CN111700711B - 一种可用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板及组织工程血管 - Google Patents
一种可用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板及组织工程血管 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属组织工程领域,具体涉及一种用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板,该模板包括骨架主体(1)、内芯(2)和防裸露层(3);所述防裸露层设置在内芯外表面;所述骨架主体设置在防裸露层的外表面;所述防裸露层(3)包括可降解材料与二价钴离子;所述骨架主体包括网状纤维骨架层。本发明的有益效果在于,防裸露层降解形成空隙最终可使脱细胞基质包覆于网状纤维骨架内腔表面,减少纤维裸露,降低对凝血反应的刺激;而网状纤维骨架可使所制备的组织工程血管具有良好的力学特性;防裸露层中的二价钴离子能够提高所制备组织工程血管的顺应性,减少内膜增生发生率,并提高体内植入后的组织再生性。
Description
技术领域
本发明属组织工程领域,具体涉及一种可用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板及组织工程血管。
背景技术
血管性疾病是全球致死率最高的疾病,该疾病的发生常由于血管狭窄或阻塞导致血流减少和营养物质缺乏,从而使组织或器官受损,通常表现为冠心病、脑血管病、外周动脉疾病。据世界卫生组织预测,到2030年全世界每年死于心血管相关疾病的人数会增加到2330万。血管移植手术仍是治疗这类疾病常规手段,目前这类手术采集使用患者自体血管(如大隐静脉,两侧胸廓内动脉、桡动脉等)仍然是血管移植的黄金标准。但是由于自体血管已经被采集过或者长度、口径不匹配或者患有复杂的血管病变而只能选择人工血管代替。
现有技术中,人造血管通常是采用人工高分子材料进行制备,如聚苯二甲酸乙二醇酯膨体聚四氟乙烯制备成的血管直接植入人体,这种情况下人工高分子材料会与人体血液或组织直接接触,会产生一定的排异反应,导致血栓、炎症和内膜增生等情况,进而造成移植失败。
运用体内工程化方法可有效的构建人工血管,其基本原理是利用机体对植入物自发的免疫包裹反应。常规的方法是将管状物植入宿主皮下,待宿主完成组织包裹后即可得到体内工程化血管。该方法的优点是所致制备的血管由细胞和组织构成,具有良好的生物相容性,但由于缺少人工合成聚合物材料的支撑,该血管力学性能欠佳,不能有效的维持管状结构,缝合难度大,而且植入动脉系统易出现动脉瘤和缝合端狭窄。在先前的研究中,我们利用人工合成聚合物材料在硅胶管表面制作纤维骨架,再将纤维骨架连同硅胶管作为模板植入动物皮下进行组织包裹,组织包裹形成后再进行脱细胞处理,得到了聚合物纤维骨架增强的组织工程血管,显著的改善了血管材料的力学性能,有效的解决了上述问题。此外,该方法制备的组织工程血管由于具有脱细胞基质,提高了血管材料的生物相容性,相比于单纯的人工合成聚合物材料构建人工血管减少了排异反应,在一定程度上提高了血管移植的成功率。但是,上述前期研究也反映出如下4个需要改进的方面:
首先,利用上述模板皮下埋植后所制备的组织工程血管内腔,有部分骨架纤维裸露,会刺激血栓形成;
第二,上述方法制备的血管的顺应性不佳,体内植入后会刺激平滑肌细胞的过度增殖,造成内膜增生;
第三,利用上述模板皮下埋植后所制备的组织工程血管外表面较为光滑,植入之内后易发生滑动,降低了血管与植入部位周围组织的整合速率;
第四,上述方法制备的组织工程学管的再生性有待提高。
因此,研发一种低刺激血栓形成,高顺应性的且具有良好再生性能的组织工程血管具有重要的临床和市场价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种可用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板及血管;该模板制备的组织工程血管内腔无纤维裸露,可降低对凝血的刺激,同时具有优异的顺应性,能够减少内膜增生,还可实现内皮细胞和具有收缩表型的功能平滑肌细胞的再生。
本发明提供了一种可用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板包括骨架主体、内芯和防裸露层;所述防裸露层设置在内芯外表面;所述骨架主体设置在防裸露层的外表面;所述防裸露层包括90天内可完全降解的可降解材料与二价钴离子。
优选的,所述的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板的防裸露层的厚度为50-500μm;所述防裸露层中二价钴离子的质量为可降解材料质量的0.05%~0.5%。
优选的,所述的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板的骨架主体包括相间排列的网状纤维骨架层与生物降解纤维层,且所述骨架主体的内外表面均为网状纤维骨架层;所述生物降解纤维层由可降解材料形成。
优选的,所述的低刺激、高顺应性组织工程血管的制作模板的网状纤维骨架层由纤维制备得到;所述网状骨架层中纤维的直径为20~200μm,所述纤维间的交叉角度是30°~110°。
优选的,所述的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板的防裸露层中的可降解材料选自成第一合成高分子材料或第一天然高分子材料;所述第一合成高分子材料选自聚乙二醇(PEO)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)与聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-4HB))中的一种或多种;所述第一天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与纤维蛋白胶中的一种或多种;
所述生物降解纤维层中的可降解材料选自第二合成高分子材料和/或第二天然高分子材料;所述第二合成高分子材料选自聚乙二醇(PEO)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-4HB))、聚对二氧六环己酮(PGS)与聚癸二酸甘油酯(PGS)中的一种或多种;所述第二天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与纤维蛋白胶中的一种或多种。
优选的,所述的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板还包括外套;所述外套设置于骨架主体的外表面;所述外套设置有镂空结构。
本发明还提供了一种低刺激、高顺应性组织工程血管,以上述的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板为模板制备得到。
优选的,所述低刺激、高顺应性组织工程血管,包括脱细胞基质内层与骨架层;所述骨架层包括纤维骨架层;所述纤维骨架层包括网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质,且所述纤维骨架层中的脱细胞基质与脱细胞基质内层呈一体化设置。
优选的,所述的低刺激、高顺应性组织工程血管,包括脱细胞基质内层与骨架层;所述骨架层包括相间排列的纤维骨架层与脱细胞基质层,且所述骨架层与脱细胞基质内层相接触的一面及相对的一面均为纤维骨架层;所述纤维骨架层包括网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质,且所述纤维骨架层中的脱细胞基质、脱细胞基质层及脱细胞基质内层呈一体化设置。
本发明的有益效果在于:
与现有技术相比,采用本发明提供的模板制备组织工程血管时,防裸露层降解形成空隙可使脱细胞基质材料包覆于网状纤维骨架内腔表面,减少纤维裸露,进而减少对凝血反应的刺激;同时防裸露层中含有的二价钴离子,一方面提高了所制备血管的顺应性,进而可抑制内膜增生,另一方面提高了所制备血管的内皮再生和具有收缩表型的功能平滑肌细胞再生;再者,网状纤维骨架可提供良好的力学性能,使其满足作为人工血管所要承受的力学强度。
所述骨架主体,可包括相间排列的网状纤维骨架层与生物降解纤维层,且所述骨架主体的内外表面均为网状纤维骨架层,生物降解纤维层在培养制备血管时会逐步降解,产生空隙,最终被脱细胞基质所替代,进一步提高所制备血管的顺应性,使之与天然血管的顺应性更为匹配。
设置有外套,可保护网状纤维骨架层中网状纤维骨架的结构,避免在培养制备时破坏骨架结构,且外套上镂空结构的设置可使制备得到的组织工程血管具有外部脊梁,增强血管抗扭结性能、抗爆破性能和缝合强度,也会因粗糙的外表面在体内植入后不易发生移动,加快与植入部位周围组织整合。
附图说明
图1为本发明提供的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板的一种实施方式的结构示意图;
图2为本发明提供的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板的另一种实施方式的结构示意图;
图3本发明提供的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板的内芯的横截面示意图;
图4本发明提供的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板的内芯的纵截面示意图;
图5为本发明提供的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板的第三种实施方式的结构示意图;
图6为本发明提供的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板的第四种实施方式的结构示意图;
图7为本发明提供的实施例4中的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板的横切面体式显微观察图片;
图8实施例2、对比例2和对比例4所制备的组织工程血管植入犬颈动脉10天后和天然犬颈动脉的超声检测的内径变化图;
图9实施例2、对比例2和对比例4所制备的组织工程血管植入犬颈动脉10天后和天然犬颈动脉的顺应性统计分析数据;
图10实施例2和对比例7所制备的组织工程血管植入犬颈动脉10天后的内腔的血栓形成情况;
图11实施例2和对比例2所制备的组织工程血管植入犬颈动脉3个月后的内腔扫面电镜图片;
图12实施例2和对比例2所制备的组织工程血管的VVG染色图片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
参见图1与图2;图1所示的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板的骨架主体为单层结构,完全由网状纤维骨架构成,其中1为骨架主体,2为内芯,3防裸露层;图2所示的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板的骨架主体为多层结构,由相间排列的网状纤维骨架层与生物降解纤维层构成,其中1为骨架主体,2为内芯,3防裸露层,11为骨架主体中的网状纤维骨架层,12为骨架主体中的生物降解纤维层。
本发明提供的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板以内芯决定制备的组织工程血管的整体形状;其作用是支撑骨架主体,使其在皮下或体外培养环境下能够保持管状形状;参见图3与图4,图3为内芯的横截面示意图;图4为内芯的纵截面示意图;所述内芯横截面可为实心结构,也可为空心结构,并无限制;当所述内芯为实心结构时,其可为整体的实心结构,也可为双层结构,这是由于所述内芯为高分子聚合物或硅胶或橡胶或尼龙制备时模板在组织培养时与细胞相容性好,但是由于管径较大时,压力作用易导致其变形,需要在其中加入硬质实心棒进行支撑,形成双层结构;所述内芯的纵截面可为矩形,也可为梯形,还可为与血管壁形状相匹配的任意异形,如U型、Y型、弓状带分枝型等;当内芯的纵截面为异形时,可利用如下方法获取:对需要进行血管移植部位的血管进行三维数据的获取,利用计算机软件将获取的血管尺寸三维数据构建相应的血管3D模型,打印出血管3D模型,即为所述异形内芯;所述内芯的外径优选为2-12mm,更优选为2-8mm;当所述内芯为空心管状结构时,其优选采用医用硅胶、橡胶、尼龙、聚氨酯(PU)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)(PLCL)共聚物、不锈钢、合金等材料中的一种或多种组成;当所述内芯为实心结构时,其优选采用医用硅胶、橡胶、尼龙、不锈钢、合金、聚氨酯(PU)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)等材料中的一种或多种制成;当所述内芯为双层结构时,其外层可以采用医用硅胶、橡胶、尼龙、聚氨酯(PU)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)等材料中的一种或多种组成,内层可采用医用硅胶、橡胶、尼龙、不锈钢、合金、聚氨酯(PU)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)等材料中的一种或多种组成。
所述内芯上设置有防裸露层;在利用用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板制备组织工程血管的过程中,防裸露层可快速降解,设置此层,可防止内芯与骨架主体的网状纤维骨架结合过于紧密,改善细胞向内芯表面的迁移和生长,围绕内芯分泌细胞外基质,使最终制备的血管材料内腔无骨架纤维裸露;所述防裸露层的厚度优选为50-500μm;在本发明提供的一些实施例中,所述防裸露层的厚度优选为50μm;在本发明提供的一些实施例中,所述防裸露层的厚度优选为500μm;在本发明提供的另一些实施例中,所述防裸露层的厚度优选为200μm;在本发明提供的另一些实施例中,所述防裸露层的厚度优选为250μm;在本发明中,所述防裸露层可为整体致密的涂层,也可为具有孔隙的疏松结构,并无特殊的限制;所述防裸露层包括可降解材料与二价钴离子;所述可降解材料可在90天内完全降解;所述可降解材料优选为第一合成高分子材料或第一天然高分子材料;所述第一合成高分子材料选自聚乙二醇(PEO)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)与聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-4HB))中的一种或多种;所述第一天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与纤维蛋白胶中的一种或多种;所述防裸露层中二价钴离子的质量优选为可降解材料质量的0.05%~0.5%,更优选为0.15%~0.5%,再优选为0.15%~0.25%;在本发明提供的一些实施例中,所述二价钴离子的质量优选为可降解材料质量的0.25%;在本发明提供的一些实施例中,所述二价钴离子的质量优选为可降解材料质量的0.05%;在本发明提供的另一些实施例中,所述二价钴离子的质量优选为可降解材料质量的0.15%;在本发明提供的另一些实施例中,所述二价钴离子的质量优选为可降解材料质量的0.25%;所述二价钴离子优选以无机钴盐提供;所述无机钴盐优选为无水氯化钴(CoCl2)和6水合氯化钴(CoCl2.6H2O);在本发明中,优选先将可降解材料与二价钴离子混合后制备可降解涂料,然后制备防裸露层;所述可降解材料与二价钴离子优选溶于溶剂中制备可降解涂料;当所述可降解材料为第一合成高分子材料时,可降解涂料中的溶剂优选为氯仿和/或甲醇;当所述可降解材料为第一天然高分子材料时,优选以水为溶剂;制备得到的可降解涂料可直接涂覆或浇铸于内芯的表面,干燥后得到防裸露层;也可将可降解涂料通过静电放纺丝、湿法纺丝等技术制备成纤维,在内芯表面形成防裸露层;其中干燥的方法可为加热干燥、自然风干、氮气吹干,也可为冷冻干燥,并无特殊的限制。
在本发明中,二价钴离子可提高所制备的组织工程血管的顺应性,从而抑制内膜增生,此外,二价钴离子还能提高所制备的组织工程血管的可再生性。
所述防裸露层上设置有骨架主体;所述骨架主体可为单层结构也可为多层结构;当所述骨架主体为单层结构时,其仅包含网状纤维骨架层,参见图1;当所述骨架层为多层结构时,其优选包括相间排列的网状纤维骨架层与生物降解纤维层,且所述骨架主体的上下表面均为网状纤维骨架层,参见图2;所述生物降解纤维层由可降解材料形成。
在本发明中,网状纤维骨架层具有独特的结构能够使最终制备的组织工程血管具有必要的力学强度;其孔隙可以满足细胞向骨架内部迁移生长的需要,填充骨架孔隙;当所述骨架主体中网状纤维骨架层为单层时,所述网状纤维骨架层的厚度优选200-2000μm,再优选为400-550μm;当所述骨架主体包含多层网状纤维骨架层时,每层网状纤维骨架层的厚度各自独立地优选为30-400μm,更优选为50-300μm,再优选为150-300μm;在本发明提供的一些实施例中,所述网状纤维骨架层的厚度优选为400μm;在本发明提供的一些实施例中,所述网状纤维骨架层的厚度优选为300μm;在本发明提供的一些实施例中,所述网状纤维骨架层的厚度优选为150μm;在本发明提供的另一些实施例中,所述网状纤维骨架层的厚度优选为100μm;在本发明提供的另一些实施例中,所述网状纤维骨架层的厚度优选为50μm;在本发明提供的另一些实施例中,所述网状纤维骨架层的厚度优选为30μm;所述网状纤维骨架层由纤维形成;其可通过静电纺丝、熔融纺丝、3D打印及纤维编织等方法制备得到;
所述网状纤维骨架层中的纤维由本领域技术人员熟知的纤维即可,并无特殊的限制,本发明中纤维优选由聚(丙交酯-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚氨基甲酸酯(PU)、聚癸二酸甘油酯(PGS)与聚乙二醇(PEO)中一种或多种形成;所述纤维的直径优选为20-200μm,更优选为20-100μm;在本发明提供的一些实施例中,所述纤维的直径优选为20μm;在本发明提供的一些实施例中,所述纤维的直径优选为40μm;在本发明提供的一些实施例中,所述纤维的直径优选为100μm;在本发明提供的另一些实施例中,所述纤维的直径优选为60μm;形成网状纤维骨架层的纤维的交叉角优选为30°-110°,更优选为50°-110°;
当所述骨架主体为多层结构时,在网状纤维骨架层之间设置有生物降解纤维层;所述生物降解纤维层的厚度优选为20-100μm,更优选为50-100μm;在网状纤维骨架层之间设置生物降解纤维层,生物降解纤维层由纤维组成,具有孔隙,可保证在培养的过程中细胞由外至内的顺利迁移生长,使整个骨架主体和防裸露层被细胞快速、充分填充;所述生物降解纤维层采用可降解材料制备;所述可降解材料可在90天内完全降解;所述可降解材料优选为第二合成高分子材料和/或第二天然高分子材料;所述第二合成高分子材料选自聚乙二醇(PEO)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-4HB))、聚对二氧六环己酮(PDS)与聚癸二酸甘油酯(PGS)中的一种或多种;所述第二天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与纤维蛋白胶中的一种或多种;所述生物降解纤维层可通过静电纺丝、熔融纺丝、3D打印、湿法纺丝、纤维编织等方法制备得到;
本发明提供的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板优选还包括外套,所述外套设置有镂空结构;参见图5和图6,图5为所述骨架主体为单层结构时模板设置外套的结构示意图,其中1为骨架主体,2为内芯,3防裸露层,4为外套,41为外套上设置的镂空结构部位;图6为所述骨架主体为多层结构时模板设置外套的结构示意图,其中1为骨架主体,2为内芯,3防裸露层,11为骨架主体中的网状纤维骨架层,12为骨架主体中的生物降解纤维层,4为外套,41为外套上设置的镂空结构部位;图5和图6中外套仅有中间设置有镂空结构,两端不含有镂空结构,从而使外套保持整体的一个结构。所述外套设置于骨架主体的外侧。通过设置外套能够防止动物皮下埋置操作或体外接种细胞及体外培养过程对骨架主体网状纤维骨架结构的破坏,并且能够控制组织工程血管的厚度,保证所制备组织工程血管壁厚的均一性;所述外套的厚度优选为300-3000μm,更优选为500-3000μm;在本发明提供的一些实施例中,所述外套的厚度优选为300μm;在本发明提供的一些实施例中,所述外套的厚度优选为500μm;在本发明提供的一些实施例中,所述外套的厚度优选为1000μm;在本发明提供的另一些实施例中,所述外套的厚度优选为3000μm;所述外套的厚度决定着所制备组织工程血管表面凸起的高度;通过镂空结构裸露出骨架主体,优选裸露出网状纤维骨架层;所述镂空结构的宽度优选为500-2000μm;所述镂空结构沿外套的径向切面的形状可为矩形、梯形、正方形或其他任意形状;镂空结构沿着所述外套的径向切面的形状决定着组织工程血管外壁凸起的外形;所述镂空结构沿外套方向优选呈螺纹状、平行的直线或平行的曲线;优选相邻平行镂空结构之间即相邻的两条平行的直线或曲线之间的距离优选为500-3000μm;在本发明提供的一些实施例中,所述相邻平行镂空结构之间的距离优选为500μm;在本发明提供的一些实施例中,所述相邻平行镂空结构之间的距离优选为1000μm;在本发明提供的一些实施例中,所述相邻平行镂空结构之间的距离优选为1500μm;在本发明提供的一些实施例中,所述相邻平行镂空结构之间的距离优选为3000μm;外套上设置镂空结构,能够在保证细胞有效迁移的前提下,在组织工程血管外形成“凸起”,能够增强所制备的组织工程血管的抗扭结性能、抗爆破性能和提高缝合强度,并且能够防止组织工程血管在植入人体内后发生滑动,使之更易于与植入部位周围组织相整合。
采用本发明提供的模板制备组织工程血管时,防裸露层降解形成空隙可使脱细胞基质材料包覆于网状纤维骨架内腔表面,减少纤维裸露,从而减少对凝血反应的刺激;同时防裸露层中含有的二价钴离子可提高所制备的组织工程血管的顺应性,从而抑制内膜增生,此外,二价钴离子还能提高所制备的组织工程血管的可再生性;再者,网状纤维骨架可提供良好的力学性能,使其满足作为人工血管所要承受的力学强度。
进一步,本发明提供的低刺激、高顺应性组织工程血管制作模板还设置有外套,可保护骨架主体网状纤维骨架层结构,避免在培养制备时破坏骨架结构,且外套上镂空结构的设置可使制备得到的组织工程血管具有外部脊梁,增强血管的抗扭结性能、抗爆破性能和提高缝合强度,也会因粗糙的外表面在体内植入后不易发生移动,加快与植入周围组织整合。
本发明还提供了一种组织工程血管,以上述的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板为模板制备得到;所述制备的方法优选为组织工程培养;所述组织工程培养可为皮下植入培养,也可为体外培养;所述体外培养可为体外静态培养,也可为体外动态培养;在进行皮下植入培养时,用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板的外套上的镂空结构可起到促进细胞向模板内部迁移、生长的作用,从而使细胞填充防裸露层、生物降解纤维层降解后产生的空隙、网状纤维骨架的孔隙和外套上的镂空部位;对于体外细胞培养,其上的镂空结构可起到促进氧气、营养物质和细胞代谢废物交换的作用。
在本发明中,优选具体采用以下方法制备:将所述低刺激、高顺应性组织工程血管制作模板植入动物皮下,或将种植有细胞的所述低刺激、高顺应性组织工程血管制作模板置于培养液中,于生物反应器中进行培养;使细胞向所述模板内部迁移生长,直至长满所述外套的镂空部位、网状纤维骨架层的纤维孔隙与所述防裸露层及生物降解纤维层降解形成的空隙;取出,去除外套与内芯,即可得到组织工程血管;所述种植的细胞优选为成纤维细胞、平滑肌细胞与干细胞分化来的平滑肌细胞中的一种或多种;当采用体外动态培养时,优选调节生物反应器中培养基的流速使压力为10-200mmHg;所述培养优选在37℃,20%O2、5%CO2条件下进行培养。
更优选地,在去除外套与内芯后,优选进行脱细胞处理步骤,得到组织工程血管。
所述脱细胞处理优选采用SDS法或液氮冻融法中至少一种。
优选地,所述SDS法包括如下步骤:将样品浸泡于1%SDS溶液中,置于摇床上室温摇晃12h,之后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的SDS冲洗干净,然后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml,其缓冲液由0.2mol/L MgCl2,0.2mol/LCaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成,DNase的浓度是50U/ml,RNase的浓度为1U/ml),于摇床上室温摇晃24h,随后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的DNase和RNase冲洗干净,最后将得到的产物置于无菌的PBS中,4℃保存。
优选地,所述液氮冻融法包括如下步骤:将样品于液氮中速冻20s,室温解冻60s,重复5遍,之后用无菌的生理盐水冲洗4-5遍,将细胞残渣冲洗干净。然后将材料置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml,其缓冲液由0.2mol/L MgCl2,0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成,DNase的浓度是50U/ml,RNase的浓度为1U/ml),于摇床上室温摇晃24h,随后用无菌生理盐水将组织包裹物上残留的DNase和RNase冲洗干净,最后将制得的产物置于无菌的PBS中,4℃保存
当所述低刺激、高顺应性组织工程血管制作模板中骨架主体仅包含一层网状纤维骨架层时,得到的组织工程血管包括脱细胞基质内层与骨架层;所述骨架层包括纤维骨架层;所述纤维骨架层包括网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质,且所述纤维骨架层中的脱细胞基质与脱细胞基质内层呈一体化设置。
当所述低刺激、高顺应性组织工程血管制作模板中骨架主体包含多层网状纤维骨架层时,得到的组织工程血管优选包括脱细胞基质内层与骨架层;所述骨架层包括相间排列的纤维骨架层与脱细胞基质层,且所述骨架层与脱细胞基质内层相接触的一面及相对的一面均为纤维骨架层,即骨架层中的脱细胞基质层均位于两层纤维骨架层之间;所述纤维骨架层包括网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质,且所述纤维骨架层中的脱细胞基质、脱细胞基质层及脱细胞基质内层呈一体化设置。
本发明得到的组织工程血管还包括设置于骨架层的外层;所述外层为具有凸起结构的脱细胞基质,所述组织工程血管外层凸起的脱细胞基质的形态与外套镂空结构相对应,所述组织工程血管外层凸起的脱细胞基质与纤维骨架层中的脱细胞基质、脱细胞基质层及脱细胞基质内层呈一体化设置。
按照本发明,脱细胞处理后得到的组织工程血管优选还负载有生物活性物质,可提高组织工程血管的通畅性;所述生物活性材料优选通过共价或物理吸附负载在组织工程血管的表面;所述生物活性物质的种类优选为肝素与水蛭素中的一种或2种混合种。
本发明得到的组织工程血管中网状纤维骨架主要起到提供良好力学性能的作用,使组织工程血管具有良好的可回弹性,抗扭结性、抗爆破性能和可缝合性;复合在网状纤维骨架上的脱细胞基质整体上提供了良好的生物相容性,能够促进血管组织再生和与植入部位组织的整合,根据脱细胞基质位置的不同,其作用也有所划分,填充于骨架纤维孔隙的脱细胞基质和填充于生物降解纤维层降解产生的空隙的脱细胞基质也起到了有效阻碍血液和生物大分子渗漏作用,位于最内层覆盖在网状纤维骨架上的一层脱细胞基质提供光滑表面,减少对凝血反应的刺激,位于组织工程血管最外层的凸起的脱细胞基质,提供了粗糙的表面,有利于组织工程血管在体内的稳定和促进与植入部位周围组织整合的作用,此外也能提高组织工程血管的可抗扭结性能、抗爆破性能和增强缝合强度;并且,本发明制备的组织工程血管还可负载抗凝物质提高血管通畅性,不容易发生急性凝血。
本发明提供的组织工程血管不仅满足植入部位所需的特定力学要求,而且生物相容性好,有利于细胞粘附性和生长,可用于临床上的血管替换,血管旁路建立或动静脉造瘘。
为了进一步说明本发明,以下结合实施例对本发明提供的一种用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板及组织工程血管进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1
本实施例提供的低刺激、高顺应性组织工程血管制作模板,其由内到外包括内芯、含Co2+的防裸露层、骨架主体;所述骨架主体包括4层网状纤维骨架层和3层生物降解纤维层,且骨架主体的内外表面均为网状纤维骨架层。
模板制备过程包括如下步骤:
1.选取硅胶管作为内芯,外径为2mm,内径1mm;内芯的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2.以PLGA/CoCl2·6H2O为原料,采用旋涂法在上述硅胶管表面制备防裸露层,具体方法为:向上述硅胶管中插入适宜口径的不锈钢棒作为接收棒,将其与旋转电机相连。以氯仿:甲醇=5:1(体积比)作为溶剂,PLGA为溶质,配制浓度为0.3g/ml的涂覆溶液,向溶液中加入CoCl2·6H2O使Co2+与PLGA的质量比率为0.5%,采用14G针头,按照15ml/h的注射速度用注射器将涂覆液挤出涂覆在以转速为150r/min、水平移动速度为2mm/s的硅胶管外壁上,针头到硅胶管外壁的距离为5mm,针头竖直向下正对硅胶管轴心。完成涂层后,将涂覆有PLGA/CoCl2·6H2O的硅胶管置于通风橱中,待溶剂挥发完成后置于真空泵中抽除残留溶剂,即可在硅胶管表面得到50μm厚的含有Co2+的PLGA防裸露层。
3.以聚己内酯(PCL)为原材料,利用熔融纺丝技术,在上述防裸露层表面制备第一网状纤维骨架层,网状纤维骨架层的纤维直径为20μm,所述纤维间的交叉角度是30°,所述网状纤维骨架层的厚度是50μm。熔融纺丝的具体方法为:将上述接收棒与旋转电机相连;PCL置于热熔器包裹的封闭的无锈钢注射器中,于210℃下加热1h后进行纺丝;不锈钢注射器配以21G不锈钢针头,注射器针头与接收棒的距离为10mm,PCL熔体的流速为0.1ml/h,接收棒的旋转速度设置为300r/min,平移速度设置为7mm/s。接收厚度为50μm。
4.以胶原为原料,利用静电纺丝技术在上述第一网状纤维骨架层的外表面制备生物降解纤维层,具体方法为:将胶原溶于六氟异丙醇中制备出浓度为0.15g/ml的电纺液,采用21G针头,设定流速为6mL/h,在电纺针头施加17kV的直流电压,采用接地的不锈钢作为导电接收板,将步骤3中的接收棒置于导电接收板与针头之间,且与导电板距离1cm,导电板与针头距离为10cm,接收棒以100r/min的转速旋转,在导电板前接受静电纺丝喷出的纤维,接收厚度为20μm。
5.在上述步骤4的生物降解纤维层的外表面制备后续网状纤维骨架层,方法同步骤3,但接收厚度调整为30μm。
6.重复上述步骤4、步骤5各2次。
实施例1中得到的模板的具体参数见表1。
本实施例中,除上述模板制备过程外,还包括组织工程血管的制备方法,具体如下:
1.将上述制备的低刺激、高顺应性组织工程血管制作模板整体植入羊皮下,60天后取出。
2.取出所述血管模板后,去除内芯,再进行脱细胞处理。
脱细胞处理步骤采用SDS法:将样品浸泡于1%SDS溶液中,置于摇床上室温摇晃12h,之后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的SDS冲洗干净,然后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml,其缓冲液由0.2mol/L MgCl2,0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成,DNase的浓度是50U/ml,RNase的浓度为1U/ml),于摇床上室温摇晃24h,随后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的DNase和RNase冲洗干净,最后将得到的产物置于无菌的PBS中。
3.脱细胞处理后再进行交联肝素处理,即可得到相应的低刺激、高顺应性组织工程血管。肝素交联具体方法为:用去离子水配制无菌的pH5.6浓度为0.05M的MES(2-吗啉乙磺酸)缓冲溶液,然后用MES配制交联反应液,反应液中各组分浓度为:EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)2.0mg/ml;NHS(N-羟基丁二酰亚胺1.2mg/ml;肝素钠2.0mg/ml。之后进行交联反应,首先将脱细胞产物浸泡于pH5.6浓度为0.05M的MES缓冲溶液中20分钟,然后将反应液置于37℃反应10分钟以活化羧基,10分钟之后将脱细胞的产物从MES缓冲液中取出,直接放入反应液中,37℃轻轻摇动(20~40rpm/min)4小时。之后用0.1M无菌Na2HPO4(含1%PS)连续洗材料2小时,接着用无菌的4M NaCl 60~80rpm/min 4℃连续洗24小时;之后用无菌水(含1%PS)60~80rpm/min 4℃连续洗24小时。最后将材料置于无菌PBS溶液中,4℃保存备用。
实施例1-5的具体参数汇总见表1。
实施例2
本实施例提供的用于低刺激、高顺应性组织工程血管制作模板,其由内到外包括内芯、含Co2+的防裸露层、骨架主体;所述骨架主体包括3层网状纤维骨架层和2层生物降解纤维层,且骨架主体的内外表面均为网状纤维骨架层。
模板制备过程包括如下步骤:
1.以外径为4mm,内径为2mm的聚氨酯管作为内芯,内芯的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2.以PLGA/PEO/CoCl2·6H2O为原材料,采用高压静电纺丝技术,在聚氨酯管表面制备防裸露层,具体方法为:向上述聚氨酯管中插入适宜口径的不锈钢棒作为接收棒,以三氯甲烷:甲醇=5:1(体积比)作为溶剂,PLGA:PEO=1:1(质量比)作为溶质,配制浓度为0.28g/ml的电纺液,向溶液中加入CoCl2·6H2O,使Co2+与PLGA和PEO总质量的质量比率为0.25%,采用20G针头,设置流速为8mL/h,在电纺针头施加16kV的直流电压,采用接地的不锈钢板作为导电接收板,将接收棒置于导电接收板与针头之间,且与导电板距离1cm,导电接收板与针头距离为8cm,接收棒以100r/min的转速旋转,在导电接收板前接收静电纺丝喷出的纤维,收集厚度为200μm的含Co2+的PLGA/PEO防裸露层。
3.以聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)为原材料,利用熔融纺丝技术,在防裸露层表面形成第一网状纤维骨架层,网状纤维骨架层的纤维直径为40μm,所述纤维间的交叉角度是50°,所述网状纤维骨架层的厚度是100μm。熔融纺丝的具体方法为:将步骤2中的接收棒与旋转电机相连;PLCL置于热熔器包裹的封闭的无锈钢注射器中,于220℃下加热1h后进行纺丝;不锈钢注射器配以20G不锈钢针头,注射器针头与接收棒的距离为13mm,熔体的流速为0.25ml/h,接收棒的旋转速度设置为200r/min,平移速度设置为18mm/s。纺丝接收厚度为100μm。
4.以PDS为原料,利用静电纺丝技术,在上述第一网状纤维骨架层的外表面制备生物降解纤维层,具体方法为:将适量PDS溶于六氟异丙醇中制备出浓度为0.18g/ml的电纺液,采用20G针头,设定流速为6mL/h,在针头施加17kV的直流电压,采用接地的不锈钢板作为导电接收板,将步骤3中的接收棒置于导电接收板与针头之间,且与导电接收板距离1cm,导电板与针头距离为10cm,接收棒以100r/min的转速旋转,在导电接收板前接受静电纺丝喷出的纤维,收集厚度为50μm。
5.在上述步骤4的生物降解纤维层外表面制备后续网状纤维骨架层,方法同步骤3。
6.重复上述步骤4、步骤5各1次。
实施例2中得到的模板的具体参数见表1。
本实施例中,除上述模板制备过程外,还包括低刺激、高顺应性组织工程血管的制备方法,具体过程同实施案例1,此处不再赘述。
实施例1-5的具体参数汇总见表1。
实施例3
本实施例提供的低刺激、高顺应性组织工程血管制作模板,其由内到外包括内芯、含Co2+的防裸露层、骨架主体;所述骨架主体包括2层网状纤维骨架层和1层生物降解纤维层,且骨架主体的内外表面均为网状纤维骨架层。
模板制备过程包括如下步骤:
1.以外径为5mm,内径为3mm的硅胶管作为内芯,内芯的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2.以P(3HB-co-4HB)/PEO/CoCl2·6H2O为原材料,采用高压静电纺丝技术,在硅胶管表面制备防裸露层,具体方法为:向上述硅胶管中插入适宜口径的不锈钢棒作为接收棒,以三氯甲烷:甲醇=5:1(体积比)作为溶剂,P(3HB-co-4HB):PEO=1:0.5(质量比)作为溶质,配制浓度为0.3g/ml的电纺液,向溶液中加入CoCl2·6H2O,使Co2+与P(3HB-co-4HB)和PEO的总质量的质量比率为0.15%,采用19G针头,设置流速为8mL/h,在针头施加14kV的直流电压,采用接地的不锈钢板作为导电接收板,将硅胶管置于导电接收板与针头之间,且与导电接收板距离1cm,导电板与针头距离为11cm,接收棒以100r/min的转速旋转,在导电接收板前接收静电纺丝喷出的纤维,收集厚度为250μm的含Co2+的P(3HB-co-4HB)/PEO防裸露层。
3.以聚己内酯(PCL)为原材料,利用熔融纺丝技术,在上述防裸露层表面形成第一网状纤维骨架层,网状纤维骨架层的纤维直径为60μm,所述纤维间的交叉角度是50°,所述网状纤维骨架层的厚度是150μm。熔融纺丝的具体方法为:将步骤2接收棒与旋转电机相连;PCL置于热熔器包裹的封闭的无锈钢注射器中,于210℃下加热1h后进行纺丝;不锈钢注射器配以17G不锈钢针头,注射器针头与接收棒的距离为15mm,PCL熔体的流速为0.7ml/h,接收棒的旋转速度设置为180r/min,平移速度设置为21mm/s。纺丝接收厚度为150μm。
4.利用PGA和胶原作为原料,利用静电纺丝技术,在上述生物降解纤维层的外表面制备生物降解纤维层,具体方法为:将适量PGA:胶原=1:1(质量比)溶于六氟异丙醇中,制备出浓度为0.25g/ml的电纺液,采用20G针头,设置流速为8mL/h,在针头施加16kV的直流电压,采用接地的不锈钢板作为导电接收板,将步骤3中的接收棒置于导电接收板与针头之间,且与导电接收板距离1cm,导电板与针头距离为8cm,接收棒以100r/min的转速旋转,在导电接收板前接收静电纺丝喷出的纤维,收集厚度为50μm的PGA/胶原生物降解纤维层。
5.在上述步骤4的生物降解纤维层外表面制备后续网状纤维骨架层,方法同步骤3。
6.重复上述步骤4、步骤5各1次。
实施例3中得到的模板的具体参数见表1。
本实施例中,除上述模板制备过程外,还包括低刺激、高顺应性组织工程血管的制备方法,具体过程同实施案例1,此处不再赘述。
实施例1-5的具体参数汇总见表1。
实施例4
本实施例提供的低刺激、高顺应性组织工程血管制作模板,其由内到外包括内芯、含Co2+的防裸露层、骨架主体;所述骨架主体完全由网状纤维骨架构成,其中不含有生物降解纤维层。
模板制备过程包括如下步骤:
1.以外径为4mm,内径为2mm的聚氨酯管作为内芯,内芯的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2.以PLGA/PEO/CoCl2·6H2O为原材料,采用高压静电纺丝技术,在聚氨酯管表面制备含防裸露层,具体方法为:向上述聚氨酯管中插入适宜口径的不锈钢棒作为接收棒,以三氯甲烷:甲醇=5:1(体积比)作为溶剂,PLGA:PEO=1:1(质量比)作为溶质,配制浓度为0.28g/ml的电纺液,向溶液中加入CoCl2·6H2O,使Co2+与PLGA和PEO的总质量的质量比率为0.25%,采用20G针头,设置流速为8mL/h,在电纺针头施加16kV的直流电压,采用接地的不锈钢板作为导电接收板,将硅胶管置于导电接收板与针头之间,且与导电接收板距离1cm,导电板与针头距离为8cm,接收棒以100r/min的转速旋转,在导电接收板前接收静电纺丝喷出的纤维,收集厚度为200μm的含Co2+的PLGA/PEO防裸露层。
3.以聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)为原材料,利用熔融纺丝技术,在防裸露层表面形成网状纤维骨架层,网状纤维骨架层的纤维直径为40μm,所述纤维间的交叉角度是50°,所述网状纤维骨架层的厚度是400μm。熔融纺丝的具体方法为:将步骤2中接收棒与旋转电机相连;PLCL置于热熔器包裹的封闭的不锈钢注射器中,于220℃下加热1h后进行纺丝;不锈钢注射器配以20G不锈钢针头,注射器针头与接收棒的距离为13mm,熔体的流速为0.25ml/h,接收棒的旋转速度设置为200r/min,平移速度设置为18mm/s。纺丝接收厚度为400μm。
实施例4中得到的模板的具体参数见表1。
本实施例中,除上述模板制备过程外,还包括组织工程血管的制备方法,具体过程同实施案例1,此处不再赘述。
图7为实施例4所制备的模板的横切面体式图片,其中2为内芯聚氨酯管,3为由PLGA、PEO和CoCl2·6H2O构成的防裸露层,1为由PLCL构成的网状纤维骨架层。由图7可看出,实施例4所制备的模板的防裸露层厚度为200μm,网状纤维骨架层厚度为50μm,且防裸露层与网状纤维骨架层紧密贴合,无分层情况。
实施例1-5的具体参数汇总见表1。
实施例5
本实施例提供的用于低刺激、高顺应性组织工程血管制作模板,其由内到外包括内芯、含Co2+的防裸露层、骨架主体;所述骨架主体包括5层网状纤维骨架层和4层生物降解纤维层,且骨架主体的内外表面均为网状纤维骨架层。
模板制备过程包括如下步骤:
1.以外径为8mm的不锈钢棒作为内芯,内芯的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2.以透明质酸和CoCl2·6H2O为原材料,采用冷冻干燥技术,在不锈钢表面制备防裸露层,具体方法为:用蒸馏水作为溶剂,配制25mg/ml的透明质酸溶液,向溶液中加入CoCl2·6H2O,使Co2+与透明质酸的质量比率为0.05%,在不锈钢圆棒外固定模具,使不锈钢表面与模具间的距离为500μm,将透明质酸溶液灌注到不锈钢圆棒与模具之间后将其置于-80℃冷冻24h,随后真空冷冻干燥72h。去除模具后,即可在不锈钢圆棒表面获得厚度为500μm的含Co2+的透明质酸防裸露层。
3.以PLA为原材料,利用熔融纺丝技术,在上述防裸露层表面形成第一网状纤维骨架层,网状纤维骨架层的纤维直径为100μm,所述纤维间的交叉角度是110°,所述网状纤维骨架层的厚度是400μm。熔融纺丝的具体方法为:以步骤2中接收棒与旋转电机相连;PLA置于热熔器包裹的封闭的不锈钢注射器中,于240℃下加热1h后进行纺丝;不锈钢注射器配以15G不锈钢针头,注射器针头与接收棒的距离为19mm,PLA熔体的流速为10ml/h,接收棒的旋转速度设置为120r/min,平移速度设置为72mm/s。纺丝接收厚度为400μm。
4.利用PEO和PGA作为原料,利用静电纺丝技术,在上述第一网状纤维骨架层的外表面制备生物降解纤维层,具体方法为:将适量PEO:PGA=1:1(质量比)溶于六氟异丙醇中,制备出浓度为0.25g/ml的电纺液采用19G针头,设置流速为8mL/h,在电纺针头施加16kV的直流电压,采用接地的不锈钢板作为导电接收板,将步骤3中的接收棒置于导电接收板与针头之间,且与导电接收板距离1cm,导电板与针头距离为8cm,接收棒以100r/min的转速旋转,在导电接收板前接收静电纺丝喷出的纤维,接收厚度为100μm。
5.在上述步骤4的生物降解纤维层外表面制备后续网状纤维骨架层,方法同步骤3,但接收厚度为300μm。
6.重复上述步骤4、步骤5各3次。
实施例5中得到的模板的具体参数见表1。
本实施例中,除上述模板制备过程外,还包括组织工程血管的制备方法,具体过程同实施案例1,此处不再赘述。
实施例1-5中模板参数汇总如下表1:
表1实施例1-5模板参数表
注:表1中所述第一网状纤维骨架层为骨架主体所有网状纤维骨架层中最内侧的网状纤维骨架层;后续网状纤维骨架层为骨架主体中除第一网状纤维骨架层外的其他网状纤维骨架层。
实施例6-10
实施例6-10与实施例1-5顺序对应,区别仅仅是与设置了外套,所述外套均以PCL为原材料,通过3D打印(Allevi3,Allevi,America)技术制备,外套内径与骨架主体外径相当,将上述外套置于所制备的骨架主体,并确保骨架主体处于镂空部位,将橡胶棒做成塞子,堵在外套的两端,防止皮下埋植或体外细胞培养过程中骨架主体在外套内发生移动。
实施例6-10的模板参数见表2:
表2实施例6-10参数表
注:表2中所述第一网状纤维骨架层为骨架主体所有网状纤维骨架层中最内侧的网状纤维骨架层;后续网状纤维骨架层为骨架主体中除第一网状纤维骨架层外的其他网状纤维骨架层。
对比例1-5
为了进一步说明实施例1-5中的二价钴离子(Co2+)的有益效果,设置对比例1-5,对比例1-5与实施例1-5顺序对应,区别仅仅在于所述的防裸露层不包含二价钴离子(Co2+)。具体区别如下表3:
表3对比例1-5参数表
对比例6-10
为了进一步说明实施例1-5中防裸露层的有益效果,设置对比例6-10,对比例6-10与实施例1-5区别在于区别仅仅在于不包括防裸露层(不包括防裸露层也不会含有二价钴离子(Co2+)。具体区别如下表4:
表4对比例6-10参数表
对比例11-13
对比例11与实施例1对应,对比例12与实施例3对应,对比例13与实施例5对应,区别仅仅在于采用与网状纤维骨架层材质和结构相同的材料替代骨架主体多层结构,即骨架主体仅由网状纤维骨架层构成,且厚度与含有生物降解纤维层时骨架主体总厚度相当。实施例4相比于实施例2已经是上述替代情况,因此实施例4本身就是实施例2在本替代情况下的对比例,因此,不在此处列出。具体区别如下表5:
表5对比例11-13参数表
以下通过相关结果的展示与分析来充分说明本发明的有益效果。
在进行相关检测前,需要对利用上述模板所制备的组织工程血管进行成品检测,具体方法为:用拇指和食指从一端到另一端轻捏,并轻微揉搓血管,如果血管有部位出现易塌陷或易扭曲的情况(此类情况常由纺丝过程造成的网状纤维骨架层纤维间孔径不均一所导致),或是肉眼可见的纤维出现不均一结构(此类情况多为皮下埋植过程造成的网状纤维骨架层结构破坏所引起,脱细胞处理后血管材料变白且略有透明,可以透过脱细胞基质看到网状纤维骨架层的大致结构)即为不合格血管。以下测试均使用合格血管进行检测。
脱细胞基质填充检测:
对实施例1-10及对比例1-13所制备的组织工程血管的脱细胞基质填充情况进行观察,具体方法如下:
1.内腔脱细胞基质覆盖检测:所制备的组织工程血管经冷冻干燥后,利用扫描电子显微镜观察血管内腔脱细胞基质覆盖和纤维裸露情况。
2.骨架主体脱细胞基质填充情况检测:所得的组织工程血管经石蜡脱水包埋后,进行石蜡切片,对切片进行H&E染色,通过显微镜观察骨架主体脱细胞基质填充情况。
2.外套镂空部位脱细胞基质填充情况检测:肉眼观察。
以上检测结果见下表6:
表6脱细胞基质填充模板的情况分析
由上述检测数据可知:
1、设置防裸露层,在皮下埋植过程中会降解。随着降解的发生,产生的空腔会被细胞组织所替代,经脱细胞处理后所得血管的内腔会被脱细胞基质所覆盖,保证最终组织工程血管内腔不会有纤维裸露;
2、设置模板骨架主体的生物降解纤维层,在皮下埋植过程中会降解。随着降解的发生,产生的空腔会被细胞组织所替代,经脱细胞处理后生物降解纤维层降解产生的空隙被脱细胞基质所替代。
3、设置外套,最终可以在组织工程血管外壁产生与镂空结构形状相对应的凸起的脱细胞基质。
4、所有防裸露层含有Co2+的模板所制备的血管与相对应的防裸露层不含有Co2+的模板所制备的血管一样,裸露层降解产生的空隙、骨架主体的生物降解纤维层降解产生的空隙和骨架主体中网状纤维骨架层的纤维孔隙均能被细胞外基质所填充,表明二价钴离子的添加和防裸露层降解所引起二价钴离子的释放没有对细胞迁移和细胞外基质的填充产生影响。
物理性能检测:
将实施例1-10及对比例1-13所制备的合格的组织工程血管进行如下方面的物理性能检测,具体检测项目及方法如下:
1.扭结半径检测:将样品放置在半径规上,逐渐减小半径规的半径直到血管样品出现微小的管道变窄或扭结,记录此时半径规的半径即为样品的扭结半径。
2.爆破强度检测:小心地将适宜大小球囊放进所得血管样品中,球囊通过导管与三通接口连接,三通接口的另外两个接口分别连接压力记录装置和加压装置,通过加压装置向球囊加压使血管膨胀,直至血管破裂,记录血管样品破裂的压力值,并通过压力换算后以mmHg为测量结果单位。
3、缝合强度检测:沿轴向截取一段血管样品,以6-0缝线在血管一端的边缘以下2mm处穿过血管壁,缝合成一个半环,缝合线末端固定于拉力机的夹具上,血管样品的另一端固定于拉力机的另一夹具上,以50mm/min速度拉伸缝合线。记录将缝线从血管壁中拉出的拉力大小。缝合强度以N为单位计算。
4、回弹性检测:用镊子夹捏血管样品2秒后立即松开镊子,用肉眼观察血管是否可恢复到原有的形貌。
以上检测结果见下表7:
表7物理性能结果检测表
由上述检测数据可知:
1、设置外套使低刺激、高顺应性组织工程血管外壁形成螺纹凸起结构脱细胞基质,以及防裸露层降解后填充的脱细胞基质层均能起到提高血管抗爆破能力的作用。
2、设置外套使低刺激、高顺应性组织工程血管外壁形成螺纹凸起结构的脱细胞基质,减少了低刺激、高顺应性组织工程血管的扭结半径,也就是提高了低刺激、高顺应性组织工程血管的抗扭结性能。
3、设置外套使低刺激、高顺应性组织工程血管外壁形成螺纹凸起结构的脱细胞基质,能够提高血管的缝合强度。
4、模板骨架主体中的网状纤维骨架层,无论是否间隔有生物降解纤维层,网状纤维骨架层中的网状纤维骨架均能使所制备的血管材料具有良好的可回弹性,并提供必要的力学强度。模板骨架主体中包含生物降解纤维层时,所制备的血管材料,相比于无生物降解纤维层时所制备的血管材料的抗扭结能力,抗爆破能力和缝合强度均有所下降,但是成品血管的各项指标仍能满足作为人工血管的要求,如爆破压高于1600mmHg,缝合强度高于1.7N。
5、防裸露层中添加二价钴离子(Co2+)的模板所制备的血管与防裸露层中未添加二价钴离子(Co2+)的模板所制备的血管在扭结半径、爆破压、缝合强度和可回弹性方面并无显著差异,表明防裸露层中添加二价钴离子(Co2+)没有对所制备的血管的物理性能产生影响。
动物体内血管移植检测:
根据以往动物实验的经验,实施例1、6和对比例1、6、11制备的组织工程血管口径为2mm,应该进行大鼠腹主动脉移植;实施例2、4、7、9和对比例2、4、7、9制备的组织工程血管口径为4mm,应该进行比格犬颈动脉移植;实施例3、8和对比例3、8、12制备的组织工程血管口径为5mm,应该进行羊(约30kg)颈动脉移植;实施例5、10和对比例5、10、13制备的组织工程血管口径为8mm,应该进行比格犬腹主动脉移植。但是,本着动物实验的“3R”原则(减少、替代和优化原则),在能够说明有益效果的前体下,我们仅选择犬颈动脉移植对相关口径组织工程血管进行检测,原因如下:
1、犬颈动脉移植是大动物血管移植实验,相比于小动物(大鼠腹主动脉移植)更具有代表性,所使用的组织工程血管尺寸也更贴近临床使用情况,所得结果更具有意义。
2、犬颈动脉移植所使用的是4mm口径的血管,是典型的小口径人工血管,对于小口径人工血管来说,口径越小越容易出现血栓和内膜增生等问题,而导致移植失败,因此4mm口径的血管比5mm和8mm口径的血管更能反映血管性能;
3、比格犬性格温顺,便于饲养管理;
4、颈动脉移植相比于腿部动脉移植,颈部活动少,易于动物恢复。犬颈动脉移植后的检测主要包括:血栓发生率,内膜增生发生率,内皮覆盖率,具有收缩功能表型的平滑肌细胞的覆盖率和与周围组织整合速度,具体操作如下:
1.样品准备:将实施例2、4、7、9和对比例2、4、7、9制备的口径为4mm的组织工程血管裁剪为4cm长的样品。
2.比格犬颈动脉移植:通过肌注盐酸噻拉嗪注射液1.5mg/kg对比格犬进行基础麻醉后于前腿埋植留置针,建立静脉通路。将实验犬仰卧位固定于手术台,选择7号的管插管进行置管,连接呼吸机辅助呼吸,给比格犬吸入含异氟烷的氧气维持麻醉的手术状态。对颈部两侧进行剃毛消毒处理,使用电刀切开皮肤,并按肌肉纹理分开肌肉层,暴露颈动脉,过程中采用电凝对小血管进行止血。钝性分离颈动脉后静脉注射肝素抗凝(100UI/kg),5分钟后阻断血流,剪去约为3cm长的颈动脉,将上述裁剪的长为4cm的组织工程血管样品用6-0Prolene缝合线以连续缝合的方式缝合到颈动脉。每只犬进行双侧颈动脉血管移植,同植入的组织工程血管为同一实施例或对比例所制备的组织工程血管。每组组织工程血管,每个时间点进行4个组织工程血管样品的重复。
3.顺应性检测:于术后10天时间点,肌注盐酸噻拉嗪注射液1.5mg/kg对犬进行麻醉,使用多普勒超声(M9,迈瑞,中国)在体检测植入组织工程血管的内径变化;同时使用微创导管检测犬股动脉内压力,然后根据如下公式(I)计算植入组织工程血管的顺应性:
P1低压数值,P2高压数值(单位为mmHg);Rp1和Rp2为分别在低压和高压时组织工程血管的内径大小。
4.与周组织整合速度检测:于术后10天时间点,顺应性检测完毕后取材,并对取材过程中植入组织工程血管与周围组织的整合情况进行分析。植入组织工程血管与周围组织易于分离即为尚未整合;植入组织工程血管与周围组织不易分离,且无发炎,肿胀迹象即为整合完毕。
5.血栓情况检测:对于术后10天时间点通过体式显微镜检测取出的组织工程血管的内腔有无血栓形成。根据血栓的严重程度计算轻微血栓发生率(未堵塞血流)和堵塞血流血栓发生率。
6.内膜增生检测:于移植3个月时间点,麻醉动物后,取出植入的组织工程血管,通过体式显微镜检测内腔有无内膜增生情况。根据内膜增生的严重程度计算轻微内膜增生发生率(未堵塞血流)和严重内膜增生发生率(堵塞血流)。
7.血管内腔的扫描电镜观察:对植入体内3个月后的组织工程血管样品进行体式观察完毕后,将每个组织工程血管样品平均切为5个样品环,选取每个组织工程血管样品的2个近缝合端样品环(近心缝合端和远心缝合端各一个)和一个最中间部位的样品环进行环向切割,并对再切割得到的每个样品环进行纵切暴露出内腔表面,经2.5%的戊二醛固定和冷冻干燥后对内腔进行扫面电镜分析,以评判是否具有内皮细胞覆盖。
8.vWF和MYH免疫荧光染色:对上述每个组织工程血管样品分割出5个样品环进行标号,经石蜡脱水、包埋后进行横向切片,并对切片进行vWF和MYH免疫荧光染色,以观察vWF+内皮细胞和MYH+具有收缩功能表型的平滑肌细胞的生长情况。vWF+内皮细胞覆盖率计算方法为:1计算每个组织工程血管样品的5个样品环中vWF+内皮细胞总长度和相应5个样品环的内腔周长总和;2以同一组织工程血管样品的5个样品环中vWF+内皮细胞总长度除以该组织工程血管样品的5个样品环的内腔周长总和即可得到该组织工程血管样品的vWF+内皮细胞覆盖率;3以同样的方法计算同组组织工程血管中每个组织工程血管样品的vWF+内皮细胞覆盖率,并将同组组织工程血管的4个组织工程血管样品的vWF+内皮细胞覆盖率进行平均即可得到本组组织工程血管的vWF+内皮细胞覆盖率。MYH+具有收缩功能表型的平滑肌细胞覆盖率的计算方法同vWF+内皮细胞。
得到的术后10天植入组织工程血管内径变化的超声检测图片如图8所示,得到的术后10天植入组织工程血管顺应性的统计分析图片如图9所示,得到的术后10天植入组织工程血管内腔的体式的照片如图10所示,得到的术后3个月组织工程血管内腔的扫描电镜图片如图11所示
由图8超声图片可以看出,天然犬颈动脉随血压变化而产生的血管内径的变化最为明显,实施例2所制备的组织工程血管植入犬颈动脉10天后随血压变化而产生的血管内径的变化和天然犬颈动脉接近,对比例2所制备的组织工程血管植入犬颈动脉10天后随血压变化而产生的血管内径的变化不太明显,内径变化幅度小于实施例2,对比例4所制备的组织工程血管植入犬颈动脉10天后随血压变化而产生的血管内径的变化很微弱。
由图9顺应性统计分析可知,天然犬颈动脉血管的顺应性为7.20±0.22%/100mmHg,实施例2所制备的组织工程血管植入犬颈动脉10天后的顺应性接近天然动脉,对比例2所制备的组织工程血管植入犬颈动脉10天后的顺应性低于实施例2所制备的血管,对比例4所制备的组织工程血管植入犬颈动脉10天后的顺应性最小。
由图10可以看出,实施例2所制备的组织工程血管植入犬颈动脉10天后血管内腔如图10所示,无血栓粘附,内腔干净且平滑,而对比例7所制备的组织工程血管植入犬颈动脉10天后血管内腔如图10所示,出现轻微血栓粘附,内腔不平滑。
由图11可以看出,实施例2所制备的组织工程血管植入犬颈动脉3个月后血管内腔如图11所示,近缝合端和血管中间区域已经全部被内皮细胞所覆盖,而且覆盖的内皮细胞呈现沿着血流方向的鹅卵石样排列,形貌良好,而对比例2所制备的组织工程血管植入犬颈动脉3个月后血管内腔如图11所示,仅近缝合端区域有内皮细胞覆盖,血管材料中间区域尚无内皮细胞覆盖。
实施例2、4、7、9与对比例2、4、7、9所制备组织工程血管的动物体内血管移植检测数据如下表8:
表8体内血管移植检测数据表
由上述检测数据可知:
1.、模板生物降解纤维层包含二价钴离子(Co2+)能够提高所制备血管的体内顺应性,减少内膜增生发生率,并增加vWF+内皮细胞再生和增加MYH+(具有收缩功能表型)的平滑肌细胞的再生。
2、设置生物降解纤维层,最终产生的组织工程血管顺应性好,与不设置生物降解纤维层相比,能够有效抑制内膜增生;
3、设置防裸露层,最终制备的血管内腔被脱细胞基质所覆盖,内腔无纤维裸露,减少了对凝血反应的刺激;
4、设置外套可使组织工程血管外壁形成螺纹凸起结构,增加外表面的摩擦力,使血管植入体内后更加稳定,不易发生移位,增加植入血管与植入部位周围组织的整合速度;
5、即使设置外套,对于组织工程血管的顺应性无负面影响(本领域技术人员通常认为增加人造血管壁厚会降低血管顺应性。而分析本发明无影响的原因在于:本发明设置外套仅仅会在组织工程血管外壁形成螺纹凸起的结构,而并非增加全部的壁厚,并且凸起是脱细胞基质材料,其材质柔软,因而不会产生负面影响);
6、模板防裸露层添加二价钴离子(Co2+)结合骨架主体的多层结构(骨架主体由网状纤维骨架层和生物降解纤维层构成),能够使最终制备的血管材料的顺应性接近天然动脉顺应性。
弹性纤维分布与弹性蛋白定量检测:
将实施例1-10及对比例1-13所制备的组织工程血管进行弹性纤维的分布和弹性蛋白的定量检测,具体方法如下:
1.弹性纤维分布检测:所得的组织工程血管经脱水石蜡包埋后,进行石蜡切片,对横切切片进行VVG染色,通过显微镜(Leica DM4 B)观察弹性纤维在血管内腔脱细胞基质层的分布情况。
4.弹性蛋白定量检测:将实施例1-10及对比例1-13所制备的血管经液氮速冻后进行冷冻干燥,将冻干后的样品称重,然后按照弹性蛋白定量检测试剂盒(Biocolor,F2000,UK)的操作说明依次对血管进行弹性蛋白分离、弹性蛋白与染料结合、提取弹性蛋白-染料复合物、释放复合物染料、检测释放的复合物染料、绘制标准曲线、计算分析。最终以干重的形式来标定弹性蛋白的含量(ug/mg).
由图12可以看出,实施例2所制备的组织工程血管内腔的脱细胞基质层有致密的弹性纤维分布,而对比例2所制备的组织工程血管内腔的脱细胞基质层的弹性纤维分布较为稀疏(白色虚线为脱细胞基质内层)。
以上检测结果见下表9:
表9弹性纤维分布与弹性蛋白定量检测表
由上述检测数据可知:
1、所有防裸露层含有二价钴离子(Co2+)所制备的血管与相对应的防裸露层不含有Co2+所制备的血管相比,其脱细胞基质内层弹性纤维的分布更为致密,表明在皮下埋植过程中,随着防裸露层降解,释放出来的Co2+能够能够刺激迁移到防裸露层降解产生的空隙处的细胞产生更多的弹性蛋白,经脱细胞处理后防裸露层产生的空隙会被富含弹性纤维的脱细胞基质所替代。
2、上述释放的Co2+也能够使最终制备的血管整体弹性蛋白的含量增加。
3、从表8可以看出实施例2所制备血管的顺应性高于对比例2,表明防裸露层添加二价钴离子(Co2+)能够增加所制备血管的顺应性,实施例2所制备血管的顺应性已经和天然犬颈动脉相当,从表9表可以看出,防裸露层添加二价钴离子(Co2+)能够增加所制备血管的弹性蛋白的含量,实施例2所制备的血管的弹性蛋白的含量达到了151.96±14.97μg/mg,虽然相比于对比例2提高了约40μg/mg,但其弹性蛋白含量仍低于天然犬颈动脉。相关研究指出弹性蛋白的增加能够提高血管材料的顺应性。实施例2所制备血管的顺应性已经接近天然犬颈动脉,但是实施例2所制备血管的弹性蛋白含量仅为天然犬颈动脉的75%,这表明防裸露层中二价钴离子(Co2+)的添加除了通过增加弹性蛋白含量外,可能还通过其他途径提高了所制备血管的顺应性。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (6)
1.一种用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板,其特征在于,包括骨架主体(1)、内芯(2)和防裸露层(3);
所述骨架主体(1)包括相间排列的网状纤维骨架层(11)与生物降解纤维层(12),且所述骨架主体(1)的内外表面均为网状纤维骨架层(11);所述生物降解纤维层(12)由90天内可完全降解的可降解材料形成;
所述防裸露层(3)设置在所述内芯(2)外表面;所述骨架主体(1)设置在所述防裸露层(3)的外表面;所述防裸露层(3)包括90天内可完全降解的可降解材料与二价钴离子;
所述防裸露层(3)的厚度为50-500μm;所述防裸露层(3)中二价钴离子的质量为可降解材料质量的0.05%~0.5%;
所述防裸露层(3)中的可降解材料选自成第一合成高分子材料或第一天然高分子材料;所述第一合成高分子材料选自聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)中的一种或多种;所述第一天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与纤维蛋白胶中的一种或多种;
所述生物降解纤维层(12)中的可降解材料选自第二合成高分子材料和/或第二天然高分子材料;所述第二合成高分子材料选自聚乙二醇、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)、聚对二氧六环己酮与聚癸二酸甘油酯中的一种或多种;所述第二天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与纤维蛋白胶中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板,其特征在于,所述网状纤维骨架层(11)由纤维制备得到;所述网状纤维骨架层(11)中纤维的直径为20~200μm,所述纤维间的交叉角度是30°~110°。
3.根据权利要求1或2所述的低刺激、高顺应性组织工程血管制作模板,其特征在于,还包括外套(4);所述外套(4)设置于骨架主体(1)的外表面;所述外套(4)设置有镂空结构(41)。
4.一种低刺激、高顺应性组织工程血管,其特征在于,以权利要求1-3任意一项所述的用于制备低刺激、高顺应性组织工程血管的模板为模板制备得到。
5.根据权利要求4所述的低刺激、高顺应性组织工程血管,其特征在于,包括脱细胞基质内层与骨架层;所述骨架层包括纤维骨架层;所述纤维骨架层包括网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质,且所述纤维骨架层中的脱细胞基质与脱细胞基质内层呈一体化设置。
6.根据权利要求4所述的低刺激、高顺应性组织工程血管,其特征在于,包括脱细胞基质内层与骨架层;所述骨架层包括相间排列的纤维骨架层与脱细胞基质层,且所述骨架层与脱细胞基质内层相接触的一面及相对的一面均为纤维骨架层;所述纤维骨架层包括网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质,且所述纤维骨架层中的脱细胞基质、脱细胞基质层及脱细胞基质内层呈一体化设置。
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