CN101584612A - 一种基于原位自体干细胞技术的再生型人工血管及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于原位自体干细胞技术的再生型人工血管及其制备方法。所述人工血管是是由至少三个相连接的仿生支架层构成的组织结构，所述仿生支架层由纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶制备得到；所述组织结构为同心圆环，自内向外依次为内层、隔离层和外层；所述内层和外层水溶胶内包覆有一种或几种特异性抗体和/或细胞因子和/或粘附短肽和/或药物。所述制备方法是：利用静电纺制备内层；在内层外表面制备隔离层；在隔离层外表面制备外层。本发明的人工血管根据创面修复过程自动安全降解，在降解过程的同时缺损的和血管得到了完全修复，这使得再生过程与正常分化过程一致，能达到良好的修复效果。

Description

一种基于原位自体干细胞技术的再生型人工血管及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种基于原位自体干细胞技术的再生型人工血管及其制备方法，属于生物医学技术领域。

背景技术

血管病变尤其是冠状动脉的闭塞性病变是人类主要病死原因之一，其主要的治疗方法是血管搭桥手术，这就需要各种直径的血管移植物作为修补材料。根据天然血管的性能及作为血管替代物的考虑，因此美国血管外科学会列举出下列作为人工血管应具备的条件。其中安全性的条件有：在生物体内的物性稳定；在化学上稳定并且无毒性；没有异物反应；不诱发癌症；没有变态反应；疲劳强度大制造简单并且成本低；消毒简单。除对这样的材料的安全性的条件之外，又要求具有下述等的生物体适应性和移植后的性能：高度的组织相容性、具有优异的抗血栓性；具有比得上生物体血管的伸缩率；要有足够的强度以免在血压变化时出现破裂；要有弹性来承受循环负荷：要与邻近的自体血管有良好的愈合性能：能迅速地得到治愈良好的新生内膜；移植后能维持管腔的长期通畅，从而提高血管移植手术的长期疗效。人工血管替代物必须在移植的同时就有良好的物理性能，也就是说，移植物本身的力学性能要符合天然血管的要求。

目前临床已经应用的血管移植物包括天然血管和合成材料管道。

天然血管包括自体血管、异体和异种血管。目前血管操作多数采用自体血管移植。因为临床上很容易得获得自体中小血管(全身的浅静脉多不胜举)作为桥接物，无排异的担忧。自体静脉移植是血管外科最常见的手术方案，手术成功率较高。异体和异种移植多用于大血管。因为大血管手术切除后(如腹主动脉瘤)很难找到合适管径的自体血管。但正常血管的内1/3由管腔内血液渗透供给营养，而血管壁2/3由滋养血管供给营养。无论是新鲜自体血管移植还是异体血管移植，移植的血管将要断绝血供，该移植血管段均不能直接复活，所移植血管段经过变性及血管内皮的脱落与再生，最终血管内膜被光滑平坦的复层内皮细胞所覆盖，血管壁被纤维组织所取代，自体血管与异体血管移植后的组织学变化类同，移植后3～14d，移植血管段退变显著，吻合口有不同程度狭窄，此期多导致血管栓塞。自体血管移植成功率虽然高，但由于手术后血管内膜增殖和血管重塑，术后1～2年内就有20％～40％的病人出现移植血管再狭窄，导致手术失败。尤其是对于直径在6mm以下的小口径动脉和血流缓慢的静脉更易导致栓塞。除此之外，异种和异种血管无法完全避免因异种组织和异种细胞的排斥反应，用药剂进行完全地交联和固定该残存细胞，所以完全不能置换自己的生物体，因此也不能促进内皮化，另外也不能再生寄生的细胞。并且，由于存活率差在目前己经不再使用。

在目前所提供使用或所报导的合成材料人工血管中，主要可列举以下的人工血管：涤纶为基材的人工血管；ePTFE为基材的人工血管。

以涤纶作为基材的人工血管，曾有报导在长期使用时发生动脉瘤的病例，并且，在临床病例中不能确认包覆内皮细胞。最近，虽有用胶原或明胶包覆该基材作为大口径人工血管使用，但是也能见到被认为是在制作阶段的内毒素的原因造成手术后不明的低烧发生。

以ePTFE为基材的人工血管，其组织亲和性低，因此不能使内皮细胞再生，而对在吻合部形成血管翁的小口径人工血管的长期存活性不能得到满意的结果。

所有上述血管都有一个共同的问题，就是抗凝血性能未能很好的解决。

抗凝血性能是目前人工血管面临的主要问题之一。因为长期的血液动力学表明：由于血液的栓塞作用，血液几乎无可避免的会发生人工血管狭窄，以至于栓塞。目前人工血管替代物仅在大中动脉上取得较好的临床效果，在小口径动脉和静脉上仍有问题。

抗凝血问题在目前的大、中动脉人工血管代用方面不太突出，但在小口径动脉(＜6mm)和静脉移植上的疗效仍然不佳，主要是因为血管代用物管径细和血流速度缓慢，极易发生狭窄和血栓栓塞有关。特别是对于6mm以下的小口径血管，在临床上应用上，其长期阻塞几乎无可避免。对于大血管，虽然目前等人工血管可在一定程度上满足临床需要，但仍需要外用抗凝、药物洗脱、人工血管表面进行抗凝修饰等多种方式抗凝血，能在一定程度上血栓形成，但植入血管需终生使用，其长期的抗凝效果不甚理想。而且目前的人工血管不能降解，一直作为异物存在人体内，且抑制血管细胞的再生功能。由于内皮细胞在抗血栓形成、抑制血小板聚集、分泌血管活性因子等方面的重要作用，人工血管的内皮化是最终解决血管血栓形成及内膜增生的最有效方法。但以往人工血管的内皮化不甚理想，究其原因在于血管内皮细胞的再生能力非常有限，宿主内皮细胞由吻合口向人工血管内迁徙仅限于吻合口周2cm。

因此，为了达到理想的修复效果，修补材料必须尽可能与天然血管接近。但血管的复杂结构和功能使血管替代物必须具有复杂的结构。

天然血管除毛细血管外，其管壁结构由内向外依次分为内膜、中膜和外膜三层。

动脉三层结构如下：(1)内膜：最薄，由内皮、内皮下层和内弹性膜组成。内皮是单层扁平上皮，表面光滑，可减少血液流动的阻力。内皮下层是薄层结缔组织，内含少量胶原纤维、弹性纤维和少许平滑肌纤维。内弹性膜是一层由弹性蛋白构成的膜，富有弹性。(2)中膜：最厚，由平滑肌和弹性纤维等构成。大动脉的中膜以弹性纤维为主，中、小动脉的中膜以平滑肌为主，故中、小动脉也称肌性动脉。小动脉平滑肌的舒缩，可明显改变血管的口径，影响其灌流器官的血流量，而且可改变血液流动的外周阻力，影响血压。(3)外膜：较厚，主要由疏松结缔组织构成。外膜中有小血管、淋巴管和神经分布。

静脉与各级相应的动脉比较，静脉的管径较大，管壁较薄，弹性小。静脉的管壁也分内膜、中膜和外膜，但三层的分界不明显。静脉的内膜薄，由一层内皮和结缔组织构成；中膜稍厚，主要由一些环行平滑肌构成；外膜最厚，由疏松结缔组织构成。大静脉的外膜内还含有较多的纵行平滑肌。

综上所述，血管特征性地由血管平滑肌细胞和内皮细胞共同培养制备。前者功能在于提供有血管活性的结构，这是对变化的血管动力学条件短期和长期适应的必要因素，而内皮细胞则为与血液相互作用的替代物提供非凝血界面。这两者的存在对植入后的正常生理功能必需的。因此采用组织工程技术制作出内层有有利于内皮细胞生长覆盖、外层便于平滑肌细胞增长有活性的小口径血管，才是能够取得满意的相容性和长期的通畅率的有效方法之一。

用生物和合成材料生产具有生理功能的组织替代物用于心血管替代治疗，是一个对自体天然组织替代的极具吸引力的可选择方法。因此，组织工程方法学作为构建血管的通用策略出现在实验研究中，目前至少有4种不同的设计血管替代物的方法，但将这些方法维系在一起的基本概念是在构建物中引入活细胞成分，这样的血管构建物可从各种生物材料支架构建，保证细胞功能被发行为具有所替代组织器官的特定功能。

目前对细胞的引入有两种方法：一种是须在植入前将细胞引入替代物，另一种则是是在植入后由体内募集细胞。

在植入前将细胞引入替代物的优势在于，由此得到的人工血管在起始就有良好的血管活性和抗凝血界面。然而，由于引入了异体细胞，引起免疫排斥，同时还存在着病毒及疾病传播的风险。尤其外源性内皮细胞和平滑肌细胞两者都不是免疫豁免细胞，到目前为止组织工程血管的免疫可接受性都被认为是一个相当大的难题。而在植入后由体内募集细胞可避免上述缺点。

因此，目前理想的人工血管，是类似于天然血管有不同结构层次的人工血管替代物。其内层可捕获内皮干细胞，并结合适当的细胞因子，能诱导其快速分化为内皮细胞，这种募集必须以相当快的速率进行，且其内层应有一定的孔隙便于内皮细胞粘附及增长，而且也应尽可能的平滑以便减小管壁对血液的阻力以及血液对管壁的冲刷；外层结构可捕获平滑肌细胞干细胞，结合并结合适当的细胞因子，能诱导其快速分化为平滑肌细胞，外层孔隙便于平滑肌细胞可以深入牢固生长。其本身在诱导血管再生后在体内可完全降解吸收，而其本身则有合适的生物动力学性能，兼有力学支持、抗血流压力等功能，在血管再生前能满足做为临时血管替代的要求。

由于血管的血液动力学特征，血管壁也展现出显著的生物力学特性，血液动力学环境对血管施加了显著的负荷，在血管的某些部位，近10％径向应变的周期性扩张。这种组织结构在组织工程血管构建物中验证以模仿，但在发展功能性血管替代物时，必须意识到血管完整性中的两个部分，血管强度和血管弹性的重要性。血管构建物必须能维持血管系统的工作压力，具有与天然血管相似的弹性恢复能力。

由于需要捕获细胞并诱导其分化增殖，这类人工血管同时作为了特定细胞培养的三维的立体支架和血管细胞的基质材料，使接种细胞能定位、贴附、局域化生长增殖，同时材料可使细胞在支架空间分布排列有序，分化具有特定功能并合成适当的细胞外基质。除此之外，为了有利于其生长，应具有适当的孔径。满足以上要求的这类人工血管的材料可分为生天然大分子材料和人工材料两类。天然材料来源于生物体，由天然生物物质构成，可分为大分子无结构材料，如胶原胶、藻酸盐等。植入体内时，且无或极低免疫排斥反应。受体自身血管与移植血管相容性好，构成血管的顺应性、通畅率等都优于非生物性材料而管。弹性蛋白提供了独特的力学性能，也许对组织工程血管长期周期性重复负荷而不发生阻塞是必需的。人工材料主要是高分子聚合物材料，在组织工程中应用广泛，合成可上规模，材料的强度、降解速率和微结构等特性易于控制。常用有聚乙醇酸(PGA)，聚乳酸(PLA)，或PGA与PLA共聚物(PLGA)，其他降解聚合材料还有聚羟基辛酯(PHO)，PGA-聚羟基烷酯(PHA)等新材料。

为了达到捕获内皮干细胞和平滑肌细胞干细胞的目的，需要在支架上接连入适当的细胞因子或/和不同的特异性抗体；为了诱导其迁移、分化及增殖，也需要在支架上接连入适当的细胞因子。而内皮干细胞和平滑肌细胞干细胞在体内来源广泛，与血管直接接触，无组织屏障。目前临床上已证实，在血管受到损伤后，能动员骨髓来源的内皮干细胞，有大量的内皮干细胞进入血液；且血液中的单核细胞也能转化为内皮干细胞。平滑肌干细胞来源更广泛，不仅可以来源于骨髓来源造血干细胞和间充质干细胞，还能来源于脂肪干细胞、骨骼肌干细胞、血管外膜细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞及单核细胞。此外，内皮细胞和平滑肌细胞还能从吻合口移行长入，但在没有外界其它因素影响的条件下，内皮细胞仅限于吻合口周2mm，其修复能力有限。如果能有效提高其修复能力，则能达到在体内完全修复的目的。为实现这一，则需要达到让更多的干细胞吸附于血管损伤部位并进一步分化为内皮细胞和平滑肌细胞。

生物打印技术是近年来出现的新技术。生物打印能按预定计划精确定位，这和传统打印技术的特点是一致的。生物打印的理论研究来源于一般的纸质打印，生物打印的纸片理论上设计为一种在体内可降解的生物纸片；生物打印的墨水理论上设计为特制的细胞溶液或有生物活性的细胞因子溶液，即“生物墨水”。将这种特制溶液喷射到可生物降解的生物纸片上。打印后再将纸片按一定顺序的堆叠。由于使用了打印技术，可以将细胞或/和细胞因子(“生物墨水”)精确的结合到预定部位；而按特定的堆叠方式的生物纸片则会形成三维结构。理论上如果所用的生物墨水是细胞溶液，则形成三维的组织结构和器官，最后生物纸片降解，细胞保留下来，形成立体结构，例如，活的三维组织、血管和器官。采用生物打印技术这种制备方法制备得到一种纳米仿生材料有望解决上述现有材料的不足。

但是生物打印技术仍处于基础研究的阶段，生物纸片具体是一种什么样的物质、细胞或/和细胞因子生物墨水具体是怎样的组成、如何实现所述的堆叠，都是理论上的一些探讨和设想，还没有出现具体的可直接利用细胞通过生物打印成功制备的纳米仿生材料，也没有见到相关技术报道。生物打印还是是一种立体打印技术，可直接在曲面上进行，因此极大的方便了具有复杂立体结构的产品。

利用生物打印技术，不仅可以打印细胞，也可以打印药物，比如在上述说到的人工血管内表面打印抗凝血药物，在内皮干细胞募集和分化为内皮细胞之前，可起到短暂的抗凝血作用。

发明内容

本发明的目的在于克服目前已有技术中存在不足，提供一种具有良好力学性能和组织相容性、能在体内完全降解吸收、能和特异性抗体/药物/细胞因子精确结合、能在体内捕获血管内周及外周的干细胞并促使其按设计要求分别分体为内皮细胞和平滑肌细胞细胞、最终实现人工血管内层内皮化、外层平滑肌化、基于原位自体干细胞技术的、可诱导天然血管完全再生的人工血管，其成本低、生产周期短、保存、运输容易、无病毒或相对安全、无免疫排斥或免疫排斥作用极低，能达到完全抗血栓形成、防止血管再狭窄发生，达到天然血管应有的力学性能，用于临床上修复血管缺损或血管搭桥。

本发明的另一个目的是提供上述人工血管的制备方法，所述方法利用生物打印技术成功制备得到纳米仿生材料，简单易行、可适应大规模生产、成本低，同时拓宽了生物打印技术应用范围的，还具体定义了生物打印技术的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种基于原位自体干细胞技术的再生型人工血管，包括纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶，所述水溶胶内包覆有一种或几种特异性抗体和/或细胞因子和/或粘附短肽和/或药物。

上述纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶制备得到仿生支架层，所述人工血管是由至少三个相连接的仿生支架层构成的组织结构，所述组织结构为同心圆环结构，自内向外依次为内层、隔离层和外层；面向血液、向管内腔的一层为内层，向外腔一为外层；两层之间还有隔离层，隔离层可以是一层，也可以是两层或多层。所述内层和外层水溶胶内包覆有一种或几种特异性抗体和/或细胞因子和/或粘附短肽和/或药物。

任意两个相邻仿生支架层之间的连接方式优选通过电纺连接。

本发明所述人工血管的内层设计为可快速捕获内皮干细胞和促进其生长分化为内皮细胞，外层设计为可捕获平滑肌干细胞和促进其生长分化为平滑肌细胞。内层为了有效诱导内皮干细胞捕获及生长分化为内皮细胞，不仅引入了适当的细胞因子，还通过静电纺丝参数调整，设计上将平均孔径达到100～500nm，这样有利于内皮细胞的粘附、增殖和生长分化。外层为了有效诱导平滑肌干细胞捕获及生长分化为平滑肌细胞，不仅引入了相应的适当的细胞因子，还通过静电纺丝参数调整，设计上将平均孔径达到5-50μM，这样有利于平滑肌细胞的迁入、粘附、增殖和生长分化。

此外，由于内外两层诱导的细胞群不同，其生长分化方向不同，其适用的细胞因子及其浓度和分布也不相同，为了分隔这两者，增加隔离层，结构致密，采用疏水性能好的材料，通过疏水作用起到阻隔内外两层细胞因子及细胞的作用，防止其相互干扰。所述隔离层的孔径分布达到隔离的作用即可，允许在一定合理的范围进行调整，但本发明选择的优选范围为不超过100nm。

本发明为了达到捕获并诱导其迁移、分化及增殖细胞的目的，要在支架上精确结合内皮干细胞和平滑肌细胞干细胞的不同的细胞因子和/或可以捕获相应细胞的特异性抗体或粘附短肽。

所述细胞因子是对内皮干细胞或平滑肌干细胞的归巢、趋化、生长、分化、增殖、表达起作用的因子。对于内皮干细胞来说，包括：内皮生长因子趋化因子SDF-1、层粘连蛋白、生长因子蛋白等等；对于平滑肌细胞包括：血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子、血管生成素等等，其中血管内皮生长因子研究最为热门，因为它在多种组织中广泛表达，有很强的促血管生长作用。

所述特异性抗体是可以捕获相应细胞的特异性抗体，优选细胞膜表面特异性抗体。可以捕获内皮细胞的特异性抗体，优选内皮细胞膜表面特异性抗体，如CD34抗体、CD133抗体等。可以捕获平滑肌干细胞的特异性抗体，优选内皮细胞膜表面特异性抗体，如CD59抗体、、SMA(抗平滑肌细胞抗体)等。

所述粘附短肽是可捕获内皮干细胞或平滑肌干细胞并诱导干细胞分化为内皮细胞或平滑肌细胞并进一步生长增殖的细胞因子，如：Gly-Arg-Gly-Asp、Arg-Gly-Asp等。

所述药物是抗凝血药物。如肝素，氯吡格雷，波立维，速碧林，克赛，法安明，拜阿司匹灵，丹奥等等。

所述纳米仿生支架是采用支架材料通过静电纺丝技术制备得到，所述支架材料包括：聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、聚对二恶酮、丙交酯、乙交酯、丁内酯、戊内酯、己内酯、环氧乙烷、环氧丙烷、聚氨酯类、聚碳酸酯、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤维素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、海藻酸、硫酸软骨素，肝素，琼脂，葡聚糖、褐藻酸。将上述材料溶于一定的溶剂，形成电纺液，就可以通过静电纺丝技术得到纳米仿生支架。这些溶剂可以为甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它们任意比例的混合物。上述的高分子材料和溶剂用于静电纺丝的相关技术，例如材料与溶剂的重量比例等参照现有技术。

用所述一种或两种以上混合材料通过静电纺丝技术，可以按照具体需要做出合适孔径和直径及理化性能的纳米材料。此项工艺在本发明制备方法一节有详细叙述，操作简单，所得到的纤维是纳米级的，比传统的方法得到的无纺布直径小几个数量级，其直径分布是从纳米级别直到微米，并可通过工艺参数调整得到不同直径，做到和人体组织高度相似，形成的网状结构的孔径大小和其分布也可调整，以利于不同类型的细胞迁入，又或为了达到防粘连的目的，可以做到孔径小于细胞直径，以防止细胞迁入。此外，人体细胞直径平均在10-20μM，平均孔径在3μM以下，已经可以有效的防止细胞迁入。静电纺纤维得到的孔隙大小分布很大程度上依赖于纤维直径，已知纤维直径减小时，孔径也在同时减小。据已发表的文献，纤维直径在4-10μM时，孔径从20-45μM；据文献报道，静电纺再生丝素纤维非织造织物的平均孔径可达到2μM。此外，为达到阻隔小分子的目的，还可以采用疏水性高分子材料，其中优选疏水能好的如疏水性聚氨酯、聚碳酸酯、聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯或聚对苯二甲酸乙二酯。由于目前高分子材料改性研究在不断发展，原本亲水性材料改性为疏水或疏水材料改性为亲水都越来越常见，范围也越来越广。

所述水溶胶可以是以下聚合物制成的水溶胶：多糖类聚合物，如淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸或壳聚糖；多肽类聚合物，如胶原、聚L-赖氨酸或聚L-谷胺酸；合成的亲水高分子聚合物，如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚N-聚代丙烯酰胺。上述聚合物制备的水溶胶通过改变温度、酸碱度、经紫外线照射或者加入交联剂(固化液)等方法，可由液态转变为固态。

本发明同时提供了上述人工血管的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备电纺溶液、含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液；

(2)用静电纺丝制备人工血管的内层纳米仿生支架，用喷墨打印机将含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述内层纳米仿生支架上；

(3)在内层纳米仿生支架外表面通过用静电纺丝或浸涂法制备隔离层；

(4)在隔离层上用静电纺丝制备人工血管的外层纳米仿生支架，用喷墨打印机将含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述外层纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。

所述步骤(2)、(3)、(4)均可以重复若干次，以制备不同厚度的层。

步骤(2)所述的通过静电纺丝制备隔离层这一技术方案也可利用已有技术来制备，如浸涂法，即将内层纳米仿生支架浸入制备隔离层的电纺溶液后取出，使其表面附着隔离层；还可以通过其他能够实施本发明的已有技术制备隔离层。

本发明的步骤(1)是为了制备人工血管各层的准备工作，但实际上制备所需溶液既可以都先制备好，也可以仅在制备人工血管某一特定结构之前制备相应的溶液，因此本发明的保护范围及于在任何不影响本明实施时制备电纺溶液、含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液。

步骤(1)所述含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液可以是含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶缓冲液；所述特异性抗体和/或细胞因子和/或药物所占质量百分比总数不高于10％。

所述药物是抗凝血药物。如肝素，氯吡格雷，波立维，速碧林，克赛，法安明，拜阿司匹灵，丹奥等等。

步骤(1)的优选方案之一是所述水溶胶缓冲溶液为藻酸盐或藻酸盐与其它物质的混合溶液，交联剂溶液为氯化钙溶液；或所述水溶胶缓冲溶液为纤维蛋白原溶液，交联剂溶液为凝血酶溶液；或所述水溶胶缓冲溶液为透明质酸碳酸氢钠溶液，交联剂溶液为酰肼或碳化二亚胺；或所述水溶胶缓冲溶液为胶原-聚阴离子溶液，交联剂为碳化二亚胺。

步骤(2)所述静电纺丝的优选参数为：注射泵推进速度为0.1～20ml/h，纺丝针头为10、12、14、16、18或20号针头，施加电压为5～50KV，调节接收装置的接收距离为5.0-50厘米，接收喷丝的细胞培养皿中装有交联剂溶液。生物打印的纸片为电纺制得的纳米仿生支架。

所述喷墨打印机优选改装的惠普550C喷墨打印机，改装方法参考美国专利US 7051654。

经清洗、灭菌、包装后贮存。

本发明更为详细的制备方法的步骤如下所述：

1、制备血管内层

(1)制备内层电纺溶液、含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液；

(2)用静电纺丝制得纳米仿生支架；用圆柱外周不停旋转接收纺丝，接收成为圆管状

(3)用喷墨打印机将含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。由于生物打印是一种立体打印，可直接在曲面上进行。

上述(2)、(3)步骤可反复进行，直到达到理想的内层厚度。

2、制备隔离层

采用静电纺丝制备或涂层制备：

(1)静电纺丝制备

制备隔离层电纺溶液；用静电纺丝制得纳米仿生支架；用圆管外周不停旋转接收纺丝，接收成为管状

(2)涂层制备

制备合适的阻隔层高分子聚合物溶液；将滚轴连同纺好的血管内层一并取下并浸没入聚合物溶液一段时间；取出，晾干；

3、制备血管外层

(1)制备外层聚合物的电纺溶液特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液；

(2)用制得的外层聚合物的电纺溶液在所述已纺就的内层上，通过静电纺制备外层，仍用圆柱外周不停旋转接收纺丝，成为人工血管的外管壁

(3)用喷墨打印机将含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。

本发明的静电纺丝技术方案均可以参照现有技术配制电纺溶液，上述的限定实际上是优选方案，未穷尽列举所有可选方案，凡是本领域中专业技术人员能预见到的利用本发明原理实施的技术方案，也是本发明所要保护的范围。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明结合了电纺丝技术及生物打印技术，将特定的特异性抗体和/或细胞因子和/或药物结合在纳米支架内和/或纳米支架表面，大大增强了纳米仿生材料对组织修复、组织再生的效果，有广阔的应用前景：

具体来说：

(1)采用了原位干细胞工程技术，采用体内募集细胞的技术，将自体干细胞吸附于在固定在支架上的特异性抗体上，并结合了细胞因子并促进其按设计要求生长分化，即避免了使用细胞引入的诸多风险，又能达到器官移植同等的修复效果；

(2)本发明利用生物打印技术，将特异性抗体和/或细胞因子和/或药物等生物物质按设计要求与纳米支架精确结合，细胞因子和刺激原在体内环境条件下可控释放，形成诱导与体内相似的微环境，诱导细胞在体外自组装为具有生理功能的人工血管。

(3)在固定在支架上结合了内皮干细胞和平滑肌干细胞的特异性抗体上，前者可快速募集内皮干细胞，达到迅速内皮化的目的，避免产生凝血。

(4)本发明所使用的材料是目前已经证实对人体无毒无害的安全生物材料，是人工材料，即不会带来免疫排斥、病毒传播、疾病传染的诸多风险，也不会带来其我它毒害作用。

(5)本发明的人工血管替代物本身不含活细胞成分，不使用外源细胞和蛋白，免除了因此而带来免疫排斥、病毒传播、疾病传染的诸多风险；

(6)本发明的人工血管由于不含活细胞成分，材料来源充分，成本较低，避免了天然材料来源不足，成本高，改性复杂的缺点，贮存运输简单；

(7)本发明的人工血管的制备方法工艺步骤简化，生产时间短，能有效避免加工过程中产品受到污染，产品质量易于控制，产品标准容易实现，产品可实现低成本、高效率的产业化生产。

(8)本发明的人工血管根据创面修复过程自动安全降解，在降解过程的同时缺损的和血管得到了完全修复，这使得再生过程与正常分化过程一致，达到良好的修复效果。材料在新生组织生成后被完全吸收的，避免了免疫组织反应；

(9)同时利用生物打印技术和静电纺丝技术制作的纳米仿生材料，药物可以做到有效按浓度和位置要求分布，加入的药物可以按目的调节其位置和用量，如：可以仅在人工血管内表面加入，起到起始抗凝的作用。

附图说明

图1为本发明人工血管的结构示意图；图中1为平滑肌细胞干细胞归巢因子及平滑肌细胞分化因子；2为人工血管外层；3为人工血管阻隔层；4为人工血管内层；5为内皮祖细胞归巢因子和内皮细胞分化因子。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

制备基于原位自体干细胞技术的再生型人工血管：

(1)制备电纺溶液、含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液：

电纺液选择L-聚乳酸和ε-聚己内酯，两者比值为50∶50，作为共聚高分子材料，溶于六氟异丙醇，质量百分比浓度3％；交联剂溶液选用0.1M氯化钙溶液；含有细胞因子的水溶胶溶液采用内皮生长因子藻酸盐溶液和血管生成素藻酸盐溶液。所述内皮生长因子藻酸盐溶液中内皮生长因子的质量百分比浓度为100ppm。

(2)用静电纺丝制备人工血管的内层纳米仿生支架，用喷墨打印机将含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述内层纳米仿生支架上：

将配置好的0.1M氯化钙溶液放入容器中，置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子定位打印；将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中；本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为5毫升/小时，调节高压发生器的电压为30KV，调节接收装置的接收距离为20厘米，用不断旋转的圆柱将纤维接收为管状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。纺丝和打印重复5次，制得人工血管的内层纳米仿生支架，厚度约0.2mm。

所得内层孔径平均0.4μM。

用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述内层纳米仿生支架上，待水溶胶固化后进行步骤(3)。

(3)在内层纳米仿生支架外表面通过用静电纺丝制备隔离层：

电纺液选择疏水性的L-聚乳酸和ε-聚己内酯，两者比值为70∶30，作为共聚高分子材料，溶于六氟异丙醇。

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0.8毫升/小时，调节高压发生器的电压为20KV，调节接收装置的接收距离为20厘米，用圆柱在原来的管壁并将纤维接收为管状结构。静电纺丝60分钟，关闭静电纺丝。

所得隔离层平均孔径80nm。

(4)在隔离层上用静电纺丝制备人工血管的外层纳米仿生支架，用喷墨打印机将含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述外层纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得：

外层电纺液选择疏水性的L-聚乳酸和ε-聚己内酯，两者比值为50∶50，作为共聚高分子材料，溶于二氯甲烷，浓度7％；交联剂溶液选用0.1M氯化钙溶液；

含有细胞因子的水溶胶溶液采用血管生成素和SDF-1细胞因子的藻酸盐溶液，所述细胞因子藻酸盐溶液血管生成素的质量百分比浓度为100ppm，所述细胞因子藻酸盐溶液SDF-1的质量百分比浓度为100ppm。

将配置好的0.1M氯化钙溶液放入容器中，置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，例如可参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子定位打印。将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中。本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为10毫升/小时，调节高压发生器的电压为13KV，调节接收装置的接收距离为30厘米，用圆柱在原来的阻隔层外将纤维接收为管状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。

纺丝和打印重复20次，制得人工血管的外层纳米仿生支架，厚度约1.2mm。

所得外层平均孔径7μM。

用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述外层纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得人工血管。

3、将制得的人工血管用蒸馏水漂洗5遍，经冻干后真空包装，经25kGy钴-60灭菌后负20摄氏度低温保存。

实施例2

制备基于原位自体干细胞技术的再生型人工血管：

(1)制备电纺溶液、含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液：

电纺液选择丝素蛋白与明胶，两者比值为50∶50，作为共聚高分子材料，溶于甲酸，浓度10％；交联剂溶液选用100mg/ml水溶性碳化二亚胺溶液；含有细胞因子的水溶胶溶液采用细胞因子的胶原与聚阴离子溶液，其中胶原浓度为1％，聚阴离子采用聚谷氨酸，浓度50mg/ml。所述水溶胶溶液中CD34抗体的质量百分比浓度为10ppm。

(2)用静电纺丝制备人工血管的内层纳米仿生支架，用喷墨打印机将含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述内层纳米仿生支架上：

将配置好的0.1M氯化钙溶液放入容器中，置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子定位打印；将配好的细胞因子溶液装入喷墨打印墨盒中；本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为5毫升/小时，调节高压发生器的电压为20KV，调节接收装置的接收距离为11厘米，用不断旋转的圆柱将纤维接收为管状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。纺丝和打印重复5次，制得人工血管的内层纳米仿生支架，厚度约0.2mm。

所得内层孔径平均0.1μM。

用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述内层纳米仿生支架上，待水溶胶固化后进行步骤(3)。

(3)在内层纳米仿生支架外表面通过用静电纺丝制备隔离层：

电纺液选择疏水性的L-聚乳酸和ε-聚己内酯，两者比值为70∶30，作为共聚高分子材料，溶于六氟异丙醇。

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0.8毫升/小时，调节高压发生器的电压为20KV，调节接收装置的接收距离为20厘米，用圆柱在原来的管壁并将纤维接收为管状结构。静电纺丝60分钟，关闭静电纺丝。

所得隔离层平均孔径80nm。

(4)在隔离层上用静电纺丝制备人工血管的外层纳米仿生支架，用喷墨打印机将含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述外层纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得：

外层电纺液选择聚己内酯，溶于二氯甲烷，浓度14％；交联剂溶液选用100mg/ml水溶性碳化二亚胺溶液；含有细胞因子的水溶胶溶液采用细胞因子的胶原与聚阴离子溶液，其中胶原浓度为1％，聚阴离子采用聚谷氨酸，浓度50mg/ml，水溶胶溶液采用VCAM-1和SDF-1细胞因子溶液，所述细胞因子溶液血管生成素的质量百分比浓度为100ppm，所述VCAM-1的质量百分比浓度为100ppm。

将配置好的100mg/ml水溶性碳化二亚胺溶液放入容器中，置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，例如可参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作细胞因子定位打印。将配好的细胞因子溶液装入喷墨打印墨盒中。本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为15毫升/小时，调节高压发生器的电压为25KV，调节接收装置的接收距离为35厘米，用圆柱在原来的阻隔层外将纤维接收为管状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。

纺丝和打印重复40次，制得人工血管的外层纳米仿生支架，厚度约2.5mm。

所得外层平均孔径11μM。

用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得人工血管。

3、将制得的人工血管用蒸馏水漂洗5遍，经冻干后真空包装，经25kGy钴-60灭菌后负20摄氏度低温保存。

实施例3

制备基于原位自体干细胞技术的再生型人工血管：

(1)制备电纺溶液、含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液：

电纺液选择L-聚乳酸和ε-聚己内酯，两者比值为50∶50，作为共聚高分子材料，溶于六氟异丙醇，浓度3％；交联剂溶液选用0.1M氯化钙溶液；含有细胞因子的水溶胶溶液采用内皮生长因子藻酸盐溶液和血管生成素藻酸盐溶液。所述内皮生长因子藻酸盐溶液中内皮生长因子的质量百分比浓度为100ppm。

(2)用静电纺丝制备人工血管的内层纳米仿生支架，用喷墨打印机将含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述内层纳米仿生支架上：

将配置好的0.1M氯化钙溶液放入容器中，置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子定位打印；将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中；本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为7毫升/小时，调节高压发生器的电压为30KV，调节接收装置的接收距离为20厘米，用不断旋转的圆柱将纤维接收为管状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。纺丝和打印重复5次，制得人工血管的内层纳米仿生支架，厚度约0.2mm。

所得内层孔径平均0.5μM。

用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述内层纳米仿生支架上，待水溶胶固化后进行步骤(3)。

(3)在内层纳米仿生支架外表面通过用静电纺丝制备隔离层：

电纺液选择疏水性的L-聚乳酸和ε-聚己内酯，两者比值为70∶30，作为共聚高分子材料，溶于六氟异丙醇；交联剂溶液选用0.1M氯化钙溶液。

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0.8毫升/小时，调节高压发生器的电压为20KV，调节接收装置的接收距离为20厘米，用圆柱在原来的管壁并将纤维接收为管状结构。静电纺丝60分钟，关闭静电纺丝。

所得隔离层平均孔径80nm。

(4)在隔离层上用静电纺丝制备人工血管的外层纳米仿生支架，用喷墨打印机将含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述外层纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得：

外层电纺液选择聚己内酯，溶于二氯甲烷，浓度12％；交联剂溶液选用0.1M氯化钙溶液；

含有细胞因子的水溶胶溶液采用血管生成素和SDF-1细胞因子的藻酸盐溶液，所述细胞因子藻酸盐溶液血管生成素的质量百分比浓度为100ppm，所述细胞因子藻酸盐溶液SDF-1的质量百分比浓度为100ppm。

将配置好的0.1M氯化钙溶液放入容器中，置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，例如可参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子定位打印。将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中。本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为8毫升/小时，调节高压发生器的电压为20KV，调节接收装置的接收距离为22厘米，用圆柱在原来的阻隔层外将纤维接收为管状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。

纺丝和打印重复20次，制得人工血管的外层纳米仿生支架，厚度约1.2mm。

所得外层平均孔径5μM。

用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得人工血管。

3、将制得的人工血管用蒸馏水漂洗5遍，经冻干后真空包装，经25kGy钴-60灭菌后负20摄氏度低温保存。

本发明在人工血管中加入细胞因子、特异性抗体、粘附短肽或药物的该法均没有本质上的区别，可以相互参考并依据具体地需要作合理调整。本发明的三个实施例制备得到的人工血管结构如图1所示，图中1为平滑肌细胞干细胞归巢因子及平滑肌细胞分化因子；2为人工血管外层；3为人工血管阻隔层；4为人工血管内层；5为内皮祖细胞归巢因子和内皮细胞分化因子。

实施例4兔动物实验

采用实施例1制得的人工血管进行实验。将通过本发明实施例1制备的的人工血管移植到家兔骼内动脉。30天后进行内皮干细胞检测，可见血管内壁布满内皮干细胞，外壁长入平滑肌细胞。90天后经光镜检测，可见血管腔内皮干细胞形态正常，密集分布，外壁平滑肌细胞形态，密集分布。说明在上述条件下，血管成功的进行了内皮干细胞和平滑肌干细胞的植入。

实施例5犬动物实验

采用实施例2制得的人工血管进行实验。

实验用犬一只，肌肉注射开他敏，Celatooru、硫酸阿托品。静脉内注射肝素1ml后，遮断，找到动物的腹部大动脉，切除约5-10mm，然后用20mm聚丙烯丝缝合。

经20日后，用血管造影确认有无狭窄，3周及18周后分别摘取出人工血管并进行评价。

3周后：在吻合部附近内皮细胞再生，在内膜上能看到内皮细胞。在外侧可看到平滑肌细胞。

18周后：在人工血管的内腔侧能看到内皮细胞完好地再生，没有缺损。在人工血管外腔侧看到平滑膜细胞长入，并有其它纤维细胞等的寄生。连接正常组织细胞，并且人工血管逐渐地吸收。

6个月后进行检测，见内细胞分布完好，形态正常，中膜有大量的平滑肌细胞顺血管长入分布，血管保持通畅，没有血管内膜增生及血栓形成。血管形态正常，结构完整，排列整齐。

Claims (10)

1.一种基于原位自体干细胞技术的再生型人工血管，其特征在于是由至少三个相连接的仿生支架层构成的组织结构，所述仿生支架层由纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶制备得到；所述组织结构为同心圆环结构，自内向外依次为内层、隔离层和外层；所述内层和外层水溶胶内包覆有一种或几种特异性抗体和/或细胞因子和/或粘附短肽和/或药物。

2.如权利要求1所述的人工血管，其特征在于所述任意两个相邻层之间的连接方式为静电纺连接。

3.如权利要求2所述的人工血管，其特征在于所述内层仿生支架的孔径分布在0.1-10μM，所述外层仿生支架的孔径分布在5-50μM；所述隔离层仿生支架用疏水性高分子材料，孔径不超过100nm。

4.如权利要求3所述的人工血管，其特征在于所述细胞因子是对内皮干细胞或平滑肌细胞的归巢、趋化、生长、分化、增殖、表达起作用的因子；所述特异性抗体选自可以捕获内皮细胞的特异性抗体或可以捕获平滑肌干细胞的特异性抗体细胞膜表面特异性抗体；所述粘附短肽是可捕获内皮干细胞或平滑肌干细胞并诱导干细胞分化为内皮细胞或平滑肌细胞并进一步生长增殖的细胞因子；所述药物选自抗凝血药物。

5.如权利要求4所述的人工血管，其特征在于所述对内皮干细胞的归巢、趋化、生长、分化、增殖、表达起作用的因子为：内皮生长因子趋化因子SDF-1、层粘连蛋白、生长因子蛋白等等；对平滑肌干细胞的归巢、趋化、生长、分化、增殖、表达起作用的因子为：血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子或血管生成素；所述可以捕获内皮细胞的特异性抗体为CD34抗体或CD133抗体；所述可以捕获平滑肌干细胞的特异性抗体为CD59抗体、或抗平滑肌细胞抗体；所述粘附短肽是Gly-Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp。

6.如权利要求1所述的人工血管，其特征在于所述纳米仿生支架是采用支架材料通过静电纺丝技术制备得到，所述支架材料选自：聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、聚对二恶酮、丙交酯、乙交酯、丁内酯、戊内酯、己内酯、环氧乙烷、环氧丙烷、聚氨酯类、聚碳酸酯、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤维素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、海藻酸、硫酸软骨素、肝素、琼脂、葡聚糖或褐藻酸。

7.如权利要求1所述的人工血管，其特征在于所述水溶胶是以下聚合物制成的水溶胶：淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸或壳聚糖、胶原、聚L-赖氨酸或聚L-谷胺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚N-聚代丙烯酰胺。

8.一种权利要求1所述人工血管的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)制备电纺溶液、含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液；

(2)用静电纺丝制备人工血管的内层纳米仿生支架，用喷墨打印机将含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述内层纳米仿生支架上；

(3)在内层纳米仿生支架外表面通过用静电纺丝或涂层法制备隔离层；

(4)在隔离层上用静电纺丝制备人工血管的外层纳米仿生支架，用喷墨打印机将含有特异性抗体和/或细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述外层纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)、(3)和(4)重复若干次。

10.如权利要求8或9所述的人工血管，其特征在于所述电纺溶液的溶剂选自甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水中的一种或两种以上的任意比例的混合物。