CN111529125A - 一种组织工程血管补片制作模板及组织工程血管补片 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种组织工程血管补片制作模板，包括依次设置的支撑层、防裸露层与骨架主体；所述防裸露层包括可降解材料与二价钴离子；所述骨架主体包括网状纤维骨架层。与现有技术相比，采用该模板制备组织工程血管补片时，防裸露层降解形成空隙可使脱细胞基质材料包覆于网状纤维骨架内腔表面，减少纤维裸露，从而减少凝血成分附着，减少血栓形成；同时防裸露层中含有的二价钴离子可促进弹性蛋白生成，使得到的血管补片富含弹性蛋白，提高补片弹性，从而抑制内膜增生，此外，所得到的血管补片弹性蛋白含量的提高也可促进内皮化，促进具有收缩表型的功能平滑肌细胞再生；再者，网状纤维骨架可提供良好的力学性能。

Description

一种组织工程血管补片制作模板及组织工程血管补片

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及一种组织工程血管补片制作模板及组织工程血管补片。

背景技术

先天性心脏缺陷是世界范围内最主要的出生缺陷，也是婴儿出生缺陷的主要死亡原因。中国是世界上先天性心脏病发病率较高的国家之一，每年有约10万患者需要手术治疗。而导致心脏缺陷的一个重要原因是儿童血管狭窄或发育不全，这就需要用血管补片进行血管重建。此外，在治疗主动脉缩窄、颈动脉内膜切除术后再狭窄、Stanford A型主动脉夹层等疾病过程中，也需要用血管补片进行血管重建。

目前，用于血管补片的材料首选是来自患者自身动脉、静脉或心包的自体材料。然而，这些自体材料的可用性往往受到患者年龄和病理的限制，以至于取材来源有限，不能完全满足临床需求，因此只能选择人工血管补片来代替。

多年来，聚合物(如聚四氟乙烯、涤纶等)和脱细胞异种移植替代物(如牛心包补片)一直是血管修补手术中最常用的补片材料。然而，聚合物制备的血管补片由于生物相容性欠佳，不利于血管组织的再生，在体内长期植入后仍不能实现内皮细胞和收缩功能平滑肌细胞的覆盖，有的甚至会引起免疫和炎症反应，进而导致增殖性平滑肌细胞过度增殖，引起内膜增生。脱细胞基质材料虽然具有优异的生物相容性，能够促进细胞生长与组织再生，但其力学性能欠佳，作为血管补片植入体内后易发生动脉瘤。

运用体内工程化方法可有效的构建人工血管补片，其基本原理是利用机体对植入物自发的免疫包裹反应。常规的方法是将外援片状物植入宿主皮下，待宿主完成组织包裹后即可得到体内工程化血管补片。该方法的优点是所致制备的血管补片由细胞和组织构成，具有良好的生物相容性，但由于缺少高分子材料的支撑，该血管补片力学性能欠佳，不能有效的维持片状结构，缝合难度大，而且植入动脉系统易出现动脉瘤和缝合端狭窄。在先前的研究中，我们利用人工合成高分子材料在硅胶管表面制作网状纤维骨架，再将网状纤维骨架连同硅胶片作为模板植入动物皮下进行组织工程化，组织包裹形成后再进行脱细胞处理，得到了聚合物纤维骨架增强的组织工程血管补片，显著的改善了血管补片材料的力学性能，有效的解决了上述问题。此外，该方法制备的组织工程血管补片由于具有脱细胞基质，提高了血管补片材料的生物相容性，相比于单纯高分子材料构建人工血管补片减少了排异反应，能够促进血管组织再生。但是，上述前期研究也反映出如下4个需要改进的方面：首先，利用上述模板皮下埋植后所制备的组织工程血管补片与硅胶片接触的面，即血液接触面，有部分骨架纤维裸露，会引起一定的凝血基质粘附；其次，利用上述模板皮下埋植后所制备的组织工程血管补片外表面较为光滑，植入之内后易发生滑动，降低了血管与植入部位周围组织的整合速率；第三，上述方法制备的血管补片的力学性能与天然血管的匹配性有待提高；第四，上述方法制备的血管补片的组织再生性有待提高。

天然血管内腔光滑，不易引起凝血物质的粘附，而且富含弹性蛋白。弹性蛋白是动脉壁的主要成分之一，其主要功能是赋予血管组织以伸缩性和可逆的变形能力，使血管组织具有良好弹性。目前，已有研究表明向心血管生物材料中添加弹性蛋白可以提高心血管材料的弹性，而弹性的提高能够有效抑制内膜增生。此外，弹性蛋白还可直接参与调节人工血管的再生，如促进内皮化，促进具有收缩功能的平滑肌细胞再生和抑制增殖性平滑肌细胞的过度生长。

因此，在现有技术的基础上，开发出内腔光滑、生物相容性好、力学性能匹配、富含弹性蛋白、可实现血管组织再生的血管补片材料具有重要的临床意义和市场前景。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种组织工程血管补片制作模板及组织工程血管补片；该模板制备的组织工程血管补片富含弹性蛋白，血液接触面无纤维裸露，且非血液接触面具有凸起结构，具有较好的生物相容性、力学特性和可再生性。

本发明提供了一种组织工程血管补片制作模板，包括依次设置的支撑层、防裸露层与骨架主体；所述防裸露层包括可降解材料与二价钴离子；所述骨架主体包括网状纤维骨架层。

优选的，所述防裸露层的厚度为50～500μm；所述防裸露层中二价钴离子的质量为可降解材料质量的0.05％～0.5％。

优选的，所述骨架主体包括相间排列的网状纤维骨架层与生物降解纤维层，且所述骨架主体的上下表面均为网状纤维骨架层；所述生物降解纤维层由可降解材料形成。

优选的，所述网状纤维骨架层由纤维制备得到；所述纤维的直径为20～200μm，所述纤维间的交叉角度是30°～110°。

优选的，所述防裸露层中的可降解材料选自成第一合成高分子材料或第一天然高分子材料；所述第一合成高分子材料选自聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或多种；所述第一天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与纤维蛋白胶中的一种或多种；

所述生物降解纤维层中的可降解材料选自合成第二高分子材料和/或第二天然高分子材料；所述第二合成高分子材料选自聚乙二醇、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)、聚对二氧六环己酮与聚癸二酸甘油酯中的一种或多种；所述第二天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与壳聚糖中的一种或多种。

优选的，还包括保护套；所述保护套设置于支撑层、防裸露层与骨架主体的外侧，且与骨架主体相接触的表面设置有镂空结构。

本发明还提供了一种组织工程血管补片，以上述的组织工程血管补片制作模板为模板制备得到。

优选的，包括脱细胞基质内层与骨架层；所述骨架层包括纤维骨架层；所述纤维骨架层包括网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质，且所述纤维骨架层中的脱细胞基质与脱细胞基质内层呈一体化设置。

优选的，包括脱细胞基质内层与骨架层；所述骨架层包括相间排列的纤维骨架层与脱细胞基质层，且所述骨架层与脱细胞基质内层相接触的一面及相对的一面均为纤维骨架层；所述纤维骨架层包括网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质，且所述纤维骨架层中的脱细胞基质、脱细胞基质层及脱细胞基质内层呈一体化设置。

优选的，所述组织工程血管补片中弹性蛋白的质量为组织工程血管补片整体干重的44.01～113.7μg/mg。

本发明提供了一种组织工程血管补片制作模板，包括依次设置的支撑层、防裸露层与骨架主体；所述防裸露层包括可降解材料与二价钴离子；所述骨架主体包括网状纤维骨架层。与现有技术相比，采用本发明提供的模板制备组织工程血管补片时，防裸露层降解形成空隙可使脱细胞基质材料包覆于网状纤维骨架内腔表面，减少纤维裸露，从而减少凝血成分附着，减少血栓形成；同时防裸露层中含有的二价钴离子可促进弹性蛋白的生成，使得到的血管补片富含弹性蛋白，提高补片弹性，从而抑制内膜增生，此外，所得到的血管补片弹性蛋白含量的提高也可促进内皮化，促进具有收缩表型的功能平滑肌细胞再生；再者，网状纤维骨架可提供良好的力学性能，使其满足作为血管补片所要承受的力学强度。

进一步，本发明提供的组织工程血管补片制作模板的骨架主体，可包括相间排列的网状纤维骨架层与生物降解纤维层，且所述骨架主体的上下表面均为网状纤维骨架层，生物降解纤维层在培养制备补片时会逐步降解，产生空隙，最终被脱细胞基质所替代，可进一步提高补片弹性，使之与天然血管的弹性更为匹配。

进一步，本发明提供的组织工程血管补片制作模板还设置有保护套，可保护骨架主体的网状纤维骨架结构，避免在培养制备时破坏骨架结构，且保护套上镂空结构的设置可使制备得到的组织工程血管补片具有外部脊梁，增强补片的弹性，也会因粗糙的外表面在体内植入后不易发生移动，加快与周围组织整合。

附图说明

图1为本发明提供的组织工程血管补片制作模板的结构示意图；

图2为本发明提供的组织工程血管补片制作模板的结构示意图；

图3为本发明提供的组织工程血管补片制作模板设置有保护套时的结构示意图；

图4为本发明实施例1中6水合氯化钴(CoCl₂.6H₂O)在氯仿/甲醇混合溶液中溶解情况的检测图；

图5为本发明实施例1中组织工程血管补片制作模板的横切面体式图片；

图6为本发明实施例1及对比例1得到的组织工程血管补片VVG染色图片；

图7为本发明实施例1及对比例1得到的组织工程血管补片植入犬颈动脉1个月后内腔面扫描电镜(SEM)图片；

图8为本发明实施例1及对比例1得到的组织工程血管补片植入犬颈动脉1个月后vWF免疫荧光染色图片；

图9为本发明实施例1及对比例1得到的组织工程血管补片植入犬颈动脉1个月的MYH免疫荧光染色图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种组织工程血管补片制作模板，包括依次设置的支撑层、防裸露层与骨架主体；所述防裸露层包括可降解材料与二价钴离子；所述骨架主体包括网状纤维骨架层。

参见图1与图2；图1与图2为本发明提供的组织工程血管补片制作模板的结构示意图。其中1为支撑层，2为防裸露层，3为网状纤维骨架层，4为生物降解纤维层；3与4共同组成了骨架主体。

本发明提供的组织工程补片制作模板以支撑层决定制备的组织工程材料的整体形状；其作用是支撑骨架主体，使其在皮下或体外培养环境下能够保持形状；所述支撑层为平面结构，其优选采用惰性医疗材料制成，更优选采用硅胶片、橡胶片、尼龙板、聚氨酯片、聚己内酯片或聚苯乙烯中的一种或多种组成；选择上述材料作为支撑层，可在培养时通过缝合将骨架主体与支撑层相互固定，以防在不带保护套的情况下，骨架主体发生位移。

所述支撑层上设置有防裸露层；在利用组织工程血管补片制作模板制备组织工程补片材料的过程中，防裸露层可快速降解，设置此层，可防止骨架主体与支撑层结合过于紧密，改善细胞向支撑层表面的迁移和生长，围绕支持体分泌细胞外基质，使最终制备的血管补片材料的血液接触面无骨架纤维裸露；所述防裸露层的厚度优选为50～500μm；在本发明提供的一些实施例中，所述防裸露层的厚度优选为50μm；在本发明提供的一些实施例中，所述防裸露层的厚度优选为200μm；在本发明提供的一些实施例中，所述防裸露层的厚度优选为100μm；在本发明提供的另一些实施例中，所述防裸露层的厚度优选为500μm；在本发明中，所述防裸露层可为整体致密的涂层结构也可为具有孔隙的疏松结构，并无特殊的限制；所述防裸露层包括可降解材料与二价钴离子；所述可降解材料优选为第一合成高分子材料或第一天然高分子材料；所述第一合成高分子材料选自聚乙二醇(PEO)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)与聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-4HB))中的一种或多种；所述第一天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与纤维蛋白胶中的一种或多种；所述防裸露层中二价钴离子的质量优选为可降解材料质量的0.05％～0.5％；在本发明提供的一些实施例中，所述二价钴离子的质量优选为可降解材料质量的0.25％；在本发明提供的一些实施例中，所述二价钴离子的质量优选为可降解材料质量的0.05％；在本发明提供的一些实施例中，所述二价钴离子的质量优选为可降解材料质量的0.125％；在本发明提供的另一些实施例中，所述二价钴离子的质量优选为可降解材料质量的0.5％；所述二价钴离子优选以无机钴盐提供；所述无机钴盐优选为无水氯化钴(CoCl₂)和6水合氯化钴(CoCl₂.6H₂O)；在本发明中，优选先将可降解材料与二价钴离子混合后制备可降解涂料，然后制备防裸露层；可降解涂料中可降解材料的浓度优选为0.025～0.3g/ml；所述可降解材料与二价钴离子优选溶于溶剂中制备可降解涂料；当所述可降解材料为第一合成高分子材料时，可降解涂料中的溶剂优选为氯仿和/或甲醇；当所述可降解材料为第一天然高分子材料时，优选以水为溶剂；制备得到的可降解涂料可直接涂覆或浇铸于支撑层的表面，干燥后得到防裸露层；也可将可降解涂料通过静电放纺丝、湿法纺丝等技术制备成纤维沉积于支撑层的表面形成防裸露层；其中干燥的方法可为加热干燥、自然风干、氮气吹干，也可为冷冻干燥，并无特殊的限制。

在本发明中，二价钴离子可在制备血管补片的过程中促进弹性蛋白的生成，使得到的血管补片富含弹性蛋白，提高补片弹性，从而抑制内膜增生，此外，所制备补片弹性蛋白含量的提高可促进内皮化，促进收缩功能平滑肌再生。

所述防裸露层上设置有骨架主体；所述骨架主体可为单层结构也可为多层结构；当所述骨架主体为单层结构时，其仅包含网状纤维骨架层，参见图1；当所述骨架层为多层结构时，其优选包括相间排列的网状纤维骨架层与生物降解纤维层，且所述骨架主体的上下表面均为网状纤维骨架层，参见图2；所述生物降解纤维层由可降解材料形成。

在本发明中，网状纤维骨架层具有独特的结构能够使最终制备的组织工程血管补片具有必要的力学强度；其孔隙可以满足细胞向骨架内部迁移生长的需要，填充骨架孔隙；当所述骨架主体中网状纤维骨架层为单层时，所述网状纤维骨架层的厚度优选400～1200μm，更优选为400～800μm，再优选为300～800μm，再优选为400～600μm；当所述骨架主体包含多层网状纤维骨架层时，每层网状纤维骨架层的厚度各自独立地优选为50～1000μm，更优选为50～800μm，再优选为50～500μm。在本发明提供的一些实施例中，所述每层网状纤维骨架层的厚度优选为400μm；在本发明提供的一些实施例中，所述每层网状纤维骨架层的厚度优选为200μm；在本发明提供的一些实施例中，所述每层网状纤维骨架层的厚度优选为300μm；在本发明提供的一些实施例中，所述每层网状纤维骨架层的厚度优选为160μm；在本发明提供的一些实施例中，所述每层网状纤维骨架层的厚度优选为50μm；在本发明提供的另一些实施例中，所述每层网状纤维骨架层的厚度优选为500μm；所述网状纤维骨架层优选由纤维形成；其可通过静电纺丝、熔融纺丝、3D打印及纤维编织等方法制备得到；所述网状纤维骨架层中的纤维为本领域技术人员熟知的纤维即可，并无特殊的限制，本发明中纤维优选由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚氨基甲酸酯(PU)、聚癸二酸甘油酯(PGS)与聚乙二醇(PEO)中一种或多种形成；所述纤维的直径优选为20～200μm，更优选为20～100μm；在本发明提供的一些实施例中，所述纤维的直径优选为40μm；在本发明提供的一些实施例中，所述纤维的直径优选为100μm；在本发明提供的一些实施例中，所述纤维的直径优选为60μm；在本发明提供的另一些实施例中，所述纤维的直径优选为20μm；形成网状纤维骨架层的纤维的交叉角优选为30°～110°；在本发明提供的一些实施例中，所述形成网状纤维骨架层的纤维的交叉角优选为50°；在本发明提供的一些实施例中，所述形成网状纤维骨架层的纤维的交叉角优选为60°；在本发明提供的一些实施例中，所述形成网状纤维骨架层的纤维的交叉角优选为30°；在本发明提供的另一些实施例中，所述形成网状纤维骨架层的纤维的交叉角优选为110°。

当所述骨架主体为多层结构时，在网状纤维骨架层之间设置有生物降解纤维层；所述生物降解纤维层的厚度优选为10～500μm，更优选为50～300μm，最优选为50～200μm；在本发明提供的一些实施例中，所述生物降解纤维层的厚度优选为50μm；在本发明提供的一些实施例中，所述生物降解纤维层的厚度优选为200μm；在本发明提供的另一些实施例中，所述生物降解纤维层的厚度优选为80μm；在网状纤维骨架层之间设置生物降解纤维层，生物降解纤维层由纤维组成，具有孔隙，可保证在培养的过程中细胞由外至内的顺利迁移生长，使整个骨架主体和防裸露层被细胞快速、充分填充；所述生物降解纤维层可通过静电纺丝、熔融纺丝、3D打印及、湿法纺丝、纤维编织等方法制备得到。

本发明提供的组织工程血管补片制作模板优选还包括保护套，参见图3，图3为本发明提供的组织工程血管补片制作模板设置有保护套时的结构示意图；其中1为支撑层，2为防裸露层，3为网状纤维骨架层，4为生物降解纤维层；3与4共同组成了骨架主体；5为保护套；所述保护套设置于支撑层、防裸露层与骨架主体的外侧。通过设置保护套能够防止动物皮下埋置操作或体外接种细胞及体外培养过程对骨架结构的破坏，并且能够控制组织工程血管补片的厚度，保证所制备组织工程血管补片壁厚的均一性；所述保护套的厚度优选为200～3000μm，更优选为500～3000μm；在本发明提供的一些实施例中，所述保护套的厚度优选为500μm；在本发明提供的一些实施例中，所述保护套的厚度优选为1000μm；在本发明提供的一些实施例中，所述保护套的厚度优选为2000μm；在本发明提供的另一些实施例中，所述保护套的厚度优选为3000μm；保护套的厚度决定着组织工程血管补片表面凸起的高度；在本发明中，所述保护套优选包含四个面，其中的一个面与骨架主体相接触，其相对的面与支撑层相接触，另外相对的两个面与骨架主体及支撑层形成的结构的相对的两个侧面相接触，从而形成扣在支撑层及骨架主体外侧的结构；所述保护套优选为盒状结构，套于支撑层、防裸露层及骨架主体的外侧，且所述保护套的内宽、内长与支撑层的宽度、长度相等，所述保护套的内高与支撑层、防裸露层及骨架主体总高度相等；所述保护套上与骨架主体相接触的表面优选设置有镂空结构；通过镂空结构裸露出骨架主体，优选裸露出网状纤维骨架层；所述镂空结构的宽度优选为500～4000μm，更优选为500～2000μm；在本发明提供的一些实施例中，所述镂空结构的宽度优选为500μm；在本发明提供的一些实施例中，所述镂空结构的宽度优选为1000μm；在本发明提供的一些实施例中，所述镂空结构的宽度优选为2000μm；在本发明提供的一些实施例中，所述镂空结构的宽度优选为4000μm；在本发明提供的另一些实施例中，所述镂空结构的宽度优选为1500μm；所述镂空结构沿保护套的径向切面的形状可为矩形、梯形、正方形或其他任意形状；当所述镂空结构沿保护套的径向切面为梯形时，优选下面的宽度(与骨架主体相接触的宽度)为上面宽度的1.5～4倍，更优选为2～4倍；镂空结构沿着所述保护层的径向切面的形状决定着组织工程材料外壁凸起的外型；所述镂空结构沿保护层方向优选呈平行的直线或平行的曲线；优选相邻平行镂空结构之间即相邻的两条平行的直线或曲线之间的距离优选为500～3000μm；在本发明提供的一些实施例中，所述相邻平行镂空结构之间的距离优选为500μm；在本发明提供的一些实施例中，所述相邻平行镂空结构之间的距离优选为1000μm；在本发明提供的一些实施例中，所述相邻平行镂空结构之间的距离优选为2000μm；在本发明提供的一些实施例中，所述相邻平行镂空结构之间的距离优选为3000μm；所述保护套与骨架主体相接触的表面仅有中间设置有镂空结构，四周不含有镂空结构，从而使保护套保持整体的一个结构，起到连接和维持镂空结构稳定的作用；保护套上设置镂空结构，能够在保证细胞有效迁移的前提下，在组织工程补片外形成“凸起”，能够增强组织工程血管补片的弹性，并且能够防止组织工程血管补片在植入人体内后发生滑动，使之更易于与植入部位周围组织相整合。为使在培养之后保护套容易去除，所述保护套上优选设置有卡扣结构，即保护套可通过卡扣结构打开放入支撑层、防裸露层及骨架主体形成的结构，并在培养完成后，通过卡扣打开取出支撑层、骨架主体及细胞组织形成的结构。

采用本发明提供的模板制备组织工程血管补片时防裸露层降解形成空隙可使脱细胞基质材料包覆于网状纤维骨架内腔表面，减少纤维裸露，从而减少凝血成分附着，减少血栓形成；同时防裸露层中含有的二价钴离子可促进弹性蛋白的生成，使得到的血管补片富含弹性蛋白，提高补片弹性，从而抑制内膜增生，此外，所得到的血管补片弹性蛋白含量的提高也可促进内皮化，促进具有收缩表型的功能平滑肌细胞再生；再者，网状纤维骨架可提供良好的力学性能，使其满足作为血管补片所要承受的力学强度。

进一步，本发明提供的组织工程血管补片制作模板的骨架主体，可包括相间排列的网状纤维骨架层与生物降解纤维层，且所述骨架主体的上下表面均为网状纤维骨架层，生物降解纤维层在培养制备补片时会逐步降解，产生空隙，最终被脱细胞基质所替代，可进一步提高补片弹性，使之与天然血管的弹性更为匹配。

进一步，本发明提供的组织工程血管补片制作模板还设置有保护套，可保护骨架主体的网状纤维骨架结构，避免在培养制备时破坏骨架结构，且保护套上镂空结构的设置可使制备得到的组织工程血管补片具有外部脊梁，增强补片的弹性，也会因粗糙的外表面在体内植入后不易发生移动，加快与周围组织整合。

本发明还提供了一种组织工程血管补片，以上述的组织工程血管补片制作模板为模板制备得到；所述制备的方法优选为组织工程培养；所述组织工程培养可为皮下植入培养，也可为体外培养；所述体外培养可为体外静态培养，也可为体外动态培养；在进行皮下植入培养时，组织工程血管补片制作模板保护套上的镂空结构可起到提供细胞向模板内部迁移、生长的作用，从而使细胞填充防裸露层、生物降解纤维层降解后产生的空隙、网状纤维骨架的孔隙和保护套上的镂空部位；对于体外细胞培养，其上的镂空结构可起到促进氧气、营养物质和细胞代谢废物交换的作用。

在本发明中，优选具体采用以下方法制备：将所述组织工程血管补片制作模板植入动物皮下，或将种植有细胞的所述组织工程血管补片制作模板置于培养液中，于生物反应器中进行培养；使细胞向所述网状纤维骨架层迁移生长，直至长满所述保护套的镂空部位、网状纤维骨架层的纤维孔隙与所述防裸露层及生物降解纤维层降解形成的空隙；取出，去除保护套与支撑层，即可得到组织工程血管补片；所述种植的细胞优选为成纤维细胞、平滑肌细胞与干细胞分化来的平滑肌细胞中的一种或多种；当采用体外动态培养时，优选调节生物反应器中培养基的流速使压力为10～200mmHg；所述培养优选在37℃，20％O₂、5％CO₂条件下进行培养。

更优选地，在去除保护套与支撑层后，优选进行脱细胞处理步骤，得到组织工程血管补片。

所述脱细胞处理优选采用SDS法或液氮冻融法。

优选地，所述SDS法包括如下步骤：将样品浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上室温摇晃12h，之后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的SDS冲洗干净，然后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl₂，0.2mol/LCaCl₂和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成，DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温摇晃24h，随后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的DNase和RNase冲洗干净，最后将得到的产物置于无菌的PBS中，4℃保存。

优选地，所述液氮冻融法包括如下步骤：将样品于液氮中速冻20s，室温解冻60s，重复5遍，之后用无菌的生理盐水冲洗4-5遍，将细胞残渣冲洗干净。然后将材料置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl₂，0.2mol/L CaCl₂和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成，DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温摇晃24h，随后用无菌生理盐水将组织包裹物上残留的DNase和RNase冲洗干净，最后将制得的产物置于无菌的PBS中，4℃保存

当所述组织工程血管补片制作模板中骨架主体仅包含一层网状纤维骨架层时，得到的组织工程血管补片包括脱细胞基质内层与骨架层；所述骨架层包括纤维骨架层；所述纤维骨架层包括网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质，且所述纤维骨架层中的脱细胞基质与脱细胞基质内层呈一体化设置。

当所述组织工程血管补片制作模板中骨架主体包含多层网状纤维骨架层时，得到的组织工程血管补片优选包括脱细胞基质内层与骨架层；所述骨架层包括相间排列的纤维骨架层与脱细胞基质层，且所述骨架层与脱细胞基质内层相接触的一面及相对的一面均为纤维骨架层，即骨架层中的脱细胞基质层均位于两层纤维骨架层之间；所述纤维骨架层包括网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质，且所述纤维骨架层中的脱细胞基质、脱细胞基质层及脱细胞基质内层呈一体化设置。

本发明得到的组织工程血管补片还包括设置于骨架层的外层；所述外层为具有凸起结构的脱细胞基质，且与纤维骨架层中的脱细胞基质、脱细胞基质层及脱细胞基质内层呈一体化设置。

按照本发明，脱细胞处理后得到的组织工程血管补片优选还负载有生物活性物质，可提高生物工程血管补片的通畅性；所述生物活性材料优选通过共价或物理吸附负载在组织工程血管补片的表面；所述生物活性物质的种类优选为肝素与水蛭素中的一种或2种混合种。

本发明得到的组织工程血管补片中网状纤维骨架主要起到提供良好力学性能的作用，使组织工程血管补片具有良好的弹性，必要的力学强度；填充于在骨架主体中的脱细胞基质整体上提供了良好的生物相容性，能够促进血管组织再生和与植入部位组织的整合，根据脱细胞基质位置的不同，其作用也有所划分，填充于骨架主体中的细胞外基质也起到了有效阻碍血液和生物大分子渗漏作用，位于最内层覆盖网状纤维骨架上的一层脱细胞基质，能够避免纤维裸露，减少凝血成分附着，位于组织工程补片最外层的凸起的脱细胞基质，提供了粗糙的表面，有利于组织工程补片在体内的稳定和促进与周围组织整合的作用，此外也能提高组织工程补片可弹性；并且，本发明制备的组织工程血管补片还可负载抗凝物质，提高通畅性，不容易发生急性凝血。

本发明提供的组织工程血管补片不仅满足植入部位所需的特定力学要求，而且生物相容性好，有利于细胞粘附性和生长，可用于血管修补手术。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种组织工程血管补片制作模板及组织工程血管补片进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1

该实施例提供的组织工程血管补片制作模板包括依次设置的支撑层、含二价钴离子(Co²⁺)的防裸露层与骨架主体，所述骨架主体完全由网状纤维骨架构成，其中不含有生物降解纤维层。

模板制备过程包括如下步骤：

1.以长方形硅胶片为支撑层，长为5cm，宽为3cm；厚度为3mm。

2.以PLGA/PEO/CoCl₂·6H₂O的混合物为原材料，在支撑层表面利用浇筑的方法制备防裸露层。具体方法是：用三氯甲烷：甲醇＝5:1(体积比)作为溶剂，以PLGA：PEO＝1:1(质量比)的混合物作为溶质，配制浓度为0.25g/ml的溶液，向溶液中加入CoCl₂.6H₂O，使Co²⁺的质量与PLGA和PEO的质量比率为0.5％，搅拌过夜。将支撑层置于其同等长宽的聚四氟乙烯小皿中(除顶部外均贴壁)，将溶液浇筑在支撑体表面，溶液上表面高于支撑体0.2mm。将浇筑完成后的小皿置于通风橱中，至其溶剂全部挥发后抽真空，即可在硅胶片表面制备出含有二价钴离子(Co²⁺)的50μm厚的PLGA/EPO防裸露层。

3.以聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)为原材料，利用3D打印技术在上述防裸露层表面形成网状纤维骨架层，得到组织工程血管补片制作模板。网状纤维骨架层的纤维直径为40μm，所述纤维间的交叉角度在支撑体宽的方向上是50°，所述网状纤维骨架层的厚度是400μm。3D打印的具体方法是：将PLCL置于3D打印机的料筒中，熔料温度为240℃，熔料完成后，将载有防裸露层的支撑层作为打印基底，选用40μm口径针头，设置打印层高为40μm，打印层数为10层，按照自定义的“X”路径打印，平行纤维间距为50μm，打印纤维的交叉角度在支撑层宽的方向上为50°。

本实施例中，除上述血管补片板制备过程外，还包括血管补片的制备方法，具体如下：

1.用3-0缝合线将上述组织工程血管补片制作模板的纤维骨架边缘与硅胶片缝合在一起，防止皮下埋植或体外细胞培养过程纤维骨架从硅胶片上滑脱出来。

2.将上述制备的组织工程血管补片制作模板整体注入羊皮下，60天后取出。

3.取出所述血管补片模板后，裁减掉缝合的边缘部分并取出支撑层，进行脱细胞处理。

脱细胞处理步骤采用SDS法：将样品浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上室温摇晃12h，之后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的SDS冲洗干净，然后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl₂，0.2mol/L CaCl₂和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成，DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温摇晃24h，随后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的DNase和RNase冲洗干净，最后将得到的产物置于无菌的PBS中，4℃保存。

4.脱细胞处理后进行交联肝素，即可得到相应的组织工程血管补片。用去离子水配制无菌的pH5.6浓度为0.05M的MES(2-吗啉乙磺酸)缓冲溶液，然后用MES配制交联反应液，反应液中各组分浓度为：EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)2.0mg/ml；NHS(N-羟基丁二酰亚胺1.2mg/ml；肝素钠2.0mg/ml。之后进行交联反应，首先将脱细胞产物浸泡于pH5.6浓度为0.05M的MES缓冲溶液中20分钟，然后将反应液置于37℃反应10分钟以活化羧基，10分钟之后将脱细胞的产物从MES缓冲液中取出，直接放入反应液中，37℃轻轻摇动(20～40rpm/min)4小时。之后用0.1M无菌Na₂HPO₄(含1％PS)连续洗材料2小时，接着用无菌的4M NaCl 60～80rpm/min 4℃连续洗24小时；之后用无菌水(含1％PS)60～80rpm/min 4℃连续洗24小时。最后将制得的产物置于无菌的PBS中，4℃保存备用。

图4表明CoCl₂·6H₂O能够完全溶解于三氯甲烷：甲醇＝5:1(体积比)的混合溶液中。

图5为实施例1所制备的组织工程血管补片制作模板的横切面体式图片，其中1为硅胶片，2为由PLGA，PEO和CoCl₂·6H₂O构成的防裸露层，3为PLCL网状纤维骨架层。由图5可看出，实施例1所制备的模板的防裸露层为50μm，网状纤维骨架层为400μm，且防裸露层与网状纤维骨架层紧密贴合，无分层情况。

实施例2

该实施例提供的组织工程血管补片制作模板包括依次设置的支撑层、含Co²⁺的防裸露层与骨架主体，所述骨架主体包括3层网状纤维骨架层与2层生物降解纤维层，生物降解纤维层位于网状纤维骨架层之间，且所述骨架主体的上下表面均为网状纤维骨架层。

模板制备过程包括如下步骤：

1.以长方形橡胶片为支撑层，长为5cm，宽为3cm，厚度为3mm。

2.以明胶/CoCl₂·6H₂O混合物为原材料，利用冷冻干燥法在上述橡胶片表面制备防裸露层。具体方法是：将适量明胶溶于蒸馏水配制成为0.3g/ml的明胶溶液，向溶液中加入CoCl₂·6H₂O使Co²⁺与明胶质量的比率为0.125％，将支撑层置于其同等长宽的聚四氟乙烯小皿中(除顶部外均贴壁)，将溶液浇筑在支撑层表面，溶液上表面高于支撑体0.2mm。将浇筑完成后的小皿置于真空冷冻干燥机中-80℃真空干燥72小时，即可在支撑层上得到含有Co²⁺的厚度为200μm的明胶防裸露层。

3.以聚己内酯(PCL)为原料，利用熔融静电直写技术在上述防裸露层表面形成网状纤维骨架层，网状纤维骨架层的纤维直径为100μm，所述纤维间的交叉角度在支撑体宽的方向上是50°，所述网状纤维骨架层的厚度是200μm。熔融静电直写的具体方法是：将上述含有Co²⁺的明胶防裸露层的橡胶片固定在导电X-Y导电平板上，橡胶片长向为X轴，宽向为Y轴，导电平板接地，将适量PCL投入到料筒中并设置210℃的熔化温度，采用16G针头，在直写针头施加8kV的高压直流电，控制针头与导电板之间的距离为8mm，利用注射泵控制流速为3ml/h，通过控制系统写入“X”形直写路径，平行纤维间距为100μm，纤维在Y轴上的角度为50°，直写层数为2层，厚度为200μm。

4.以PDS为原料，利用熔融静电直写技术在上述纤维骨架外表面制备PDS生物降解纤维层，具体制备方法是：将上述含有防裸露层和纤维骨架层的橡胶片固定在导电X-Y导电平板上，橡胶片长向为X轴，宽向为Y轴，导电平板接地，将适量PDS投入到料筒中并设置220℃的熔化温度，采用21G针头，在直写针头施加10kV的高压直流电，控制针头与导电板之间的距离为8mm，利用注射泵控制流速为1ml/h，通过控制系统写入“X”形直写路径，平行纤维间距为30μm，纤维在Y轴上的角度为50°，直写层数为2层，厚度为50μm。

5、重复步骤3，步骤4后再次重复步骤3，得到组织工程血管补片制作模板。

本实施例中，除上述模血管补片板制备过程外，还包括血管补片的制备方法，具体方法同实施例1。

实施例3

该实施例提供的组织工程血管补片制作模板包括依次设置的支撑层、防裸露层与骨架主体，所述骨架主体包括2层网状纤维骨架层与1层生物降解纤维层，生物降解纤维层位于网状纤维骨架层之间，且所述骨架主体的上下表面均为网状纤维骨架层。

模板制备过程包括如下步骤：

1.以长方形尼龙片作为支撑层，长为5cm，宽为3cm；厚度为3mm。

2.以P(3HB-co-4HB)/PEO/CoCl₂·6H₂O混合物为原料，利用喷涂技术在上述尼龙片上制备防裸露层。具体方法如下：将支撑层浸入到以10mM Tris缓冲液(pH8.5)配制的2mg/mL的多巴胺溶液中24h，在支撑层表面形成粘附层。将P(3HB-co-4HB):PEO＝1:1(质量比)混合物溶解到氯仿：甲醇＝5：1(体积比)的溶剂中，配制成为0.25g/ml的溶液，向溶液中加入CoCl₂·6H₂O，使Co²⁺质量与P(3HB-co-4HB)和PEO的质量的比率为0.25％，采用气泵喷枪以0.2mL/s的流速将溶液垂直喷涂到旋转的尼龙片上10s。然后，将尼龙片在气流下排干。重复喷涂6次以获得厚度为100μm的防裸露层。

3.以聚己内酯(PCL)为原料，利用熔融静电直写技术在防裸露层表面形成聚己内酯(PCL)网状纤维骨架层，网状纤维骨架层的纤维直径为60μm，所述纤维间的交叉角度在支撑体宽的方向上是60°，所述网状纤维骨架层的厚度是300μm。熔融静电直写的具体方法是：将上述含有Co²⁺的透明质酸防裸露层的尼龙片固定在导电X-Y导电平板上，尼龙片长向为X轴，宽向为Y轴，导电平板接地，将适量PCL投入到料筒中并设置210℃的熔化温度，采用17G针头，在直写针头施加8kV的高压电，控制针头与导电板之间的距离为8mm，利用注射泵控制流速为2ml/h，通过控制系统写入“X”形直写路径，平行纤维间距为60μm，纤维在Y轴上的角度为60°，直写层数为5层，厚度为300μm。

4.以PDS为原料，利用静电纺丝技术在上述纤维骨架层外制备PDS生物降解纤维层。具体方法为：以六氟异丙醇作为溶液，PDS作为溶质，配制0.18g/ml的纺丝液，采用不锈钢作为导电接收板，将步骤3得到的网状纤维骨架、防裸露层和支撑层复合体固定于导电接收板与针头之间，且与导电板距离为1cm，导电板与针头距离为8cm，采用20G针头，17kV电压，设定流速为6mL/h，静电纺丝PDS纤维从针头喷向导电接收板的过程中被网状纤维骨架层接收，获得厚度为200μm的PDS生物降解纤维层。

5、在步骤4的基础上，重复步骤3，得到组织工程血管补片制作模板。

本实施例中，除上述模血管补片板制备过程外，还包括血管补片的制备方法，具体方法同实施例1。

实施例4

该实施例提供的组织工程血管补片制作模板包括依次设置的支撑层、含Co²⁺的防裸露层与骨架主体，所述骨架主体包括2层网状纤维骨架层与1层生物降解纤维层，生物降解纤维层位于网状纤维骨架层之间，且所述骨架主体的上下表面均为网状纤维骨架层。

模板制备过程包括如下步骤：

1.以长方形硅胶片为支撑层，长为5cm，宽为3cm；厚度为3mm。

2.以PLGA/PEO/CoCl₂·6H₂O的混合物为原材料，在支撑层表面利用浇筑的方法制备防裸露层。具体方法是：用三氯甲烷：甲醇＝5:1(体积比)作为溶剂，以PLGA：PEO＝1：1(质量比)的混合物作为溶质，配制浓度为0.25g/ml的溶液，向溶液中加入CoCl₂·6H₂O，使Co²⁺与PLGA和PEO的质量和的质量比率为0.5％，搅拌过夜。将支撑层置于其同等长宽的聚四氟乙烯小皿中(除顶部外均贴壁)，将溶液浇筑在支撑体表面，溶液上表面高于支撑体0.2mm。将浇筑完成后的小皿置于通风橱中，至其溶剂全部挥发后抽真空，即可在硅胶片表面制备出含有Co²⁺的50μm厚的PLGA/EPO防裸露层。

3.以聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)为原材料，利用3D打印技术，在上述防裸露层表面形成网状纤维骨架层，网状纤维骨架层的纤维直径为40μm，所述纤维间的交叉角度在支撑体宽的方向上是50°，所述网状纤维骨架层的厚度是160μm。3D打印的具体方法是：将PLCL置于3D打印机的料筒中，熔料温度为220℃，熔料完成后，将载有防裸露层的支撑层作为打印基底，选用40μm口径针头，设置打印层高为40μm，打印层数为4层，按照自定义的“X”路径打印，平行纤维间距为40μm，打印纤维的交叉角度在支撑层宽的方向上为50°。

4.以胶原为原料，利用静电纺丝技术在上述纤维骨架层外制备胶原生物降解纤维层。具体方法为：以六氟异丙醇作为溶液，胶原作为溶质，配制浓度为0.15g/ml的纺丝液，采用21G针头，17kV电压，设定流速为6mL/h，采用不锈钢作为导电接收板，将步骤3得到的网状纤维骨架、防裸露层和支撑层复合体固定于导电接收板与针头之间，且与导电板距离为1cm，导电板与针头距离为10cm，，静电纺丝胶原纤维从针头喷向导电接收板的过程中被网状纤维骨架层接收，获得厚度为80μm的胶原生物降解纤维层。

5.在步骤4的基础上，按顺序重复步骤3，得到组织工程血管补片制作模板。

本实施例中，除上述模血管补片板制备过程外，还包括血管补片的制备方法，具体方法同实施例1。

实施例5

该实施例提供的组织工程血管补片制作模板包括依次设置的支撑层、含Co²⁺的防裸露层与骨架主体，所述骨架主体包括3层网状纤维骨架层与2层生物降解纤维层，生物降解纤维层位于网状纤维骨架层之间，且所述骨架主体的上下表面均为网状纤维骨架层。

模板制备过程包括如下步骤：

1.以长方形尼龙片作为支撑层，长为5cm，宽为3cm；厚度为3mm。

2.以PLGA/CoCl₂·6H₂O混合物为原料，利用静电纺丝技术在上述尼龙片上制备防裸露层。具体方法如下：将PLGA溶解到氯仿：甲醇＝5：1(体积比)的溶剂中，配制成为0.25g/ml的溶液，向溶液中加入CoCl₂·6H₂O，使Co²⁺与PLGA的质量比率为0.5％，采用不锈钢作为导电接收板，将尼龙片固定于导电接收板与针头之间，且与导电板距离为1cm，导电板与针头距离为10cm，采用20G针头，15kV电压，设定流速为8mL/h，静电纺丝PLGA纤维从针头喷向导电接收板的过程中尼龙片接收，获得厚度为50μm的含Co²⁺的防裸露层。

3.以聚己内酯(PCL)为原料，利用熔融静电直写技术在防裸露层表面形成网状纤维骨架层，网状纤维骨架层的纤维直径为20μm，所述纤维间的交叉角度在支撑体宽的方向上是30°，所述网状纤维骨架层的厚度是50μm。熔融静电直写的具体方法是：将表面有含Co²⁺的明胶降解层的橡胶片固定在导电X-Y导电平板上，橡胶片长向为X轴，宽向为Y轴，导电平板接地，将适量PCL投入到料筒中并设置210℃的熔化温度，采用18G针头，在针头施加8kV的高压电，控制针头与导电板之间的距离为8mm，利用注射泵控制流速为3ml/h，通过控制系统写入“X”直写路径，平行纤维间距为100μm，纤维在Y轴上的角度为50°，直写层数为2层，厚度为200μm。

4.以PDS为原料，利用3D打印技术在上述纤维骨架层外制备PDS生物降解层。具体方法为：将PDS置于3D打印机的料筒中，熔料温度为220℃，熔料完成后，将载有防裸露层和网状纤维骨架的支撑层作为打印基底，选用50μm口径针头，按照自定义的“X”路径打印单层纤维，获得厚度为50μm的生物降解层，

5、在步骤4的基础上，按顺序重复步骤3、4各一次。

6、在步骤5的基础上重复步骤3一次，得到组织工程血管补片制作模板。

本实施例中，除上述模血管补片板制备过程外，还包括血管补片的制备方法，具体方法同实施例1。

实施例6

该实施例提供的组织工程血管补片制作模板包括依次设置的支撑层、含Co²⁺的防裸露层与骨架主体，所述骨架主体包括2层网状纤维骨架层与1层生物降解纤维层，生物降解纤维层位于网状纤维骨架层之间，且所述骨架主体的上下表面均为网状纤维骨架层。

模板制备过程包括如下步骤：

1.以长方形硅胶片作为支撑层，长为5cm，宽为3cm；厚度为3mm。

2.以透明质酸/CoCl₂·6H₂O混合物为原料，利用冷冻干燥技术在上述硅胶片上制备防裸露层。具体方法如下：将适量透明质酸溶解到蒸馏水中，配制成为25mg/ml的透明质酸溶液，向溶液中加入CoCl₂·6H₂O，使Co²⁺质量与透明质酸质量的比率为0.05％。将支撑层置于其同等长宽的聚四氟乙烯小皿中(除顶部外均贴壁)，将溶液浇筑在支撑体表面，溶液上表面高于支撑体0.5mm。将浇筑完成后的小皿于-80℃冷冻24h，随后真空冷冻干燥72h。去除模具后，即可在硅胶片表面制备出含有Co²⁺的500μm厚的透明质酸防裸露层。

3.以聚丙交酯(PLA)为原料，利用3D打印技术在防裸露层表面形成网状纤维骨架层，网状纤维骨架层的纤维直径为100μm，所述纤维间的交叉角度在支撑体宽的方向上是110°，所述网状纤维骨架层的厚度是500μm。3D打印具体方法为：将PLA置于3D打印机的料筒中，熔料温度为260℃，熔料完成后，将载有防裸露层的支撑层作为打印基底，选用100μm口径针头，设置打印层高为100μm，打印层数为5层，按照自定义的“X”路径打印，平行纤维间距为100μm，打印纤维的交叉角度在支撑层宽的方向上为50°。

4.利用PEO和PGA作为原料，利用静电纺丝技术在上述支撑层的外表面制备生物降解纤维层，具体方法为：将适量PEO：PGA＝1：1(质量比)溶于六氟异丙醇中制备出浓度为0.25g/ml的电纺液，采用不锈钢作为导电接收板，将步骤3得到的网状纤维骨架、防裸露层和支撑层复合体固定于导电接收板与针头之间，且与导电板距离为1cm，导电板与针头距离为8cm，采用19G针头，16kV电压，设定流速为8mL/h，静电纺丝PEO/PGA纤维从针头喷向导电接收板的过程中被网状纤维骨架层接收，获得厚度为200μm的PEO/PGA生物降解纤维层。

5、在步骤4的基础上，按顺序重复步骤3，得到组织工程血管补片制作模板。

本实施例中，除上述模血管补片板制备过程外，还包括血管补片的制备方法，具体方法同实施例1。

实施例1～6的组织工程血管补片制作模板的具体参数见表1。

表1实施例1～6组织工程血管补片制作模板的具体参数

实施例7～12

实施例7～12与实施例1～6顺序对应，区别在于增加了保护套，所述保护层均以PCL为原材料，通过3D打印技术制备，保护套紧邻网状纤维骨架的一面设置有平行的镂空结构，平行的镂空结构在网状纤维骨架的正上方，平行的镂空结构的边缘为实体的无镂空结构的PCL板，起到连接和维持镂空结构稳定的作用，保护套与支撑层相接触的一面为实体片层结构，所打印的保护套为长方形的盒子，其内宽，内长与支撑体长、宽相等，其内高与支撑体、放裸露层及骨架主体的总厚度相当，保护套厚度向的四周也为实体结构。

实施例7～12的得到的组织工程血管补片制作模板的具体参数见表2。

表2实施例7～12组织工程血管补片制作模板的具体参数

对比例1～6

对比例1～6与实施例1～6顺序对应，区别仅仅在于设置在支撑层上的防裸露层不包含Co²⁺。

对比例1～6的得到的组织工程血管补片制作模板的具体参数见表3。

表3组织工程血管补片制作模板的具体参数

对比例7～12

对比例7～12与实施例1～6顺序对应，区别仅仅在于未设置防裸露层，没有防裸露层也就不会包含二价钴离子(Co²⁺)。对比例7～12的得到的组织工程血管补片制作模板的具体参数见表4。

表4对比例7～12中组织工程血管补片制作模板的具体参数

以下选取实施例1-4，7-10和对比例1-4，7-10，进行如下检测，以说明本发明的有益效果。

脱细胞基质填充模板检测：

将实施例1-4，7-10及对比例1-4，7-10所述的血管补片作模板埋置于羊皮下60天后，取出组织化的模板并去除支撑体，裁减掉缝合的边缘部分，对于有保护套的实施例和对比例，还需去除保护套，裁减掉边缘无凸起结构的部分，随后进行脱细胞处理和肝素交联处理，具体方法同实施例1，处理完毕后对所得的组织工程补片的脱细胞基质填充模板的情况进行观察，具体方法如下：

1.补片贴敷于支撑体面的脱细胞基质覆盖检测：所制备的血管补片经冷冻干燥后，利用扫描电子显微镜观察补片贴敷于支撑体面的脱细胞基质的覆盖和纤维裸露情况。所制备的补片贴敷于支撑体的面在使用时作为血液接触面。

2.骨架主体脱细胞基质填充情况检测：所得的血管补片经脱水、石蜡包埋后，进行石蜡切片，对切片进行H&E染色，通过光学正置显微镜(Leica DM4B)观察骨架主体脱细胞基质填充情况。

3.保护套镂空部位脱细胞基质填充情况检测：肉眼观察。所制备的补片接触保护套镂空部位的面在使用时作为与周围组织接触的面，不与血液接触。

得到脱细胞基质填充模板检测结果见表5。

表5脱细胞基质填充模板结果检测表

由上述检测数据可知：

1、设置于组织工程血管补片模板骨架主体中的生物降解纤维层，在皮下埋植过程中会降解，随着降解的发生，产生的空腔会被细胞组织所替代，经脱细胞处理后降解层产生的空隙成功被脱细胞基质所替代。

2、设置于支撑体上的防裸露层，在皮下埋植过程中会降解，随着降解的发生，产生的空腔会被细胞组织所替代，经脱细胞处理后所得血管补片会被脱细胞基质所覆盖，确保了最终制备的组织工程血管补片的血液接触面无纤维裸露。

3、设置保护套，最终可以使组织工程血管补片与周围组织接触面产生与镂空结构形状相对应的凸起的脱细胞基质。

4、所有防裸露层含有Co²⁺的模板所制备的血管补片与相对应的防裸露层不含有Co²⁺的模板所制备的血管补片一样，裸露层降解产生的空隙、骨架主体的生物降解纤维层降解产生的空隙和网状纤维骨架层的纤维孔隙均能被细胞外基质所填充，表明在皮下埋植过程中，防裸露层降解所释放出的Co²⁺，没有对细胞迁移和细胞外基质的填充产生影响。

血管补片弹性蛋白分布与含量及血管补片力学性能检测：

1.利用模板所制备血管补片的成品检测：用两只手捏住组织工程血管补片两端，将补片拱起成圆形，如果有部位出现易打折或表面扭曲的情况(此类情况多为纺丝过程造成骨架纤维孔径不均一所导致)，或是肉眼可见的纤维出现不均一结构(此类情况多为皮下埋植过程造成的骨架结构破坏所导致，脱细胞后血管补片材料变白且略有透明，可以透过脱细胞基质看到骨架纤维的大致结构)即为不合格血管补片，并计算利用模板所制备血管补片的成品率。以下测试均使用合格血管进行检测。

2.VVG染色：将实施例1-4，7-10及对比例1-4，7-10所制备的血管补片，经梯度脱水、石蜡包埋后，进行石蜡切片，对切片进行VVG染色，通过正置光学显微镜(Leica DM4 B)观察弹性纤维在补片血液接触面脱细胞基质层上的分布。

3.弹性蛋白定量检测：将实施例1-4，7-10及对比例1-4，7-10所制备的血管补片经液氮速冻后进行冷冻干燥，将冻干后的样品称重，然后按照弹性蛋白定量检测试剂盒(Biocolor，F2000，UK)的操作说明依次对血管补片进行弹性蛋白分离、弹性蛋白与染料结合、提取弹性蛋白-染料复合物、释放复合物染料、检测释放的复合物染料、绘制标准曲线、计算分析。最终以干重的形式来标定弹性蛋白的含量(ug/mg).

4.拉伸力学检测：将实施例1-4，7-10及对比例1-4，7-10所制备的血管补片及羊脱细胞颈动脉裁剪成宽为1cm，长为3cm的样品，注意所得补片样品的宽和长的方位应与裁剪前保持一致，以确保裁剪后样品中骨架纤维的交叉角度在宽的方向与裁剪前保持一致。注意羊脱细胞颈动脉裁剪后样品的长的方位应与裁剪前血管的血液流经方向一致。将裁剪好的材料沿长向夹在拉力机上(Instron-3345)，确保中间间隔为1cm，两端夹住的距离均为1cm，然后将软件的拉力设定为长向拉伸，拉伸速率为20mm/min，拉伸直至拉断为止，并记录材料的拉伸应力和断裂伸长率，然后通过应力-应变曲线的初始线性区域10％(0-10％)计算材料的杨氏模量。杨氏模量越低代表材料弹性越佳。

由图6VVG染色的图片可以看出，实施例1中所制备补片血液接触面的脱细胞基质层弹性纤维分致密，而对比例1中所制备补片血液接触面的脱细胞基质层弹性纤维相对稀疏。原因是实施例1使用的模板的防裸露层含有Co²⁺，羊皮下埋置之后，随着生物降解层的降解，产生的空腔会被细胞组织所替代，而释放的Co2⁺能够刺激迁移到空隙的细胞产生更多的弹性蛋白，因此制备的补片的血液接触面富含弹性纤维(图中白色虚线上面为血液接触面的脱细胞基质层，下面为含有纤维骨架的主体)。

以上检测结果请见下表6：

表6弹性蛋白定量和材料的力学数据

由上述检测数据可知：

1、设置外套，避免皮下埋植过程对纤维骨架结构的破坏，提高了组织工程血管补片的成品率。

2、设置于支撑层表面的防裸露层所含有的Co²⁺，在皮下埋植过程中随着防裸露层的降解，产生的空腔会被细胞组织所替代，同时释放Co²⁺能够刺激迁移到空隙处的细胞产生更多的弹性蛋白，经脱细胞处理后防裸露层产生的空隙会被富含弹性纤维的脱细胞基质所替代，即补片的血液接触面富含弹性纤维。

3、上述释放的Co²⁺也能够使最终制备的补片整体弹性蛋白的含量增加。

4、弹性蛋白含量的增加降低了血管补片的杨氏模量，但对补片的最大拉伸应力和断裂伸长率没有影响。杨氏模量的降低意味着补片的弹性增加，提高其与天然血管的弹性的匹配性。

5、引入保护套后，在补片非血液接触面产生的凸起的脱细胞基质结构在一定程度上降低了最大拉伸应力和杨氏模量，原因是由于最大拉伸应力和杨氏模量的计算均与材料的厚度有关，而补片非血液接触面产生的凸起增加了样品厚度，但是该凸起是间隔开的，其对样品整体所能承受的最大载荷的提升基本没有作用，因此，凸起的脱细胞基质结构在一定程度上降低了最大拉伸应力和杨氏模量，但是样品的最大拉伸应力，杨氏模量和断裂伸长率仍高于天然血管，可以满足作为补片的使用。

血管补片动物体内移植检测：

根据以往动物实验的经验，将上述实施例与对比例中所制备的血管补片裁剪成宽0.8cm，长1cm大小(注意所得补片样品的宽和长的方位应与裁剪前保持一致，以确保裁剪后样品中骨架纤维间的交叉角度在宽的方向与裁剪前保持一致)，进行羊(50kg)颈动脉血管补片植入手术。但是，本着动物实验的“3R”原则(减少、优化、替代原则)，在能够说明有益效果的前体下，本发明仅选取了有代表性的实施例和对比例血管补片进行羊双侧颈动脉补片移植。实施例1补片模板的骨架主体完全由网状纤维骨架构成，不具有生物可降解纤维层，而实施例4与实施例1的区别仅在于实施例4的骨架主体中包含生物可降解纤维层，其他均与实施例1相同，实施例1和实施例4能够很好的说明生物可降解纤维层的作用。因此，选择实施例1和实施例4作为代表性样品进行补片移植实验，相应的增加保护套的实施例7和实施例10，以及防裸露层不包含二价钴离子的对比例1和对比例4，以及不具有防裸露层的对比例7和对比例10也被选择进行动物实验。

将选取的实施例1，4，7，10及对比例1，4，7，10所制备的血管补片移植入动物体内后主要检测指标包括：血栓发生率，内膜增生发生率，内皮覆盖率，具有收缩表型的功能平滑肌覆盖率和与周围组织整合速度，具体如下：

1.样品准备：实施例1，4，7，10及对比例1，4，7，10中制备的血管补片裁剪成宽0.8cm，长1cm，注意所得补片样品的宽和长的方位应与裁剪前保持一致，以确保裁剪后样品中骨架纤维间的交叉角度在宽的方向与裁剪前保持一致。

2.补片植入：肌肉注射盐酸塞拉嗪注射液0.2mg/kg和咪达唑仑0.1mg/kg对羊进行基础麻醉，然后建立静脉通道，将实验羊(50kg)仰卧位固定于手术台，选择7.5号的气管插管进行置管，连接呼吸机辅助呼吸，给羊吸入含异氟烷的氧气维持麻醉的手术状态。对羊颈部进行剃毛消毒处理，使用电刀切开皮肤，并按肌肉纹理分开肌肉层，暴露颈动脉，过程中采用电凝对小血管进行止血。钝性分离颈动脉后静脉注射肝素抗凝(100UI/kg)，5分钟后阻断血流，切除宽0.8cm，长1cm的羊颈动脉片段，将上述裁剪的宽0.8cm，长1cm的血管补片用6-0Prolene缝合线以连续缝合的方式缝合到颈动脉。每只羊双侧颈动脉均进行血管补片的植入，每侧颈动脉植入相同组别的2个补片样品，2个补片样品之间间隔4cm以上，每组每个时间点进行4个血管补片样品的植入检测。

3.补片与植入部位整合速度检测：于术后10天时间点，肌肉注射盐酸塞拉嗪注射液0.2mg/kg和咪达唑仑0.1mg/kg对羊进行麻醉和取材，对取材过程中植入血管补片与周围组织的整合情况进行分析。植入血管与周围组织易于分离即为尚未整合；植入血管与周围组织不易分离，且无发炎，肿胀迹象即为整合完毕。

4.血栓情况检测：对于术后10天时间点取出的血管补片，通过体式显微镜检测内腔有无血栓形成情况并计算血栓发生率。血栓发生率分别计算为轻微血栓发生率(未堵塞)和堵塞血流血栓发生率。

5.内膜增生情况检测：于移植1个月时间点麻醉动物，取出植入的血管补片，通过体式显微镜检测补片内腔是否具有内膜增生的情况，并计算内膜增生发生率。内膜增生发生率计算为未阻塞血管内膜增生发生率和阻塞血管内膜增生发生率。

6.补片血液接触面的SEM检测：体式观察完毕后，将样品纵切一分为二，一部分经2.5％的戊二醛固定和冷冻干燥后对内腔进行扫描电镜分析，以评判是否具有内皮细胞覆盖。

7.免疫荧光染色：另一部分纵切样品从中部一分为二，每份长度为0.5cm，经梯度脱水、石蜡包埋后，进行石蜡切片，并对切片进行vWF和MYH免疫荧光染色，以判断内皮细胞、具有收缩功能表型的平滑肌细胞覆盖率。内皮细胞覆盖率计算方法为vWF⁺内皮细胞的覆盖长度占纵切补片样品总长度的比例；收缩功能表型的平滑肌细胞覆盖率计算方法为MYH⁺平滑肌的覆盖长度占纵切补片样品总长度的比例。

得到扫描电子显微镜(SEM)图片如图7所示；得到免疫荧光染色图片如图8与图9所示；得到血管移植检测结果见表7。

由图7扫描电子显微镜(SEM)图片可以看出，实施例1所使用的模板的防裸露层含有Co²⁺，因此其最终制备的补片血液接触面富含弹性纤维，植入羊颈动脉1个月后促进了内皮化，补片的近心缝合端、补片中部以及补片的远心缝合端已经均被内皮细胞所覆盖，而且覆盖的内皮细胞呈现了沿着血流方向排列的鹅卵石样形态。而对比例1所使用的模板的防裸露层不含有Co²⁺，因此其最终制备的补片血液接触面弹性纤维分布稀疏，植入羊颈动脉1个月后内皮化进程慢，补片仅近心缝合端和远心缝合端处被皮细胞所覆盖，而中间区域未被内皮细胞覆盖。

由图8vWF免疫荧光染色图片可以看出，实施例1所制备的血管补片植入羊颈动脉后1个月后，vWF⁺阳性的内皮细胞几乎完全覆盖了补片内腔。而对比例1所制备的补片，植入羊颈动脉1个月后，vWF⁺阳性的内皮细胞没有完全覆盖补片内腔(图片中的箭头代表缝合端)。

由图9MYH免疫荧光染色图片可以看出，实施例1所使用的模板的防裸露层含有Co^{2 +}，因此其最终制备的补片血液接触面富含弹性纤维，植入羊颈动脉1个月后促进了具有收缩表型的平滑肌细胞的再生，MYH⁺的平滑肌细胞几乎完全覆盖了补片内腔。而对比例1所使用的模板的防裸露层不含有Co²⁺，因此其最终制备的补片血液接触面弹性纤维分布稀疏，植入羊颈动脉1个月后具有收缩表型的平滑肌细胞的再生慢，MYH⁺的平滑肌细胞没有完全覆盖补片内腔(图片中的箭头代表缝合端)。

表7血管补片移植检测结果

由上述检测数据可知：

1、模板防裸露层中Co²⁺的添加增加了所制备补片弹性蛋白含量，提高了补片的弹性(杨氏模量降低)，弹性的提高抑制了内膜增生的发生。

2、模板防裸露层中Co²⁺的添加提高了所制备补片血液接触面脱细胞基质层弹性纤维的分布，进而促进了vWF⁺内皮细胞再生和MYH⁺(具有收缩功能表型)的平滑肌细胞的再生。

3、设置生物降解纤维层，最终产生的组织工程血管弹性好(杨氏模量降低)，与不设置生物降解纤维层相比，能够有效抑制内膜增生；

4、设置防裸露层，最终制备的血管补片内腔被脱细胞基质层所覆盖，无纤维裸露，可以抑制血栓形成；

5、设置外套可使组织工程血管外壁形成螺纹凸起结构，增加外表面的摩擦力，使血管植入体内后更加稳定，不易发生移位，增加植入血管与植入部位周围组织的整合速度。

Claims (10)

1.一种组织工程血管补片制作模板，其特征在于，包括依次设置的支撑层、防裸露层与骨架主体；所述防裸露层包括可降解材料与二价钴离子；所述骨架主体包括网状纤维骨架层。

2.根据权利要求1所述的组织工程血管补片制作模板，其特征在于，所述防裸露层的厚度为50～500μm；所述防裸露层中二价钴离子的质量为可降解材料质量的0.05％～0.5％。

3.根据权利要求1所述的组织工程血管补片制作模板，其特征在于，所述骨架主体包括相间排列的网状纤维骨架层与生物降解纤维层，且所述骨架主体的上下表面均为网状纤维骨架层；所述生物降解纤维层由可降解材料形成。

4.根据权利要求3所述的组织工程血管补片制作模板，其特征在于，所述网状纤维骨架层由纤维制备得到；所述纤维的直径为20～200μm，所述纤维间的交叉角度是30°～110°。

5.根据权利要求3所述的组织工程血管补片制作模板，其特征在于，所述防裸露层中的可降解材料选自成第一合成高分子材料或第一天然高分子材料；所述第一合成高分子材料选自聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或多种；所述第一天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与纤维蛋白胶中的一种或多种；

所述生物降解纤维层中的可降解材料选自合成第二高分子材料和/或第二天然高分子材料；所述第二合成高分子材料选自聚乙二醇、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)、聚对二氧六环己酮与聚癸二酸甘油酯中的一种或多种；所述第二天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与壳聚糖中的一种或多种。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的组织工程血管补片制作模板，其特征在于，还包括保护套；所述保护套设置于支撑层、防裸露层与骨架主体的外侧，且与骨架主体相接触的表面设置有镂空结构。

7.一种组织工程血管补片，其特征在于，以权利要求1～6任意一项所述的组织工程血管补片制作模板为模板制备得到。

8.根据权利要求7所述的组织工程血管补片，其特征在于，包括脱细胞基质内层与骨架层；所述骨架层包括纤维骨架层；所述纤维骨架层包括网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质，且所述纤维骨架层中的脱细胞基质与脱细胞基质内层呈一体化设置。

9.根据权利要求7所述的组织工程血管补片，其特征在于，包括脱细胞基质内层与骨架层；所述骨架层包括相间排列的纤维骨架层与脱细胞基质层，且所述骨架层与脱细胞基质内层相接触的一面及相对的一面均为纤维骨架层；所述纤维骨架层包括网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质，且所述纤维骨架层中的脱细胞基质、脱细胞基质层及脱细胞基质内层呈一体化设置。

10.根据权利要求7所述的组织工程血管补片，其特征在于，所述组织工程血管补片中弹性蛋白的质量为组织工程血管补片整体干重的44.01～113.7μg/mg。

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