CN111921016B - 一种人工器官制造模具及人工器官制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于人工器官制造技术领域，尤其涉及一种人工器官制造模具及人工器官制造方法。能够实现在复杂器官前体中带有树状分支通道的血管、胆管、神经、器官、乳管等通道的体外快速制造。包括底座模具、支撑模具、顶盖模具、多个二级通道模具和至少一级的外壳模具；一级通道模具垂直或倾斜地固定在底座模具上；底座模具底面为平面、凹面或者凸面，采用多层台阶形状，最内侧的台阶固定的是支撑模具，其余外侧台阶固定的是外壳模具，支撑模具固定在底座模具上；顶盖模具四周有一圈向下的台阶，顶盖模具中间设置有一个加料孔，用于注入含有细胞的基质材料，加料孔四周设置有多个倾斜的安装孔。

Description

一种人工器官制造模具及人工器官制造方法
技术领域
本发明属于人工器官制造技术领域，尤其涉及一种人工器官制造模具及人工器官制造方法。
背景技术
利用先进的技术构建生物人工器官进行器官移植，高通量药物筛选，病理学研究等是现代科学技术发展的必然趋势。人体组织器官的损伤、衰竭或缺损等情况会造成器官功能障碍以致会影响患者的正常生活和生命安全。药物治疗等方法只能在一段时间起到作用，不能长期保持患者的健康，器官移植是治疗此类疾病的希望，但存在供体器官缺乏，患者免疫排斥反应等的问题。所以为了解决此类终末期器官损伤，使用组织工程技术，将细胞生物学和材料科学相结合，进行体外或体内构建组织和器官成为了一大发展方向。使用组织工程技术，可以利用患者自身的自体细胞进行体外培养，培养出符合患者需求的人工组织和器官，既能解决供体器官缺乏的问题，又能解决患者器官移植后会产生的免疫排斥反应的问题，给终末期器官损伤的患者带来了希望。体外构建组织和器官还可以作为体外疾病/癌症组织模型来预测药物对疾病的治疗反映或药物的毒性反应，并且可以通过构建的疾病模型来研究疾病的发生过程，研究组织病理学。相较二维细胞培养模型和动物模型，组织工程学中构建的体外模型更具优势。
近年来，组织工程已经在骨、皮肤等结构相对简单的领域取得了一些成就，但在一些结构相对复杂的器官的体外构建上迟迟难以得到突破。主要原因是复杂的器官往往需要更复杂的细胞构成，需要血管，神经，胆管，气管等管状网络体系。尤其是对于血管网络的构建，是在体外培养复杂组织器官的重要一环。血管网络能够为器官的各部分组织细胞提供充足的氧气和营养的同时将代谢废物排出体外，保证各种生理功能正常运行。研究表明，肝细胞在毛细血管周围100～200μm的范围内才容易存活，否则很快会因氧气和营养物质的缺乏而死亡，缺乏足够精细的血管网络将很难实现体积较大的组织的构建。其他的一些管状结构在器官构建中也非常重要，如果不能很好的构建这些管状结构，那么制造出的人工器官就容易产生相当大的死核区域，很难维持正常的组织结构和生理功能。因此，血管，神经等分支管道的构建已经成为了人工器官制造领域的研究热点。
专利（申请号为201210324600.4）《利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法》中提出了一种利用可旋转组合模具制备纺锤体状的多层次的复杂器官前体的方法。该方法的优点是在旋转的过程中细胞和基质充分混合，水凝胶块中也不会有气泡，理论上可以通过模具的旋转形纺锤体状的多层次复杂器官，但缺点是模具的旋转中心只有一个，所以这种组合模具目前只能用于含一组分支通道的纺锤体状器官前体的成形，另一个缺点是在拔除内模具时易造成已成型的结构的破坏。
专利（申请号为201510419730.X）《一种制备带多分支通道的组织器官前体的方法及专用模具》中提出了一种用于制备带多分支通道的器官前体的专用模具，此种模具的缺点在于分支内模具不能拆卸，且大小管道之间易错位，将多分支通道模具脱模时容易对已经成形的结构造成破坏。操作上中间操作步骤复杂，粘稠度稍高的基质溶液很难充满整个内腔。
专利申请文件（申请号为201910682212.5）《可拆卸式专用模具及制备多分支通道复杂器官前体的方法》中提出了一种用于制备多分支通道的复杂器官前体的专用模具以及相应的制备方法。该专用模具内部通道模具是可拆卸的，从已成型的细胞基质层中取出时不会对已成形的结构造成破坏，但存在拆卸操作比较困难的问题。
专利申请文件（申请号为202010361588.9）《制备复杂器官的专用组合模具及其制备肝脏前体的方法》中提出了一种仿肝小叶结构的组合模具用于制备拥有血管和胆管网络的肝脏前体并介绍了制备方法。该专用组合模具采用仿生学方法，血管网络贯穿整个肝脏前体，但存在的问题是更适合制备肝脏前体，对于其他复杂器官的制备不理想。
发明内容
本发明就是针对现有技术存在的缺陷，提供一种人工器官制造模具及人工器官制造方法，其利用仿生学原理模仿血管，胆管等分支结构，通过将一组树状分支通道拆分为上下两组，克服了整体树状通道模具难以从已成型的水凝胶结构中完全不破坏其结构取出的缺点。能够实现在复杂器官前体中带有树状分支通道的血管、胆管、神经、器官、乳管等通道的体外快速制造。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，一种人工器官制造模具，包括设置有一级通道模具的底座模具、支撑模具、顶盖模具、多个二级通道模具和至少一级的外壳模具。
一级通道模具垂直或倾斜地固定在底座模具上。
底座模具底面为平面、凹面或者凸面，采用多层台阶形状，最内侧的台阶固定的是支撑模具，其余外侧台阶固定的是外壳模具，（如阶梯数为n，则外壳模具数量为n-1；）。
支撑模具固定在底座模具上，并支撑顶盖模具。
顶盖模具四周有一圈向下的台阶，能卡在支撑模具上进行固定，顶盖模具中间设置有一个加料孔，用于注入含有细胞的基质材料，加料孔四周设置有多个倾斜的安装孔，用来固定多个二级通道模具。
二级通道模具的数目与顶盖模具上对应的安装孔的数目相同。
外壳模具的外围尺寸和底座模具对应的阶梯的尺寸相同，（可调节底座模具阶梯的尺寸和外壳模具的尺寸调节每一层细胞基质层的厚度；）。
下一级外模具的内腔和上一级外模具的内腔平滑过渡，且外模具的内腔具有和预设组织器官相同的轮廓。
进一步地，二级通道模具包括底座，中部和上部通道柱；底座是一个扁平的圆柱体，用于将二级通道模具固定（限位）在顶盖模具上；中部与顶盖模具上的安装孔契合；上部通道柱的尺寸小于中部，用于在通道柱上交联好的细胞水凝胶层在顶盖模具的安装孔中进出留空间；并在上部通道柱上提前进行细胞基质材料的交联，进行血管化，胆管化培养，再进行模具组装，形成细胞基质块。
进一步地，一级通道模具在底座模具上的位置是可以根据需求来进行变化的，根据所需的树状分支通道的形状和已确定好的一级通道模具的位置和长度，确定需要二级通道模具的数量以及计算各个二级通道模具应固定的位置和二级通道模具的长度，进而确定各个二级通道模具和顶盖模具安装孔的位置和角度。
进一步地，由一级通道模具和二级通道模具所构成的树状分支通道可以为多组。
例如在底座模具上设计两个一级通道模具，并设计相应的二级通道模具的位置，长度和粗细，进一步调节其他部分模具，就得到了内部双树状分支通道，外部多层细胞基质层的复杂器官前体。
进一步地，底座模具，支撑模具，顶盖模具，一级通道模具，二级通道模具和外壳模具的材料均采用硬质无生物毒性的合成高分子材料或者金属材料；所述合成高分子材料为合成纤维、光敏树枝、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚氨酯中的任意一种。
进一步地，一级通道模具的尺寸大于二级通道模具的尺寸，一级通道模具的直径在1mm～3cm；二级通道模具的直径在0.1mm～1cm；支撑模具的直径根据通道模具直径的变化和实验的需要进行调整；顶盖模具的加料口的位置和大小可通过避开已定的二级通道模具安装孔的位置，根据需要进行调节；底座模具的台阶从中间向两边逐级升高，台阶的级数范围为1～20；底座模具外形及各级台阶截面为圆型、椭圆型中任意一种。
利用人工器官制造模具的人工器官制造方法，包括以下步骤。
步骤1、使用3D打印技术，将无细胞毒性的材料打印制成专用组合模具的各个组成部分；
步骤2、制备质量百分浓度为1％～30％的水凝胶溶液作为基质溶液，提取或购买动物或人细胞制成细胞悬浮液，细胞悬浮液密度为1×103～5×107个/ml，将基质溶液与细胞悬浮液按体积比1～9：9～1混合制成含细胞的基质溶液，通过改变选择的细胞类型和基质溶液类型得到多种含有一种（或多种不同）细胞的基质溶液。
步骤3、在所有的通道模具上涂覆一层含细胞（如内皮细胞，胆管上皮细胞，脂肪干细胞，血旺细胞等）的基质溶液，采用物理、化学交联或聚合方法进行交联得到一层管状的细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。
步骤4、将专用组合模具的各个组成部分进行组装：将支撑模具安装到底座模具的内侧阶梯上，再将顶盖模具安装到支撑模具上，将（上一步骤）中已经进行交联或聚合处理的二级通道模具分别固定在顶盖模具各自的安装孔上，将一种含有细胞（如肝细胞）的基质溶液通过顶盖模具的加料口加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。使用物理、化学交联或聚合等方法制成中心细胞基质层。
步骤5、拔除所有的二级通道模具，去掉顶盖模具和支撑模具，将最内侧的外壳模具安装到底座模具相应的阶梯上，向中心细胞水凝胶块和外壳模具之间的空腔内加入第二种含有细胞的基质溶液，并使用物理、化学等方法进行交联，形成第二层细胞基质层。
步骤6、去除内侧外壳模具，安装第二层外壳模具（外侧外壳模具）到底座模具相应的阶梯上，重复上一步骤的加料步骤制备出第三层细胞基质层，得到需要的细胞水凝胶层数。
步骤7、将外壳模具和底座模具去除，取出已形成的内部带有树状分支通道的多层次细胞基质块，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得（相对完整的）含树状分支通道的复杂器官前体。
进一步地，水凝胶溶液采用胶原蛋白、琼脂糖、纤维蛋白原、海藻酸钠、丝素蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、粘连蛋白、凝血酶、聚乙二醇、普朗尼克中的任意一种或任意几种（以多种材料相互混合得到的水凝胶溶液效果较佳）；可形成多层含有不同细胞的细胞基质层，每层细胞基质层采用的细胞和水凝胶都可不相同，完成多种细胞多种基质材料的组装。
更进一步地，多套树状分支通道中，应保证各个通道模具之间互不连接，互不干扰，保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。
更进一步地，在细胞基质溶液中加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子中的一种或几种，以及肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖中的一种或几种，以诱导通道表层细胞分化形成血管、胆管、气管等管状组织，细胞生长因子及抗凝血因子体积占总溶液的体积百分比为0.001％～0.1％。
与现有技术相比本发明有益效果。
本发明采用的可拆分的树状通道组合模具可制备内部带有模仿血管，胆管等结构的树状通道的复杂人工器官。多级外壳模具的设计可以通过分层灌注得到不同的细胞基质层。内部一级通道模具和二级通道模具可通过涂敷细胞水凝胶并进行交联得到一圈细胞基质层，通过细胞-水凝胶的诱导形成血管、胆管、气管等结构，再将诱导好的含细胞基质层的通道模具进行组装，可以更高效地得到复杂人工器官。同时，树状通道模具拆分为一级通道模具和二级通道模具的设计可以避免破坏水凝胶块的结构。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。本发明保护范围不仅局限于以下内容的表述。
图1是专用组合模具(除了外壳模具)组装在一起的整体剖面图。
图2是专用组合模具的整体剖面拆分图。
图3a是底座模具的结构示意图（以一组树状分支通道为例）。
图3b是顶盖模具的结构示意图（以一组树状分支通道，四个二级通道模具为例）。
图3c是一个二级通道模具的结构示意图。
图3d是支撑模具或外壳模具的结构示意图。
图4a和图4b是顶盖模具和四个二级通道模具组装在一起的结构示意图。
图5是带树状分支通道的复杂器官成型后的结构剖面图（以一组树状分支通道，三种不同细胞基质层的器官前体为例）。
图6是专用组合模具整体示意图。
图中，101-底座模具；102-支撑模具；103-顶盖模具；201-一级通道模具；202-二级通道模具；301-内侧外壳模具；302-外侧外壳模具；401-底座；402-中部；403-上部通道柱；501-中空管道；502-中心细胞基质层；503-第二种细胞基质层；504-第三种细胞基质层。
具体实施方式
如图1-6所示，本发明提供的含树状分支通道的人工器官制造模具和方法，其具体工艺步骤如下。
（1）使用3D打印技术，将无细胞毒性的材料打印制成专用组合模具的各个组成部分。
（2）制备质量百分浓度为1％～30％的水凝胶溶液作为基质溶液，提取或购买动物或人细胞制成细胞悬浮液，细胞悬浮液密度为1×103～5×107个/ml，将基质溶液与细胞悬浮液按体积比1～9：9～1混合制成含细胞的基质溶液，可通过改变选择的细胞类型和基质溶液类型得到多种含有一种（或多种不同）细胞的基质溶液。
（3）在所有的通道模具上涂覆一层含细胞（如内皮细胞，胆管上皮细胞，脂肪干细胞，血旺细胞等）的基质溶液，采用使用物理、化学交联或聚合等方法进行交联得到一层管状的细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。
（4）将专用组合模具的各个组成部分进行组装：将支撑模具安装到底座模具的内侧阶梯上，再将顶盖模具安装到支撑模具上，将（3）中已经进行交联或聚合处理的二级通道模具分别固定在顶盖模具各自的安装孔上，将一种含有细胞（如肝细胞）的基质溶液通过顶盖模具的加料口加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔。使用物理、化学交联或聚合等方法制成中心细胞基质层。
（5）拔除所有的二级通道模具，去掉顶盖模具和支撑模具，将最内侧的外壳模具安装到底座模具相应的阶梯上，向中心细胞水凝胶块和外壳模具之间的空腔内加入第二种含有细胞的基质溶液，并使用物理、化学等方法进行交联，形成第二层细胞基质层。
（6）去除内侧外壳模具，安装第二层外壳模具（外侧外壳模具）到底座模具相应的阶梯上，重复步骤（5）的加料步骤制备出第三层细胞基质层，依次类推，采用此种方法得到需要的细胞水凝胶层数。
（7）将外壳模具和底座模具去除，取出已形成的内部带有树状分支通道的多层次细胞基质块，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的含树状分支通道的复杂器官前体。
本发明的优选方案是配制的水凝胶溶液的天然高分子材料通常采用明胶、纤维蛋白原、海藻酸钠、琼脂糖、壳聚糖、胶原蛋白、透明质酸、丝素蛋白、粘连蛋白、聚乙二醇、普朗尼克等材料中的一种或者几种，以多种材料相互混合得到的水凝胶溶液效果较佳。在细胞基质溶液中可加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子等细胞生长因子中的一种或几种，以及肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖等抗凝血因子中的一种或几种，细胞生长因子及抗凝血因子体积占总溶液的体积百分比为0.001％～0.1％。
底座模具，支撑模具，顶盖模具，通道模具和外壳模具的材料采用无生物毒性的合成高分子材料（如合成纤维、聚氯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、光敏树脂或聚氨酯等）或者金属材料。一级通道模具的尺寸要大于多个二级通道模具的尺寸，一级通道模具的直径范围在1mm～3cm；二级通道模具的直径范围在0.1mm～1cm；支撑模具的直径根据通道模具直径的变化和实验的需要进行调整；顶盖模具的加料口的位置和大小可以通过避开已定的二级通道模具安装孔的位置，根据需要进行调节；设计底座模具的台阶从中间向两边逐级升高，台阶的级数范围为1～20；底座模具外形及各级台阶截面为圆型、椭圆型等，可根据需要进行设计。
实施例1：含树状分支血管网络的人工肝脏制造。
（1）使用3D打印技术，将无细胞毒性的光敏树脂打印成专用组合模具的各个组成部分，底座模具打印3层台阶，外壳模具打印两层。
（2）将4%明胶、3%的海藻酸钠共混溶于PBS溶液中作为基质溶液，分离病人脂肪干细胞制成细胞悬浮液，细胞密度为1×106个/ml，将基质溶液与细胞悬浮液分别按体积比1：1混合制成含细胞基质溶液。将含细胞基质溶液中分别加入内皮细胞生长因子（EGF 0.1ng/ml）、肝细胞生长因子（HGF 0.2ng/ml）、胆管上皮细胞生长因子（GGF 0.1ng/ml），制成含细胞和生长因子的混合物。
（3）在所有一级通道和二级通道模具上涂覆一层含脂肪干细胞和内皮细胞生长因子的明胶和海藻酸钠混合基质溶液，采用2%的氯化钙溶液进行交联得到一层管状的细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。
（4）将专用组合模具的各个组成部分进行组装：将支撑模具安装到底座模具的内侧阶梯上，再将顶盖模具安装到支撑模具上，将（3）中已经进行交联处理的二级通道模具分别固定在顶盖模具各自的安装孔上，通过顶盖模具的加料口将含脂肪干细胞和内皮细胞生长因子的基质溶液加到模具内腔中使其充分填满整个内腔，使用2%的氯化钙溶液进行交联制成中心细胞基质层。
（5）拔除所有的二级通道模具，去掉顶盖模具和支撑模具，将最内侧的外壳模具安装到底座模具相应的阶梯上，向中心细胞水凝胶块和外壳模具之间的空腔内加入肝细胞，肝星状细胞和明胶，海藻酸钠的基质溶液，基质溶液中加入脂肪干细胞和肝细胞生长因子（HGF 0.2ng/ml），并使用2%的氯化钙溶液交联，形成第二层细胞基质层。
（6）去除内侧外壳模具，安装第二层外壳模具到底座模具相应的阶梯上，向第二层细胞基质层和外壳模具之间的空腔内加入含脂肪干细胞和胆管上皮细胞生长因子（GGF0.1ng/ml）的明胶，海藻酸钠的基质溶液，并使用2%的氯化钙溶液交联，形成第三层细胞基质层。
（7）将外壳模具和底座模具去除，取出已形成的内部带有树状分支通道的多层次细胞基质块，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的含树状分支血管通道的肝脏前体。
实施例2：含双树状分支血管通道，胆管通道的生物型人工肝脏制造。
（1）使用3D打印技术，将无细胞毒性的聚四氟乙烯打印成专用模具的各个组成部分，设计两套树状分支通道模具，底座上的一级通道模具打印两根，分别对应各自的二级模具，底座模具打印3层台阶，外壳模具打印两层。
（2）配制1%纤维蛋白原水凝胶溶液作为基质溶液，分离病人血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝星状细胞、肝血窦内皮细胞、肝干细胞和肝细胞制成细胞悬浮液，将基质溶液与细胞悬浮液混合制成含细胞的基质溶液。
（3）在一套一级通道和二级通道模具上涂覆一层含血管内皮细胞的纤维蛋白原水凝胶溶液，细胞密度为1×107个/ml，采用凝血酶溶液（20 IU/ml）交联3min得到一层管状内皮细胞基质层，另一套一级通道和二级通道模具上涂敷一层含胆管上皮细胞的纤维蛋白原水凝胶溶液，细胞密度为1×107个/ml，采用凝血酶溶液（20 IU/ml）交联3min得到一层管状胆管上皮细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。
（4）将专用组合模具的各个组成部分进行组装：将支撑模具安装到底座模具的内侧阶梯上，再将顶盖模具安装到支撑模具上，将（3）中已经进行交联处理的二级通道模具分别固定在顶盖模具各自的安装孔上，通过顶盖模具的加料口将含肝细胞和肝干细胞的基质溶液加到模具内腔中使其充分填满整个内腔，细胞密度为1×107个/ml，使用凝血酶溶液（20 IU/ml）交联2min制成中心细胞基质层。
（5）拔除所有的二级通道模具，去掉顶盖模具和支撑模具，将最内侧的外壳模具安装到底座模具相应的阶梯上，向中心细胞水凝胶块和外壳模具之间的空腔内加入肝细胞，肝星状细胞和纤维蛋白原水凝胶的基质溶液，细胞密度为1×107个/ml，使用凝血酶溶液（20 IU/ml）交联2min，形成第二层细胞基质层。
（6）去除内侧外壳模具，安装第二层外壳模具到底座模具相应的阶梯上，向第二层细胞基质层和外壳模具之间的空腔内加入肝细胞，肝血窦内皮细胞和纤维蛋白原水凝胶的基质溶液，细胞密度为1×107个/ml，并使用凝血酶溶液（20 IU/ml）交联2min，形成第三层细胞基质层。
（7）将外壳模具和底座模具去除，取出已形成的内部带有树状分支通道的多层次细胞基质块，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得相对完整的含双树状分支血管通道和胆管通道的肝脏前体。
实施例3：含三树状分支血管通道，神经通道和肾小管通道的人工肾脏。
（1）使用3D打印技术，将无细胞毒性的硅橡胶打印成专用模具的各个组成部分，设计三套树状分支通道模具，底座上的一级通道模具打印三根，分别对应各自的二级模具，底座模具打印2层台阶，外壳模具打印一层。
（2）配制10%明胶溶液作为基质溶液，购买内皮细胞、血旺细胞、肾细胞和脂肪干细胞制成细胞悬浮液，将基质溶液与细胞悬浮液混合制成含细胞的基质溶液。
（3）在一套一级通道和二级通道模具上涂覆一层含内皮细胞生长因子和内皮细胞的明胶溶液，细胞密度为1×105个/ml，使用物理交联方法在37℃下放置10分钟，使胶原与细胞混合物结构稳定，得到一层管状内皮细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。另两套一级通道和二级通道模具不做处理。
（4）将专用组合模具的各个组成部分进行组装：将支撑模具安装到底座模具的内侧阶梯上，再将顶盖模具安装到支撑模具上，将（3）中已经进行交联处理的二级通道模具和未进行处理的两套二级通道模具分别固定在顶盖模具各自的安装孔上，通过顶盖模具的加料口将含肾细胞和脂肪干细胞的基质溶液加到模具内腔中使其充分填满整个内腔，细胞密度为1×105个/ml，使用物理交联方法在37℃下放置10分钟，使胶原与细胞混合物结构稳定，制成中心细胞基质层。
（5）拔除所有的二级通道模具，去掉顶盖模具和支撑模具，将最外壳模具安装到底座模具相应的阶梯上，向中心细胞水凝胶块和外壳模具之间的空腔内加入肾细胞的基质溶液，细胞密度为1×105个/ml，使用物理交联方法在37℃下放置10分钟，使胶原与细胞混合物结构稳定，形成第二层细胞基质层。
（6）将外壳模具和底座模具去除，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，取出已形成的内部带有三树状分支通道的多层次细胞基质块，将细胞基质块放到培养皿中，向未提前处理的两组通道中的一组通道内灌注血旺细胞和明胶溶液混合的细胞基质，细胞密度为1×105个/ml，使用物理交联方法在37℃下放置10分钟，使胶原与细胞混合物结构稳定，以此培养神经通道，剩余一组通道起到肾小管的作用，获得含血管通道，神经通道和肾小管通道的三树状分支的肾脏前体。
实施例4：含血管、神经和尿道的三树状通道的人工膀胱制造。
（1）使用3D打印技术，将无细胞毒性的聚四氟乙烯打印成专用模具的各个组成部分，设计三套树状分支通道模具，底座上的一级通道模具打印三根，分别对应各自的二级模具，底座模具打印2层台阶，外壳模具打印1层。
（2）配制5%纤维蛋白原和4%海藻酸钠的混合溶液作为基质溶液，10%明胶溶液作为基质溶液，购买内皮细胞、血旺细胞、尿道上皮细胞和膀胱细胞制成细胞悬浮液，将基质溶液与细胞悬浮液混合制成含细胞的基质溶液。配制10IU/ml凝血酶溶液和2%氯化钙溶液。
（3）在一套一级通道和二级通道模具上涂覆一层含内皮细胞生长因子和内皮细胞的明胶溶液，细胞密度为1×106个/ml，使用物理交联方法在37℃下放置10分钟，使胶原与细胞混合物结构稳定，得到一层管状内皮细胞基质层。在另一套一级通道和二级通道模具上涂覆一层含尿道上皮细胞的明胶溶液，细胞密度为1×106个/ml，使用物理交联方法在37℃下放置10分钟，使胶原与细胞混合物结构稳定，得到一层管状尿道上皮细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。最后一套一级通道和二级通道模具不做处理。
（4）将专用组合模具的各个组成部分进行组装：将支撑模具安装到底座模具的内侧阶梯上，再将顶盖模具安装到支撑模具上，将（3）中已经进行交联处理的两套二级通道模具和未进行处理的一套二级通道模具分别固定在顶盖模具各自的安装孔上，通过顶盖模具的加料口将含膀胱细胞的纤维蛋白原和海藻酸钠的细胞基质溶液加到模具内腔中使其充分填满整个内腔，细胞密度为1×106个/ml，使用凝血酶和氯化钙溶液进行交联制成中心细胞基质层。
（5）拔除所有的二级通道模具，去掉顶盖模具和支撑模具，将最外壳模具安装到底座模具相应的阶梯上，向中心细胞水凝胶块和外壳模具之间的空腔内加入含膀胱细胞的明胶基质溶液，细胞密度为1×106个/ml，使用物理交联方法在37℃下放置10分钟，使胶原与细胞混合物结构稳定，形成第二层细胞基质层。
（6）将外壳模具和底座模具去除，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，取出已形成的内部带有三树状分支通道的多层次细胞基质块，将细胞基质块放到培养皿中，向未提前处理的那组通道内灌注血旺细胞和明胶溶液混合的细胞基质，细胞密度为1×106个/ml，使用物理交联方法在37℃下放置10分钟，使胶原与细胞混合物结构稳定，以此培养神经通道，获得含血管通道，神经通道和尿道的三树状分支的膀胱前体。
实施例5：含血管、神经的双树状分支通道的人工大脑制造。
（1）使用3D打印技术，将无细胞毒性的聚碳酸酯打印成专用模具的各个组成部分，设计两套树状分支通道模具，底座上的一级通道模具打印两根，分别对应各自的二级模具，底座模具打印2层台阶，外壳模具打印1层。
（2）将1%明胶和1%海藻酸钠共混溶于PBS溶液中作为基质溶液，购买脂肪干细胞、神经细胞和大脑胶质细胞制成细胞悬浮液，将基质溶液与细胞悬浮液混合制成含细胞的基质溶液。
（3）在一套一级通道和二级通道模具上涂覆一层含内皮细胞生长因子和脂肪干细胞的细胞基质溶液，细胞密度为1×107个/ml，采用2%的氯化钙溶液进行交联得到一层管状细胞基质层，另一套一级通道和二级通道模具上涂敷一层含脂肪干细胞和神经细胞生长因子的细胞基质溶液，细胞密度为1×107个/ml，采用2%的氯化钙溶液进行交联得到一层管状胆管上皮细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度，可以在组装前先血管化和神经化培养一段时间。
（4）将专用组合模具的各个组成部分进行组装：将支撑模具安装到底座模具的内侧阶梯上，再将顶盖模具安装到支撑模具上，将（3）中已经进行交联处理的二级通道模具分别固定在顶盖模具各自的安装孔上，通过顶盖模具的加料口将含大脑胶质细胞的基质溶液加到模具内腔中使其充分填满整个内腔，细胞密度为1×107个/ml，使用2%的氯化钙溶液交联制成中心细胞基质层。
（5）拔除所有的二级通道模具，去掉顶盖模具和支撑模具，将外壳模具安装到底座模具相应的阶梯上，向中心细胞水凝胶块和外壳模具之间的空腔内加入含神经细胞的基质溶液，细胞密度为1×107个/ml，使用2%的氯化钙溶液交联，形成第二层细胞基质层。
（6）将外壳模具和底座模具去除，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，取出已形成的内部带有双树状分支通道的多层次细胞基质块，将细胞基质块放到培养皿中，向神经通道内灌注脂肪干细胞和神经细胞生长因子混合的细胞基质，细胞密度为1×107个/ml，使用2%的氯化钙溶液交联，以此培养得到神经通道，获得含血管通道和神经通道的双树状分支的大脑前体。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人工器官制造模具，包括设置有一级通道模具（201）的底座模具（101）、支撑模具（102）、顶盖模具（103）、多个二级通道模具（202）和至少一级的外壳模具；其特征在于，一级通道模具（201）垂直或倾斜地固定在底座模具（101）上；
底座模具（101）底面为平面、凹面或者凸面，采用多层台阶形状，最内侧的台阶固定的是支撑模具，其余外侧台阶固定的是外壳模具，支撑模具（102）固定在底座模具上，并支撑顶盖模具；
顶盖模具（103）四周有一圈向下的台阶，能卡在支撑模具上进行固定，顶盖模具中间设置有一个加料孔，用于注入含有细胞的基质材料，加料孔四周设置有多个倾斜的安装孔，用来固定多个二级通道模具；
二级通道模具（202）的数目与顶盖模具上对应的安装孔的数目相同；
外壳模具的外围尺寸和底座模具对应的阶梯的尺寸相同，下一级外壳模具的内腔和上一级外壳模具的内腔平滑过渡，且外壳模具的内腔具有和预设组织器官相同的轮廓。
2.根据权利要求1所述的一种人工器官制造模具，其特征在于：二级通道模具（202）包括底座（401），中部（402）和上部通道柱（403）；底座（401）是一个扁平的圆柱体，用于将二级通道模具固定或限位在顶盖模具上；中部（402）与顶盖模具上的安装孔契合；上部通道柱（403）的尺寸小于中部（402），用于在通道柱上交联好的细胞水凝胶层在顶盖模具的安装孔中进出留空间；并在上部通道柱上提前进行细胞基质材料的交联，进行血管化，胆管化培养，再进行模具组装，形成细胞基质块。
3.根据权利要求1所述的一种人工器官制造模具，其特征在于：一级通道模具（201）在底座模具上的位置是根据需求来进行变化的，根据所需的树状分支通道的形状和已确定好的一级通道模具的位置和长度，确定需要二级通道模具的数量以及计算各个二级通道模具应固定的位置和二级通道模具的长度，进而确定各个二级通道模具和顶盖模具安装孔的位置和角度。
4.根据权利要求1所述的一种人工器官制造模具，其特征在于：由一级通道模具和二级通道模具所构成的树状分支通道为多组。
5.根据权利要求1所述的一种人工器官制造模具，其特征在于：底座模具、支撑模具、顶盖模具、一级通道模具、二级通道模具及外壳模具的材料均采用硬质无生物毒性的合成高分子材料或者金属材料；所述合成高分子材料为合成纤维、光敏树脂、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚氨酯中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的一种人工器官制造模具，其特征在于：一级通道模具（201）的尺寸大于二级通道模具的尺寸，一级通道模具的直径在1mm～3cm；二级通道模具的直径在0.1mm～1cm；支撑模具（102）的直径根据通道模具直径的变化和实验的需要进行调整；顶盖模具（103）的加料口的位置和大小可通过避开已定的二级通道模具安装孔的位置，根据需要进行调节；底座模具（101）的台阶从中间向两边逐级升高，台阶的级数范围为1～20；底座模具外形及各级台阶截面为圆型、椭圆型中任意一种。
7.根据权利要求1所述的人工器官制造模具的人工器官制造方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1、使用3D打印技术，将无细胞毒性的材料打印制成专用组合模具的各个组成部分；
步骤2、制备质量百分浓度为1％～30％的水凝胶溶液作为基质溶液，提取或购买动物或人细胞制成细胞悬浮液，细胞悬浮液密度为1×103～5×107个/mL，将基质溶液与细胞悬浮液按体积比1～9：9～1混合制成含细胞的基质溶液，通过改变选择的细胞类型和基质溶液类型得到一种或多种细胞的基质溶液；
步骤3、在所有的通道模具上涂覆一层含细胞的基质溶液，采用物理、化学交联或聚合方法进行交联得到一层管状的细胞基质层，要保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度；
步骤4、将专用组合模具的各个组成部分进行组装：将支撑模具安装到底座模具的内侧阶梯上，再将顶盖模具安装到支撑模具上，将上一步骤中已经进行交联或聚合处理的二级通道模具分别固定在顶盖模具各自的安装孔上，将一种含有细胞的基质溶液通过顶盖模具的加料口加到模具内腔中使基质溶液充分填满整个内腔；使用物理、化学交联或聚合等方法制成中心细胞基质层；
步骤5、拔除所有的二级通道模具，去掉顶盖模具和支撑模具，将最内侧的外壳模具安装到底座模具相应的阶梯上，向中心细胞水凝胶块和外壳模具之间的空腔内加入第二种含有细胞的基质溶液，并使用物理和/或化学方法进行交联，形成第二层细胞基质层；
步骤6、去除内侧外壳模具，安装第二层外壳模具到底座模具相应的阶梯上，重复上一步骤的加料步骤制备出第三层细胞基质层，得到需要的细胞水凝胶层数；
步骤7、将外壳模具和底座模具去除，取出已形成的内部带有树状分支通道的多层次细胞基质块，沿着模具的安装方向逆向拆除可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，获得含树状分支通道的复杂器官前体。
8.根据权利要求1所述的一种人工器官制造模具，其特征在于：水凝胶溶液采用胶原蛋白、琼脂糖、纤维蛋白原、海藻酸钠、丝素蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、粘连蛋白、凝血酶、聚乙二醇、普朗尼克中的任意一种或任意几种；可形成多层含有不同细胞的细胞基质层，每层细胞基质层采用的细胞和水凝胶都不相同，完成多种细胞多种基质材料的组装。
9.根据权利要求8所述的一种人工器官制造模具，其特征在于：各个通道模具之间互不连接，互不干扰，保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。
10.根据权利要求9所述的一种人工器官制造模具，其特征在于：在细胞基质溶液中加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子中的一种或几种，以及肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖中的一种或几种，以诱导通道表层细胞分化形成管状组织，该管状组织包括血管、胆管、气管；细胞生长因子及抗凝血因子体积占总溶液的体积百分比为0.001％～0.1％。
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