KR20130007610A

KR20130007610A - 다층 혈관

Info

Publication number: KR20130007610A
Application number: KR1020127026891A
Authority: KR
Inventors: 치라그 카티왈라; 케이트 머피; 벤자민 세퍼드
Original assignee: 오가노보, 인크.
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2013-01-18
Also published as: WO2011116125A3; GB2489081A; KR20150038665A; JP2013538064A; CN105749349A; RU2522966C2; JP2016052527A; JP5950899B2; CA2793205C; US20130345794A1; GB2478801B; EP2547288A4; GB2489081B; WO2011116125A2; CN102883680A; CN102883680B; AU2011227282A1; GB201203622D0; US20230320837A1; CA2793205A1

Abstract

분화된 성인 섬유아세포의 하나 이상의 층 및 분화된 성인 평활근 세포의 하나 이상의 층을 포함하는 조작된 다층 혈관(engineered multilayered vascular tube)으로서, 임의의 층은 분화된 성인 내피 세포를 추가로 포함하고, 상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 1:99 내지 약 45:55인 점; (b) 관은 순응성(compliant)을 갖는다는 점; (c) 관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (d) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (e) 관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며, 단, 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 조작된 다층 혈관이 본원에 기재되어 있다. 또한, 상기 관의 형성 방법, 및 상기 관을 치료를 필요로 하는 환자에게 제공하는 단계를 포함하는 환자를 치료하는 방법을 포함한, 상기 관에 대한 용도가 본원에 기재되어 있다.

Description

다층 혈관{MULTILAYERED VASCULAR TUBES}

관련 출원에 대한 교차 참조

본원은 2010년 3월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/314,238호; 및 2010년 5월 26일에 출원된 영국 특허 출원 제1008781.5호의 이익을 주장한 것이며, 이들 출원의 각자 개시내용은 전문이 본원에 참조 인용되어 있다.

발명의 분야

본 발명은 다층 혈관에 관한 것이다.

미국에서는 질환이 있는 동맥에 대해 대체 혈관 또는 대체 복부 기관, 특히 소직경의 혈관 이식물에 대한 필요성이 있다. 직경이 6 밀리미터 미만인 작은 동맥은 혈전증의 발생율이 높아 인공 재료로 대체될 수 없다(Connolly et al. (1988); Greisler et al. (1988))

발명의 개요

조작된 다층 혈관(engineered multilayered vascular tube), 상기 관의 형성 방법, 및 상기 관에 대한 치료, 진단 및 연구 용도가 본원에 기재되어 있다. 예비형성된 스카폴드는 본원에 기재된 조작된 다층 혈관의 생성에 이용되지 않기 때문에, 본원에 기재된 조작된 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없다. 이러한 혁신은 다른 무엇보다도, 예비형성된 스카폴드 물질이 없는 생육성의 조작된 다층 혈관을 제공하고, 이에 따라서 조작되지 않은 다층 혈관에 대한 치료학적으로 허용가능한 대안이 된다.

한 측면에서, 분화된 성인 섬유아세포의 하나 이상의 층 및 분화된 성인 평활근 세포의 하나 이상의 층을 포함하는 조작된 다층 혈관으로서, 임의의 층은 분화된 성인 내피 세포를 추가로 포함하고, 상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 1:99 내지 약 45:55인 점; (b) 조작된 다층 혈관이 순응성(compliant)을 갖는다는 점; (c) 조작된 다층 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (d) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (e) 조작된 다층 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며, 단, 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 조작된 다층 혈관이 본원에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 섬유아세포, 평활근 세포, 및 내피 세포는 자가성(autologous)을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 파열 강도는 생리학적 혈압을 견디기에 충분하다. 다른 실시양태에서, 관의 루멘은 제거가능한 루멘-형성 충전제체로부터 형성된다. 다른 실시양태에서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 5:95 내지 약 25:75이다. 다른 실시양태에서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 15:85이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 순응성을 가진다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 내경은 약 6 mm 이하이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 내경은 약 0.5 mm 이하이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 두께는 관의 영역에 걸쳐 실질적으로 균일하다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 두께는 관의 길이에 걸쳐 실질적으로 균일하다. 다른 실시양태에서, 관은 미분화된 성인 섬유아세포가 실질적으로 없다. 다른 실시양태에서, 관은 미분화된 성인 평활근 세포가 실질적으로 없다. 다른 실시양태에서, 관은 미분화된 성인 내피 세포가 실질적으로 없다. 다른 실시양태에서, 관은 분지된 구조를 가진다. 다른 실시양태에서, 관은 자기 입자를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 관은 우회 이식술(bypass grafting)에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 관은 동정맥류 통로(arteriovenous access)에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 관은 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 관은 심혈관 장치 시험에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 심혈관 장치는 스텐트이다. 일부 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 비지배성(non-innervated)을 가진다. 일부 실시양태에서, 상기 분화된 성인 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포이다.

또 다른 측면은, 조작된 다층 혈관의 형성 방법으로서, 하나 이상의 충전제 기질체, 세포들이 상호 응집되어 있는 평활근 세포의 하나 이상의 다세포체, 세포들이 상호 응집되어 있는 내피 세포의 하나 이상의 다세포체, 및 세포들이 상호 응집되어 있는 섬유아세포 세포의 하나 이상의 다세포체를 위치시켜서 원하는 혈관 구조를 형성시키는 단계로서, 여기서 하나 이상의 충전제 기질체는 관의 루멘을 형성하고, 복수개의 충전제 기질체는 관을 둘러싸고 있는 것인 단계; 및 조작된 다층 혈관의 다세포체를 응집시키는 단계를 포함하고, 단, 어떠한 때에도 예비형성된 스카폴드가 사용되지 않아야 하는 것인 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 조작된 다층 혈관 내에서의 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 1:99 내지 약 45:55이다. 또 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관 내에서의 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 5:95 내지 약 25:75이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관 내에서의 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 15:85이다. 다른 실시양태에서, 관의 루멘은 약 6 mm 이하이다. 다른 실시양태에서, 관의 루멘은 약 0.5 mm 이하이다. 다른 실시양태에서, 평활근 세포, 내피 세포, 및/또는 섬유아세포는 자가성을 가진다. 다른 실시양태에서, 평활근 세포, 내피 세포, 및/또는 섬유아세포는 인간 성인 분화된 세포이다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 성숙 체임버에서 조작된 다층 혈관을 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 중 다세포체의 하나 이상은 신장형(elongate)이다. 일부 실시양태에서, 세포 중 다세포체의 하나 이상은 실질적으로 구형이다.

또 다른 측면은, 분화된 성인 섬유아세포의 하나 이상의 층 및 분화된 성인 평활근 세포의 하나 이상의 층을 포함하는 조작된 다층 혈관으로서, 임의의 층은 분화된 성인 내피 세포를 추가로 포함하고, 상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 5:95 내지 약 25:75인 점; (b) 조작된 다층 혈관이 순응성을 갖는다는 점; (c) 조작된 다층 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (d) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (e) 조작된 다층 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며, 단, 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 조작된 다층 혈관에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 파열 강도는 생리학적 혈압을 견디기에 충분하다. 또 다른 실시양태에서, 관의 루멘은 루멘-형성 충전제체로부터 형성되었다. 다른 실시양태에서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 15:85이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 두께는 관의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 균일하다. 다른 실시양태에서, 관은 자기 입자를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 관은 분지된 구조를 가진다. 다른 실시양태에서, 관은 우회 이식술에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 관은 동정맥류 통로에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 관은 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 관은 심혈관 장치 시험에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 심혈관 장치는 스텐트이다. 일부 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 비지배성을 가진다. 일부 실시양태에서, 상기 분화된 성인 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포이다.

또 다른 측면은, 분화된 성인 섬유아세포의 외층 및 분화된 성인 평활근 세포 및 분화된 성인 내피 세포의 하나 이상의 내층을 포함하는 조작된 다층 혈관으로서, 상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 1:99 내지 약 45:55인 점; (b) 조작된 다층 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (c) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (d) 조작된 다층 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며, 단, 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 다층 혈관에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 5:95 내지 약 25:75이다. 또 다른 실시양태에서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 15:85이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 내경은 약 6 mm 이하이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 내경은 약 0.5 mm 이하이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 순응성을 가진다. 다른 실시양태에서, 관은 분지된 구조를 가진다. 다른 실시양태에서, 관의 길이는 약 1 cm 내지 약 30 cm이다. 다른 실시양태에서, 관의 두께는 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다. 다른 실시양태에서, 관의 두께는 관의 길이를 따라 실질적으로 균일하다. 다른 실시양태에서, 관은 외부 지지체 구조를 가진다. 다른 실시양태에서, 관은 미분화된 성인 섬유아세포가 실질적으로 없다. 다른 실시양태에서, 관은 미분화된 성인 평활근 세포가 실질적으로 없다. 다른 실시양태에서, 관은 미분화된 성인 내피 세포가 실질적으로 없다. 다른 실시양태에서, 관은 자성 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 비지배성을 가진다. 일부 실시양태에서, 상기 분화된 성인 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포이다.

또 다른 측면은, 분화된 성인 섬유아세포의 하나 이상의 층 및 분화된 성인 평활근 세포의 하나 이상의 층을 포함하는 조작된 다층 혈관으로서, 임의의 층은 분화된 성인 내피 세포를 추가로 포함하고, 상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 1:99 내지 약 45:55인 점; (b) 조작된 다층 혈관이 순응성을 갖는다는 점; (c) 조작된 다층 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (d) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (e) 조작된 다층 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며, 단, 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 조작된 다층 혈관에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 섬유아세포, 평활근 세포, 및 내피 세포는 자가성을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 15:85이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 파열 강도는 생리학적 혈압을 견디기에 충분하다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 루멘은 루멘-형성 충전제체로부터 형성되었다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 순응성을 가진다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 내경은 약 6 mm 이하이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 내경은 약 0.5 mm 이하이다. 다른 실시양태에서, 관의 길이는 약 1 cm 내지 약 30 cm이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 두께는 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 두께는 관의 길이를 따라 실질적으로 균일하다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관 분지된 구조를 가진다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관 자기 입자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 비지배성을 가진다. 일부 실시양태에서, 상기 분화된 성인 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포이다. 다른 실시양태에서, 환자는 관상 또는 말초성 우회술(coronary or peripheral bypass)을 필요로 한다. 다른 실시양태에서, 환자는 혈액투석을 필요로 한다. 다른 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 환자는 말기 신질환을 가진다. 다른 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 환자는 당뇨병을 가진다. 다른 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 환자는 동맥경화증을 가진다. 다른 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 환자는 선천성 심장 출생 기형(birth deffect)을 가진다.

또 다른 측면은, 분화된 성인 섬유아세포의 외층, 및 분화된 성인 평활근 세포 및 분화된 성인 내피 세포의 하나 이상의 내층을 포함하는 조작된 다층 혈관으로서, 상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 5:95 내지 약 25:75인 점; (b) 조작된 다층 혈관이 순응성을 갖는다는 점; (c) 조작된 다층 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (d) 관의 길이가 약 1 cm 내지 약 30 cm인 점; 및 (e) 조작된 다층 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며, 단, 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 조작된 다층 혈관에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 파열 강도는 생리학적 혈압을 견디기에 충분하다. 또 다른 실시양태에서, 관은 루멘-형성 충전제체로부터 형성되었다. 또 다른 실시양태에서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 15:85이다. 또 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 두께는 관의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 균일하다. 또 다른 실시양태에서, 관은 미분화된 성인 섬유아세포가 실질적으로 없다. 또 다른 실시양태에서, 관은 미분화된 성인 평활근 세포가 실질적으로 없다. 또 다른 실시양태에서, 관은 미분화된 성인 내피 세포가 실질적으로 없다. 또 다른 실시양태에서, 관은 자기 입자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 관은 분지된 구조를 가진다. 일부 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 비지배성을 가진다. 일부 실시양태에서, 상기 분화된 성인 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포이다. 또 다른 실시양태에서, 관은 우회 이식술에 사용하기 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 관은 동정맥류 통로에 사용하기 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 관은 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 관은 심혈관 장치 시험에 사용하기 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 심혈관 장치는 스텐트이다. 한 실시양태에서, 조작된 다층 혈관 내에서의 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 5:95 내지 약 25:75이다. 또 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관 내에서의 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 15:85이다. 또 다른 실시양태에서, 관의 루멘은 약 6 mm 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 평활근 세포, 내피 세포, 및/또는 섬유아세포는 인간 성인 분화된 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 성숙 체임버 내에서 조작된 다층 혈관을 배양하는 단계를 포함한다.

또 다른 측면은, 분화된 성인 섬유아세포의 외층, 및 분화된 성인 평활근 세포 및 분화된 성인 내피 세포의 하나 이상의 내층을 포함하는 조작된 다층 혈관으로서, 상기 관은 다음의 특성들: (a) 제거가능한 루멘-형성 충전제체를 갖는다는 점; (b) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 5:95 내지 약 25:75인 점; (c) 조작된 다층 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (d) 관의 길이가 약 1 cm 내지 약 30 cm인 점; 및 (e) 조작된 다층 혈관의 두께가 실질적으로 균일하다는 점; (f) 외부 지지체 구조를 갖는다는 점을 가지며, 단, 조작된 다층 혈관은 비지배성이고 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 조작된 다층 혈관에 관한 것이다

한 실시양태에서, 외부 지지체 구조가 제거된다. 또 다른 실시양태에서, 루멘-형성 충전제체가 제거된다. 또 다른 실시양태에서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 15:85이다. 또 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 순응성을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 관은 분지된 구조를 가진다.

또 다른 측면은, 분화된 성인 평활근 세포, 분화된 성인 내피 세포, 및 분화된 성인 섬유아세포를 포함하는 조작된 혈관으로서, 상기 세포들은 상호 응집되어 있고, 상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 1:99 내지 약 45:55인 점; (b) 조작된 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (c) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (d) 조작된 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며, 단, 조작된 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 조작된 혈관에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 분화된 성인 평활근 세포, 분화된 성인 내피 세포, 및 분화된 성인 섬유아세포는 조작된 혈관 내에 균일하게 분포되어 있다. 다른 실시양태에서, 분화된 성인 평활근 세포, 분화된 성인 내피 세포, 및 분화된 성인 섬유아세포는 조작된 혈관 내에 균일하지 않게 분포되어 있다. 다른 실시양태에서, 세포는 층 내에 분포되어 있다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 층은 하나 이상의 다른 층과 상이한 세포 유형의 분포를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 세포는 조작된 혈관이 형성될 때 균일하지 않게 분포된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포 유형은 어느 정도 이동하거나 격리되어, 균일하지 않은 분포를 형성한다.

일부 실시양태에서, 조작된 혈관은 순응성을 가진다. 한 실시양태에서, 섬유아세포, 평활근 세포, 및 내피 세포는 자가성을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 파열 강도는 생리학적 혈압을 견디기에 충분하다. 다른 실시양태에서, 관의 루멘 제거가능한 루멘-형성 충전제체로부터 형성되었다. 다른 실시양태에서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 5:95 내지 약 25:75이다. 다른 실시양태에서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 15:85이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 순응성을 가진다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 내경은 약 6 mm 이하이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 내경은 약 0.5 mm 이하이다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 두께는 관의 영역에 걸쳐 실질적으로 균일하다. 다른 실시양태에서, 조작된 다층 혈관의 두께는 관의 길이에 걸쳐 실질적으로 균일하다. 다른 실시양태에서, 관은 미분화된 성인 섬유아세포가 실질적으로 없다. 다른 실시양태에서, 관은 미분화된 성인 평활근 세포가 실질적으로 없다. 다른 실시양태에서, 관은 미분화된 성인 내피 세포가 실질적으로 없다. 다른 실시양태에서, 관은 분지된 구조를 가진다. 다른 실시양태에서, 관은 자기 입자를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 관은 우회 이식술에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 관은 동정맥류 통로에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 관은 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 관은 심혈관 장치 시험에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 심혈관 장치는 스텐트이다. 일부 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 비지배성을 가진다. 일부 실시양태에서, 상기 분화된 성인 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포이다.

본원에 사용되는 용어 "응집하다(cohere)", "응집된" 및 "응집"이라는 용어는 세포를 결합시키는 세포-세포 간의 세포 접착 성질, 세포 응집체, 다세포체 및/또는 층을 지칭한다. 본원에 사용되는 용어는 "융합하다(fuse)", "융합된" 및 "융합(fusion)"과 혼용된다.

본원에 사용되는 용어 "스카폴드"는 중합체 스카폴드와 같은 합성 스카폴드, 세포외 기질 층과 같은 비합성 스카폴드, 및 조작된 다층 혈관의 물리적 구조에 통합되고 관으로부터 제거되지 않는, 임의의 다른 유형의 예비형성된 스카폴드를 지칭한다.

도면의 간단한 설명

본 발명의 신규 특성은 첨부된 특허청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 원리가 이용되는, 예시적 실시양태를 기술하는 하기 발명의 상세한 설명 및 이하와 같은 첨부 도면을 참고로 할 때, 본 발명의 특성 및 이점을 보다 잘 이해하게 된다:

도 1은 HASMC-HAEC(인간 대동맥 평활근 세포-인간 대동맥 내피 세포) 혼합 세포 실린더의 도시적 헤마톡실린 및 에오신 염색이다.

도 2는 HDF 다세포체 및 HASMC-HAEC 혼합 다세포체를 이용한, HDF의 외층 및 HASMC-HAEC의 내층을 가지는 혈관을 구성하는 도시적 기하학적 배치이다.

도 3A는 도시적 비단리 다층 혈관이다.

도 3B는 인큐베이션 후 24시간 시의 아가로스 지지체 구조 내에 캡슐화된 실린더 간의 응집에 의해 형성된, 도시적 단리 다층 혈관이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 재생 의약 및 조직 조작의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 섬유아세포, 평활근 세포, 및 내피 세포를 포함하고 특별한 특성을 가지는 다층 혈관의 생성에 관한 것이다.

조직 조작은 혈관을 포함한, 이식가능한 기관의 결손과 결부된 기관 대체에 대한 필요성이 증대하고 있음으로 비롯되는 문제에 대한 해결책을 제공한다(문헌[Langer and Vacanti (1993)]). 미국에서는, 질환이 있는 동맥에 대한 대체 혈관 또는 대체 복부 기관, 특히 직경이 작은 혈관 이식물에 대한 필요가 있다. 또한, 향상된 연구용 혈액에 대한 필요도 인식되고 있다. 직경이 5 내지 6 mm 미만의 작은 동맥은 혈전증의 발생율이 높아서 인공 물질로 대체될 수 없다(문헌[Connolly et al. (1988)]; 문헌[Greisler et al. (1988)]). 조직 조작된 혈관 이식물은, 네이티브(native) 이식가능한 혈관의 결손을 해결하는 실행가능한 방법으로서, 예를 들어 심혈관 장치 시험 및 약물 실험과 같은 용도에 사용되는 방법을 제공한다.

네이티브 관은 3개의 층, 즉 내피 세포로 이루어진 내층(내막), 혈관 평활근의 중간층(중막), 및 섬유아세포의 외층(외막)을 포함한다. 이상적인 조직 조작된 혈관 이식물은, 다른 경우라면 이식물의 장기 거동에 영향을 미치거나 그것의 일차적 생물학적 기능을 간섭할 수 있는 합성 스카폴드가 없어야 한다. 본원에 기재된 다층 혈관이 이 결과를 달성한다. 내경이 약 6 mm 이하인 직경이 작은 조직 조작된 혈관 이식물이 요망된다. 본원에 기재된 다층 혈관이 이 결과(및 필요한 경우, 보다 큰 직경)를 달성한다. 다른 자들은 생리학적 혈압을 견딜 수 있는 합성 스카폴드가 없는 순응성 이식물을 생성시킬 수 없었다. 본원에 기재된 다층 혈관이 이 결과를 달성한다. 다른 자들은 지지 생물학적 물질은 존재하지 않으면서 혈관 조직, 섬유아세포, 평활근 세포, 및 내피 세포에 존재하는 3개의 주된 세포 유형을 포함하는 혈관 구조물을 재생시킬 수 없었다. 본원에 기재된 다층 혈관이 이 결과를 달성한다.

순응성을 가지고, 실질적으로 균일하며, 합성 스카폴딩이 없고, 내경이 약 0.5 mm 이하인, 섬유아세포, 평활근 세포, 및 내피 세포를 포함하는 다층 혈관 구조체 관의 집합체(assembly)가 아직 달성되지 않았다. 본원에 기재된 다층 혈관이 이 결과를 달성한다.

분화된 성인 섬유아세포의 하나 이상의 층 및 분화된 성인 평활근 세포의 하나 이상의 층을 포함하는 조작된 다층 혈관으로서, 임의의 층은 분화된 성인 내피 세포를 추가로 포함하고, 상기 관은 다음의 특성: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 1:99 내지 약 45:55인 점; (b) 조작된 다층 혈관이 순응성을 갖는다는 점; (c) 조작된 다층 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (d) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (e) 조작된 다층 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며, 단, 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 한다는 점 중 1가지 이상을 가지는 다층 혈관이 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 상기 특성들 중 2가지 이상을 가진다. 다른 특정 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 상기 특성들 중 3가지 이상을 가진다. 다른 특정 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 상기 특성들 중 4가지 이상을 가진다. 다른 특정 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 상기 특성들 모두를 가진다. 일부 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 비지배성을 가진다. 일부 실시양태에서, 상기 분화된 성인 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포이다.

또한, 조작된 다층 혈관의 형성 방법으로서, 하나 이상의 충전제 기질체, 세포들이 상호 응집되어 있는 평활근 세포의 하나 이상의 다세포체, 세포들이 상호 응집되어 있는 내피 세포의 하나 이상의 다세포체, 및 세포들이 상호 응집되어 있는 섬유아세포 세포의 하나 이상의 다세포체를 위치시켜서 원하는 혈관 구조를 형성시키는 단계로서, 여기서 하나 이상의 충전제 기질체는 관의 루멘을 형성하고, 복수개의 충전제 기질체는 관을 둘러싸고 있는 것인 단계; 및 조작된 다층 혈관의 다세포체를 응집시키는 단계를 포함하고, 단, 어떠한 때에도 예비형성된 스카폴드가 사용되지 않아야 하는 것인 방법이 본원에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 다세포체는 신장형 세포체이다. 전문에 걸쳐 사용되는 신장형 세포체란 단지 한 예로서 제공된 것으로, 제한적 실시양태가 아니다. 따라서, 당업자라면 본원의 개시내용을 이용하여, 신장형 세포체에 대한 교시내용을 임의의 다른 세포체(예를 들어, 비신장형 세포체)에 적용할 수 있을 것이다. 한 실시양태에서, 세포체는 실질적으로 구형인 세포체이다.

또한, 분화된 성인 섬유아세포의 하나 이상의 층 및 분화된 성인 평활근 세포의 하나 이상의 층을 포함하는 조작된 다층 혈관으로서, 임의의 층은 분화된 성인 내피 세포를 추가로 포함하고, 상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 5:95 내지 약 25:75인 점; (b) 조작된 다층 혈관이 순응성을 갖는다는 점; (c) 조작된 다층 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (d) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (e) 조작된 다층 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며, 단, 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 다층 혈관이 본원에 기재되어 있다.

또한, 분화된 성인 섬유아세포의 외층, 및 분화된 성인 평활근 세포 및 분화된 성인 내피 세포의 하나 이상의 내층을 포함하는 조작된 다층 혈관으로서, 상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 1:99 내지 약 45:55인 점; (b) 조작된 다층 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (c) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (d) 조작된 다층 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점 중 하나 이상을 가지며, 단, 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 조작된 다층 혈관이 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 상기 특성들 중 2가지 이상을 가진다. 다른 특정 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 상기 특성들 중 3가지 이상을 가진다. 다른 특정 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 상기 특성들 중 4가지 이상을 가진다. 다른 특정 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 상기 특성들 모두를 가진다. 일부 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 비지배성을 가진다. 일부 실시양태에서, 상기 분화된 성인 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포이다.

또한, 분화된 성인 섬유아세포의 하나 이상의 층 및 분화된 성인 평활근 세포의 하나 이상의 층을 포함하는 조작된 다층 혈관을 제공하는 단계를 포함하는 환자의 치료 방법으로서, 임의의 층은 분화된 성인 내피 세포를 추가로 포함하고, 상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 1:99 내지 약 45:55인 점; (b) 조작된 다층 혈관이 순응성을 갖는다는 점; (c) 조작된 다층 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (d) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (e) 조작된 다층 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며, 단, 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 방법이 본원에 기재되어 있다.

또한, 분화된 성인 평활근 세포, 분화된 성인 내피 세포, 및 분화된 성인 섬유아세포를 포함하는 조작된 혈관으로서, 상기 세포들은 상호 응집되어 있고, 상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 1:99 내지 약 45:55인 점; (b) 조작된 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (c) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (d) 조작된 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며, 단, 조작된 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 조작된 혈관이 본원에 기재되어 있다.

조작된 다층 혈관에 사용되는 세포 유형은 임의적으로 동종이계 조직(수령자와 동종인 도너로부터 유래되거나 그로부터 유도되는 세포 또는 조직) 또는 자가성 이식물(수령자로부터 유래되거나 그로부터 유도되는 세포 또는 조직)으로부터 비롯되고, 임의적으로 신선하거나 저온보존된다. 세포는 줄기 세포, 예를 들어 하나 이상의 특정 기능을 수행하고 자가 재생하는 능력을 가지는 다른 각종 세포 유형으로 분화될 가능성을 가지는 다분화능 재생 세포, 또는 간세포, 예를 들어 하나 이상의 세포 유형으로 분화할 가능성을 가지고 자가재생하는 능력이 제한되거나 그러한 능력이 없는 단분화능 또는 다분화능 재생 세포로부터 분화될 수 있다. 세포는 또한 예를 들어, 인간 대동맥 세포, 인간 제대 세포, 인간 지방질 조직, 인간 골수, 인간 태반, 또는 인간 분화된 세포가 수득될 수 있는 임의의 다른 출처로부터 비롯될 수 있다. 바람직하게, 본원에 기재되어 있는 조작된 다층 혈관에 사용되는 세포 유형은 성인 분화된 세포이다.

조작된 다층 혈관에 사용되는 세포 유형은 당업계에 공지된 임의의 방식으로 배양될 수 있다. 세포 및 조직 배양 방법이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures; Freshney (1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques](이의 내용은 상기 정보를 위해 본원에 참조 인용됨)에 기재되어 있다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 일반적 포유동물 세포 배양 기법, 세포주 및 세포 배양 시스템이 또한 문헌[Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G., (eds.) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998)](이의 내용은 상기 정보를 위해 본원에 참조 인용됨)에 기재되어 있다.

배양 내 포유동물 세포에 대한 적당한 성장 조건이 당업계에 공지되어 있다. 세포 배양 배지는 일반적으로, 배양하는 세포 유형(들)에 따라서 선택될 수 있는 필수 영양소 및 임의적으로는 부가적 성분, 예컨대 성장 인자, 염, 미네랄, 비타민 등을 포함한다. 세포 성장, 분화, 특정 단백질 분비 등을 증진시키기 위해, 특정 성분이 선택될 수 있다. 일반적으로, 표준 성장 배지는 10 내지 20% 우태 혈청(FBS) 또는 송아지 혈청 및 100 U/ml 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신이 보충된, 110 mg/L 피루브산염 및 글루타민을 가지는 저포도당의 둘베토 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM)가, 당업자에게 공지된 다른 각종 표준 배지와 마찬가지로 적당하다. 바람직하게, 세포는 세포의 기원이 된 동물의 체온 또는 그 부근의 온도에서 3 내지 15% CO₂, 바람직하게는 5% CO₂의 분위기에서 무균 조건 하에 배양된다. 예를 들어, 인간 세포는 바람직하게 대략 37℃에서 배양된다.

세포는 또한 원하는 주(line)에 따라 세포의 분화를 유도하기 위한 세포 분화제와 함께 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포는 성장 인자, 사이토킨 등과 함께 배양될 수 있다. 본원에 사용되는 "성장 인자"라는 용어는, 세포에 의해 생성되고 자체 및/또는 다른 각종 이웃 세포 또는 원거리 세포에 영향을 미칠 수 있는, 사이토킨을 비롯한, 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 착물을 지칭한다. 전형적으로, 성장 인자는 발달에 따라 또는 큰 생리적 또는 환경적 자극에 반응하여, 특정 유형의 세포의 성장 및/또는 분화에 영향을 준다. 전부는 아니라도 일부의 성장 인자는 호르몬이다. 예시적 성장 인자는 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 신경 성장 인자(NGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 각질 형성 세포 성장 인자(KGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 예컨대 기본 FGF (bFGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 예컨대 PDGF-AA 및 PDGF-AB, 간세포 성장 인자(HGF), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 예컨대 TGFβ1 및 TGFβ3, 표피 성장 인자(EGF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 인터류킨-6(IL-6), IL-8 등이다. 성장 인자는 특히 문헌[Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Darnell et al, eds., 1986]; 문헌[Principles of Tissue Engineering, 2d ed., Lanza et al., eds., Academic Press, 2000]에 논의된다. 당업자라면, 본원에 기재되어 있는 임의의 모든 배양-유래 성장 인자가 본 발명의 범주 내에 속함을 이해할 것이다.

본 발명의 섬유아세포, 평활근 세포, 및 내피 세포는 혈관으로 형성되기 위해 다세포체에 조합되기 전에 별도로 배양될 수 있다. 예를 들어, 섬유아세포, 평활근 세포, 및 내피 세포를 조직 배양 플라스크에 분리되어 성장시킬 수 있고, 컨플루언시 시에는 계대되어 한 배양으로 함께 혼합하여 혼합 세포 현탁액을 형성하고, 이를 원심분리하고 상등액을 제거하여, 혼합 세포 페이스트를 위한 매우 조밀하고 압축된 세포 펠렛을 형성한다. 적당한 혼합 세포 현탁액은 섬유아세포 및 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포, 및 평활근 세포 및 내피 세포의 조합을 포함한다. 혼합 세포 현탁액 내의 세포는 예를 들어, 오비탈 쉐이커에 인큐베이션함으로써 상호 응집하고 세포간 접착을 개시하도록 될 수 있다. 혼합 세포 페이스트는 예를 들어 모세관 내로 흡인함으로써 다세포체 내로 형성될 수 있다. 이어서, 세포 실린더는 예를 들어 플런저를 이용하여 모세관으로부터 몰드의 홈으로 압출될 수 있다. 대안적으로, 섬유아세포, 평활근 세포, 및 내피 세포는 예를 들어, 신장형 세포를 포함한 다세포에 분리하여 도입될 수 있다. 신장형 세포체는 세포와 예비혼합된 하나 초과의 세포외 기질 성분을 함유할 수 있다. 이어서, 다세포체는 바이오프린터의 사용을 통해 이후에 혈관 내로 도입되기 위해 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션될 수 있다.

본 발명의 다세포체는 또한 복수의 세포에 부가하여 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 성분, 또는 하나 이상의 ECM 성분의 하나 이상의 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 신장형 세포체는 각종 ECM 단백질(예를 들어, 젤라틴, 피브리노겐, 피브린, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 및/또는 프로테오글리칸류)을 함유할 수 있다. ECM 성분, 또는 그 ECM 성분의 유도체는 신장형 세포체 형성에 사용되는 세포 페이스트에 첨가될 수 있다. 세포 페이스트에 첨가된 ECM 성분 또는 그 ECM 성분의 유도체는 인간 또는 동물 출처로부터 정제되거나, 당업계에 공지된 재조합 방법에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, ECM 성분 또는 그 ECM 성분의 유도체는 신장형 세포체 내의 세포에 의해 자연 분비될 수 있거나, 신장형 세포체의 제조에 사용되는 세포는 하나 이상의 ECM 성분 또는 그 ECM 성분의 유도체 및/또는 하나 이상의 세포 접착 분자 또는 세포-기질 접착 분자(예를 들어, 셀렉틴, 인테그린, 면역글로불린 및 카드헤린)의 발현 수준을 변화시키기 위한 것으로 당업계에 공지된 임의의 적당한 방법에 의해 유전 조작될 수 있다. ECM 성분 또는 그 ECM 성분의 유도체는 신장형 세포체 내의 세포의 응집을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 젤라틴 및/또는 피브리노겐은 신장형 세포체 형성에 사용되는 세포 페이스트에 적당히 첨가될 수 있다. 이어서, 피브리노겐은 트롬빈 첨가에 의해 피브린으로 전환될 수 있다.

내피 세포 대 평활근 세포의 비는 다세포체 내의 약 1:99 내지 약 45:55의 내피 세포 대 평활근 세포의 임의의 비일 수 있다. 예를 들어, 조작된 다층 혈관 내에서의 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 1:99, 약 5:95, 약 10:90, 약 15:85, 약 20:80, 약 25:75, 약 30:70, 약 35:65, 약 40:60, 약 45:55, 또는 약 1:99 내지 약 45:55 내피 세포 대 평활근 세포의 임의의 비일 수 있다.

일부 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 미분화된 성인 섬유아세포가 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 미분화된 성인 평활근 세포가 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 미분화된 성인 내피 세포가 실질적으로 없다.

본 발명의 섬유아세포는, 예를 들어 조직 배양 플라스크 내에서 배양될 수 있다. 컨플루언시 시에는 섬유아세포를 계대하여, 원심분리하고 상등액을 제거하여, 단일 세포 페이스트를 형성할 수 있다. 섬유아세포 세포 페이스트는 예를 들어 모세관으로의 흡인에 의해 신장형 세포체로 형성될 수 있다. 이어서, 신장형 세포체는 예를 들어 플런저의 사용에 의해, 모세관으로부터 몰드의 홈으로 압출될 수 있다. 이어서, 신장형 세포체는 바이오프린터의 사용을 통해 이후에 혈관 내로 도입되기 위해 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션될 수 있다.

본 발명의 평활근 세포는 또한, 예를 들어 조직 배양 플라스크 내에서 배양될 수 있다. 컨플루언시 시에는 평활근 세포를 계대하여, 원심분리하고 상등액을 제거하여, 단일 세포 페이스트를 형성할 수 있다. 평활근 세포 페이스트는 예를 들어 모세관으로의 흡인에 의해 신장형 세포체로 형성될 수 있다. 이어서, 신장형 세포체는 예를 들어 플런저의 사용에 의해, 모세관으로부터 몰드의 홈으로 압출될 수 있다. 이어서, 신장형 세포체는 바이오프린터의 사용을 통해 이후에 혈관 내로 도입되기 위해 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션될 수 있다.

본 발명의 내피 세포는 또한, 예를 들어 조직 배양 플라스크 내에서 배양될 수 있다. 컨플루언시 시에는 내피 세포를 계대하여, 원심분리하고 상등액을 제거하여, 단일 세포 페이스트를 형성할 수 있다. 내피 세포 페이스트는 예를 들어 모세관으로의 흡인에 의해 신장형 세포체로 형성될 수 있다. 이어서, 신장형 세포체는 예를 들어 플런저의 사용에 의해, 모세관으로부터 몰드의 홈으로 압출될 수 있다. 이어서, 신장형 세포체는 바이오프린터의 사용을 통해 이후에 혈관 내로 도입되기 위해 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션될 수 있다.

겔 기질 몰드는 평활근/내피 및 섬유아세포 세포 실린더의 인큐베이션을 위해 제작될 수 있다. 겔 기질 몰드는 임의의 생체적합성 겔 기질, 예컨대 아가로스, 아가, 또는 기타 생체적합성 히드로겔, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 이루어질 수 있다. 겔 기질 물질은 영양소 매질에 대해 투과성이나, 세포의 내성장, 이동 및 접착에 저항한다. 겔 기질 몰드는 무균화될 수 있다. 겔 기질 몰드는 겔 기질의 상단에 배치된 음성 몰드를 이용하여 제작되어, 겔을 기질 몰드의 형태로 성형할 수 있다. 예를 들어, 테플론(Teflon) 음성 몰드가 사용될 수 있다. 신장형 세포체는, 예를 들어 혈관 구조로 형성되도록 하기 위해 모세관 내로 재흡인되기 전에, 겔 기질 몰드 내에서 24시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 겔 기질 몰드는 원통형 형상을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 겔 기질 몰드는 반원통형 형상을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 겔 기질 몰드는 직사각형 형상을 특징으로 한다.

신장형 세포체 내의 세포를 세포 생육성에 대해, 예를 들어 통상의 조직학을 이용하여, 예를 들어 H&E 염색에 의해 평가할 수 있다. 신장형 세포체 내의 세포를 또한 취급 용이성에 대해 평가할 수도 있다. 예를 들어, 인큐베이션 시점의 말기에 실린더 컬(예를 들어, 컬링)의 양을 평가할 수 있다. 예를 들어, 주관적 선호도 배점 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들어, 컬링 점수는 1 내지 10점(여기서, 1점은 신장형 세포체가 컬링을 나타내지 않음을 의미하고, 10점은 신장형 세포체가 컬링되어 나선 유사 구조를 형성하였음을 의미함)에 기초하여, 신장형 세포체에 배점될 수 있다. 부가적으로, 신장형 세포체의 일체도, 예를 들어 응집은 주관적 점수를 이용하여 인큐베이션 시간 말기에 평가될 수 있다. 예를 들어, 이 2가지 점수로써, 다층 혈관의 형성 중 취급 용이성을 확실히 하기 위해 신장형 세포체 제조에 바람직한 조건을 선택하게 된다. 예를 들어, 응집 점수는 10점(여기서, 1점은 실린더가 그 매끄러운 원통형 구조를 완전히 유지하였음을 의미하고 10점의 응집 점수는 원통형 구조가 소실됨을 의미함)에 기초하여 신장형 세포체에 배점될 수 있다.

다층 혈관 이식물은, 예를 들어 복수개의 다세포체를 집합시키고 그 다세포체를 응집시킴으로써 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포, 세포 응집체, 다세포체 및/또는 층은 세포-세포 간 접착에 의해 응집한다. 다른 실시양태에서, 세포, 세포 응집체, 다세포체 및/또는 층은 융합한다. 일부 실시양태에서, 다층 혈관 이식물은, 복수개의 신장형 세포체를 탄성 컨시스턴시를 가지는 원하는 관형 형상으로 집합시켜, 그 신장형 세포체가 응집하도록 함으로써 형성된다. 다른 실시양태에서, 신장형 세포체 내의 세포 및/또는 세포 응집체는 함께 응집하여, 탄성 컨시스턴시, 원하는 세포 밀도 및 용이한 조작 및 취급에 충분한 일체성을 가지는 혈관형 구조물을 형성할 수 있다.

신장형 세포체의 생성 방법은, 1) 원하는 세포 밀도 및 점도를 가지는 복수개의 예비선택된 세포 또는 세포 응집체를 함유하는 세포 페이스트를 제공하는 단계, 2) 세포 페이스트를 원하는 관형 형상으로 조작하는 단계, 및 3) 성숙을 통해 신장형 세포체를 형성하는 단계를 포함한다.

단독 또는 신장형 세포체와 조합한 실질적으로 구형인 세포체는 본원에 기재된 유형의 혈관을 구축하는 데에도 적당하다. 실질적으로 구형인 세포체의 생성 방법은, 1) 원하는 세포 밀도 및 점도를 가지는 복수개의 예비선택된 세포 또는 세포 응집체를 함유하는 세포 페이스트를 제공하는 단계, 2) 세포 페이스트를 원하는 원통형 형상으로 조작하는 단계, 3) 실린더를 동등한 구획으로 절단하는 단계, 4) 구획을 선회식 쉐이커 상에서 하룻밤 동안 회전시키는 단계, 및 5) 성숙을 통해 실질적으로 구형인 세포체를 형성하는 단계를 포함한다.

신장형 충전제체는 혈관 구축을 위해 상기 신장형 세포체와 조합하여 사용될 수 있다. 신장형 충전제체는 소정의 형상, 예컨대 막대 또는 기타 몰드의 물질을 포함하고, 반면 그 물질은 영양소 매질에 대해 투과성이나 세포의 내성장, 이동 및 접착을 방지한다. 충전제체 단위는 아가로스, 아가 또는 기타 생체적합성 히드로겔, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 이루어질 수 있다. 조작된 다층 혈관을 구성하는 중, 신장형 충전제체가 소정의 패턴에 따라 혈관을 위한 지지체 구조를 한정하도록 이용될 수 있다. 신장형 충전제체는 다층 혈관 이식물의 루멘을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 루멘-형성 충전제체는 관의 루멘을 형성하기 위해 제거가능할수 있다. 신장형 충전제체 및 신장형 세포체 및 이의 형성 방법의 예는 미국 특허 출원 제12/491,228호에 찾아볼 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 다층 혈관은 층을 포함한다. 다른 실시양태에서, 층은 하나 이상의 세포 유형의 존재에 의해 특징화된다. 다른 실시양태에서, 층은 조작된 다층 혈관 내 위치에 의해 특징화된다. 일부 실시양태에서, 층은 하나 이상의 성분, 요소, 또는 화합물의 농도, 및/또는 물성, 예컨대 순응성, 강도, 또는 탄성에 의해 특징화된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 층은 구별된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 층은 구분된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 층은 인접해 있다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 층은 분리가능하지 않다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 층은 조작된 다층 혈관의 영역을 가로지르는 연속 구배가 변화하는 성질에 의해 특징화된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 층은 경시적으로 변화하는 성질에 의해 특징화된다.

조작된 다층 혈관은 평활근 세포 및 내피 세포의 신장형 세포체의 내층, 및 섬유아세포의 신장형 세포체의 외층을 이용하여 제작된다. 평활근 세포 및 내피 세포의 신장형 세포체, 섬유아세포의 신장형 세포체, 및 신장형 충전제 기질체의 기하학적 패턴이 3차원 혈관 구조를 형성하도록 배치되어 있는, 도 2에 나와 있는 바와 같은 기하학적 배치를 사용할 수 있다. 다층 혈관은 겔 기질, 예컨대 아가로스를 가지는 기판(base plate) 상에 형성될 수 있다. 예를 들어, 겔 기질은 모세관 내에 흡인되어, 예를 들어 냉(4℃) PBS 용액 중에서 겔화되며, 모세관으로부터 압출되고 겔 기질 기판 상에 똑바로 배치되어, 신장형 충전제 기질체를 형성한다. 제2 신장형 충전제 기질체를 제1 신장형 충전제 기질체에 결합시키고, 원하는 지지체 구조가 형성될 때까지 공정을 반복시켰다. 습윤 용액, 예컨대 PBS를 신장형 충전제 기질체 상에 분배할 수 있고, 이 때 이는 침착되어 습윤화되고 체들 간에 접착되도록 한다. 섬유아세포의 신장체는 겔 기질 신장체 상의 다음 층 상에 침착되어, 다층 혈관의 외층을 형성할 수 있고, 평활근 세포 및 내피 세포의 신장체는 층별 기초 하에 내층을 형성하는 것을 계속하도록 압출될 수 있다. 각 신장형 세포체를 압출한 후, 배양 배지와 같은 습윤 용액을 침착된 세포체 상단에 분배하여, 후속 신장형 세포체의 침착을 보조하고 이미 침착된 신장형 세포체의 탈수를 방지할 수 있다. 원하는 혈관 구조가 형성할 때까지 상기 공정을 반복한다. 부가적으로, 조작된 다층 혈관은 실질적으로 구형인 세포체의 층을 단독으로 또는 신장형 세포체와 조합하여 제작될 수 이다. 원하는 혈관 구조는 직선형 관이거나, 하나 이상의 분지를 가지는 관(예를 들어, 분지된 구조)일 수 있다. 일단 전체 혈관 구조체가 완성되면, 겔 기질이 구조체 각 말단에 분배되어 겔화될 수 있다. 겔화 후, 전 구조체를 배양 배지와 같은 습윤 용액에 침액시켜, 세포 실린더간의 응집이, 예를 들어 37℃ 및 5% CO₂에서 24시간 동안 일어나도록 인큐베이션할 수 있다.

조작된 다층 혈관은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, 조작된 다층 혈관은 신장형 및/또는 실질적으로 구형인 세포체 및 겔 기질의 신장체를 수동으로, 예컨대 마이크로피펫으로 또는 자동화로, 예컨대 특수 목적의 바이오프린터(예컨대 미국 특허출원 제10/590,446호의 것)를 이용하여, 배치시켜 형성될 수 있다.

대안적으로, 다층 혈관은 각종 방법들의 조합, 예컨대 복수개의 신장형 세포체 및/또는 복수개의 신장형 충전제체의 세포 씨딩 및 집합을 이용하여 형성될 수 있다. 예를 들어, 내피 세포는 평활근 세포의 신장형 세포체 및 섬유아세포의 신장형 세포체로 형성된 혈관의 루멘을 통해 씨딩될 수 있다(예를 들어 상기 루멘을 통해 유동될 수 있다). 또 다른 예로서, 섬유아세포의 층은 평활근 세포 및 내피 세포의 신장형 세포체로 형성된 혈관 주위의 싸여질 수 있다. 또 다른 예로서, 혈관 형성에 사용되는 예비형성된 세포체는 하나 초과의 세포 유형을 포함한다. 또 다른 예로서, 혈관 형성에 사용되는 층은 하나 초과의 세포 유형을 포함한다.

일부 실시양태에서, 혈관 형성에 사용되는 예비형성된 세포체는 3가지 모든 세포 유형(내피 세포, 평활근 세포, 및 섬유아세포)를 포함하고; 그러한 예에서, 각 세포 유형은 (예를 들어, 성숙 체임버 내에 있는 시간 동안) 적절한 위치로 이동하여, 조작된 다층 혈관을 형성한다. 다른 실시양태에서, 혈관 형성에 사용되는 예비형성된 세포체는 2가지 세포 유형(내피 세포, 평활근 세포, 및 섬유아세포로부터 선택됨)을 포함하고, 양 세포 유형 모두는 (예를 들어, 성숙 체임버 내에 있는 시간 동안) 적절한 위치로 이동하여, 조작된 다층 혈관을 형성한다. 일부 실시양태에서, 각 유형의 세포는 혈관의 세포체 또는 층 내에 균일하게 분포된다. 다른 실시양태에서, 각 유형의 세포는 혈관의 세포체 또는 층 내에 특정 영역에 국소화된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 다층 혈관은 비지배성을 가진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 다층 혈관은 비혈관 섬유아세포인 분화된 성인 섬유아세포를 포함한다.

인큐베이션 기간의 종료 시에, 둘러싸고 있는 겔 기질 지지체 구조를 제거하고, 형성응집된 다층 혈관을 성장 및 세포외 기질 형성을 위해 성숙 체임버(예를 들어, 바이오리액터)에 둘 수 있다. 지지체 구조/충전제체는 혈관의 루멘으로부터 제거되고/되거나, 충전제체를 빼내거나 열가역성 또는 감광성 방법과 같은 기타 방법에 의해 혈관을 둘러쌀 수 있다.

조작된 다층 혈관의 이동 중에 루멘내 유체 살포(fluid perfusion)를 사용할 수 있다. 예를 들어, 다층 혈관을 성숙 체임버(예를 들어, 바이오리액터) 내에 둘 때, 루멘내 살포를 이용할 수 있다. 루멘내 살포는 비교적 낮은 압력에서 시작되어, 조작된 다층 관의 이동 진행 중에 증가될 수 있다. 예를 들어, 루멘내 살포는 네이티브 조직 내 압력 및 전단력과 유사하거나 초과하는 수준으로 증가될 수 있다. 예를 들어, 동맥 및 정맥 다층 관에 대한 내압은 정상 혈압 및/또는 상승 혈압과 유사하도록, 60 mm Hg 미만, 60 내지 150 mm Hg, 150 내지 200 mm Hg, 또는 200 mm Hg 초과의 압력에 적용될 수 있다. 조직의 붕괴를 피하기 위해 조작된 다층 관의 성숙 단계에 초기 동안에는 압력이 낮을수록 좋다. 마찬가지로, 조작된 다층 관은 순환계에서의 정상 전단력 및/또는 상승 전단력과 유사하도록 5 dynes/cm² 미만, 5 내지 30 dynes/cm², 30 내지 60 dynes/cm², 또는 60 dynes/cm² 초과의 전단력에 적용될 수 있고, 초기에는 보다 낮은 수준이 바람직하게 사용된다. 그러한 루멘내 살포 기법이 당업계에 공지되어 있다.

박동력은 당업계에 공지된 바와 같이 루멘내 실포에는 박동력이 포함될 수 있다. 박동력은 예를 들어, 동맥 및 정맥 내 순환하는 혈액의 천연 박동과 유사하도록 하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 60/min 미만, 60 내지 90/min, 75/min, 90/min 초과, 또는 140 내지 160/min, 또는 160/min 초과의 맥동, 또는 성인 또는 태아의 휴지 맥동과 유사하도록 하는 임의의 다른 맥동이 사용될 수 있다. 박동력의 사용은 초기에는 비교적 낮을 수 있고, 그 힘은 조직 구조체가 더욱 완전히 성숙됨에 따라 생리학적 수준으로 증가하게 된다.

본 발명의 조작된 다층 혈관은, 예를 들어 혈관의 임의의 층의 형성 또는 관형 형상의 형성을 위해, 어떠한 예비형성된 스카폴드도 이용하지 않는다. 한 비제한적 예로서, 본 발명의 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 합성 스카폴드, 예컨대 중합체 스카폴드, 세포외 기질 층 또는 임의의 기타 유형의 예비형성된 스카폴드도 이용하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없다. 일부 실시양태에서, 조작된 다층 혈관은 검출가능하나 미량 또는 극소량의 스카폴드, 예를 들어 총 조성물의 0.5% 미만의 스카폴드를 함유한다. 다른 실시양태에서, 미량 또는 극소량의 스카폴드는 이식물의 장기 거동에 영향을 미치거나 그것의 일차 생물학적 기능을 간섭하는 데에 불충분하다.

본 발명의 조작된 다층 혈관은 혈관 형성을 위해 단지 세포 시트, 예를 들어 섬유아세포 세포 시트의 형성만을 이용하지 않는다.

본 발명의 조작된 다층 혈관은 약 6 mm, 약 5 mm, 약 4 mm, 약 3 mm, 약 2 mm, 약 1 mm, 또는 약 0.5 mm 이하, 또는 이들 사이의 임의의 직경, 바람직하게, 약 6 mm 이하의 내경을 가진다. 조작된 다층 혈관은 약 1 cm 이하 내지 약 30 cm 이상 범위의 길이를 가질 수 있다. 바람직하게, 혈관은 약 1 cm 내지 약 30 cm 범위의 길이를 가진다.

조작된 다층 관을 살포에, 예를 들어 약 4일 이상 동안 적용한 후, 혼합 평활근 세포 및 내피 세포의 내층을 섬유아세포의 외층과 함께 세포 접착, 재조직화 및 이동하도록 하여, 내막, 중막 및 외막의 네이티브 구조가 형성되도록 하며, 이 때 내피 세포는 안으로 이동하고, 평활근 세포는 중간으로 이동하고, 섬유아세포는 외층에 남는다.

대안적으로, 조작된 다층 관에서의 각종 세포 유형의 세포 재조직화 및 이동을 인도하기 위해 자기장을 사용할 수 있다. 예를 들어, 조작된 다층 관은 자기 입자(예를 들어, 강자성 나노입자 등)를 포함할 수 있고, 세포 재조직화 및 이동을 인도하기 위해 자기장에 적용될 수 있다.

혈관의 3개 층의 두께는 혈관의 길이의 적어도 한 영역에 대해 실질적으로 균일하고, 예를 들어 ±20% 이하이다. 일부 실시양태에서, 혈관의 두께는 ±10% 이하, 또는 ±5% 이하이다. 혈관의 두께는 또한 혈관의 길이에 걸쳐 실질적으로 균일할 수 있다. 혈관의 각 층의 두께는 또한 네이티브 혈관 조직의 두께와 유사할 수 있다.

본 발명의 조작된 다층 혈관은 또한 순응성일 수 있고 네이티브 생리학적 혈압에 필적하는 압력을 견디는 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 조작된 다층 혈관의 파열 강도는 생리학적 혈압을 견디기에 충분할 수 있다. 조작된 다층 혈관의 생물기계학적 성질을 시험하기 위해 각종 방법들을 이용할 수 있다. 혈관의 성질의 생물기계학적 성질을 시험하기 위한 적당한 방법은 파열 강도 및 순응성의 측정을 포함한다. 단일 하중 대 신장 시험, 응력 이완 시험 및 인장 파단 시험과 같은 응력-변형률 분석도 또한 적당하고, 적용될 수 있다. 당업자에 공지된 부가적 시험도 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 조작된 다층 혈관이 수가지 용도에 사용될 수 있고; 예를 들어, 혈관은 우회 이식술에, 동정맥류 통로를 위해, 약물 시험 용도에, 혹은 심혈관 장치 시험 용도를 위해 사용될 수 있다. 혈관이 사용될 수 있는 심혈관 장치의 예는 스텐트를 포함한다.

또한, 본 발명의 하나 이상의 조작된 다층 혈관을 제공하는 단계를 포함하는 환자의 치료 방법이 본원에 기재되어 있다. 조작된 다층 혈관을 필요로 하는 환자는, 예를 들어 관상 또는 말초성 우회술을 필요로 하는 환자 또는 혈액투석을 필요로 하는 환자이다. 치료를 필요로 하는 환자는 손상된 혈관을 가질 수 있다. 치료를 필요로 하는 환자는 또한 예를 들어, 말기 신질환, 당뇨병, 동맥경화증, 또는 선천성 심장 출생 기형을 가진 자일 수 있다. 본 발명의 조작된 다층 혈관은 대체 혈관을 필요로 하는 임의의 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 나와 있고 기재되어 있으나, 그러한 실시양태는 단지 예로서 제공된 것임은 당업자에게 자명할 것이다. 이제 본 발명을 벗어나지 않는 한, 다수의 변형, 변화 및 치환도 당업자에게 이루어질 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 각종 대안들이 본 발명을 수행하는 데 이용될 수 있음을 이해하도록 한다. 하기 특허청구범위가 본 발명의 범주를 한정하고, 이 특허청구범위의 범주 내에 속하는 방법 및 구조, 및 이의 균등물도 본원에 포함되는 것으로 의도된다.

실시예

하기 특정 실시예는 단지 예시적이며 본 개시내용의 나머지 내용을 어떠한 식으로 제한하지 않는 것으로 간주하도록 한다. 추가 연구없이도, 당업자라면 본원의 설명에 기초하여 본 발명을 최대한도로 이용하는 것으로 판단된다. 본원에 인용된 모든 공보는 전문이 본원에 참조 인용된다. 이에 대한 언급은 상기 정보의 이용가능성 및 공중 보급을 입증한다.

실시예 1: HASMC - HAEC 혼합 세포 실린더

재료 및 방법

1. 세포 배양

1.1 평활근 세포: 일차 인간 대동맥 평활근 세포(HASMC; GIBCO/인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corp.)(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))를, 37℃ 및 5% CO₂에서 10% 우태 혈청(FBS), 100 U/ml 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신, 0.25 ㎍/ml의 암포테리신 B, 0.01 M의 HEPES(이들 모두 인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재)), 50 mg/L의 프롤린, 50 mg/L의 글리신, 20 mg/L의 알라닌, 50 mg/L의 아스코르브산, 및 3 ㎍/L의 CuSO₄(이들 모두 시그마(Sigma)(미국 미주리주 세인트루이스 소재))로 보충된 저포도당 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; 인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재)) 중에 유지시키고 확대시켰다. 모든 연구에 계대 4 내지 8의 HASMC의 컨플루언트 배양을 사용하였다.

1.2 내피 세포: 일차 인간 대동맥 내피 세포(HAEC; GIBCO/인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))를, 2% FBS, 1 ㎍/ml의 히드로코르티손, 10 ng/ml의 인간 표피 성장 인자, 3 ng/ml의 기초 섬유아세포 성장 인자, 10 ㎍/ml의 헤파린, 100 U/ml 페니실린, 0.1 mg/ml의 스트렙토마이신, 및 0.25 ㎍/ml의 암포테리신 B(이들 모두 인비트로젠 코포레이션제(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))로 보충된 미디엄 200(Medium 200)(인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재)) 중에 유지시키고 확대시켰다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 젤라틴(돼지 혈청에서 수득됨; 시그마(미국 미주리주 세인트루이스 소재))로 코팅된 조직 배양 처리 플라스크에서 성장시켰다. 모든 연구에 계대 4 내지 8의 HAEC의 컨플루언트 배양을 사용하였다.

2. 아가로스 몰드

2.1 2% w/v 아가로스 용액의 제조: 1 g의 저융점 아가로스(울트라퓨어 LMP(Ultrapure LMP); 인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))를 50 ml의 둘베코 인산염 완충 염액(DPBS; 인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))에 용해시켰다. 간략히, DPBS 및 아가로스를 아가로스가 완전히 용해될 때까지 꾸준히 교반하면서 고온 플레이트 상에서 85℃로 가열한다. 아가로스 용액을 125℃에서 25분 동안 증기 살균으로 무균화한다. 온도가 36.5℃ 초과로 유지되는 한, 아가로스 용액이 액상으로 남는다. 이 온도 미만에서는, 상 전이가 일어나고, 아가로스 용액의 점도가 증가하며, 아가로스가 고체 겔을 형성한다.

2.2 아가로스 몰드의 제조: 10 cm 페트리디쉬에 맞는 테플론(Teflon) 몰드를 이용하여 세포 실린더의 인큐베이션을 위해 아가로스 몰드를 제작한다. 간략히, 테플론 몰드를 70% 에탄올 용액을 이용하여 예비무균화하고, 몰드를 45분 동안 UV 광에 적용한다. 무균화된 몰드를 10 cm 페트리디쉬(VWR 인터내셔널 LLC(VWR International LLC)(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))의 상단에 두어, 잘 부착시킨다. 이 집합체(테플론 몰드+페트리디쉬)를 수직으로 유지시키고, 45 ml의 예비가온된 무균 2% 아가로스 용액을 테플론 몰드와 페트리디쉬 사이의 공간에 붓는다. 이어서, 집합체를 실온에서 1시간 동안 수평으로 두어, 아가로스가 완전히 겔화되도록 한다. 겔화 후, 테플론 프린트를 제거하고, 아가로스 몰드를 DPBS를 이용하여 2회 세정한다. 이어서, 17.5 ml의 HASMC 배양 배지를 아가로스 몰드에 첨가한다.

3. HASMC-HAEC 실린더

3.1 HASMC-HAEC 혼합 세포 실린더의 제작: 혼합 세포 실린더의 제조를 위해, HASMC 및 HAEC를 개별적으로 수집한 후, 소정의 비로 혼합하였다. 간략히, 배양 배지를 컨플루언트 배양 플라스크로부터 제거하고, 세포를 DPBS(1 ml/5 cm²의 성장 면적)로 세정하였다. 트립신(1 ml/15 cm²의 성장 면적; 인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))의 존재 하에 10분 동안 인큐베이션함으로써, 배양 플라스크의 표면으로부터 세포를 탈착시켰다. HASMC는 0.15% 트립신을 이용하여 탈착시킨 반면, HAEC는 0.1% 트립신을 이용하여 탈착시켰다. 인큐베이션 후, 적절한 배양 배지를 플라스크(트립신 체적 대비 2X 체적)에 첨가하였다. 세포 현탁액을 6분 동안 200 g에서 원심분리한 후, 상등액 용액을 완전히 제거하였다. 세포 펠렛을 각 배양 배지에 재현탁시키고, 혈구계수기를 이용하여 계수하였다. 적절한 체적의 HASMC 및 HAEC를 조합하여, 5, 7.5, 10, 12.5, 및 15% HAEC(총 세포 모집단 중의 %로 제시됨)를 함유하는 혼합 세포 현탁액을 수득하였다. 혼합 세포 현탁액을 5분 동안 200 g에서 원심분리한 후, 상등액 용액을 완전히 제거하였다. 혼합 세포 펠렛을 6 ml의 HASMC 배양 배지에 재현탁시키고, 20 ml의 유리 바이알(VWR 인터내셔널 LLC(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))에 옮긴 후, 60분 동안 150 rpm에서, 또한 37℃ 및 5% CO₂에서 오비탈 쉐이커에서 인큐베이션하였다. 이로써, 세포가 상호 응집하게 되고, 세포-세포 간 응집을 개시한다. 인큐베이션 후, 세포 현탁액을 15 ml의 원심분리관에 옮기고, 200 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액 배지의 제거 후, 세포 펠렛을 400 ㎕의 HASMC 배양 배지 중에 현탁시키고, 수회 상하 피펫팅하여, 모든 세포 클러스터가 확실히 파쇄되도록 하였다. 세포 현탁액을 15 ml의 원심분리관 내에 배치된 0.5 ml 마이크로퓨지(microfuge) 관(VWR 인터내셔널 LLC(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))에 옮긴 후, 2000 g에서 4분 동안 원심분리하여, 매우 조밀하고 압축된 세포 펠렛을 형성하였다. 상등액 매질을 흡인시키고, 흡인에 의해 세포를 모세관(OD 1.5 mm, ID 0.5 mm, L 75 mm; 드럼몬드 사이언티픽 컴퍼니(미국 펜실베니아주 브루몰 소재))에 옮겨, 길이가 50 mm인 세포 실린더를 수득하였다. 모세관 내의 세포 페이스트를 20분 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 HASMC 배지 중에 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 실린더를 모세관을 갖춘 플런저를 이용하여 모세관으로부터 (HASMC 배지로 덮힌) 아가로스 몰드의 홈으로 압출하였다. 세포 실린더를 24 및 48시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다.

4. 혼합 세포 실린더 생육성 및 취급 용이성의 평가

4.1 세포 생육성의 평가: 24, 48 및 72시간 인큐베이션의 종료 시, 혼합 세포 실린더 내 세포 생육성을 평가하기 위해, 통상의 조직학을 수행하였다. 간략히, 각 시점에서, 혼합 세포 실린더를 (수동으로 플런저를 이용하여) 모세관에 다시 흡인시키고, 다중웰 플레이트에 옮겼다. 실린더를 파라핀 포매하기 24시간 이상 전에 10% 중성 완충 포르말린을 이용하여 고정하였다. 포매된 실린더를 (십자형으로) 분획화하고, H & E 염색을 수행하였다.

4.2 취급 용이성의 평가: 혼합 세포 실린더의 취급 용이성을 평가하기 위해, 2개의 분리된 매개변수를 평가하였다. 먼저, 각 인큐베이션 시점의 종료 시에 컬링된 실린더의 양을 평가하였다. 주관적 선호 배점 시스템을 이용하였다. 두 번째로, 세포 실린더의 일체성을 또한 두 번째 주관적 점수를 이용하여 각 인큐베이션 시점 종료 시에 평가하였다. 조합하여, 이 두 점수를 조합함으로써, 이후 단계 동안 취급 용이성을 확실히 하기 위해 실린더 제조에 바람직한 조건을 선택할 수 있게 되었다.

결과

1. 세포 생육성 및 HASMC-HAEC 혼합 세포 실린더의 취급 용이성

HASMC-HAEC 혼합 세포 실린더를 상기 기재된 방법에 따라 5, 7.5, 10, 12.5 및 15% HAEC를 함유하도록 제작하였다. 실린더를 24 및 48시간 동안 아가로스 몰드 중에 인큐베이션하였다. 각 시점에서, 실린더에 컬링 및 응집 점수를 배점하였다. 표 1 및 2는 결과를 요약하고 있다. 볼 수 있는 바와 같이, 인큐베이션 시간이 24시간에서 48시간으로 증가함에 따라, 모든 혼합 세포 실린더에 대해 취급 용이성은 감소한다. 15% HAEC 및 잔량의 85%-HASMC를 함유하는 실린더는 아가로스 몰드 중 24시간 동안 인큐베이션 후에 취급이 가장 용이하다. 또한, 5% HAEC 및 95% HASMC를 함유하는 실린더는 양 시점 모두에서 취급이 가장 어렵다.

H&E 염색(도 1)을 이용하여, 모든 시점들에서 각 조건에 대한 세포 생육성을 평가하였다. 염색은, 아가로스 몰드 중 24시간 동안 인큐베이션한 모든 실리더는 가장 생육성이 큰(가작 적은 양의 분홍색 염색으로 입증됨) 세포를 함유하고, 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 세포 생육성이 감소함을 나타냈다. 또한, 아가로스 몰드 중 24시간 동안 인큐베이션한 후, 15% HAEC 및 85% HASMC를 함유하는 실린더 내 세포 생육성이 가장 높았다.

"컬링 점수"는 1 내지 10점(여기서, 1점은 신장형 세포체가 컬링을 나타내지 않았음을 의미하고, 10점은 신장형 세포체가 컬링되어 나선 유사 구조를 형성하였음을 의미함)에 기초하여 각 실린더에 배점되었다.

"응집 점수"는 10점(여기서, 1점은 실린더가 그 매끄러운 원통형 구조를 완전히 유지하였음을 의미하고 10점의 응집 점수는 원통형 구조가 완전히 소실되었을 의미함)에 기초하여 각 실린더에 배점되었다.

컬링 점수

인큐베이션 시간 (hr)	% HAEC(세포 총수 중의 %)
인큐베이션 시간 (hr)	5	7.5	10	12.5	15
24	3	2	3	2	1
48	5	4	5	5	4

표 2: 응집 점수

인큐베이션 시간 (hr)	% HAEC(세포 총수 중의 %)
인큐베이션 시간 (hr)	5	7.5	10	12.5	15
24	4	3	3	2	1
48	7	6	6	6	5

실시예 2: 다층 혈관

재료 및 방법

1. 세포 배양

1.1 평활근 세포: 일차 인간 대동맥 평활근 세포(HASMC; GIBCO/인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))를, 37℃ 및 5% CO₂에서 10% 우태 혈청(FBS), 100 U/ml 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신, 0.25 ㎍/ml의 암포테리신 B, 0.01 M의 HEPES(이들 모두 인비트로젠 코포레이션제(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재)), 50 mg/L의 프롤린, 50 mg/L의 글리신, 20 mg/L의 알라닌, 50 mg/L의 아스코르브산, 및 3 ㎍/L의 CuSO₄(이들 모두 시그마(미국 미주리주 세인트루이스 소재))로 보충된 저포도당 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; 인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재)) 중에 유지시키고 확대시켰다. 모든 연구에 계대 4 내지 8의 HASMC의 컨플루언트 배양을 사용하였다.

1.2 내피 세포: 일차 인간 대동맥 내피 세포(HAEC; GIBCO/인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))를, 2% FBS, 1 ㎍/ml의 히드로코르티손, 10 ng/ml의 인간 표피 성장 인자, 3 ng/ml의 기초 섬유아세포 성장 인자, 10 ㎍/ml의 헤파린, 100 U/ml 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신, 및 0.25 ㎍/ml의 암포테리신 B(이들 모두 인비트로젠 코포레이션제(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))로 보충된 미디엄 200(Medium 200)(인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재)) 중에 유지시키고 확대시켰다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 젤라틴(돼지 혈청에서 수득됨; 시그마(미국 미주리주 세인트루이스 소재))로 코팅된 조직 배양 처리 플라스크에서 성장시켰다. 모든 연구에 계대 4 내지 8의 HAEC의 컨플루언트 배양을 사용하였다.

1.3 섬유아세포: 일차 인간 피부 섬유아세포(HDF; GIBCO/인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))를 37℃ 및 5% CO₂에서 2% FBS, 1 ㎍/ml의 히드로코르티손, 10 ng/ml의 인간 표피 성장 인자, 3 ng/ml의 기초 섬유아세포 성장 인자, 10 ㎍/ml의 헤파린, 100 U/ml 페니실린, 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신(이들 모두 인비트로젠 코포레이션제(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))으로 보충된 미디엄 106(Medium 106)(인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재)) 중에 유지시키고 확대시켰다. 모든 연구에 계대 4 내지 8의 HDF의 컨플루언트 배양을 사용하였다.

2. 아가로스 용액 및 몰드

2.1 2% 및 4%(w/v) 아가로스 용액의 제조: 1 g 또는 2 g(각기 2% 또는 4%)의 저융점 아가로스(울트라퓨어 LMP; 인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))를 50 ml의 둘베코 인산염 완충 염액(DPBS; 인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))에 용해시켰다. 간략히, DPBS 및 아가로스를 아가로스가 완전히 용해될 때까지 꾸준히 교반하면서 고온 플레이트 상에서 85℃로 가열한다. 아가로스 용액을 125℃에서 25분 동안 증기 살균으로 무균화한다. 온도가 36.5℃ 초과로 유지되는 한, 아가로스 용액이 액상으로 남는다. 이 온도 미만에서는, 상 전이가 일어나고, 아가로스 용액의 점도가 증가하며, 아가로스가 고체 겔을 형성한다.

2.2 아가로스 몰드의 제조: 10 cm 페트리디쉬에 맞는 테플론 몰드를 이용하여 세포 실린더의 인큐베이션을 위해 아가로스 몰드를 제작하였다. 간략히, 테플론 몰드를 70% 에탄올 용액을 이용하여 예비무균화하고, 몰드를 45분 동안 UV 광에 적용하였다. 무균화된 몰드를 10 cm 페트리디쉬(VWR 인터내셔널 LLC(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))의 상단에 두어, 잘 부착시켰다. 이 집합체(테플론 몰드+페트리디쉬)를 수직으로 유지시키고, 45 ml의 예비가온된 무균 2% 아가로스 용액을 테플론 몰드와 페트리디쉬 사이의 공간에 부었다. 이어서, 집합체를 실온에서 1시간 동안 수평으로 두어, 아가로스가 완전히 겔화되도록 하였다. 겔화 후, 테플론 프린트를 제거하고, 아가로스 몰드를 DPBS를 이용하여 2회 세정한다. 이어서, 17.5 ml의 HASMC 배양 배지를 아가로스 몰드에 첨가하여 HASMC-HAEC 혼합 세포 실린더를 인큐베이션하거나, 17.5 ml의 HDF 배양 배지를 아가로스 몰드에 첨가하여 HDF 세포 실린더를 인큐베이션한다.

3. 세포 실린더

3.1 HASMC-HAEC 혼합 세포 실린더의 제작: 혼합 세포 실린더의 제조를 위해, HASMC 및 HAEC를 개별적으로 수집한 후, 소정의 비로 혼합한다. 간략히, 배양 배지를 컨플루언트 배양 플라스크로부터 제거하였고, 세포를 DPBS(1 ml/5 cm²의 성장 면적)로 세정하였다. 트립신(1 ml/15 cm²의 성장 면적; 인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))의 존재 하에 10분 동안 인큐베이션함으로써, 배양 플라스크의 표면으로부터 세포를 탈착시켰다. HASMC는 0.15% 트립신을 이용하여 탈착시킨 반면, HAEC는 0.1% 트립신을 이용하여 탈착시켰다. 인큐베이션 후, 적절한 배양 배지를 플라스크(트립신 체적 대비 2X 체적)에 첨가하였다. 세포 현탁액을 6분 동안 200 g에서 원심분리한 후, 상등액 용액을 완전히 제거하였다. 세포 펠렛을 각 배양 배지에 재현탁시키고, 혈구계수기를 이용하여 계수하였다. 적절한 체적의 HASMC 및 HAEC를 조합하여, 15% HAEC 및 잔량의 85% HASMC(총 세포 모집단 중의 %로 제시됨)를 함유하는 혼합 세포 현탁액을 수득하였다. 혼합 세포 현탁액을 5분 동안 200 g에서 원심분리한 후, 상등액 용액을 완전히 제거하였다. 혼합 세포 펠렛을 6 ml의 HASMC 배양 배지에 재현탁시키고, 20 ml의 유리 바이알(VWR 인터내셔널 LLC(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))에 옮긴 후, 60분 동안 150 rpm에서, 또한 37℃ 및 5% CO₂에서 오비탈 쉐이커에서 인큐베이션하였다. 이로써, 세포가 상호 응집하게 되고, 세포-세포 간 응집을 개시한다. 인큐베이션 후, 세포 현탁액을 15 ml의 원심분리관에 옮기고, 200 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액 배지의 제거 후, 세포 펠렛을 400 ㎕의 HASMC 배양 배지 중에 현탁시키고, 수회 상하 피펫팅하여, 모든 세포 클러스터가 확실히 파쇄되도록 하였다. 세포 현탁액을 15 ml의 원심분리관 내에 배치된 0.5 ml 마이크로퓨지 관(VWR 인터내셔널 LLC(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))에 옮긴 후, 2000 g에서 4분 동안 원심분리하여, 매우 조밀하고 압축된 세포 펠렛을 형성하였다. 상등액 매질을 흡인시키고, 흡인에 의해 세포를 모세관(OD 1.5 mm, ID 0.5 mm, L 75 mm; 드럼몬드 사이언티픽 컴퍼니(미국 펜실베니아주 브루몰 소재))에 옮겨, 길이가 50 mm인 세포 실린더를 수득하였다. 모세관 내의 세포 페이스트를 20분 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 HASMC 배지 중에 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 실린더를 모세관을 갖춘 플런저를 이용하여 모세관으로부터 (HASMC 배지로 덮힌) 아가로스 몰드의 홈으로 압출하였다. 세포 실린더를 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다.

3.2 HDF 세포 실린더의 제조: HASMC-HAEC 혼합 세포 실린더의 제조와 유사한 방법을 이용하여, HDF 실린더를 제조하였다. 간략히, 배양 배지를 컨플루언트 HDF 배양 플라스크로부터 제거하고, 세포를 DPBS(1 ml/5 cm²의 성장 면적)로 세정하였다. 트립신(1 ml/15 cm²의 성장 면적; 인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))의 존재 하에 10분 동안 인큐베이션함으로써, 배양 플라스크의 표면으로부터 세포를 탈착시켰다. 인큐베이션 후, HDF 배양 배지를 플라스크(트립신 체적 대비 2X 체적)에 첨가하였다. 세포 현탁액을 6분 동안 200 g에서 원심분리한 후, 상등액 용액을 완전히 제거하였다. 세포 펠렛을 6 ml의 HDF 배양 배지에 재현탁시키고, 20 ml 유리 바이알(VWR 인터내셔널 LLC(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))로 옮긴 후, 75분 동안 150 rpm에서, 또한 37℃ 및 5% CO₂에서 오비탈 쉐이커에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포 현탁액을 15 ml의 원심분리관에 옮기고, 200 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액 배지의 제거 후, 세포 펠렛을 400 ㎕의 HDF 배양 배지에 재현탁시키고, 수회 상하 피펫팅하여, 모든 세포 클러스터가 확실히 파쇄되도록 하였다. 세포 현탁액을 15 ml의 원심분리관 내에 배치된 0.5 ml 마이크로퓨지 관(VWR 인터내셔널 LLC(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))에 옮긴 후, 2000 g에서 4분 동안 원심분리하고, 이어서 고밀도 및 압착 세포 펠렛을 형성하였다. 상등액 매질을 흡인시키고, 흡인에 의해 세포를 모세관(OD 1.5 mm, ID 0.5 mm, L 75 mm; 드럼몬드 사이언티픽 컴퍼니(미국 펜실베니아주 브루몰 소재))에 옮겨, 길이가 50 mm인 세포 실린더를 수득하였다. 모세관 내의 세포 페이스트를 또한 37℃ 및 5% CO₂에서 20분 동안 HDF 배양 배지에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 실린더를 모세관을 갖춘 플런저를 이용하여 모세관으로부터 (HDF 배지로 덮힌) 아가로스 몰드의 홈으로 압출하였다. 세포 실린더를 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다.

4. 다층 혈관의 제작

4.1 아가로스 기판의 제조: 10 ml의 예비가온된(>40℃) 아가로스(2% w/v)를 10 cm 페트리디쉬 내로 분배함으로써, 아가로스 기판을 제작하였다. 분배 직후, 아가로스를 균일하게 전착시켜, 디쉬의 전체 기반을 덮고 균일한 층을 형성한다. 페트리디쉬를 20분 동안 실온에서 인큐베이션하여, 아가로스가 완전히 겔화되도록 한다.

4.2 다층 혈관: HDF 실린더, 및 HASMC-HAEC 혼합 세포 실린더를 이용하여, HDF의 외층 및 HASMC-HAEC의 내층으로 이루어진 혈관을 제작하였다. 도 2에 도시된 바와 같은 기하학적 배치를 이용하였다. 간략히, 24시간 동안의 인큐베이션 기간 종료 시, 성숙 HDF 및 HASMC-HAEC 실린더를 모세관에 다시 흡인시키고, 추가 사용 시까지 적절한 배양 배지에 두었다. 이하와 같이, 아가로스 막대로 이루어진 지지체 구조를 제조하였다. 예비가온된 2% 아가로스를 모세관(L=50 mm)에 흡인시키고, 냉 PBS 용액(4℃) 중에 급냉동시켰다. 5 cm 길이의 겔화된 아가로스 실린더를 (플런저를 이용하여) 모세관으로부터 압출하고, 아가로스 기판 상에 바로 배치하였다. 제2 아가로스 실린더를 제1 아가로스 실린더에 결합시키고, 이 공정을 10개의 아가로스 실린더가 침착되어 제1 층이 형성될 때까지 반복시켰다. 이 시점에, 20 ㎕의 PBS를 아가로스 실린더 위에 분배하여, 이를 습윤 상태로 유지시켰다. 또한, 6개의 아가로스 실린더를 도 2에 나와 있는 바와 같은 위치들에 층 1의 상단에 침착시켰다(층 2). 이어서, 3개의 HDF 실린더를 위치 4, 5 및 6에 침착시켜, 층 2를 완성시켰다. 각 HDF 실린더의 압출 후, 40 ㎕의 HDF 배양 배지를 침착된 실린더의 상단에 분배시켜, 후속 실린더의 침착을 도움과 동시에 세포 실린더의 탈수를 방지하였다. 그 다음, 층 3의 아가로스 실린더를 침착시킨 후, HDF 실린더를 위치 3 및 6에 침착시켰다. 구조를 HDF 배양 배지로 재습윤화한 후, HASMC-HAEC 혼합 실린더를 위치 4 및 5에 배치하였다. 후속하여, 40 ㎕의 HASMC 배지 및 40 ㎕의 HDF 배지를 세포 실린더의 상단에 분배하였다. 아가로스 실린더를 위치 1 및 7에 침착시키고, HDF 실린더는 위치 2 및 6에 침착시키며, HASMC-HAEC 혼합 실린더는 위치 3 및 5에 침착시키고, 마지막으로 4% 아가로스 실린더는 위치 4에 침착시킴으로써 층 4를 완성하였다. 아가로스 실린더를 배치한 후, HDF 실린더를 배치하고 마지막으로 HASMC-HAEC 실린더를 도 2에 도시된 위치에 높음으로써, 유사하게 층 5, 6 및 7를 완성하였다. 일단 전체 구조체가 완성되면, 0.5 ml의 따뜻한 아가로스를 구조체의 각 말단 상에 분배하여, 5분 동안 실온에서 겔화하도록 두었다. 상기 아가로스의 겔화 후, 30 ml의 HASMC 배지를 페트리디쉬에 첨가하였다(이로써, 전 구조체가 완전히 침액되도록 확실히 하였다). 구조체를 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하여, 세포 실린더 간에 응집되도록 하였다. 24시간의 종료 시, 둘러싸고 있는 아가로스 지지체 구조를 제거하였고, 응집된 다층 혈관을 수득하였다(도 3).

실시예 3: 지방 조직의 SVF 로부터의 세포를 가지는 혈관 구조체

재료 및 방법

1. 세포 배양

1.1 SVF로부터의 SMC-유사 세포: 리포아스퍼레이트를 콜라게나제로 분해한 후 단리된 세포의 접착 분획으로부터 SMC-유사 세포를 발생시켰다. 이 분해로서, 기질 혈관 분획(SVF)으로 알려진 세포의 집단을 생성한다. SVF의 세포를 표준 조직 배양 플라스틱 상에 도말할 수 있고, 접착성 세포를 또한 적절한 배양 조건으로 선택할 수 있다. 지방 조직 리포아스퍼레이트의 SVF로부터의 SMC-유사 세포를, 37℃ 및 5% CO₂에서 10% 우태 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신, 0.25 ㎍/ml의 암포테리신 B, 0.01 M의 HEPES(이들 모두 인비트로젠 코포레이션제(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재)), 50 mg/L의 프롤린, 50 mg/L의 글리신, 20 mg/L의 알라닌, 50 mg/L의 아스코르브산, 및 3 ㎍/L의 CuSO₄(이들 모두 시그마(미국 미주리주 세인트루이스 소재))로 보충된 고포도당 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; 인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재)) 중에 유지시키고 확대시켰다. 모든 연구에 계대 3 내지 8의 SVF-SMC의 컨플루언트 하위배양을 사용하였다.

1.2 SVF-EC: 기질 혈관 분획(SVF)로부터의 내피 세포를 진정 내피 세포(EC)의 일차적 단리물을 성장시키는 데 통상 사용되는 성장 배지 중에 유지시키고 확대시켰다. 구체적으로, SVF-EC를, 10% FBS, 1 ㎍/ml의 히드로코르티손, 10 ng/ml의 인간 표피 성장 인자, 3 ng/ml 기초 섬유아세포 성장 인자, 10 ㎍/ml의 헤파린, 100 U/ml 페니실린, 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 M199 중에 유지시켰다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 조직 배양-처리 플라스크 상에 성장시켰다. 모든 연구에 계대 3 내지 8의 SVF-EC의 컨플루언트 배양을 사용하였다.

2. 아가로스 용액 및 몰드

2.2 아가로스 몰드의 제조: 100 mm 페트리디쉬에 맞는 테플론 몰드를 이용하여 세포 실린더의 인큐베이션을 위해 아가로스 몰드를 제작하였다. 간략히, 테플론 몰드를 70% 에탄올 용액을 이용하여 예비무균화하고, 몰드를 45분 동안 UV 광에 적용하였다. 무균화된 몰드를 100 mm 페트리디쉬(VWR 인터내셔널 LLC(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))의 상단에 두어, 잘 부착시켰다. 이 집합체(테플론 몰드+페트리디쉬)를 수직으로 유지시키고, 45 ml의 예비가온된 무균 2% 아가로스 용액을 테플론 몰드와 페트리디쉬 사이의 공간에 부었다. 이어서, 집합체를 실온에서 1시간 동안 수평으로 두어, 아가로스가 완전히 겔화되도록 하였다. 겔화 후, 테플론 프린트를 제거하고, 아가로스 몰드를 DPBS를 이용하여 2회 세정하였다. 이어서, 17.5 ml의 HASMC 배양 배지를 아가로스 몰드에 첨가한다. 이어서, SVF-SMC:SVF-EC 혼합 세포 실린더를 인큐베이션하기 위해, 17.5 ml의 HASMC 배양 배지를 아가로스 몰드에 첨가하거나, HDF 세포 실린더를 인큐베이션하기 위해 17.5 ml의 HDF 배양 배지를 아가로스 몰드에 첨가한다.

3. 세포 실린더

3.1 SVF-SMC:SVF-EC 혼합 세포 실린더: 혼합 세포 실린더를 제조하기 위해, SVF-SMC 및 SVF-EC를 개별적으로 수집한 후, 소정의 비로 혼합한다. 간략히, 배양 배지를 컨플루언트 배양 플라스크로부터 제거하고, 세포를 DPBS(1 ml/5 cm²의 성장 면적)로 세정하였다. 트립신(인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))의 존재 하에 5 내지 10분 동안 인큐베이션함으로써, 배양 플라스크의 표면으로부터 세포를 탈착시켰다. 인큐베이션 후, 적절한 배양 배지를 플라스크에 첨가하여, 효소 활성을 소멸시켰다. 세포 현탁액을 6분 동안 200 g에서 원심분리한 후, 상등액 용액을 완전히 제거하였다. 세포 펠렛을 각 배양 배지에 재현탁시키고, 혈구계수기를 이용하여 계수하였다. 적절한 체적의 SVF-SMC 및 SVF-EC를 조합하여, 15% SVF-EC 및 잔량의 85% SVF-SMC(총 세포 모집단 중의 %로 제시됨)를 함유하는 혼합 세포 현탁액을 수득하였다. 혼합 세포 현탁액을 5분 동안 200 g에서 원심분리한 후, 상등액 용액을 완전히 제거하였다. 혼합 세포 펠렛을 6 ml의 SVF-SMC 배양 배지에 재현탁시키고, 20 ml의 유리 바이알(VWR 인터내셔널 LLC(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))에 옮긴 후, 60분 동안 150 rpm에서, 또한 37℃ 및 5% CO₂에서 오비탈 쉐이커에서 인큐베이션하였다. 이로써, 세포가 상호 응집하게 되고, 세포-세포 간 응집을 개시한다. 인큐베이션 후, 세포 현탁액을 15 ml의 원심분리관에 옮기고, 200 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액 배지의 제거 후, 세포 펠렛을 400 ㎕의 SVF-SMC 배양 배지 중에 현탁시키고, 수회 상하 피펫팅하여, 모든 세포 클러스터가 확실히 파쇄되도록 하였다. 세포 현탁액을 15 ml의 원심분리관 내에 배치된 0.5 ml 마이크로퓨지 관(VWR 인터내셔널 LLC(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))에 옮긴 후, 2000 g에서 4분 동안 원심분리하여, 매우 조밀하고 압축된 세포 펠렛을 형성하였다. 상등액 매질을 흡인시키고, 흡인에 의해 세포를 모세관(OD 1.25 mm, ID 0.266 mm, L 75 mm; 드럼몬드 사이언티픽 컴퍼니(미국 펜실베니아주 브루몰 소재))에 옮겨, 길이가 50 mm인 세포 실린더를 수득하였다. 모세관 내의 세포 페이스트를 20분 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 SVF-SMC 배지 중에 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 실린더를 모세관을 갖춘 플런저를 이용하여 모세관으로부터 (SVF-SMC 배지로 덮힌) 아가로스 몰드의 홈으로 압출하였다. 세포 실린더를 6 내지 12시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다.

4. 혈관의 제작

4.1 아가로스 기판의 제조: 12 ml의 예비가온된(>60℃) 아가로스(2% w/v)를 10 cm 페트리디쉬 내로 분배함으로써, 아가로스 기판을 제작하였다. 분배 직후, 아가로스를 균일하게 전착시켜, 디쉬의 전체 기반을 덮고 균일한 층을 형성한다. 페트리디쉬를 20분 동안 실온에서 인큐베이션하여, 아가로스가 완전히 겔화되도록 한다.

4.2 혈관: SVF-SMC:SVF-EC 혼합 세포 실린더로 이루어진 혈관을 제작하였다. 간략히, 6시간 동안의 인큐베이션 기간 종료 시, 성숙 SVF-SMC 및 SVF-EC 실린더를 모세관에 다시 흡인시키고, 추가 사용 시까지 적절한 배양 배지에 두었다. 이하와 같이, 아가로스 막대로 이루어진 지지체 구조를 제조하였다. 예비가온된 2% 아가로스를 모세관(L=50 mm)에 흡인시키고, 냉 PBS 용액(4℃) 중에 급냉동시켰다. 5 cm 길이의 겔화된 아가로스 실린더를 (플런저를 이용하여) 모세관으로부터 압출하고, 아가로스 기판 상에 바로 배치하였다. 제2 아가로스 실린더를 제1 아가로스 실린더에 결합시키고, 이 공정을 적절한 수의 아가로스 실린더를 압출하여 최종 관형 기하학을 수용하도록 할 때까지 반복시켰다. 관형 세포 구조체의 중심에 있는 아가로스 실린더를 4% 아가로스를 포함하는 층별 인쇄 공정을 이용하여, SVF-SMC 및 SVF-EC 다세포 실린더를 함유하는 관형 관 구조체를 제작하였다. 일단 전체 구조체가 완성되면, 0.5 ml의 따뜻한 아가로스를 구조체의 각 말단 상에 분배하여, 5분 동안 실온에서 겔화하도록 두었다. 상기 아가로스의 겔화 후, 30 ml의 SVF-SMC 배지를 페트리디쉬에 첨가하였다(이로써, 전 구조체가 완전히 침액되도록 확실히 하였다). 구조체를 12 내지 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하여, 인접 세포 실린더 간에 응집되도록 하였다. 12 내지 24시간의 종료 시, 둘러싸고 있는 아가로스 지지체 구조를 제거하였고, 응집된 혈관을 단리하였다.

실시예 4. HASMC - HDF - HAEC 다세포 실린더를 가지는 혈관 구조체.

재료 및 방법

1. 세포 배양

1.2 내피 세포: 일차 인간 대동맥 내피 세포(HAEC; GIBCO/인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))를, 10% FBS, 1 ㎍/ml의 히드로코르티손, 10 ng/ml의 인간 표피 성장 인자, 3 ng/ml의 기초 섬유아세포 성장 인자, 10 ㎍/ml의 헤파린, 100 U/ml 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신, 및 0.25 ㎍/ml의 암포테리신 B(이들 모두 인비트로젠 코포레이션제(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))로 보충된 미디엄 199(Medium 199)(인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재)) 중에 유지시키고 확대시켰다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 젤라틴(돼지 혈청에서 수득됨; 시그마(미국 미주리주 세인트루이스 소재))로 코팅된 조직 배양 처리 플라스크에서 성장시켰다. 모든 연구에 계대 4 내지 8의 HAEC의 컨플루언트 배양을 사용하였다.

1.3 섬유아세포: 일차 인간 피부 섬유아세포(HDF; GIBCO/인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))를, 37℃ 및 5% CO₂에서 2% FBS, 1 ㎍/ml의 히드로코르티손, 10 ng/ml의 인간 표피 성장 인자, 3 ng/ml의 기초 섬유아세포 성장 인자, 10 ㎍/ml의 헤파린, 100 U/ml 페니실린, 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신(이들 모두 인비트로젠 코포레이션제(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))로 보충된 미디엄 106(인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재)) 중에 유지시키고 확대시켰다. 모든 연구에 계대 4 내지 8의 HDF의 컨플루언트 배양을 사용하였다.

2. 아가로스 용액 및 몰드

2.2 아가로스 몰드의 제조: 10 cm 페트리디쉬에 맞는 테플론 몰드를 이용하여 세포 실린더의 인큐베이션을 위해 아가로스 몰드를 제작하였다. 간략히, 테플론 몰드를 70% 에탄올 용액을 이용하여 예비무균화하고, 몰드를 45분 동안 UV 광에 적용하였다. 무균화된 몰드를 10 cm 페트리디쉬(VWR 인터내셔널 LLC(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))의 상단에 두어, 잘 부착시켰다. 이 집합체(테플론 몰드+페트리디쉬)를 수직으로 유지시키고, 45 ml의 예비가온된 무균 2% 아가로스 용액을 테플론 몰드와 페트리디쉬 사이의 공간에 부었다. 이어서, 집합체를 실온에서 1시간 동안 수평으로 두어, 아가로스가 완전히 겔화되도록 하였다. 겔화 후, 테플론 프린트를 제거하였고, 아가로스 몰드를 DPBS를 이용하여 2회 세정하였다. 이어서, 17.5 ml의 HASMC 배양 배지를 아가로스 몰드에 첨가하여 혼합 세포 실린더를 인큐베이션한다.

3. HASMC-HDF-HAEC 실린더

3.1 HASMC-HDF-HAEC 혼합 세포 실린더의 제작: 혼합 세포 실린더를 제조하기 위해, HASMC, HDF 및 HAEC를 개별적으로 수집한 후, 소정의 비(예를 들어, 70:25:5의 HASMC:HDF:HAEC 비)로 혼합하였다. 간략히, 배양 배지를 컨플루언트 배양 플라스크로부터 제거하였고, 세포를 DPBS(1 ml/10 cm²의 성장 면적)로 세정하였다. 트립신(1 ml/15 cm²의 성장 면적; 인비트로젠 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))의 존재 하에 10분 동안 인큐베이션함으로써, 배양 플라스크의 표면으로부터 세포를 탈착시켰다. HASMC 및 HDF는 0.15% 트립신을 이용하여 탈착시킨 반면, HAEC는 0.1% 트립신을 이용하여 탈착시켰다. 인큐베이션 후, 적절한 배양 배지를 플라스크(트립신 체적 대비 2X 체적)에 첨가하였다. 세포 현탁액을 6분 동안 200 g에서 원심분리한 후, 상등액 용액을 완전히 제거하였다. 세포 펠렛을 각 배양 배지에 재현탁시키고, 혈구계수기를 이용하여 계수하였다. 적절한 체적의 HASMC, HDF 및 HAEC를 조합하여, 혼합 세포 현탁액을 수득하였다. 혼합 세포 현탁액을 5분 동안 200 g에서 원심분리한 후, 상등액 용액을 흡인하였다. 혼합 세포 펠렛을 6 ml의 HASMC 배양 배지에 재현탁시키고, 20 ml의 유리 바이알(VWR 인터내셔널 LLC(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))에 옮긴 후, 60분 동안 150 rpm에서, 또한 37℃ 및 5% CO₂에서 오비탈 쉐이커에서 인큐베이션하였다. 이로써, 세포가 상호 응집하게 되고, 세포-세포 간 응집을 개시한다. 인큐베이션 후, 세포 현탁액을 15 ml의 원심분리관에 옮기고, 200 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액 배지의 제거 후, 세포 펠렛을 400 ㎕의 HASMC 배양 배지 중에 현탁시키고, 수회 상하 피펫팅하여, 모든 세포 클러스터가 확실히 파쇄되도록 하였다. 세포 현탁액을 15 ml의 원심분리관 내에 배치된 0.5 ml 마이크로퓨지 관(VWR 인터내셔널 LLC(미국 펜실베니아주 웨스트체스터 소재))에 옮긴 후, 2000 g에서 4분 동안 원심분리하여, 매우 조밀하고 압축된 세포 펠렛을 형성하였다. 상등액 매질을 흡인시키고, 흡인에 의해 세포를 모세관(OD 1.25 mm, ID 0.266 mm, L 75 mm; 드럼몬드 사이언티픽 컴퍼니(미국 펜실베니아주 브루몰 소재))에 옮겨, 길이가 50 mm인 세포 실린더를 수득하였다. 모세관 내의 세포 페이스트를 20분 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 HASMC 배지 중에 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 실린더를 모세관을 갖춘 플런저를 이용하여 모세관으로부터 (HASMC 배지로 덮힌) 아가로스 몰드의 홈으로 압출하였다. 세포 실린더를 6 내지 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다.

4. 다세포 실린더(HASMC:HDF:HAEC)를 갖는 혈관의 제조

4.2 다세포 혈관: 다세포 실린더를 이용하여 3개 모든 세포 유형, HASMC:HDF:HAEC를 함유하는 실린더로 이루어진 혈관을 제작하였다. 각기 6 또는 12개의 세포 실린더 및 1 또는 7개의 중심 아가로스 실린더를 포함하는 기하학적 배치를 이용하였다. 간략히, 6시간 내지 12시간 동안의 인큐베이션 기간의 종료 시, 성숙 HASMC-HDF-HAEC 실린더를 모세관에 다시 흡인시키고, 추가 사용 시까지 적절한 배양 배지에 두었다. 이하와 같이, 아가로스 막대로 이루어진 지지체 구조를 제조하였다. 예비가온된 2% 아가로스를 모세관(L=50 mm)에 흡인시키고, 냉 PBS 용액(4℃) 중에 급냉동시켰다. 5 cm 길이의 겔화된 아가로스 실린더를 (플런저를 이용하여) 모세관으로부터 압출하고, 아가로스 기판 상에 바로 배치하였다. 제2 아가로스 실린더를 제1 아가로스 실린더에 결합시키고, 이 공정을 7 또는 10개의 아가로스 실린더가 침착되어 제1 층이 형성될 때까지 반복시켰다. 6개의 다세포 실린더 및 1개의 중심 아가로스 실린더를 가지는 혈관의 제작이 더욱 상세히 기재된다. 이 시점에, 20 ㎕의 PBS를 아가로스 실린더 위에 분배하여, 이를 수화된 상태로 유지시켰다. 또한, 2개의 아가로스 실린더는 층 1의 상단에 침착시키고, 제1 아가로스 실린더는 맨좌측 말단에 침착시키며, 제2 아가로스 실린더는 그것의 우측에 침착시켰다. 이어서, 2개의 다세포 HASMC-HDF-HAEC 실린더를 층 2 내 2개의 아가로스 실린더의 우측에 침착시켰다. 후속하여, 20 ㎕의 HASMC 배지를 세포 실린더의 상단에 분배하였다. 이어서, 추가 2개의 아가로스 실린더를 2개의 다세포 실린더의 우측에 침착시켰다. 층 3을 층의 맨좌측 말단에 있는 아가로스 실린더와 함께 구성시켰다. 다세포 실린더를 실린더의 우측에 침착시켰다. 이어서, 4% 아가로스 실린더를 다세포 실린더의 우측에 침착시켰다. 또 다른 다세포 실린더를 4% 아가로스 실린더의 우측에 침착시켰다. 마지막으로, 또 다른 2% 아가로스 실린더를 제2 다세포 실린더의 우측에 침착시켰다. 후속하여, 20 ㎕의 HASMC 배지를 세포 실린더의 상단에 분배하였다. 층 4를 맨우측 말단에 있는 2% 아가로스 실린더와 함께 개시한 후, 2개의 세포 실린더를 아가로스 실린더의 우측에 침착시켰다. 층 4을, 최종 아가로스 실린더를 2개의 다세포 실린더의 우측에 두도록 하여 마무리하였다. 후속하여, 20 ㎕의 HASMC 배지를 세포 실린더의 상단에 분배하였다. 층 5를 3개의 아가로스 실린더를 층 4의 상단에 침착시킴으로써 구성시켰다. 일단 전체 구조체가 완성되면, 0.5 ml의 따뜻한 아가로스를 구조체의 각 말단 상에 분배하여, 5분 동안 실온에서 겔화하도록 두었다. 상기 아가로스의 겔화 후, 30 ml의 HASMC 배지를 페트리디쉬에 첨가하였다(이로써, 전 구조체가 완전히 침액되도록 확실히 하였다). 구조체를 12 내지 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하여, 세포 실린더 간에 응집되도록 하였다. 12 내지 24시간의 종료 시, 둘러싸고 있는 아가로스 지지체 구조를 제거하였고, 응집된 다층 혈관을 수득하였다(도 3).

Claims

분화된 성인 섬유아세포의 하나 이상의 층, 및 분화된 성인 평활근 세포의 하나 이상의 층을 포함하는 조작된 다층 혈관(engineered multilayered vascular tube)으로서,
임의의 층은 분화된 성인 내피 세포를 추가로 포함하고,
상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 1:99 내지 약 45:55인 점; (b) 조작된 다층 혈관이 순응성(compliant)을 갖는다는 점; (c) 조작된 다층 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (d) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (e) 조작된 다층 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며,
단, 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 조작된 다층 혈관.
제1항에 있어서, 파열 강도는 생리학적 혈압을 견디기에 충분한 것인 조작된 다층 혈관.
제1항에 있어서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 5:95 내지 약 25:75인 것인 조작된 다층 혈관.
제3항에 있어서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 15:85인 것인 조작된 다층 혈관.
제1항에 있어서, 조작된 다층 혈관의 내경은 약 0.5 mm 이하인 것인 조작된 다층 혈관.
제1항에 있어서, 조작된 다층 혈관의 두께는 관의 길이에 걸쳐 실질적으로 균일한 것인 조작된 다층 혈관.
제1항에 있어서, 조작된 다층 혈관은 미분화된 성인 섬유아세포, 미분화된 성인 평활근 세포, 및/또는 미분화된 성인 내피 세포가 실질적으로 없는 것인 조작된 다층 혈관.
제1항에 있어서, 관은 분지된 구조를 가지는 것인 조작된 다층 혈관.
제2항에 있어서, 약물 시험 또는 심혈관 장치 시험에 사용하기 위한 조작된 다층 혈관.
제9항에 있어서, 심혈관 장치는 스텐트인 것인 조작된 다층 혈관.
제2항에 있어서, 손상된 혈관을 수복하는 데 사용하기 위한 조작된 다층 혈관.
제2항에 있어서, 관상 또는 말초성 우회술(coronary or peripheral bypass) 또는 동정맥류 통로(arteriovenous access)를 필요로 하는 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 조작된 다층 혈관.
제2항에 있어서, 말기 신질환, 당뇨병, 동맥경화증, 또는 선천성 심장 출생 기형(birth deffect)을 가지는 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 조작된 다층 혈관.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 다층 혈관의 섬유아세포, 평활근 세포, 및/또는 내피 세포는 자가성(autologous)을 가지는 것인 조작된 다층 혈관.
제1항에 있어서, 관은 비지배성(non-innervated)을 가지는 것인 조작된 다층 혈관.
제1항에 있어서, 상기 분화된 성인 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포인 것인 조작된 다층 혈관.
조작된 다층 혈관의 형성 방법으로서,
하나 이상의 충전제 기질체, 세포들이 상호 응집되어 있는 평활근 세포의 하나 이상의 다세포체, 세포들이 상호 응집되어 있는 내피 세포의 하나 이상의 다세포체, 및 세포들이 상호 응집되어 있는 섬유아세포 세포의 하나 이상의 다세포체를 위치시켜서 원하는 혈관 구조를 형성시키는 단계로서, 여기서 하나 이상의 충전제 기질체는 관의 루멘을 형성하고, 복수개의 충전제 기질체는 관을 둘러싸고 있는 것인 단계; 및
조작된 다층 혈관의 다세포체를 응집시키는 단계
를 포함하고, 단, 어떠한 때에도 예비형성된 스카폴드는 사용되지 않아야 하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 조작된 다층 혈관 내에서의 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 5:95 내지 약 25:75인 것인 방법.
제17항에 있어서, 관의 루멘의 직경은 약 6 mm 이하인 것인 방법.
제17항에 있어서, 성숙 체임버에서 조작된 다층 혈관을 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 다세포체 중 하나 이상은 신장형(elongate)인 것인 방법.
분화된 성인 섬유아세포의 외층, 및 분화된 성인 평활근 세포 및 분화된 성인 내피 세포의 하나 이상의 내층을 포함하는 조작된 다층 혈관으로서,
상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 1:99 내지 약 45:55인 점; (b) 조작된 다층 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (c) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (d) 조작된 다층 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며,
단, 조작된 다층 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 조작된 다층 혈관.
제22항에 있어서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 5:95 내지 약 25:75인 것인 조작된 다층 혈관.
제23항에 있어서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 15:85인 것인 조작된 다층 혈관.
제22항에 있어서, 조작된 다층 혈관의 내경은 약 0.5 mm 이하인 것인 조작된 다층 혈관.
제22항에 있어서, 관은 분지된 구조를 가지는 것인 조작된 다층 혈관.
제22항에 있어서, 관의 두께는 관의 길이를 따라 실질적으로 균일한 것인 조작된 다층 혈관.
제22항에 있어서, 미분화된 성인 섬유아세포, 미분화된 성인 평활근 세포, 및/또는 미분화된 성인 내피 세포가 실질적으로 없는 것인 조작된 다층 혈관.
제22항에 있어서, 관은 비지배성을 가지는 것인 조작된 다층 혈관.
제22항에 있어서, 상기 분화된 성인 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포인 것인 조작된 다층 혈관.
분화된 성인 평활근 세포, 분화된 성인 내피 세포, 및 분화된 성인 섬유아세포를 포함하는 조작된 혈관으로서,
상기 세포들은 상호 응집되어 있고,
상기 관은 다음의 특성들: (a) 내피 세포 대 평활근 세포의 비가 약 1:99 내지 약 45:55인 점; (b) 조작된 혈관의 내경이 약 6 mm 이하인 점; (c) 상기 관의 길이가 약 30 cm 이하인 점; 및 (d) 조작된 혈관의 두께가 관의 영역을 따라 실질적으로 균일하다는 점을 가지며,
단, 조작된 혈관은 어떠한 예비형성된 스카폴드도 없어야 하는 것인 조작된 혈관.
제31항에 있어서, 파열 강도는 생리학적 혈압을 견디기에 충분한 것인 조작된 다층 혈관.
제31항에 있어서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 5:95 내지 약 25:75인 것인 조작된 다층 혈관.
제33항에 있어서, 내피 세포 대 평활근 세포의 비는 약 15:85인 것인 조작된 다층 혈관.
제31항에 있어서, 조작된 다층 혈관의 두께는 관의 길이에 걸쳐 실질적으로 균일한 것인 조작된 다층 혈관.
제31항에 있어서, 조작된 다층 혈관은 미분화된 성인 섬유아세포, 미분화된 성인 평활근 세포, 및/또는 미분화된 성인 내피 세포가 실질적으로 없는 것인 조작된 다층 혈관.
제31항에 있어서, 관은 분지된 구조를 가지는 것인 조작된 다층 혈관.
제31항에 있어서, 관은 비지배성을 가지는 것인 조작된 다층 혈관.
제31항에 있어서, 상기 분화된 성인 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포인 것인 조작된 다층 혈관.