气液界面，更精确地模拟肺泡空气空间的内衬。该发明的分隔通道结构使其能够控制液体流动以及细胞和营养物质的独立输送到上皮和内皮。

发明专利（申请号为201110448154.3）《基于一种组合模具的复杂器官前体的制备方法》中提供了一种多分支及多层结构的复杂组织器官前体的制备方法，利用组合模具分层灌注来形成含有多分支结构的复杂器官组织前体。该发明的缺点在于采用直接拆模的方式，在脱模时实心多分支内模具由于其形状不规则会破坏已经成型的细胞基质层，该制备方法对模具内部形状及粗糙度要求较高。同时由于交联剂或聚合剂与高分子溶液材料接触面过少，会容易影响交联或聚合效果，继而影响细胞基质层的成形效果，而且网格和通道较少，不适宜组织与外界进行物质交换。因为不能进行高精度的控制细胞微环境，因此不适用于进行药物筛选。

发明专利（申请号为201210324600.4）《利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法》中提出了一种利用旋转组合模具制备纺锤体状的复杂器官前体的方法。理论上可以通过模具的旋转形成带多分支管状通路的纺锤体状的复杂器官，但缺点在于模具的旋转速度不同，纺锤体成型高度就不同，对于不同组合模具，其旋转速度难以进行定量限制，所以难以确定纺锤体的具体成型形状。这种组合模具目前只用于含一组分支通道的纺锤体状器官前体的成形，且在拔除内模具时易造成含细胞基质材料结构的破坏，并且由于进行旋转对细胞活性产生影响。

发明专利（申请号为201510419730.X）《一种制备带多分支通道的组织器官前体的方法及专用模具》中提出了一种制备带多分支通道的组织器官前体的专用模具，其缺点在于中间操作步骤复杂，大小管道间易错位。粘稠度稍高的水凝胶溶液很难充满整个内腔，分支内模具不可拆卸，从细胞基质层中取出时会对已成形的结构造成破坏。

发明专利（申请号为201910682212.5）《可拆卸式专用模具及制备多分支通道复杂器官前体的方法》中提出了一种制备多分支通道的复杂器官前体的专用模具以及方法。该专用模具内部分支模具可拆卸，从细胞基质层取出时不会对已成形的结构造成破坏。

发明内容

本发明就是针对现有技术存在的缺陷，提供一种用于药物筛选的专用组合模具及其使用方法，其利用仿生学原理模拟复杂器官结构并设计主通道模具、分支通道模具和孔板模具，可以得到具有中间大通道和周围许多小通道的具有不同细胞基质层的复杂器官。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，一种用于药物筛选的专用组合模具，包括底座模具、外层孔板模具、中间层孔板模具、内层框架模具、两个中央通道模具、多个分支通道模具。

内层框架模具、中间层孔板模具、外层孔板模具三者由内置外依次嵌套设置，形成三层结构，且各层彼此不接触，并嵌于同一底座模具内；两个中央通道模具位于内层框架模具内、并嵌入底座模具的凹槽中。

外层孔板模具、中间层孔板模具、内层框架模具三者外壁均设置有多个嵌孔，外层孔板模具外壁还设置有嵌槽，多个分支通道模具由嵌孔或嵌槽插入；各模具组合起来用于模拟多通道复杂器官。

进一步地，所述底座模具呈矩形，底面为平面或凹面或凸面，中间设置有用于固定中央主通道模具的圆柱形凹槽，底座模具的矩形四边各设一用于固定四个外层孔板模具的矩形凹槽，底座模具内还设有四个用于固定中间层孔板模具的矩形凹槽和四个用于固定内层框架模具的矩形凹槽。

所述外层孔板模具包括外层孔板模具一、外层孔板模具二、外层孔板模具三、外层孔板模具四；四个外层孔板模具嵌入至对应底座模具的矩形凹槽内。

所述中间层孔板模具包括中间层孔板模具一、中间层孔板模具二、中间层孔板模具三、中间层孔板模具四；四个中间层孔板模具嵌入至对应底座模具的凹槽内。

多个分支通道模具共有八层分支通道模具，每层分支通道由两个全尺寸分支通道模具和两个半尺寸分支通道模具组成。

全尺寸分支通道模具有25个分支通道包括16个长支通道和9个短支通道。

半尺寸分支通道模具有9个分支通道且都为短支通道；长分支通道模具长度大于两个对面孔板模具之间的距离，短分支通道长度为外层孔板模具与内层框架模具距离。

进一步地，所述复杂器官包括肺脏结构，固定在底座模具中心的两条中央主通道可模仿肺脏中的气管，多个分支通道模具可模仿围绕中间动静脉血管的小血管、神经导管和支气管结构。

进一步地，所述三层结构选用水凝胶材料，用于培养器官不同部位的特定组织，不同管道可以用来培养不同细胞。

进一步地，所述底座模具、两个中央通道模具、框架模具、分支通道模具和孔板模具的材料均为无生物毒性的合成高分子材料（如合成纤维、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、光敏树枝或聚氨酯等）或者金属材料。

该专用组合模具使用方法包括以下步骤：

步骤1、提取或购买动物或人细胞制成细胞悬浮液，细胞悬浮液密度为1×10³～5×10⁷个/ml，制备质量百分浓度为1％～30％的天然高分子水凝胶溶液作为基质溶液，将基质溶液与细胞悬浮液按体积比1～9：9～1混合制成含细胞的基质溶液，可通过改变选择的细胞类型和基质溶液类型得到多种含有一种（或多种不同）细胞的基质溶液。

步骤2、在所有的通道模具上涂覆一层含细胞（如气管内皮细胞，血管内皮细胞等）的基质溶液，采用使用物理、化学交联或聚合等方法进行交联得到一层管状细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。

步骤3、将专用组合模具的各个组成部分进行组装：首先固定好外中内三层孔板模具，然后将步骤2中已经进行交联处理分支通道模具插入孔板模具上对应的孔内，再将两个中央通道模具固定在底座模具的中央凹槽内；将一种含有细胞的基质溶液加到模具内腔中使基质溶液充分填满由内层框架组成的整个内腔。使用物理、化学交联或聚合法制成内层细胞基质层。然后取出内层框架模具，再将另一种含有细胞的基质溶液加到由中间层孔板模具和内层框架模具组成的整个内腔中使基质溶液充分填满整个内腔；使用物理、化学交联或聚合法制成中间层细胞基质层。最后将分支通道模具退出到中间层孔板模具处，取出中间层孔板模具，将另一种含有细胞的基质溶液加到由中间层孔板模具和外层孔板模具围成的内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。使用物理、化学交联或聚合法制成外层细胞基质层。

步骤4、用镊子拔出所有安装的分支通道模具，通过加入种子细胞、培养基和生长因子并且针对性培养形成相应的支气管黏膜内皮细胞，神经导管内皮细胞和血管内皮细胞。

步骤5、（用镊子）拔出所有安装的主通道模具，通过加入种子细胞、培养基和生长因子并且针对性培养形成相应的气管内皮细胞、平滑肌细胞。

进一步地，水凝胶溶液采用胶原蛋白、琼脂糖、纤维蛋白原、海藻酸钠、丝素蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、粘连蛋白、凝血酶、聚乙二醇中的一种或者几种。

进一步地，用于溶解天然高分子材料的溶剂采用水、PBS溶液、生理盐水、3－羟甲基氨基甲烷盐酸溶液、pH＝6～8的0.09M氯化钠或细胞培养液。

进一步地，用于成型多层含有不同细胞的细胞基质层，完成多种细胞组织的组装。

进一步地，在细胞基质溶液中可加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肺细胞生长因子等细胞生长因子中的一种或几种，以及肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖等抗凝血因子中的一种或几种，细胞生长因子及抗凝血因子体积占总溶液的体积百分比为0.001％～0.1％。

与现有技术相比本发明有益效果。

本发明采用仿生学方法模仿复杂器官的结构设计出的多通道可拆分组合模具可制备内部带有模仿中间动静脉血管、神经和气管的大通道和周围模仿毛细血管和支气管、神经的小通道的复杂器官。多层模具的设计可以通过分层灌注得到不同的细胞基质层，内部通道可通过细胞-水凝胶的诱导形成血管、神经和支气管结构。完全贯通的中央主通道和分支通道为体外脉动培养和营养液/血液灌流提供了可能。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。本发明保护范围不仅局限于以下内容的表述。

图1是专用组合模具的整体剖面图。

图2是专用组合模具的结构爆炸示意图。

图3是专用组合模具的俯视图一。

图4是专用组合模具的左视图。

图5是专用组合模具的透视图。

图6是带多通道网络的复杂器官前体成型图（以三种不同细胞基质层的器官前体为例）。

图7是专用组合模具的俯视图二。

图8是专用组合模具的俯视角度爆炸示意图。

图中，143-底座模具；138-两个中央通道模具；133-外层孔板模具一；136-外层孔板模具二；139-外层孔板模具三；142-外层孔板模具四；134-中间层孔板模具一；137-中间层孔板模具二；140-中间层孔板模具三；141-中间层孔板模具四；135-内层框架模具；

101-分支通道模具一；102-分支通道模具二；103-分支通道模具三；104-分支通道模具四；105-分支通道模具五；106-分支通道模具六；107-分支通道模具七；108-分支通道模具八；109-分支通道模具九；110-分支通道模具十；111-分支通道模具十一；112-分支通道模具十二；113-分支通道模具十三；114-分支通道模具十四；115-分支通道模具十五；116-分支通道模具十六；117-分支通道模具十七；118-分支通道模具十八；119-分支通道模具十九；120-分支通道模具二十；121-分支通道模具二十一；122-分支通道模具二十二；123-分支通道模具二十三；124-分支通道模具二十四；125-分支通道模具二十五；126-分支通道模具二十六；127-分支通道模具二十七；128-分支通道模具二十八；129-分支通道模具二十九；130-分支通道模具三十；131-分支通道模具三十一；132-分支通道模具三十二；

201-第一种细胞基质层；202-第二种细胞基质层；203-第三种细胞基质层。

具体实施方式

如图1-8所示，本发明包括底座模具143、两个中央通道模具138、外层孔板模具一133，外层孔板模具二136、外层孔板模具三139、外层孔板模具四142、中间层孔板模具一134、中间层孔板模具二137、中间层孔板模具三140、中间层孔板模具四141。

内层框架模具135。

分支通道模具一101、分支通道模具二102、分支通道模具三103、分支通道模具四104、分支通道模具五105、分支通道模具六106、分支通道模具七107、分支通道模具八108、分支通道模具九109、分支通道模具十110、分支通道模具十一111、分支通道模具十二112、分支通道模具十三113、分支通道模具十四114、分支通道模具十五115、分支通道模具十六116、分支通道模具十七117、分支通道模具十八118、分支通道模具十九119、分支通道模具二十120、分支通道模具二十一121、分支通道模具二十二122、分支通道模具二十三123、分支通道模具二十四124、分支通道模具二十五125、分支通道模具二十六126、分支通道模具二十七127、分支通道模具二十八128、分支通道模具二十九129、分支通道模具三十130、分支通道模具三十一131、分支通道模具三十二132。

所述底座模具143为矩形，底面为平面、凹面或者凸面，中间有可以固定中央主通道模具的圆柱形凹槽，最外面边缘四周各有一个有固定四个外层孔板模具的矩形凹槽，向内依次有四个固定中间层孔板模具的矩形凹槽和四个固定内层框架模具的矩形凹槽。

共有八层分支通道模具，每层分支通道由两个全尺寸分支通道模具和两个半尺寸分支通道模具组成；全尺寸分支通道模具有25个分支通道包括16个长支通道和9个短支通道，半尺寸分支通道模具有9个分支通道且都为短支通道，长分支通道模具长度大于两个对面孔板模具之间的距离，短分支通道长度为外层孔板模具与内层框架模具距离，便于拆卸，而且可以根据具体需要进行自由组合。

优选方案一、模具采用仿生学方法模仿复杂器官如肺脏的结构，固定在底座模具中心的两条中央主通道可模仿肺脏中的气管，在体外培养时保证营养物质的一进一出，实现营养物质循环的脉动培养，多个分支通道模具可模仿围绕中间动静脉血管的小血管、神经导管和支气管结构，由于是贯通结构，也可实现脉动培养。

优选方案二、专用组合模具采用从内至外三层且多管道的框架孔板结构。从内至外三层结构可以选用最适合的水凝胶材料用来培养器官不同部位的特定组织，不同管道可以用来培养不同细胞，例如，血管上皮细胞、神经和支气管上皮细胞等。

优选方案三、所述的底座模具，两个中央通道模具，框架模具、分支通道模具和孔板模具的材料为无生物毒性的合成高分子材料（如合成纤维、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、光敏树枝或聚氨酯等）或者金属材料。

优选方案四、分支通道模具的直径范围在0.1mm～5mm；中央主通道模具（138）的直径底座模具上预留的凹槽相同；底座模具（143）的凹槽与孔板模具厚度对应相同，以保证密封良好。

专用组合模具用于药物筛选，包括步骤：（1）采用无生物毒性的合成高分子材料（如合成纤维、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、光敏树枝或聚氨酯等）或者金属材料制备底座模具，两个中央通道模具，分支通道模具和孔板模具。

（2）分支通道模具的直径范围在0.1mm～5mm；中央主通道模具的直径底座模具上预留的凹槽相同；底座模具的矩形凹槽与孔板模具厚度对应相同，以保证密封良好。

（3）提取或购买动物或人细胞制成细胞悬浮液，细胞悬浮液密度为1×10³～5×10⁷个/ml，制备质量百分浓度为1％～30％的天然高分子水凝胶溶液作为基质溶液，将基质溶液与细胞悬浮液按体积比1～9：9～1混合制成含细胞的基质溶液，可通过改变选择的细胞类型和基质溶液类型得到多种含有一种（或多种不同）细胞的基质溶液。

（2）在所有的通道模具上涂覆一层含细胞（如气管内皮细胞，血管内皮细胞等）的基质溶液，采用使用物理、化学交联或聚合等方法进行交联得到一层管状细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。

（3）将专用组合模具的各个组成部分进行组装：首先固定好外中内三层孔板模具，然后将（2）中已经进行交联处理分支通道模具插入孔板模具上对应的孔内，再将两个中央通道模具固定在底座模具的中央凹槽内。将一种含有细胞的基质溶液加到模具内腔中使基质溶液充分填满由内层框架组成的整个内腔。使用物理、化学交联或聚合法制成内层细胞基质层。然后取出内层框架模具，再将另一种含有细胞的基质溶液加到由中间层孔板模具和内层框架模具组成的整个内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。使用物理、化学交联或聚合法制成中间层细胞基质层。最后将分支通道模具退出到中间层孔板模具处，取出中间层孔板模具，将另一种含有细胞的基质溶液加到由中间层孔板模具和外层孔板模具围成的内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。使用物理、化学交联或聚合法制成外层细胞基质层。

（4）用镊子拔出所有安装的分支通道模具，通过加入种子细胞、培养基和生长因子并且针对性培养形成相应的支气管黏膜内皮细胞，神经导管内皮细胞和血管内皮细胞。

（5）用镊子拔出所有安装的主通道模具，通过加入种子细胞、培养基和生长因子并且针对性培养形成相应的气管内皮细胞、平滑肌细胞。

本发明的优选方案是配制的水凝胶溶液的天然高分子材料通常采用胶原蛋白、琼脂糖、纤维蛋白原、海藻酸钠、丝素蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、粘连蛋白、凝血酶、聚乙二醇等材料中的一种或者几种，以多种材料相互混合得到的水凝胶溶液效果较佳。在萃取部分用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、PBS溶液、生理盐水、3－羟甲基氨基甲烷盐酸溶液、pH＝6～8的0.09M氯化钠或细胞培养液。在细胞基质溶液中可加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肺细胞生长因子等细胞生长因子中的一种或几种，以及肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖等抗凝血因子中的一种或几种，细胞生长因子及抗凝血因子体积占总溶液的体积百分比0.001％～0.1％。

实施例1：带多分支血管网络的乳房制造及药物筛选。

（1）使用光敏树脂制备含底座模具、五个竖直通道模具、水平通道模具和孔板模具。

（2）配制1%纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液（20 IU/ml）。

（3）在所有的通道模具上涂覆一层内皮细胞和纤维蛋白原的混合物，该基质溶液的细胞密度为5×10⁷个/ml，基质溶液中加入重量/体积（w/v）为1%肝素，使用凝血酶溶液（20 IU/ml）使纤维蛋白原聚合2 min得到一层管状细胞基质层。

（4）将组合模具的各个组成部分进行组装：首先将孔板模具和五个竖直通道模具通过凹槽固定在底座模具上，然后将（3）中所有水平通道模具插入到孔板模具对应的孔内。通过顶部将细胞密度为5×10⁷个/ml的乳小管细胞和纤维蛋白原的混合基质溶液加到由内层孔板模具组成的内腔中使基质溶液充分填满整个模具内腔。使用凝血酶溶液（20 IU/ml）使纤维蛋白原聚合制成内层细胞基质层。然后将水平通道模具退出到外层孔板模具处，取出内层孔板模具。最后通过顶部将细胞密度为2×10⁵个/ml的乳小管细胞和纤维蛋白原的混合基质溶液加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个由外层孔板模具和内层孔板模具组成的内腔。使用凝血酶溶液（20 IU/ml）使纤维蛋白原聚合制成底层细胞基质层。

（5）用镊子拔出所有安装的水平通道模具，通过形成的水平通道口向通道中加乳小管细胞和纤维蛋白原混合的基质溶液，细胞密度为2×10⁵个/ml，使用凝血酶溶液（20IU/ml）使纤维蛋白原聚合，制成适宜管道细胞生长的基质层，即生物型人工乳房。

（6）将抗乳腺癌药物溶解在细胞培养液或PBS溶液中,注射到组合模具上管道中流经含多细胞层的生物型人工乳房，定时提取管道中液体，测定其中药物浓度变化，并对其中细胞形态进行表征,鉴定细胞对药物的反应程度。

实施例2：带多分支血管、神经网络的大脑制造及药物筛选。

（1）使用聚四氟乙烯制备底座模具、五个竖直通道模具、水平通道模具和孔板模具。

（2）将5%明胶、2%海藻酸钠共混溶于PBS溶液中作为明胶/海藻酸钠基质溶液，其中加入内皮细胞生长因子（EGFs 0.5 ng/ml）。配制1%（w/v）的氯化钙溶液。

（3）在所有的通道模具上涂覆一层含脂肪干细胞（1×10⁵个/ml）和内皮细胞生长因子（EGFs 0.5 ng/ml）的明胶/海藻酸钠基质溶液，用1%（w/v）的氯化钙溶液使海藻酸钠交联，得到管状内皮细胞层。

（4）将组合模具的各个组成部分进行组装：首先将孔板模具和五个竖直通道模具通过凹槽固定在底座模具上，然后将（3）中所有水平通道模具插入到孔板模具对应的孔内。通过顶部将细胞密度为3×10⁶个/ml的大脑胶质细胞和明胶/海藻酸钠基质溶液加到由内层孔板模具组成的内腔中使基质溶液充分填满整个模具内腔。使用1%（w/v）的氯化钙溶液使海藻酸钠交联制成内层细胞基质层。然后取出内层孔板模具。再将细胞密度为1×10³个/ml的血旺氏细胞和明胶/海藻酸钠基质溶液加到由内层框架模具和外层孔板模具组成的内腔中，使基质溶液充分填满整个内腔。使用1%（w/v）的氯化钙溶液使海藻酸钠交联制成外层细胞基质层。

（5）用镊子拔出所有安装的水平通道模具和竖直通道模具，通过形成的通道口向通道中加含脂肪干细胞（1×10⁵个/ml）和内皮细胞生长因子（EGFs 0.5 ng/ml）的明胶/海藻酸钠基质溶液，用1%（w/v）的氯化钙溶液使海藻酸钠交联，得到中层细胞基质层。

（6）将脑肿瘤药物溶解在细胞培养液或PBS溶液中,注射到组合模具上管道中流经含多细胞层的人工大脑中，定时提取管道中液体，测定其中药物浓度变化，并对其中细胞形态进行表征,鉴定细胞对药物的反应程度。

实施例3：带多分支血管、神经导管网络的胃制造及药物筛选。

（1）使用硅橡胶制备底座模具、五个竖直通道模具、水平通道模具和孔板模具。

（2）配制10%的明胶溶液作为基质溶液和10%（w/v）谷氨酰胺转胺酶（mTG，100 U/ml）溶液。

（3）在一半的通道模具上涂覆一层雪旺氏细胞（1×10³个/ml）和基质溶液的混合物，在另一半的通道模具上涂敷一层血管上皮细胞和基质溶液的混合物，基质溶液中细胞的密度为5×10⁶个/ml，使用谷氨酰胺转胺酶交联，在37℃下放置10分钟，使明胶与细胞混合物结构稳定，得到一层管状细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。

（4）将专用组合模具的各个组成部分进行组装：首先将孔板模具和五个竖直通道模具通过凹槽固定在底座模具上，然后将（3）所有水平通道模具插入到孔板模具对应的孔内。通过顶部将细胞密度为1×10³个/ml的胃黏膜上皮细胞和明胶溶液加到由内层孔板模具组成的内腔中使基质溶液充分填满整个模具内腔。使用谷氨酰胺转胺酶交联制成底层细胞基质层。然后将水平通道模具退出到外层孔板模具处，取出内层孔板模具。然后通过顶部将细胞密度为1×10³个/ml的脂肪干细胞和明胶溶液加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个由外层孔板模具和内层孔板模具组成的内腔。使用谷氨酰胺转胺酶交联制成外层细胞基质层。

（5）用镊子拔出所有安装的水平通道模具，通过形成的通道口向通道中加脂肪干细胞和明胶溶液，细胞密度为1×10⁶个/ml，基质溶液中加入神经细胞生长因子（IGFs 0.1ng/ml），使用谷氨酰胺转胺酶交联，制成内外两层细胞基质层。

（6）将抗胃癌药物溶解在细胞培养液或PBS溶液中,注射到组合模具上管道中流经含多细胞层的人工胃中，定时提取管道中液体，测定其中药物浓度变化，并对其中细胞形态进行表征,鉴定细胞对药物的反应程度。

可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于药物筛选的专用组合模具，包括底座模具、外层孔板模具、中间层孔板模具、内层框架模具、两个中央通道模具、多个分支通道模具；其特征在于,内层框架模具、中间层孔板模具、外层孔板模具三者由内置外依次嵌套设置，形成三层结构，且各层彼此不接触，并嵌于同一底座模具内；两个中央通道模具位于内层框架模具内、并嵌入底座模具的凹槽中；

外层孔板模具、中间层孔板模具、内层框架模具三者外壁均设置有多个嵌孔，外层孔板模具外壁还设置有嵌槽，多个分支通道模具由嵌孔或嵌槽插入；各模具组合起来用于模拟多通道复杂器官。

2.根据权利要求1所述的一种用于药物筛选的专用组合模具，其特征在于：所述底座模具呈矩形，底面为平面或凹面或凸面，中间设置有用于固定中央主通道模具的圆柱形凹槽，底座模具的矩形四边各设一用于固定四个外层孔板模具的矩形凹槽，底座模具内还设有四个用于固定中间层孔板模具的矩形凹槽和四个用于固定内层框架模具的矩形凹槽；

所述外层孔板模具包括外层孔板模具一、外层孔板模具二、外层孔板模具三、外层孔板模具四；四个外层孔板模具嵌入至对应底座模具的矩形凹槽内；

所述中间层孔板模具包括中间层孔板模具一、中间层孔板模具二、中间层孔板模具三、中间层孔板模具四；四个中间层孔板模具嵌入至对应底座模具的凹槽内；

多个分支通道模具共有八层分支通道模具，每层分支通道由两个全尺寸分支通道模具和两个半尺寸分支通道模具组成；

全尺寸分支通道模具有25个分支通道包括16个长支通道和9个短支通道；

半尺寸分支通道模具有9个分支通道且都为短支通道；长分支通道模具长度大于两个对面孔板模具之间的距离，短分支通道长度为外层孔板模具与内层框架模具距离。

3.根据权利要求1所述的一种用于药物筛选的专用组合模具，其特征在于：所述复杂器官包括肺脏结构，固定在底座模具中心的两条中央主通道可模仿肺脏中的气管，多个分支通道模具可模仿围绕中间动静脉血管的小血管、神经导管和支气管结构。

4.根据权利要求1所述的一种用于药物筛选的专用组合模具，其特征在于：所述三层结构选用水凝胶材料，用于培养器官不同部位的特定组织，不同管道可以用来培养不同细胞。

5.根据权利要求2所述的一种用于药物筛选的专用组合模具，其特征在于：所述底座模具、两个中央通道模具、框架模具、分支通道模具和孔板模具的材料均为无生物毒性的合成高分子材料。

6.专用组合模具使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1、提取或购买动物或人细胞制成细胞悬浮液，细胞悬浮液密度为1×10³～5×10⁷个/ml，制备质量百分浓度为1％～30％的天然高分子水凝胶溶液作为基质溶液，将基质溶液与细胞悬浮液按体积比1～9：9～1混合制成含细胞的基质溶液，可通过改变选择的细胞类型和基质溶液类型得到多种含有一种细胞的基质溶液；

步骤2、在所有的通道模具上涂覆一层含细胞的基质溶液，采用使用物理、化学交联或聚合等方法进行交联得到一层管状细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度；

步骤3、将专用组合模具的各个组成部分进行组装：首先固定好外中内三层孔板模具，然后将步骤2中已经进行交联处理分支通道模具插入孔板模具上对应的孔内，再将两个中央通道模具固定在底座模具的中央凹槽内；将一种含有细胞的基质溶液加到模具内腔中使基质溶液充分填满由内层框架组成的整个内腔；

使用物理、化学交联或聚合法制成内层细胞基质层；然后取出内层框架模具，再将另一种含有细胞的基质溶液加到由中间层孔板模具和内层框架模具组成的整个内腔中使基质溶液充分填满整个内腔；使用物理、化学交联或聚合法制成中间层细胞基质层；

最后将分支通道模具退出到中间层孔板模具处，取出中间层孔板模具，将另一种含有细胞的基质溶液加到由中间层孔板模具和外层孔板模具围成的内腔中使基质溶液充分填满整个内腔；

使用物理、化学交联或聚合法制成外层细胞基质层；

步骤4、用镊子拔出所有安装的分支通道模具，通过加入种子细胞、培养基和生长因子并且针对性培养形成相应的支气管黏膜内皮细胞，神经导管内皮细胞和血管内皮细胞；

步骤5、拔出所有安装的主通道模具，通过加入种子细胞、培养基和生长因子并且针对性培养形成相应的气管内皮细胞、平滑肌细胞。

7.根据权利要求6所述的专用组合模具使用方法，其特征在于：水凝胶溶液采用胶原蛋白、琼脂糖、纤维蛋白原、海藻酸钠、丝素蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、粘连蛋白、凝血酶、聚乙二醇中的一种或者几种。

8.根据权利要求6所述的专用组合模具使用方法，其特征在于：用于溶解天然高分子材料的溶剂采用水、PBS溶液、生理盐水、3－羟甲基氨基甲烷盐酸溶液、pH＝6～8的0.09M氯化钠或细胞培养液。

9.根据权利要求6所述的专用组合模具使用方法，其特征在于：用于成型多层含有不同细胞的细胞基质层，完成多种细胞组织的组装。

10.根据权利要求6所述的专用组合模具使用方法，其特征在于：在细胞基质溶液中可加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肺细胞生长因子等细胞生长因子中的一种或几种，以及肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖等抗凝血因子中的一种或几种，细胞生长因子及抗凝血因子体积占总溶液的体积百分比为0.001％～0.1％。

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