CN102883680A - 多层血管 - Google Patents

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Abstract

本文描述工程化多层血管，包含至少一层分化成体成纤维细胞、至少一层分化成体平滑肌细胞，其中任一层进一步包含分化成体内皮细胞，其中所述管具有下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约1∶99至约45∶55；(b)该管具顺应性；(c)该管的内径为约6mm或更小；(d)该管的长度为至多约30cm；及(e)该管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是该工程化多层血管没有任何预成型架。本文还描述形成所述管的方法及所述管的用途，包括用于治疗患者的方法，包含提供这样的管给需要的患者。

Description

多层血管
相关申请的交叉参考
本申请要求2010年3月16日提交的美国临时案申请号61/314,238的权益；以及2010年5月26日提交的英国申请号1008781.5，该等申请的公开内容在此全文并入作为参考。
发明背景
在美国，有对于供动脉病变之置换血管或置换腹部器官的需要，特别是供小直径的血管移植物。由于高血栓形成率，具小于6毫米直径的小动脉无法以人工材料置换(Connolly等人(1988)；Greisler等人(1988))。
发明概述
本文描述工程化多层血管、制造此等管的方法以及此等管的治疗、诊断及研究用途。本文所述的工程化血管没有任何预成型架，因为预成型架未使用在本文所述之工程化多层血管的制造中。本创新，除了其他方面，还提供可行的工程化多层血管，其没有预成型架材料，因此，为非工程化多层血管在治疗上可接受的另一项选择。
在一方面，本文描述工程化多层血管，包含至少一层分化成体成纤维细胞、至少一层分化成体平滑肌细胞，其中任一层进一步包含分化成体内皮细胞，其中所述管具有下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约1：99至约45：55；(b)该工程化多层血管具顺应性；(c)该工程化多层血管的内径为约6mm或更小；(d)该管的长度至多约30cm；及(e)该工程化多层血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是工程化多层血管没有任何预成型架。
在一实施方式中，成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞为自体的。在另一实施方式中，胀裂强度足以承受生理血压。仍在另一实施方式中，该管的内腔由可移动式形成内腔的填充体形成。仍在另一实施方式中，内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约5：95至约25：75。仍在另一实施方式中，内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约15：85。仍在另一实施方式中，工程化多层血管具顺应性。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的内径为约6mm或更小。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的内径为约0.5mm或更小。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的厚度在该管的一个区域上为实质上相同。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的厚度在该管的长度上为实质上相同。仍在另一实施方式中，该管实质上没有非分化成体成纤维细胞。仍在另一实施方式中，该管实质上没有非分化成体平滑肌细胞。仍在另一实施方式中，该管实质上没有非分化成体内皮细胞。仍在另一实施方式中，该管具有分支结构。仍在另一实施方式中，该管进一步包含雌性粒子。仍在另一实施方式中，该管用于旁路移植术。仍在另一实施方式中，该管用于动静脉通路(arteriovenousaccess)。仍在另一实施方式中，该管用于药物测试。仍在另一实施方式中，该管用于心血管装置测试。仍在另一实施方式中，该心血管装置为一个支架。在一些实施方式中，该工程化多层血管不受神经支配。在一些实施方式中，所述分化成体成纤维细胞为非血管成纤维细胞。
在另一方面为形成工程化多层血管的方法，包含：放置至少一个填料基质体，至少一个平滑肌细胞的多细胞体，其中该等细胞互相附著，至少一个内皮细胞的多细胞体，其中该等细胞互相附著，及至少一个成纤维细胞的多细胞体，其中该等细胞互相附著，以形成所要的血管结构，其中一或多个填料基质体形成该管的内腔，且数个填料基质体包围著该管；且使得该等工程化多层血管的多细胞体附著；条件是在任何时候未使用预成型架。
在一实施方式中，在该工程化多层血管中内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约1：99至约45：55。在另一实施方式中，在该工程化多层血管中内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约5：95至约25：75。仍在另一实施方式中，在该工程化多层血管中内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约15：85。仍在另一实施方式中，该管的内腔为约6mm或更小。仍在另一实施方式中，该管的内腔为约0.5mm或更小。仍在另一实施方式中，平滑肌细胞、内皮细胞及/或成纤维细胞为自体的。仍在另一实施方式中，平滑肌细胞、内皮细胞及/或成纤维细胞为人类成体分化细胞。仍在另一实施方式中，该方法进一步包含在成熟室(maturation chamber)中培养该等工程化多层血管。在一些实施方式中，一或多种细胞的多细胞体呈长状。在一些实施方式中，一或多种细胞的多细胞体为实质上呈球形。
在另一方面为工程化多层血管，包含至少一层分化成体成纤维细胞、至少一层分化成体平滑肌细胞，其中任一层进一步包含分化成体内皮细胞，其中所述管具有下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约5：95至约25：75；(b)工程化多层血管具顺应性；(c)该工程化多层血管的内径为约6mm或更小；(d)该管的长度至多约30cm；及(e)该工程化多层血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是工程化多层血管没有任何预成型架。
在一实施方式中，胀裂强度足以承受生理血压。在另一实施方式中，该管的内腔由形成内腔的填充体来形成。仍在另一实施方式中，内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约15：85。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的厚度在该管的全长上为实质上相同。仍在另一实施方式中，该管进一步包含雌性粒子。仍在另一实施方式中，该管具有分支结构。仍在另一实施方式中，该管用于旁路移植术。仍在另一实施方式中，该管用于动静脉通路。仍在另一实施方式中，该管用于药物测试。仍在另一实施方式中，该管用于心血管装置测试。仍在另一实施方式中，该心血管装置为一个支架。在一些实施方式中，该工程化多层血管不受神经支配。在一些实施方式中，所述分化成体成纤维细胞为非血管成纤维细胞。
在另一方面为工程化多层血管，包含一层分化成体成纤维细胞的外层、至少一层分化成体平滑肌细胞及分化成体内皮细胞的内层，且其中所述管具有下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约1：99至约45：55；(b)该工程化多层血管的内径为约6mm或更小；(c)该管的长度至多约30cm；及(d)该工程化多层血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是该工程化多层血管没有任何预成型架。
在一实施方式中，内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约5：95至约25：75。在另一实施方式中，内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约15：85。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的内径为约6mm或更小。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的内径为约0.5mm或更小。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管具顺应性。仍在另一实施方式中，该管具有分支结构。仍在另一实施方式中，该管的长度为约1cm至约30cm。仍在另一实施方式中，该管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同。仍在另一实施方式中，该管的厚度沿著该管的长度为实质上相同。仍在另一实施方式中，该管具有外部支撑结构。仍在另一实施方式中，该管实质上没有非分化成体成纤维细胞。仍在另一实施方式中，该管实质上没有非分化成体平滑肌细胞。仍在另一实施方式中，该管实质上没有非分化成体内皮细胞。仍在另一实施方式中，该管包含雌性粒子。在一些实施方式中，该工程化多层血管不受神经支配。在一些实施方式中，所述分化成体成纤维细胞为非血管成纤维细胞。
在另一方面用于治疗患者的方法，包含提供工程化多层血管，其包含至少一层分化成体成纤维细胞、至少一层分化成体平滑肌细胞，其中任一层进一步包含分化成体内皮细胞，其中所述管具有下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约1：99至约45：55；(b)该工程化多层血管具顺应性；(c)该工程化多层血管的内径为约6mm或更小；(d)该管的长度至多约30cm；及(e)该工程化多层血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是该工程化多层血管没有任何预成型架。
在一实施方式中，该工程化多层血管的成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞为自体的。在另一实施方式中，该工程化多层血管的内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约15：85。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的胀裂强度足以承受生理血压。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的内腔由形成内腔的填充体形成。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管具顺应性。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的内径为约6mm或更小。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的内径为约0.5mm或更小。仍在另一实施方式中，该管的长度为从约1cm至约30cm。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的厚度沿著该管的长度为实质上相同。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管具有分支结构。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管进一步包含雌性粒子。在一些实施方式中，该工程化多层血管不受神经支配。在一些实施方式中，所述分化成体成纤维细胞为非血管成纤维细胞。仍在另一实施方式中，该患者需要冠状动脉或外周血管旁路术。仍在另一实施方式中，该患者需要血液透析。仍在另一实施方式中，需要之患者患有终末期肾病。仍在另一实施方式中，需要之患者患有糖尿病。仍在另一实施方式中，需要之患者患有动脉硬化。仍在另一实施方式中，需要之患者患有先天性心脏出生缺陷(congenital heart birth defects)。
在另一方面为工程化多层血管，包含一层分化成体成纤维细胞的外层，至少一层分化成体平滑肌细胞及分化成体内皮细胞的内层，且具有下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约5：95至约25：75；(b)该工程化多层血管具顺应性；(c)该工程化多层血管的内径为约6mm或更小；(d)该管的长度为约1cm至约30cm；及(e)该工程化多层血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是该工程化多层血管没有任何预成型架。
在一实施方式中，胀裂强度足以承受生理血压。在另一实施方式中，该管由形成内腔的填充体形成。在另一实施方式中，内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约15：85。在另一实施方式中，该工程化多层血管的厚度在该管的全长上为实质上相同。在另一实施方式中，该管实质上没有非分化成体成纤维细胞。在另一实施方式中，该管实质上没有非分化成体平滑肌细胞。在另一实施方式中，该管实质上没有非分化成体内皮细胞。在另一实施方式中，该管包含雌性粒子。在另一实施方式中，该管具有分支结构。在一些实施方式中，该工程化多层血管不受神经支配。在一些实施方式中，所述分化成体成纤维细胞为非血管成纤维细胞。在另一实施方式中，该管用于旁路移植术。在另一实施方式中，该管用于动静脉通路。在另一实施方式中，该管用于药物测试。在另一实施方式中，该管用于心血管装置测试。在另一实施方式中，该心血管装置为一个支架。在一实施方式中，在该工程化多层血管中内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约5：95至约25：75。在另一实施方式中，在工程化多层血管中内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约15：85。在另一实施方式中，该管的内腔为约6mm或更小。在另一实施方式中，平滑肌细胞、内皮细胞及/或成纤维细胞为人类成体分化细胞。在另一实施方式中，该方法包含在成熟室中培养该等工程化多层血管。
在另一方面为工程化多层血管，包含一层分化成体成纤维细胞的外层、至少一层分化成体平滑肌细胞及分化成体内皮细胞的内层，且具有下列特征：(a)可移动式形成内腔的填充体；(b)内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约5：95至约25：75；(c)该工程化多层血管的内径为约6mm或更小；(d)该管的长度为约1cm至约30cm；(e)该工程化多层血管的厚度为实质上相同；及(f)外部支撑结构；条件是该工程化多层血管不受神经支配且没有任何预成型架。
在一实施方式中，将该外部支撑结构移出。在另一实施方式中，将形成内腔的填充体移出。在另一实施方式中，内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约15：85。在另一实施方式中，该工程化多层血管具顺应性。在另一实施方式中，该管具有分支结构。
在另一方面为工程化血管，包含分化成体平滑肌细胞、分化成体内皮细胞及分化成体成纤维细胞，其中所述细胞互相附著，且其中所述管具有下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约1：99至约45：55；(b)该工程化血管的内径为约6mm或更小；(c)该管的长度至多约30cm；及(d)该工程化血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是该工程化血管没有任何预成型架。
在一些实施方式中，分化成体平滑肌细胞、分化成体内皮细胞及分化成体成纤维细胞均匀分布在该工程化血管中。在其他实施方式中，分化成体平滑肌细胞、分化成体内皮细胞及分化成体成纤维细胞非均匀地分布在该工程化血管中。在进一步实施方式中，该等细胞分布在层中。尚在进一步实施方式中，一或多层的特征在于与一或其他层有不同的细胞类型分布。在一些实施方式中，在该工程化血管形成的时候该等细胞为非均匀地分布。在一些实施方式中，一或多种细胞类型进行某程度上的迁移或分离，因此造成非均匀分布。
在一些实施方式中，该工程化血管具顺应性。在一实施方式中，成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞为自体的。在另一实施方式中，胀裂强度足以承受生理血压。仍在另一实施方式中，该管的内腔由可移动式形成内腔的填充体所形成。仍在另一实施方式中，内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约5：95至约25：75。仍在另一实施方式中，内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约15：85。仍在另一实施方式中，工程化多层血管具顺应性。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的内径为约6mm或更小。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的内径为约0.5mm或更小。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的厚度在该管的区域上为实质上相同。仍在另一实施方式中，该工程化多层血管的厚度在该管的长度上为实质上相同。仍在另一实施方式中，该管实质上没有非分化成体成纤维细胞。仍在另一实施方式中，该管实质上没有非分化成体平滑肌细胞。仍在另一实施方式中，该管实质上没有非分化成体内皮细胞。仍在另一实施方式中，该管具有分支结构。仍在另一实施方式中，该管进一步包含雌性粒子。仍在另一实施方式中，该管用于旁路移植术。仍在另一实施方式中，该管用于动静脉通路。仍在另一实施方式中，该管用于药物测试。仍在另一实施方式中，该管用于心血管装置测试。仍在另一实施方式中，该心血管装置为一个支架。在一些实施方式中，该工程化多层血管不受神经支配。在一些实施方式中，所述分化成体成纤维细胞为非血管成纤维细胞。
如本文所用的术语“附著”、“已附著”及“附著性”系指可结合细胞、细胞聚集体、多细胞体及/或层的细胞-细胞粘附特性，该等术语与“融合”、“已融合”及“融合性”可交换使用。
如本文所用的术语“架”系指合成架(如聚合物架)、非合成架(如细胞外基质层)及任何其他类型的与该工程化多层血管之物理结构成一体且无法从该管移出的预成型架。
附图简述
本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考阐述了利用本发明之原理的说明性实施方式的以下详细描述及附图，将对本发明的特征和优点有更佳地理解，附图中：
图1说明HASMC-HAEC(人类主动脉平滑肌细胞-人类主动脉内皮细胞)混合细胞柱的苏木素及伊红染色。
图2说明使用HDF多细胞体及HASMC-HAEC混合多细胞体来构建具有HDF外层及HASMC-HAEC内层的血管的几何配置。
图3A说明未分离的多层血管。
图3B说明分离的多层血管，在24小时培育后包于琼脂糖支撑结构内的柱体之间经由附著形成。
发明详述
本发明系关于再生医学及组织工程学的领域。更具体地说，本发明系关于多层血管的制造，该多层血管包含成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞，并具有特定特征。
组织工程学提供因对于器官置换的需求增加再加上可移植器官的缺乏所造成之问题的解决方案。(Langer及Vacanti(1993))。在美国，有对于供动脉病变之置换血管或置换腹部器官的需要，特别是对于小直径的血管移植物。同时也认知到对于供研究用之改良血管的需要。由于高血栓形成率(Connolly等人(1988)；Greisler等人(1988))，具小于5至6mm直径的小动脉无法以人工材料置换。组织工程化的血管移植物提供了一个解决天然可移植性血管缺乏的可行方法，以及在例如心血管装置测试及药物测试上的应用。
天然血管包含三层：由内皮细胞组成的内层(intima)、血管平滑肌的中层(media)及成纤维细胞的外层(adventitia)。理想之组织工程化的血管移植物应没有合成架，因其可能会影响移植物的长程反应或干扰其主要生物功能。本文所述的多层血管可达成这个结果。小直径的组织工程化血管移植物需要具有约6mm或更小的内直径。本文所述的多层血管可达成这个结果(以及根据需要之较大直径)。其他人还未能够创造出无合成架且可承受生理血压的顺应性移植物。本文所述的多层血管达成这个结果。其他人还未能够创造一种血管构建物，其含有三种存在于血管组织中的主要细胞类型，成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞，且不具有支撑性生物材料。本文所述的多层血管达成这个结果。
包含成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞、且具顺应性、为实质上相同、没有合成架、并具有约0.5mm或更少内径的多层血管构建管的集合尚未被完成。本文所述的多层血管达成这个结果。
本文描述工程化多层血管，包含至少一层分化成体成纤维细胞、至少一层分化成体平滑肌细胞，其中任一层进一步包含分化成体内皮细胞，其中所述管具有至少一项下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约1：99至约45：55；(b)该工程化多层血管具顺应性；(c)该工程化多层血管的内径为约6mm或更小；(d)该管的长度至多约30cm；及(e)该工程化多层血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是该工程化多层血管没有任何预成型架。在特定的实施方式中，该工程化多层血管具有至少两项这些特征。仍在更特定的实施方式中，该工程化多层血管具有至少三项这些特征。甚至在更特定的实施方式中，该工程化多层血管具有至少四项这些特征。甚至还在更特定的实施方式中，该工程化多层血管具有所有的这些特征。在一些实施方式中，该工程化多层血管不受神经支配。在一些实施方式中，所述分化成体成纤维细胞为非血管成纤维细胞。
本文也描述形成工程化多层血管的方法，包含：放置至少一个填料基质体，至少一个平滑肌细胞的多细胞体，其中该等细胞互相附著，至少一个内皮细胞的多细胞体，其中该等细胞互相附著，及至少一个成纤维细胞的多细胞体，其中该等细胞互相附著，以形成所要的血管组织，其中一或多个填料基质体形成该管的内腔，且数个填料基质体包围著该管；及使得该工程化多层血管的多细胞体附著；条件是在任何时候未使用预成型架。
在一实施方式中，该多细胞体呈长状细胞体。如整个正文中所用之术语，长状细胞体，只提供作为一实例，并非为限制性实施方式。据此，使用本文公开内容的本领域技术人员将能够将长状细胞体的教示应用在任何其他的细胞体(例如非长状的细胞体)。在一实施方式中，该细胞体为实质上呈球形的细胞体。
本文还描述工程化多层血管，包含至少一层分化成体成纤维细胞、至少一层分化成体平滑肌细胞，其中任一层进一步包含分化成体内皮细胞，其中所述管具有下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约5：95至约25：75；(b)该工程化多层血管具顺应性；(c)该工程化多层血管的内径为约6mm或更小；(d)该管的长度至多约30cm；及(e)该工程化多层血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是该工程化多层血管没有任何预成型架。
同时，本文描述工程化多层血管，包含一层分化成体成纤维细胞的外层，至少一层分化成体平滑肌细胞及分化成体内皮细胞内层，且其中所述管具有至少一项下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约1：99至约45：55；(b)该工程化多层血管的内径为约6mm或更小；(c)该管的长度至多约30cm；及(d)该工程化多层血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是该工程化多层血管没有任何预成型架。在特定的实施方式中，该工程化多层血管具有至少两项这些特征。仍在更特定的实施方式中，该工程化多层血管具有至少三项这些特征。甚至在更特定的实施方式中，该工程化多层血管具有至少四项这些特征。甚至还在更特定的实施方式中，该工程化多层血管具有所有的这些特征。在一些实施方式中，该工程化多层血管不受神经支配。在一些实施方式中，所述分化成体成纤维细胞为非血管成纤维细胞。
再者，本文描述用于治疗患者的方法，包含提供工程化多层血管，包含至少一层分化成体成纤维细胞、至少一层分化成体平滑肌细胞，其中任一层进一步包含分化成体内皮细胞，其中所述管具有下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约1：99至约45：55；(b)该工程化多层血管具顺应性；(c)该工程化多层血管的内径为约6mm或更小；(d)该管的长度至多约30cm；及(e)该工程化多层血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是该工程化多层血管没有任何预成型架。
本文还描述工程化血管，包含分化成体平滑肌细胞、分化成体内皮细胞及分化成体成纤维细胞，其中所述细胞互相附著，且其中所述管具有下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约1：99至约45：55；(b)该工程化血管的内径为约6mm或更小；(c)该管的长度至多约30cm；及(d)该工程化血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是该工程化血管没有任何预成型架。
用于该工程化多层血管中细胞类型的来源可任选地得自于同种异体的组织(源自或衍生自与受体为相同种之供体的细胞或组织)，或是得自于自体移植(源自于或衍生自受体的细胞或组织)，且可任选为新鲜的或冻存的。细胞可分化自干细胞，例如具有分化为各种其他细胞类型之潜能的多能性再生细胞，其表现一或多种特定功能并具有自我更新的能力，或是祖细胞，具有分化为至少一种细胞类型的潜能的单能性或多能性再生细胞，且其具有限自我更新的能力或无自我更新的能力。细胞也可以源自于例如人类主动脉细胞、人类脐带细胞、人类脂肪组织、人类骨髓、人类胎盘或是任何其他可从其中获得人类分化细胞的来源。优选地，用于本文所述的工程化多层血管中的细胞类型为成体分化细胞。
用于该工程化多层血管中的细胞类型可用任何本领域已知的方式来培养。细胞及组织培养方法为本领域已知，并描述在例如Cell & Tissue Culture:Laboratory Procedures；Freshney(1987)、Cultureof Animal Cells:A Manual of Basic Techniques之中，这些信息中的该等内容在此并入作为参考。可与本发明结合使用的一般哺乳动物之细胞培养技术、细胞株及细胞培养系统也描述在Doyle,A.,Griffiths,J.B.,Newell,D.G,(编)CellandTissueCulture:LaboratoryProcedures,Wiley(1998)之中，这些信息中的该等内容在此并入作为参考。
哺乳动物之细胞培养的适当生长条件为本领域所熟知。细胞培养基通常包括必需营养素，及可任选的添加元素，如生长因子、盐、矿质、维生素等等，可根据培养细胞类型进行选择。可选用特定成分来促进细胞生长、分化、特定蛋白的分泌等等。一般来说，标准生长基包括低糖DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)，具有110mg/L丙酮酸盐及谷氨酸盐，补充以10-20%胎牛血清(FBS)或小牛血清，及100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素，如本领域技术人员所熟知的各种其他标准培养基亦为适当的。在该细胞的来源动物的体温或近于该体温的温度下，于3-15%CO2氛围中(优选为5%CO2)，在无菌条件下培养优选细胞。举例来说，人类细胞优选培养在约37°C之下。
细胞也可以用细胞分化剂来培养，以诱导细胞循著所要的路径进行分化。举例来说，细胞可用生长因子、细胞因子等来培养。如本文所用的术语“生长因子”系指蛋白、多肽或多肽复合体，包括细胞因子，其由细胞所产生且可影响自身及/或各种其他邻近或远端细胞。一般来说，生长因子就发育上或是回应众多生理的或环境的刺激来影响特定细胞类型的生长及/或分化。一些(但不是全部的)生长因子为激素。例示性生长因子为胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF，包括碱性FGF(bFGF))、血小板衍生生长因子(PDGF，包括PDGF-AA及PDGF-AB)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β，包括TGFβ1及TGFβ3)、表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素-6(IL-6)、IL-8及相似因子。生长因子在下列文献及其他处有所讨论：Molecular CellBiology,Scientific American Books,Darnell等人编，1986；Principles ofTissue Engineering，第2版,Lanza等人编，Academic Press,2000。本领域技术人员将会了解，在本文中描述之条件培养基中的任何及全部培养衍生生长因子系落入本发明的范畴中。
在将本发明的成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞组合成为多细胞体供形成血管之前，可分别培养本发明的成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞。举例来说，成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞可个别培养在组织培养瓶中，且当细胞汇合时，可传代培养，并混合在一个培养基中以形成混合细胞悬浮液，并离心将上清液移除，以形成高密实之作为混合细胞糊(mixed cell paste)的细胞沉淀物(cellpellet)。合适的混合细胞悬浮液包括成纤维细胞和平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞、以及平滑肌细胞和内皮细胞的组合。例如经培育在定轨振荡器上，混合细胞悬浮液中的细胞可互相聚集，并启动细胞-细胞黏附作用。混合细胞糊可例如经抽吸进入毛细管中形成多细胞体。然后例如经由使用柱塞将细胞柱从该毛细管中挤出到模具槽中。或者，成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞可个别并入到多细胞体，包括例如长状细胞体。长状细胞体可含有多于一种的预先与细胞混合的细胞外基质成分。接著将该多细胞体培育在37°C及5%CO2之下，供后续通过使用生物复印机(bioprinter)将之整合为血管。
除了数种细胞之外，本发明的多细胞体还可包括一或多种细胞外基质(ECM)成分或一或多种ECM成分的一或多种衍生物。举例来说，长状细胞体可含有各种ECM蛋白(例如动物胶、纤维蛋白原、纤维蛋白、胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白及/或蛋白聚糖)。ECM成分或ECM成分的衍生物可添加到用于形成长状细胞体的细胞糊中。添加到细胞糊中的ECM成分或ECM成分的衍生物可自人类或动物来源中纯化，或通过本领域已知的重组方法来产生。或者，ECM成分或ECM成分的衍生物可由长状细胞体中的细胞自然分泌，或是可经本领域已知的任何适合方法将用于制造长状细胞体的细胞经基因改造，以变化一或多种ECM成分或ECM成分的衍生物及/或一或多种细胞粘附分子或细胞-基质黏附分子(例如选择蛋白、整合蛋白、免疫球蛋白及钙粘蛋白)的表达水平。ECM成分或ECM成分的衍生物可促进长状细胞体中的细胞附著。举例来说，动物胶及/或纤维蛋白原可适宜地添加到用于形成长状细胞体的细胞糊中。接著经由添加凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。
在多细胞体中，内皮细胞对平滑肌细胞的比例可为介于约1：99至约45：55之间的任何比例。例如该工程化多层血管中内皮细胞对平滑肌细胞的比例可为约1：99、约5：95、约10：90、约15：85、约20：80、约25：75、约30：70、约35：65、约40：60、约45：55，或任何介于约1：99至约45：55之间的内皮细胞对平滑肌细胞的比例。
在一些实施方式中，该工程化多层血管实质上没有非分化成体成纤维细胞。在一些实施方式中，该工程化多层血管实质上没有非分化成体平滑肌细胞。在一些实施方式中，该工程化多层血管实质上没有非分化成体内皮细胞。
本发明的成纤维细胞可培养在例如组织培养瓶中。当细胞汇合时，可将成纤维细胞传代培养，并离心将上清液移除以形成单细胞糊。成纤维细胞糊例如经抽吸进入毛细管中可形成长状细胞体。然后例如经由使用柱塞将长状细胞体从该毛细管中挤出到模具槽中。接著将长状细胞体培育在37°C及5%CO2之下，供后续通过使用生物复印机将之整合为血管。
本发明的平滑肌细胞也可以培养在例如组织培养瓶中。当细胞汇合时，可将平滑肌细胞传代，并离心将上清液移除以形成单细胞糊。平滑肌细胞糊例如经抽吸进入毛细管中可形成长状细胞体。然后例如经由使用柱塞将长状细胞体从该毛细管中挤出到模具槽中。接著将长状细胞体培育在37°C及5%CO2之下，供后续通过使用生物复印机将之整合为血管。
本发明的内皮细胞可培养在例如组织培养瓶中。当细胞汇合时，可将内皮细胞传代，并离心将上清液移除以形成单细胞糊。内皮细胞糊例如经抽吸进入毛细管中可形成长状细胞体。然后例如经由使用柱塞将长状细胞体从该毛细管中挤出到模具槽中。接著将长状细胞体培育在37°C及5%CO2之下，供后续通过使用生物复印机将之整合为血管。
可以制造凝胶基质模(gel matrix mold)，作为培育平滑肌细胞/内皮细胞及成纤维细胞的细胞柱之用。凝胶基质模可由任何生物相容性凝胶基质(例如琼脂糖、琼脂)或其他生物相容性水凝胶(如聚乙二醇(PEG))构成。凝胶基质材料具营养基可透性，但可抵抗细胞的内生、迁移及黏附。凝胶基质模可经灭菌。凝胶基质模可使用阴模制成，将阴模置于凝胶基质上，并且使凝胶成形为该凝胶基质模的版型。举例来说，可使用铁氟龙(Teflon)阴模。于再抽吸进入毛细管中以形成血管结构之前，可将长状细胞体培育在凝胶基质模中达例如24小时，在一些实施方式中，凝胶基质模的特徵在于呈柱形。在一些实施方式中，凝胶基质模的特徵在于呈半柱形。在一些实施方式中，凝胶基质模的特徵在于呈长方形。
可评估长状细胞体中细胞的细胞活性，例如使用常规组织学，如H&E染色。也可评估长状细胞体中细胞的操作方便性，例如可评估在培育时间点结束时该等柱体卷曲(例如卷曲性)的量。举例来说，可以使用主观性偏好评分系统。举例来说，可针对长状细胞体赋予基于1至10点的卷曲性评分，其中1分表示长状细胞体未展现卷曲，而10分表示长状细胞体卷成螺旋样结构。另外，在培育时间点结束时可使用主观评分评估长状细胞体的完整性，例如附著性。举例来说，这两种评分可提供用于制备长状细胞体之较佳条件的选择性，以确保多层血管形成期间的操作方便性。举例来说，可针对长状细胞体赋予基于10点的附著性评分，其中1分表示该柱体完全维持其平滑柱形的结构，而附著性10分表示柱形结构已丧失。
举例来说，可经由集合数个多细胞体并使得该等细胞体附著，来形成多层血管移植物。在一些实施方式中，细胞、细胞聚集体、多细胞体及/或层经细胞-细胞粘附作用附著。在其他实施方式中，细胞、细胞聚集体、多细胞体及/或层融合。在一些实施方式中，经由在具一致弹性的所要管状物中集合数个长状细胞体，并使得长状细胞体附著，来形成多层血管移植物。在进一步实施方式中，在长状细胞体中的细胞及/或细胞聚集体可附著在一起以形成血管状的构建物，其具有一致弹性、所要的细胞密度及可供方便处理及操作的足够完整性。
一种产生长状细胞体的方法包含下列步骤：1)提供含具有所要细胞密度及粘度的数个预选细胞或细胞聚集体的细胞糊，2)将细胞糊操作成为所要的管状，且3)通过成熟作用形成长状细胞体。
实质上球形的细胞体，单独或是与长状细胞体组合，也适于建构本文所述的血管类型。一种产生实质上球形的细胞体的方法包含下列步骤：1)提供含具有所要细胞密度及粘度的数个预选细胞或细胞聚集体的细胞糊，2)将细胞糊操作成为柱体形状，3)将柱体切成相等片段，4)在旋转搅拌机上让该等片段形成球形过夜，且5)通过成熟作用形成实质上球形细胞体。
长状填充体可与前述长状细胞体组合使用来构建血管。长状填充体包含呈预定形状(如棒或其他模)的材料，虽然该材料具营养基可透性，但可防止细胞的内生、迁移及黏附。填充体单元可由如琼脂糖、琼脂的材料或其他生物相容性水凝胶(如聚乙二醇(PEG))组成。在工程化多层血管的构建期间，可根据预定图案采用长状填充体来界定血管的支撑结构。长状填充体可用来形成多层血管移植物的内腔。为了形成该管的内腔，形成内腔的填充体为可移动的。长状填充体和长状细胞体及其等之形成方法的实例可于美国专利申请号12/491,228中获得。
在一些实施方式中，本发明的工程化多层血管包含多层。在进一步实施方式中，该多层的特征在于存在一或多种细胞类型。尚在进一步实施方式中，该多层的特征在于位在该工程化多层血管内。在一些实施方式中，该多层的特征在于一或多种成分、元素或化合物的浓度及/或物理特性(如顺应性、强度或弹性)。在一些实施方式中，一或多层为独特的。在进一步实施方式中，一或多层为可分的。在一些实施方式中，一或多层为相接的。在进一步实施方式中，一或多层为不可分的。尚在进一步实施方式中，一或多层的特征在于在该工程化多层血管的一个区域上呈连续梯度变化的特性。在一些实施方式中，一或多层的特征在于随著时间变化的特性。
可使用平滑肌细胞和内皮细胞的长状细胞体的内层及成纤维细胞的长状细胞体的外层来制造该工程化多层血管。可使用譬如显示于图2中的几何配置，依据平滑肌细胞和内皮细胞的长状细胞体、成纤维细胞的长状细胞体及填料基质的长状体的几何图案来配置，以形成三维血管结构。多层血管可形成在具有例如琼脂糖的凝胶基质的基盘上。举例来说，可将凝胶基质抽吸进入毛细管中并凝胶化，例如在冷的(4°C)PBS溶液中，并从毛细管中挤出，且笔直地放在凝胶基质的基盘上以形成长状填料基质体。第二个长状填料基质体可紧邻著第一个长状填料基质体，并重复该过程直到形成所要的支撑结构。当放置长状填料基质体时，将润湿溶液(如PBS)分配于长状填料基质体上，以保持它们湿润并让体和体之间粘附。在逐层的基础上，于凝胶基质长状体上可将成纤维细胞的长状体放置在下一层以形成多层血管的外层，且平滑肌细胞和内皮细胞的长状体可进一步被挤出以继续形成内层。在挤出每个长状细胞体之后，可将如培养基的润湿溶液分配在已被放置的体上，以帮助随后的长状细胞体的放置并防止已经放置的长状细胞体脱水。重复此过程直到形成所要的血管结构。另外，可使用实质上球形细胞体层，单独或与长状细胞体组合，来制造该工程化多层血管。所要的血管结构可为直管，或是它可为具一或多个分支的管(例如分支结构)。一旦完成了整个血管构建物，可将凝胶基质分配在该构建物的每个末端上并凝胶化。在凝胶化之后，可将整个构建物浸到如培养基的润湿溶液中，并培育以让该等细胞柱之间能够附著，例如在37°C及5%CO2下进行24小时。
该工程化多层血管可通过本领域已知的任何方法来形成。举例来说，该工程化多层血管的形成可通过手动置放长状及/或实质上球形细胞体及长状凝胶基质体，如使用微量吸液管，或是自动置放，如使用特殊用途的生物复印机(如于美国专利申请号10/590,446中所描述的)。
或者，经由使用各种方法的组合，如细胞接种并集合数个长状细胞体及/或数个长状填充体，来形成多层血管。举例来说，可将内皮细胞接种(例如流过)在由平滑肌细胞的长状细胞体和成纤维细胞的长状细胞体所形成的血管内腔上。作为另一个实例，可将一层成纤维细胞围绕在由平滑肌细胞和内皮细胞的长状细胞体所形成的血管周围。仍作为另一实例，用来形成血管的预先形成的细胞体包含多于一种细胞类型。仍作为另一实例，用于形成血管的层包含多于一种细胞类型。
在一些实施方式中，用于形成血管的预先形成的细胞体包含所有三种细胞类型(内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞)；在此一实例中，每种细胞类型迁移到适当位置(例如在成熟室内的时间期间)以形成工程化多层血管。在其他实施方式中，用于形成血管的预先形成细胞体包含两种细胞类型(选自于内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞)，且两种细胞类型皆迁移至适当位置(例如在成熟室内的时间期间)以形成工程化多层血管。在一些实施方式中，每一细胞类型均匀分布在细胞体或血管层内。在其他实施方式中，每一细胞类型局限在细胞体或血管层内的特定区域。
在一些实施方式中，本发明的多层血管不受神经支配。在一些实施方式中，本发明的多层血管包含非血管成纤维细胞的分化成体成纤维细胞。
在培育期结束时，可将周围的凝胶基质支撑结构移出，且将已经附著的多层血管置于成熟室(例如生物反应器)中生长，并形成细胞外基质。经由将填充体抽出或经由其他方法，如热可逆法或光敏法，将该支撑结构/填充体自血管内腔及/或血管周围移出。
在该工程化多层血管的成熟作用期间，可使用腔内液体灌注。举例来说，当将多层血管置于成熟室(例如生物反应器)中时，可使用腔内灌注。可以在相对较低的压力下开始腔内灌注，并在工程化多层管成熟进展期间增加。举例来说，可增加腔内灌注至摹拟或超过自然组织中的压力及剪切力的程度。举例来说，动脉及静脉多层管的内部压力可受到少于60mm Hg、60-150mm Hg、150-200mm Hg或大于200mm Hg的压力，以摹拟正常及/或升高血压。在工程化多层管成熟的早期阶段建议用较低压力，以避免破坏组织。类似地，工程化多层管可受到少于5达因/cm2、5-30达因/cm2、30-60达因/cm2或大于60达因/cm2的剪切力，以摹拟循环系统中正常及/或升高剪切力，在开始时优选使用较低水平。此类腔内灌注技术为本领域已知。
如本领域所知，在腔内灌注中还可包括脉动力。举例来说，可使用脉动力以摹拟动脉及静脉中血液循环的自然脉动。举例来说，可使用少于60/min、60-90/min、75/min、大于90/min或140-160/min、或大于160/min的脉搏率、或是摹拟成体或胎儿的静息脉搏的任何其他脉搏率。脉动力的使用在开始时相对较低，当组织构建物更加完全成熟时，增加该力至生理水平。
本发明的工程化多层血管在例如任一层血管的形成或管状物的形成上未采用任何预成型架。作为非限制性实例，本发明的工程化多层血管未采用任何预成型合成架，如聚合物架，细胞外基质层或任何其他类型的预成型架。在一些实施方式中，该工程化多层血管没有任何预成型架。在一些实施方式中，该工程化多层血管含有可测得但为痕量或微量的架，例如少于0.5％的总组成。在进一步实施方式中，痕量或微量的架不足以影响移植物的长程反应或干扰其主要生物功能。
本发明的工程化多层血管未采用只有为了形成血管的细胞片的形成，例如成纤维细胞片。
本发明的工程化多层血管可具有约6mm、约5mm、约4mm、约3mm、约2mm、约1mm或约0.5mm或更小的内径，或是介于之间的任何直径，优选为约6mm或更小。该工程化多层血管可具有从约1cm或更短至约30cm或更长的范围的长度。优选地，该血管具有从约1cm至约30cm的范围的长度。
在工程化多层管接受灌注之后，例如约4天或更长的时间，让混合平滑肌细胞及内皮细胞的内层连同成纤维细胞的外层进行细胞黏附、重组及迁移，以形成内层、中层和外层的自然结构，内皮细胞往内迁移，平滑肌细胞在中间，而成纤维细胞仍留在外层。
或者，可使用磁场来引导工程化多层管中各种细胞类型的细胞重组及迁移。举例来说，工程化多层管可包含雌性粒子(例如铁磁纳米粒子等等)并受到磁场作用以引导细胞重组及迁移。
至少在血管长度的一个区域上，三层血管的厚度为实质上相同，例如加或减20％或更小。在一些实施方式中，血管厚度为加或减10％或更小，或是加或减5％或更小。在血管的长度上血管厚度也是实质上相同的。每层血管的厚度也可为类似于天然血管组织的厚度。
本发明的工程化多层血管还具顺应性，且具有可承受相当于天然生理血压的压力的厚度。举例来说，该工程化多层血管的胀裂强度足以承受生理血压。可采用若干方法来测试工程化多层血管的生物力学特性。用于测试血管的生物力学特性的合适方法包括胀裂强度及顺应性的测量。应力应变分析法，如单一载荷对伸长试验、应力松弛试验及拉伸破坏试验，也是适当的并可加以应用。也可以使用本领域技术人员所知的其他试验。
本发明的工程化多层血管可用在若干应用上；举例来说，血管可用在旁路移植术、动静脉通路、药物测试应用或心血管装置测试应用。可使用该血管的心血管装置的实例包括支架。
再者，本文描述用于治疗患者的方法，包含提供至少一种本发明的工程化多层血管。需要工程化多层血管的患者可以是例如需要冠状动脉或外周血管旁路术的患者或是需要血液透析的患者。有需要的患者可能有受损的血管。有需要的患者也可能为患有例如终末期肾病、糖尿病、动脉硬化或先天性心脏出生缺陷的患者。本发明的工程化多层血管可用于治疗任何需要置换血管的患者。
虽然本文已经展示和描述了本发明的优选实施方式，但对本领域中技术人员而言显然的是，这样的实施方式仅仅是以示例的方式提供的。本领域中技术人员现将在不背离本发明的情况下想到多种变化、改变和替换。应当理解，本文所述的本发明的实施方式的各种替代方案在发明的实践中也可得到采用。下面的权利要求书旨在限定本发明的范围，这些权利要求的范围内的方法和结构以及它们的等同物从而也被涵盖在内。
实施例
以下特定实施例仅视为说明，且决不以任何方式限制本揭示之其馀部分。在没有进一步阐述之下，一般相信本领域技术人员基于本文说明可使用本发明至其最完整的程度。所有本文引用的出版物在此全文并入作为参考。对其之参考证明了此类信息的可获得性及公开传播。
实施例1：HASMC-HAEC混合细胞柱
材料及方法
1.细胞培养
1.1平滑肌细胞：在37°C及5%CO2下，于低糖DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中维持及扩增原代人类主动脉平滑肌细胞(HASMC；GIBCO/InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)，该低糖DMEM中补充有10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B、0.01MHEPES(全部皆来自于Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)、50mg/L脯氨酸、50mg/L甘氨酸、20mg/L丙氨酸、50mg/L抗坏血酸及3μg/LCuSO4(全部皆来自于Sigma,St.Louis,MO)。在所有研究中使用介于传代4及8之间的HASMC汇合培养。
1.2内皮细胞：原代人类主动脉内皮细胞(HAEC；GIBCO/Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)维持并扩增在Medium 200(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中，Medium 200中补充有2%FBS、1μg/ml氢化可的松、10ng/ml人类表皮生长因子、3ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10μg/ml肝素、100U/ml青霉素、0.1mgml链霉素及0.25μg/ml两性霉素B(所有皆来自于Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。于37°C及5%CO2下，该等细胞生长在涂有动物胶(来自于猪血清；Sigma,St.Louis,MO)之经处理过的组织培养瓶中。在所有研究中使用介于传代4及8之间的HAEC汇合培养。
2.琼脂糖模
2.12%w/v琼脂糖液的制备：将lg低熔点的琼脂糖(Ultrapure LMP；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)溶在50ml的杜氏磷酸盐缓冲液(dulbecco’s phosphate buffered saline(DPBS)；InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)中。简言之，在电热板上将DPBS和琼脂糖加热到85°C，并持续搅拌直到琼脂糖完全溶解。在125°C下经蒸汽灭菌法将琼脂糖液灭菌25分钟。只要温度维持在36.5°C以上，琼脂糖液会维持在液相。低于这个温度时，相转变发生，琼脂糖液的粘度增加，琼脂糖形成固态凝胶。
2.2琼脂糖模的制备：使用可适配10cm培养皿(Petridish)的铁氟龙模来制造琼脂糖模，以用于培育细胞柱。简言之，使用70%乙醇溶液将铁氟龙模预先灭菌，并使该模接受UV光45分钟。将经灭菌的模置于10cm培养皿(VWR International LLC,West Chester,PA)上，并牢固地附于其上。此一装配(铁氟龙模+培养皿)保持垂直，并在铁氟龙模和培养皿之间的空间倒入45ml预温热、无菌2%琼脂糖液。接著将该装配水平放置在室温下1小时，以使得琼脂糖完全凝胶化。在凝胶化之后，移开铁氟龙印模，使用DPBS洗涤琼脂糖模两次。然后将17.5ml的HASMC培养基加到该琼脂糖模。
3.HASMC-HAEC柱
3.1HASMC-HAEC混合细胞柱的制造：为制备混合细胞柱，个别地收集HASMC及HAEC，然后以预定比例混合。简言之，从细胞汇合培养瓶中移除培养基，用DPBS(1ml/5cm2生长区)洗涤细胞。经由在胰蛋白酶(1ml/15cm2生长区；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)存在下培育细胞10分钟，使细胞脱离培养瓶的表面。使用0.15%胰蛋白酶使HASMC脱离，而使用0.1％胰蛋白酶使HAEC脱离。培育之后，加入适当的培养基到瓶中(相对于胰蛋白酶体积的2X体积)。在200g下离心细胞悬浮液6分钟，之后将上清液完全移除。将细胞沉淀物再悬浮于各自的培养基中，并使用血球计数器计数。结合适当体积的HASMC及HAEC，以产生含有5、7.5、10、12.5及15%HAEC(以％总细胞群表示)的混合细胞悬浮液。在200g下离心混合细胞悬浮液5分钟，之后完全移除上清液。将混合细胞沉淀物再悬浮于6ml的HASMC培养基中，并转移到20ml小玻璃瓶(VWR International LLC,West Chester,PA)中，接著于37°C及5%CO2下，培育在150rpm下的定轨振荡器60分钟。此步骤会让细胞互相聚集，并开始细胞-细胞粘附。培育后，将细胞悬浮液转移到15ml离心管中，并在200g下离心5分钟。移除上层培养基之后，将细胞沉淀物再悬浮于400μl的HASMC培养基中，并用吸液管上下吸取数次，确保所有细胞群集破裂。将细胞悬浮液转移至0.5ml微量离心管(VWR International LLC,West Chester,PA)中，置于15ml离心管内，接著在2000g下离心4分钟，以形成高密实的细胞沉淀物。吸出上层培养基，并经由抽吸将细胞转移毛细管(OD 1.5mm,ID 0.5mm,L 75mm；Drummond ScientificCo.,Broomall,PA)中，以便产生50mm长度的细胞柱。在37°C及5%CO2下，将毛细管内的细胞糊培育在HASMC培养基中20分钟。接著，使用毛细管配用的柱塞将细胞柱从毛细管中挤出到琼脂糖模槽(用HASMC培养基覆盖)中。在37°C及5%CO2下，培育细胞柱24及48小时。
4.混合细胞柱活性及操作方便性的评定
4.1细胞活性的评估：为了在24、48及72小时培育结束时评估混合细胞柱中的细胞活性，进行常规组织学检查。简言之，在每个时间点，将混合细胞柱吸回到毛细管中(手动使用柱塞)，并转移至多孔盘。在用石蜡包埋之前，使用10％中性缓冲福马林固定该等柱体至少24小时。经包埋的柱体经切片(横向)并进行H&E染色。
4.2操作方便性的评估：为了评估混合细胞柱的操作方便性，评量两种不同的参数。第一，评估在每个培育时间点结束的时候该等柱体卷曲的量。使用了一种主观性偏好评分系统。第二，还使用第二种主观评分在每个培育时间点结束时评估细胞柱的完整性。综合这两种评分选择出制备柱体的优选条件，以确保后续步骤期间的操作方便性。
结果
1.HASMC-HAEC混合细胞柱的细胞活性及操作方便性
按照本文所述的方法，制造HASMC-HAEC混合细胞柱，以便含有5、7.5、10、12.5及15%HAEC。将柱体培育在琼脂糖模中24及48小时。在每个时间点，该等柱体被赋予卷曲性及附著性评分。表1及2对结果做总结。如所见，当培育时间从24增加至48小时，所有的混合细胞柱的操作方便性降低。于琼脂糖模中进行24小时培育期间之后，含15%HAEC及其馀85%-HASMC的柱体为最容易操作。再者，含5%HAEC及95%HASMC的柱体在两个时间点均为最难操作。
使用H&E染色(图1)在所有时间点对每个条件来评估细胞活性。染色显示出所有于琼脂糖模中培育24小时的柱体含有最有生命力的细胞(由最少量的粉红染色可证明之)，而细胞活性随著培育时间的增加而降低。再者，于琼脂糖模中培育24小时之后，含15%HAEC及85%HASMC柱中的细胞活性为最高。
对每个柱体赋予基于10点的“卷曲性评分”，其中1分表示该柱体未展现卷曲，而10分表示该柱体卷曲成螺旋样结构。
对每个柱体赋予基于10点的“附著性评分”，其中1分表示该柱体完全维持它们平滑柱形结构，而附著性10分表示柱形结构完全丧失。
表1：卷曲性评分
Figure BDA00002298863300301
表2：附著性评分
Figure BDA00002298863300302
实施例2：多层血管
材料及方法
1.细胞培养
1.1平滑肌细胞：在37°C及5%CO2下，于低糖DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中维持及扩增原代人类主动脉平滑肌细胞(HASMC；GIBCO/InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)，该低糖DMEM中补充有10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B、0.01MofHEPES(全部均来自于Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)、50mg/L脯氨酸、50mg/L甘氨酸、20mg/L丙氨酸、50mg/L抗坏血酸及3μg/LCuSO4(全部均来自于Sigma,St.Louis,MO)。在所有研究中使用介于传代4及8之间的HASMC汇合培养。
1.2内皮细胞：原代人类主动脉内皮细胞(HAEC；GIBCO/Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)维持并扩增在Medium 200(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中，Medium 200补充有2%FBS、1μg/ml氢化可的松、10ng/ml人类表皮生长因子、3ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10μg/ml肝素、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素及0.25μg/ml两性霉素B(所有均来自于Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。于37°C及5%CO2下，该等细胞生长在涂有动物胶(来自于猪血清；Sigma,St.Louis,MO)经处理过的组织培养瓶中。在所有研究中使用介于传代4及8之间的HAEC汇合培养。
1.3成纤维细胞：在37°C及5%CO2下，将原代人类真皮成纤维细胞(HDF；GIBCO/Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)维持及扩增在Medium 106(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中，Medium 106中补充有2%FBS、1μg/ml氢化可的松、10ng/ml人类表皮生长因子、3ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10μg/ml肝素、100U/ml青霉素及0.1mg/ml链霉素(所有均来自于Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。在所有研究中使用介于传代4及8之间的HDF汇合培养。
2.琼脂糖液及模
2.12％及4%(w/v)琼脂糖液的制备：1g或2g(分别用于2%或4%)低熔点的琼脂糖(Ultrapure LMP；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)溶在50ml杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中。简言之，在电热板上加热DPBS及琼脂糖到85°C，并持续搅拌直到琼脂糖完全溶解。在125°C下经蒸汽灭菌法将琼脂糖液灭菌25分钟。只要温度维持在36.5°C以上，琼脂糖液会维持在液相。低于这个温度时，相转变发生，琼脂糖液的粘度增加，琼脂糖形成固态凝胶。
2.2琼脂糖模的制备：使用可适配10cm培养皿的铁氟龙模来制造琼脂糖模，以用于培育细胞柱。简言之，使用70%乙醇溶液将铁氟龙模预先灭菌，并使该模接受UV光45分钟。将经灭菌的模置于10cm培养皿(VWR International LLC,West Chester,PA)的上面，并牢固地附于其上。此一装配(铁氟龙模+培养皿)保持垂直，并在铁氟龙模和培养皿之间的空间倒入45ml预温热、无菌2%琼脂糖液。接著将该装配水平放置在室温下1小时，以使得琼脂糖完全凝胶化。在凝胶化之后，移开铁氟龙印模，使用DPBS洗涤琼脂糖模两次。然后将17.5ml的HASMC培养基添加到该琼脂糖模以培育HASMC-HAEC混合细胞柱，或是将17.5ml HDF培养基添加到琼脂糖模以培育HDF细胞柱。
3.细胞柱
3.1HASMC-HAEC混合细胞柱的制造：为制备混合细胞柱，个别收集HASMC及HAEC，然后以预定比例混合。简言之，从细胞汇合培养瓶中移除培养基，用DPBS(1ml/5cm2生长区)洗涤细胞。经由在胰蛋白酶(1ml/15cm2生长区；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)存在下培育细胞10分钟，使细胞脱离培养瓶的表面。使用0.15%胰蛋白酶使HASMC脱离，而使用0.1％胰蛋白酶使HAEC脱离。培育之后，添加适当培养基到瓶中(相对于胰蛋白酶体积的2X体积)。在200g下离心细胞悬浮液6分钟，之后将上清液完全移除。将细胞沉淀物再悬浮于各自的培养基中，并使用血球计数器计数。结合适当体积的HASMC及HAEC，以产生含有15%HAEC及其馀85%HASMC(以％总细胞群表示)混合的细胞悬浮液。在200g下离心混合的细胞悬浮液5分钟，之后將上清液完全移除。将混合细胞沉淀物再悬浮于6ml的HASMC培养基中，并转移到20ml小玻璃瓶(VWR InternationalLLC,West Chester,PA)中，接著于37°C及5%CO2下，在150rpm下的定轨振荡器上培育60分钟。此步骤会让细胞互相聚集，并开始细胞-细胞粘附。培育后，将细胞悬浮液转移到15ml离心管中并在200g下离心5分钟。移除上层培养基之后，将细胞沉淀物再悬浮于400μl的HASMC培养基中，并用吸液管上下吸取数次，以确保所有细胞群集破裂。将细胞悬浮液转移到0.5ml微量离心管(VWR InternationalLLC,West Chester，PA)中，置于15ml离心管内，接著在2000g离心4分钟，以形成高密实的细胞沉淀物。吸出上层培养基，并经由抽吸将细胞转移到毛细管(OD 1.5mm,ID 0.5mm,L 75mm；DrummondScientific Co.,Broomall,PA)中，以便产生50mm长度的细胞柱。在37°C及5%CO2下，将毛细管内的细胞糊培育在HASMC培养基中20分钟。然后使用毛细管配用的柱塞将细胞柱从毛细管中挤出到琼脂糖模槽(用HASMC培养基覆盖)中。在37°C及5%CO2下培育细胞柱24小时。
3.2HDF细胞柱的制造：使用相似于制备HASMC-HAEC混合细胞柱的方法来制备HDF柱。简言之，从HDF汇合的培养瓶中移除培养基，用DPBS(1ml/5cm2生长区)洗涤细胞。经由在胰蛋白酶(0.1%；1ml/15cm2生长区；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)存在下培育细胞10分钟，使细胞脱离培养瓶的表面。培育之后，将HDF培养基添加到瓶中(相对于胰蛋白酶体积的2X体积)。在200g下离心细胞悬浮液6分钟，之后将上清液完全移除。将细胞沉淀物再悬浮于6ml的HDF培养基中，并转移到20ml小玻璃瓶(VWR International LLC,West Chester,PA)中，随后于37°C及5%CO2下，在150rpm下的定轨振荡器上培育75分钟。培育后，将细胞悬浮液转移到15ml离心管中并在200g下离心5分钟。移除上层培养基之后，将细胞沉淀物再悬浮于400μl HDF培养基中，并用吸液管上下吸取数次，以确保所有细胞群集破裂。将细胞悬浮液转移至0.5ml微量离心管(VWR InternationalLLC,West Chester,PA)中，置于15ml离心管中，接著在2000g离心4分钟，以形成高密实的细胞沉淀物。吸出上层培养基，并经由抽吸将细胞转移到毛细管(OD 1.5mm,ID 0.5mm,L 75mm；DrummondScientific Co.,Broomall,PA)中，以便产生50mm长度的细胞柱。在37°C及5%CO2下，将毛细管内的细胞糊培育于HDF培养基中20分钟。然后将细胞柱从毛细管挤出到琼脂糖模槽(用HDF培养基覆盖)中。在37°C and 5%CO2下，培育细胞柱24小时。
4.多层血管的制造
4.1琼脂糖基盘的制备：经由将10ml的预温热(>40°C)琼脂糖(2%w/v)分配在10cm培养皿上来制造琼脂糖基盘。紧接在分配之后，将琼脂糖平均地铺开，以便覆盖整个培养皿的底部并形成均匀层。将培养皿培育在室温下20分钟，让琼脂糖完全凝胶化。
4.2多层血管：运用HDF柱及HASMC-HAEC混合细胞柱来制造由HDF外层及HASMC-HAEC内层所组成的血管。采用显示于图2中的几何配置。简言之，在24小时培育期间结束时，将成熟HDF及HASMC-HAEC柱吸回毛细管中，并置于适当培养基中直到使用。由琼脂糖棒组成的支撑结构如以下方法制备。将预温热的2%琼脂糖吸到毛细管(L=50mm)中并快速冷却于冷的PBS溶液(4°C)中。将5cm长的凝胶化琼脂糖柱从毛细管中挤出(使用柱塞)，并笔直放在琼脂糖基盘上。第二个琼脂糖柱紧邻著第一个琼脂糖柱，重复该过程直到放置10个琼脂糖柱以形成第一层。此时将20μl PBS分配到琼脂糖柱上使它们保持湿润。再将六个琼脂糖柱放置在层1上于如图2中所示的位置(层2)。接著将三个HDF柱放置在位置4、5及6，以完成层2。挤出每个HDF柱之后，将40μl HDF培养基分配到已放置的柱体的上面，以帮助随后柱体的放置以及防止细胞柱脱水。放置下一步用于层3的琼脂糖柱，然后在位置3及6放置HDF柱。用HDF培养基再次润湿该结构之后，在位置4及5放HASMC-HAEC混合柱。随后，将40μl的HASMC培养基及40μl的HDF培养基分配到细胞柱上。在位置1及7上放置琼脂糖柱，在位置2及6上放置HDF柱，在位置3及5上放置HASMC-HAEC混合柱，最后在位置4上放置4%琼脂糖柱，层4就完成了。类似地，在如图2所示的位置上，放琼脂糖柱，然后是HDF柱，最后是HASMC-HAEC柱，就完成了层5、6及7。一旦完成整个构建物，将0.5ml的温琼脂糖分配在构建物的每个末端上，并在室温下进行凝胶化5分钟。在琼脂糖凝胶化之后，将30ml的HASMC培养基添加到培养皿上(以确保整个构建物完全浸入)。在37°C及5%CO2下，培育构建物24小时，以使得细胞柱之间黏附。24小时结束时，移出周围的琼脂糖支撑结构，得到已附著的多层血管(图3)。
实施例3：具有来自脂肪组织SVF的细胞的血管构建物
材料及方法
1.细胞培养
1.1来自SVF的SMC样细胞：SMC样细胞系产生自经胶原酶消化脂肪组织提取物(lipoaspirates)之后分离出的细胞粘附组分。这一消化过程会产生所谓基质血管组分(stromal vascular fraction，SVF)的细胞群。SVF细胞可以放置在标准组织培养塑料皿上，并进一步用适当培养条件将粘附细胞选出。于37°C及5%CO2下，将来自脂肪组织提取物的SVF的SMC样细胞维持并扩增在高糖DMEM(Dulbecco sModifimed Eagle Medium；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中，该高糖DMEM中补充有10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、0.1mg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B、0.01M HEPES(所有均来自InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)、50mg/L脯氨酸、50mg/L甘氨酸、20mg/L丙氨酸、50mg/L抗坏血酸及3μg/L CuSO4(所有均来自Sigma,St.Louis,MO)。在所有研究中使用介于传代3及8之间的SVF-SMC汇合继代培养。
1.2SVF-EC：将来自基质血管组分(SVF)的内皮细胞维持并扩增在常用于生长真正内皮细胞(EC)的原代分离系的生长培养基中。特定地，SVF-EC维持在M199中，M199中补充有10%FBS、1μgml氢化可的松、10ng/ml人类表皮生长因子、3ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10μg/ml肝素、100U/ml青霉素及0.1mg/ml链霉素。在37°C及5%CO2下，将细胞生长在经处理过的组织培养瓶中。在所有研究中使用介于传代3及8之间的SVF-EC汇合培养。
2.琼脂糖液及模
2.12％及4%(w/v)琼脂糖液的制备：将1g或2g(分别用于2％或4％)的低熔点琼脂糖(Ultrapure LMP；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)溶在50ml的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中。简言之，在电热板上将DPBS及琼脂糖加热到85°C，并持续搅拌直到琼脂糖完全溶解。在125°C下经蒸汽灭菌法将琼脂糖液灭菌25分钟。只要温度维持在36.5°C以上，琼脂糖液会维持在液相。低于这个温度时，相转变发生，琼脂糖液的粘度增加，琼脂糖形成固态凝胶。
2.2琼脂糖模的制备：使用可适配100mm培养皿的铁氟龙模来制造琼脂糖模，以用于培育细胞柱。简言之，使用70%乙醇溶液将铁氟龙模预先灭菌，并使该模接受UV光45分钟。将经灭菌的模置于100mm培养皿(VWR International LLC,West Chester,PA)的上面，并牢固地附于其上。此一装配(铁氟龙模+培养皿)保持垂直，并在铁氟龙模和培养皿之间的空间倒入45ml预温热、无菌2%琼脂糖液。接著将该装配水平放置在室温下1小时，以使得琼脂糖完全凝胶化。在凝胶化之后，移开铁氟龙印模，使用DPBS洗涤琼脂糖模两次。接著，将17.5ml的HASMC培养基添加到琼脂糖模上用于培育SVF-SMC：SVF-EC混合细胞柱，或是将17.5ml的HDF培养基添加到琼脂糖模上用于培育HDF细胞柱。
3.细胞柱
3.1SVF-SMC：SVF-EC混合细胞柱的制造：为制备混合细胞柱，个别地收集SVF-SMC及SVF-EC，并接著以预定比例混合。简言之，从细胞汇合培养瓶中移除培养基，用DPBS(1ml/5cm2生长区)洗涤细胞。经由在TrypLE(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)存在下培育细胞5至10分钟，使细胞脱离培养瓶的表面。培育之后，添加适当培养基至瓶中，以终止酶活性。在200g下离心细胞悬浮液6分钟，之后将上清液完全移除。将细胞沉淀物再悬浮于各自的培养基中，并使用血球计数器计数。结合适当体积的SVF-SMC及SVF-EC，以产生含有15%SVF-EC及其馀85%SVF-SMC(以％总细胞群表示)的混合细胞悬浮液。在200g下离心混合的细胞悬浮液5分钟，之后将上清液完全移除。将混合细胞沉淀物再悬浮于6ml的SVF-SMC培养基中，并转移到20ml小玻璃瓶(VWR International LLC,West Chester,PA)中，接著在37°C及5%CO2下，培育在150rpm下的定轨振荡器上60分钟。此步骤会让细胞互相聚集，并开始细胞-细胞粘附。培育后，将细胞悬浮液转移到15ml离心管中，且在200g下离心5分钟。移除上层培养基之后，将细胞沉淀物再悬浮于400μl的SVF-SMC培养基中，并用吸液管上下吸取数次，以确保所有细胞群集破裂。将细胞悬浮液转移到0.5ml微量离心管(VWR International LLC,West Chester,PA)中，置于15ml离心管内，接著在2000g下离心4分钟，以形成高密实的细胞沉淀物。吸出上层培养基，并经由抽吸将细胞转移到毛细管(OD 1.25mm,ID 0.266mm,L 75mm；Drummond Scientific Co.,Broomall,PA)中，以便产生50mm长度的细胞柱。在37°C及5%CO2下，将毛细管内的细胞糊培育在SVF-SMC培养基中20分钟。接著，使用毛细管配用的柱塞将细胞柱从毛细管中挤出到琼脂糖模槽(用SVF-SMC培养基覆盖)中。在37°C及5%CO2下，培育细胞柱6至12小时。
4.血管的制造
4.1琼脂糖基盘的制备：经由将12ml的预温热(>60°C)琼脂糖(2%w/v)分配到10cm培养皿上来制造琼脂糖基盘。紧接在分配之后，将琼脂糖平均地铺开，以便覆盖整个培养皿的底部并形成均匀层。将培养皿培育在室温下20分钟，让琼脂糖完全凝胶化。
4.2血管：制造由SVF-SMC：SVF-EC混合细胞柱组成的血管。简言之，在6小时培育期结束时，将成熟的SVF-SMC及SVF-EC柱吸回至毛细管中，并置于适当培养基中直到进一步使用。由琼脂糖棒组成的支撑结构如以下方法制备。将预温热的2%琼脂糖吸到毛细管(L=50mm)中，并快速冷却于冷的PBS溶液(4°C)中。将5cm长的凝胶化琼脂糖柱从毛细管中挤出(使用柱塞)，并笔直放在琼脂糖基盘上。第二个琼脂糖柱紧邻著第一个琼脂糖柱，重复该过程，直到挤出适当数目的琼脂糖柱来供应最终的管状几何结构。使用逐层的打印过程来制造含有SVF-SMC及SVF-EC多层细胞柱的管状血管构建物，其中在管状细胞构建物中心的琼脂糖柱由4%琼脂糖组成。一旦完成整个构建物，将0.5ml的温热琼脂糖分配到构建物的各个末端上，并在室温下进行凝胶化5分钟。在琼脂糖凝胶化之后，将30ml的SVF-SMC培养基添加到培养皿上(以确保整个构建物完全浸入)。在37°C及5%CO2下，培育构建物12至24小时，以使得相邻细胞柱之间附著。在12至24小时结束时，移出周围的琼脂糖支撑结构，分离出已附著的血管。
实施例4.具有HASMC-HDF-HAEC多细胞柱的血管构建物。
材料及方法
1.细胞培养
1.1平滑肌细胞：在37°C and 5%CO2下，于低糖DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中维持及扩增原代人类主动脉平滑肌细胞(HASMC；GIBCO/InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)，该低糖DMEM中补充有10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B、0.01MHEPES(所有均来自于Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)、50mg/L脯氨酸、50mg/L甘氨酸、20mg/L丙氨酸、50mg/L抗坏血酸及3μg/LCuSO4(所有均来自于Sigma,St.Louis,MO)。在所有研究中使用介于传代4及8之间的HASMC汇合培养。
1.2内皮细胞：原代人类主动脉内皮细胞(HAEC；GIBCO/Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)维持及扩增在Medium 199(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中，Medium 199中补充有10%FBS、1μg/ml氢化可的松、10ng/ml人类表皮生长因子、3ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10μg/ml肝素、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素及0.25μg/ml两性霉素B(所有均来自于Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。37°C and 5%CO2下，该等细胞生长在涂有动物胶(来自于猪血清；Sigma,St.Louis,MO)之经处理过的组织培养瓶中。在所有研究中使用介于传代4及8之间的HAEC汇合培养。
1.3成纤维细胞：在37°C及5%CO2下，将原代人类真皮成纤维细胞(HDF；GIBCO/Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)维持及扩增在Medium 106(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中，Medium 106中补充有2%FBS、1μg/ml氢化可的松、10ng/ml人类表皮生长因子、3ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10μg/ml肝素、100U/ml青霉素及0.1mg/ml链霉素(全部来自于Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。在所有研究中使用介于传代4及8之间的HDF汇合培养。
2.琼脂糖液及模
2.12％及4%(w/v)琼脂糖液的制备：1g或2g(分别用于2%或4%)的低熔点琼脂糖(Ultrapure LMP；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)溶在50ml杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中。简言之，在电热板上加热DPBS及琼脂糖到85°C，并持续搅拌直到琼脂糖完全溶解。在125°C下经蒸汽灭菌法将琼脂糖液灭菌25分钟。只要温度维持在36.5°C以上，琼脂糖液会维持在液相。低于这个温度时，相转变发生，琼脂糖液的粘度增加，琼脂糖形成固态凝胶。
2.2琼脂糖模的制备：使用可适配10cm培养皿的铁氟龙模来制造琼脂糖模，以用于培育细胞柱。简言之，使用70%乙醇溶液将铁氟龙模预先灭菌，并使该模接受UV光45分钟。将经灭菌的模置于10cm培养皿(VWR International LLC,West Chester,PA)上，并牢固地附于其上。此一装配(铁氟龙模+培养皿)保持垂直，并在铁氟龙模和培养皿之间的空间倒入45ml预温热、无菌2%琼脂糖液。接著将该装配水平放置在室温下1小时，以使得琼脂糖完全凝胶化。在凝胶化之后，移开铁氟龙印模，使用DPBS洗涤琼脂糖模两次。然后将17.5ml的HASMC培养基添加到琼脂糖模以用于培育混合细胞柱。
3.HASMC-HDF-HAEC柱
3.1HASMC-HDF-HAEC混合细胞柱的制造：为制备混合细胞柱，个别地收集HASMC、HDF、HAEC，然后以预定比例混合(例如HASMC：HDF：HAEC的比例为70：25：5)。简言之，从细胞汇合培养瓶中移除培养基，并用DPBS(1ml/10cm2生长区)洗涤细胞。经由在胰蛋白酶(1ml/15cm2生长区；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)存在下培育细胞10分钟，使细胞脱离培养瓶的表面。使用0.15％胰蛋白酶使HASMC及HDF脱离，而使用0.1％胰蛋白酶使HAEC脱离。培育之后，添加适当的培养基到瓶中(相对于胰蛋白酶体积的2X体积)。在200g下离心细胞悬浮液6分钟，接著将上清液完全移除。将细胞沉淀物再悬浮于各自的培养基中，并使用血球计数器计数。结合适当体积的HASMC、HDF及HAEC，以产生混合细胞悬浮液。在200g下离心混合细胞悬浮液5分钟，之后将上清液吸出。将混合细胞沉淀物再悬浮于6ml的HASMC培养基中，并转移到20ml小玻璃瓶(VWR International LLC,West Chester,PA)中，接著于37°C and 5%CO2下，在150rpm下的定轨振荡器上培育60分钟。此步骤会让细胞互相聚集，并开始细胞-细胞粘附。培育后，将细胞悬浮液转移到15ml离心管中，并在200g下离心5分钟。移除上层培养基之后，将细胞沉淀物再悬浮于400μl的HASMC培养基中，并用吸液管上下吸取数次，以确保所有细胞群集破裂。将细胞悬浮液转移到0.5ml微量离心管(VWR International LLC,West Chester,PA)中，置于15ml离心管内，接著在2000g下离心4分钟，以形成高密实的细胞沉淀物。吸出上层培养基，并经由抽吸将细胞转移到毛细管(OD 1.25mm,ID 0.266mm,L 75mm；Drummond Scientific Co.,Broomall,PA)中，以便产生50mm长度的细胞柱。在37°C及5%CO2下，将毛细管内的细胞糊培育在HASMC培养基中20分钟。然后使用毛细管配用的柱塞将细胞柱从毛细管中挤出到琼脂糖模槽(用HASMC培养基覆盖)中。在37°C及5%CO2下，培育细胞柱6至24小时。
4.具有多细胞柱的血管的制造(HASMC：HDF：HAEC)
4.1琼脂糖基盘的制备：经由将10ml的预温热(>40°C)琼脂糖(2%w/v)分配在10cm培养皿上来制造琼脂糖基盘。紧接在分配之后，将琼脂糖平均地铺开，以便覆盖整个培养皿的底部并形成均匀层。将培养皿培育在室温下20分钟，让琼脂糖完全凝胶化。
4.2多细胞血管：运用多细胞柱来制造由含所有三种细胞类型HASMC：HDF：HAEC的柱体组成的血管。运用分别有6或12个细胞柱及1或7个中心琼脂糖柱的几何配置。简言之，在6小时至12小时培育期结束时，将成熟的HASMC-HDF-HAEC柱吸回至毛细管中，并置于适当培养基中直到进一步使用。由琼脂糖棒组成的支撑结构如以下过程制备。将预温热的2%琼脂糖吸到毛细管(L=50mm)中，并快速冷却于冷的PBS溶液(4°C)中。将5cm长的凝胶化琼脂糖柱从毛细管中挤出(使用柱塞)，并笔直放在琼脂糖基盘上。第二个琼脂糖柱紧邻著第一个琼脂糖柱，重复该过程直到放置7或10个琼脂糖柱以形成第一层。进一步详细描述的是具有6个多细胞柱及1个中心琼脂糖柱的血管的制造。此时，将20μl之PBS分配在琼脂糖柱的上面，使他们保持湿润。再将两个琼脂糖柱放在层1的上面，第一个琼脂糖柱放在最左边，第二个琼脂糖柱放在最右边。然后将两个多细胞HASMC-HDF-HAEC柱放在层2的两个琼脂糖柱的右边。接著，将20μl的HASMC培养基分配到细胞柱的上面。然后将另两个琼脂糖柱放在两个多细胞柱的右边。在层的最左边用琼脂糖柱构建层3。将多细胞柱放置在彼柱的右边。接著将4%琼脂糖柱放置在多细胞柱的右边。将另一个多细胞柱放置在4%琼脂糖柱的右边。最后，将另一个2%琼脂糖柱放置在第二个多细胞柱的右边。其后，将20μl的HASMC培养基分配在细胞柱的上面。在最右边用2%琼脂糖柱开始构建层4，然后在琼脂糖柱的右边放置两个细胞柱。将最后一个琼脂糖柱放在两个多细胞柱的右边以完成层4。之后，将20μl的HASMC培养基分配在细胞柱的上面。将3个琼脂糖柱放在层4的上面来构建层5。一旦整个完成构建物，将0.5ml的温热琼脂糖分配在构建物的各个末端上，并在室温下进行凝胶化5分钟。琼脂糖凝胶化之后，将30ml的HASMC培养基添加到培养皿上(以确保整个构建物完全浸入)。在37°C及5%CO2下，培育构建物12至24小时，以使得相邻细胞柱之间附著。在12至24小时结束时，移出周围的琼脂糖支撑结构，得到已附著的多层血管(图3)。

Claims (39)

1.一种工程化多层血管，包含至少一层分化成体成纤维细胞、至少一层分化成体平滑肌细胞，其中任一层进一步包含分化成体内皮细胞，其中所述管具有下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约1：99至约45：55；(b)该工程化多层血管具顺应性；(c)该工程化多层血管的内径为约6mm或更小；(d)该管的长度至多约30cm；及(e)该工程化多层血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是该工程化多层血管没有任何预成型架。
2.根据权利要求1所述的工程化多层血管，其中其胀裂强度足以承受生理血压。
3.根据权利要求1所述的工程化多层血管，其中内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约5：95至约25：75。
4.根据权利要求3所述的工程化多层血管，其中内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约15：85。
5.根据权利要求1所述的工程化多层血管，其中该工程化多层血管的内径为约0.5mm或更小。
6.根据权利要求1所述的工程化多层血管，其中该工程化多层血管的厚度在该管的长度上为实质上相同。
7.根据权利要求1所述的工程化多层血管，其中该工程化多层血管实质上没有非分化成体成纤维细胞、非分化成体平滑肌细胞及/或非分化成体内皮细胞。
8.根据权利要求1所述的工程化多层血管，其中该管具有分支结构。
9.根据权利要求2所述的工程化多层血管，系用于药物测试或心血管装置测试。
10.根据权利要求9所述的工程化多层血管，其中该心血管装置为一个支架。
11.根据权利要求2所述的工程化多层血管，系用于修复受损的血管。
12.根据权利要求2所述的工程化多层血管，系用于治疗需要冠状动脉或外周血管旁路术或动静脉通路(arteriovenous access)的患者。
13.根据权利要求2所述的工程化多层血管，用于治疗患有终末期肾病、糖尿病、动脉硬化或先天性心脏出生缺陷的患者。
14.根据权利要求11-13所述的工程化多层血管，其中该工程化多层血管的成纤维细胞、平滑肌细胞及/或内皮细胞为自体的。
15.根据权利要求1所述的工程化多层血管，其中该管不受神经支配。
16.根据权利要求1所述的工程化多层血管，其中所述分化成体成纤维细胞为非血管成纤维细胞。
17.一种形成工程化多层血管的方法，包含：放置至少一个填料基质体，至少一个平滑肌细胞的多细胞体，其中该等细胞互相附著，至少一个内皮细胞的多细胞体，其中该等细胞互相附著，及至少一个成纤维细胞的多细胞体，其中该等细胞互相附著，以形成所要的血管结构，其中一或多个填料基质体形成该管的内腔，且数个填料基质体包围著该管；且使得该等工程化多层血管的多细胞体附著；条件是在任何时候未使用预成型架。
18.根据权利要求17所述的方法，其中在该工程化多层血管中内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约5：95至约25：75。
19.根据权利要求17所述的方法，其中该管之内腔的直径为约6mm或更小。
20.根据权利要求17所述的方法，进一步包含在成熟室中培养该工程化多层血管。
21.根据权利要求17-20所述的方法，其中一或多个细胞的多细胞体呈长状。
22.一种工程化多层血管，包含一层分化成体成纤维细胞的外层、至少一层分化成体平滑肌细胞及分化成体内皮细胞的内层，且其中所述管具有下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约1：99至约45：55；(b)该工程化多层血管的内径为约6mm或更小；(c)该管的长度至多约30cm；及(d)该工程化多层血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是该工程化多层血管没有任何预成型架。
23.根据权利要求22所述的工程化多层血管，其中内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约5：95至约25：75。
24.根据权利要求23所述的工程化多层血管，其中内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约15：85。
25.根据权利要求22所述的工程化多层血管，其中该工程化多层血管的内径为约0.5mm或更小。
26.根据权利要求22所述的工程化多层血管，其中该管具有分支结构。
27.根据权利要求22所述的工程化多层血管，其中该管的厚度沿著该管的长度为实质上相同。
28.根据权利要求22所述的工程化多层血管，实质上没有非分化成体成纤维细胞、非分化成体平滑肌细胞及/或非分化成体内皮细胞。
29.根据权利要求22所述的工程化多层血管，其中该管不受神经支配。
30.根据权利要求22所述的工程化多层血管，其中所述分化成体成纤维细胞为非血管成纤维细胞。
31.一种工程化血管，包含分化成体平滑肌细胞、分化成体内皮细胞及分化成体成纤维细胞，其中所述细胞互相附著，且其中所述管具有下列特征：(a)内皮细胞对平滑肌细胞的比例约1：99至约45：55；(b)该工程化血管的内径为约6mm或更小；(c)该管的长度至多约30cm；及(d)该工程化血管的厚度沿著该管的一个区域为实质上相同；条件是该工程化血管没有任何预成型架。
32.根据权利要求31所述的工程化多层血管，其中其胀裂强度足以承受生理血压。
33.根据权利要求31所述的工程化多层血管，其中内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约5：95至约25：75。
34.根据权利要求33所述的工程化多层血管，其中内皮细胞对平滑肌细胞的比例为约15：85。
35.根据权利要求31所述的工程化多层血管，其中该工程化多层血管的厚度在该管的长度上为实质上相同。
36.根据权利要求31所述的工程化多层血管，其中该工程化多层血管实质上没有非分化成体成纤维细胞、非分化成体平滑肌细胞及/或非分化成体内皮细胞。
37.根据权利要求31所述的工程化多层血管，其中该管具有分支结构。
38.根据权利要求31所述的工程化多层血管，其中该管不受神经支配。
39.根据权利要求31所述的工程化多层血管，其中所述分化成体成纤维细胞为非血管成纤维细胞。
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