CN111714703B - 一种高顺应性组织工程血管制备模板及组织工程血管 - Google Patents

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Abstract

本发明属组织工程领域，具体涉及一种高顺应性组织工程血管制备模板，包括骨架主体(1)、内芯(2)；所述内芯(2)设置在所述骨架主体(1)的内部，所述内芯(2)外径与所述骨架主体(1)的内径相匹配；所述骨架主体(1)主体包括相间排列的支撑层(11)与降解层(12)，且所述骨架主体的内外表面均为支撑层(11)；所述降解层(12)采用可降解材料；所述高顺应性组织工程血管制备模板用于埋植在动物皮下或体外组织培养后，抽离所述内芯(2)，再经脱细胞处理后可制备出高顺应性组织工程血管。本发明的有益效果在于利用高顺应性组织工程血管制备模板制备的组织工程血管具有良好的顺应性，可以抑制内膜增生。

Description

一种高顺应性组织工程血管制备模板及组织工程血管
技术领域
本发明属组织工程领域，具体涉及一种高顺应性组织工程血管制备模板及组织工程血管。
背景技术
血管性疾病是全球致死率最高的疾病，血管狭窄或阻塞导致血流减少和营养物质缺乏，从而使组织或器官受损是该疾病发生的主要原因。通常表现为脑血管病、冠心病、外周动脉疾病。据世界卫生组织预测，到2030年全世界每年死于心血管相关疾病的人数将会增加到2330万。血管移植手术仍是治疗这类疾病的常规手段，目前这类手术采集使用患者自体血管(如大隐静脉，两侧胸廓内动脉、桡动脉等)仍然是血管移植的黄金标准。然而自体血管存在一些问题，如：自体血管已经被采集；所采集血管长度、口径与植入部位不匹配；患有复杂的系统血管病变，自身血管不再适用于移植等，这些情况下只能选择人工血管代替。
现有技术中，人造血管通常是采用人工聚合物材料进行制备，如聚苯二甲酸乙二醇酯
Figure BDA0002483184410000011
膨体聚四氟乙烯
Figure BDA0002483184410000012
制备成的血管直接植入人体，这种情况下人工聚合物材料会与人体血液或组织直接接触，会产生一定的排异反应，导致血栓、炎症和内膜增生等情况，进而造成移植失败。
运用体内工程化方法可有效的构建人工血管，其基本原理是利用机体对植入物自发的免疫包裹反应。常规的方法是将管状物植入宿主皮下，待宿主完成组织包裹后即可得到体内工程化血管。该方法的优点是所致制备的血管由细胞和组织构成，具有良好的生物相容性，但由于缺少人工聚合物材料的支撑，该血管力学性能欠佳，不能有效的维持管状结构，缝合难度大，而且植入动脉系统易出现动脉瘤和缝合端狭窄。在先前的研究中，我们利用人工聚合物材料在硅胶管表面制作纤维骨架，再将纤维骨架连同硅胶管作为模板植入动物皮下进行组织工程化，组织包裹形成后再进行脱细胞处理，得到了聚合物纤维骨架增强的组织工程血管，显著的改善了血管材料的力学性能，有效的解决了上述问题。此外，该方法制备的组织工程血管由于具有脱细胞基质，提高了血管材料的生物相容性，相比于单纯人工聚合物材料构建的人工血管减少了排异反应，在一定程度上提高了血管移植的成功率。但是，上述前期研究也反映出如下问题：首先，利用上述模板皮下埋植后所制备的组织工程血管内腔，有部分骨架纤维裸露，会刺激血栓形成；其次，利用上述模板皮下埋植后所制备的组织工程血管外表面较为光滑，植入之内后易发生滑动，降低了血管与植入部位的整合速率；第三，上述方法制备的血管的顺应性不佳；第四，体内植入后会发生一定的内膜增生。
有研究发现，人工血管植入体内后发生内膜增生的一个主要原因人工血管顺应性与天然血管顺义性的不匹配，进而造成人工血管上再生的平滑肌细胞受到力学刺激与在天然血管上所收到的力学刺激不匹配，引起平滑肌细胞过度增殖，导致内膜增生。
基于以上分析，设计具有良好顺应性的人工血管具有重大意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高顺应性组织工程血管制备模板及组织工程血管；该模板制备的组织工程血管顺应性佳，能够降低体内植入后发生内膜增生的概率。
本发明提供了一种高顺应性组织工程血管制备模板，所述内芯设置在所述骨架主体的内部，所述内芯外径与所述骨架主体的内径相匹配；所述骨架主体包括相间排列的支撑层与降解层，且所述骨架主体的内外表面均为支撑层；所述降解层采用可降解材料；所述高顺应性组织工程血管制备模板用于埋植在动物皮下或体外组织培养后，抽离所述内芯，再经脱细胞处理制备高顺应性组织工程血管。
优选的，所述降解层采用聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-4HB))、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚癸二酸甘油酯(PGS)与聚乙二醇(PEO)、明胶、胶原、透明质酸、纤维蛋白胶中一种或几种的任意比例混合物。
优选的，所述降解层采用静电纺丝、熔融纺丝、3D打印、湿法纺丝、编织中一种或几种技术制造。
优选的，所述支撑层由网状纤维构成；所述纤维直径为20-200μm，所述纤维间的交叉角度是30-110°。
优选的，所述高顺应性组织工程血管制备模板还包括防裸露层，所述防裸露层设置在所述内芯外表面。
优选的，所述防裸露层采用90天以内降解的材料。
更优选的，所述防裸露层采用合成高分子材料和/或天然高分子材料形成；所述合成高分子材料选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙醇酸(PGA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚癸二酸甘油酯(PGS)与聚乙二醇(PEO)、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-4HB))一种或多种的任意比例混合物；所述天然高分子材料选自胶原、明胶、透明质酸、纤维蛋白胶中的一种或多种的任意比例混合物。
优选的，所述高顺应性组织工程血管制备模板还包括外套；所述外套设置在最外层所述骨架主体的外部，所述外套的内径与骨架主体的外径相匹配，所述外套上设置有镂空结构。
优选的，所述外套厚度为300-3000μm；所述镂空结构的宽度为500-2000μm。
本发明还提供了一种高顺应性组织工程血管，以上述的高顺应性组织工程血管制备模板为模板制备得到。
优选的，所述高顺应性组织工程血管包括脱细胞基质层、支撑纤维；所述支撑纤维即为模板中所述的支撑层的纤维，所述细胞外基质层为包裹在所述支撑纤维外部的一体形成的细胞组织填充后，经脱细胞处理形成的脱细胞基质。
优选的，所述的高顺应性组织工程血管的脱细胞基质层外部还包括凸起；所述凸起为所述外套的镂空结构被细胞组织填充后，经脱细胞处理形成的脱细胞基质。
本发明的有益效果在于：
1、高顺应性组织工程血管制备模板骨架主体中的降解层在制备组织工程血管过程中会逐渐降解，降解后产生的空隙会被脱细胞基质所填充，能够提高所制备血管的顺应性。
2、高顺应性组织工程血管可以降低内膜增生发生率。
3、利用高顺应性组织工程血管制备模板为模板制备的高顺应性组织工程血管中的脱细胞基质为一体化形成，因而不易出现血管分层的情况。
4、设置外套，能够控制高顺应性组织工程血管的厚度，并且保证高顺应性组织工程血管壁厚的均一性；
5、外套上设置的镂空结构，能够在保证细胞均匀迁移的前提下，在高顺应性组织工程血管外部形成凸起的脱细胞基质脊梁，能够增强高顺应性组织工程血管的抗扭结性能，抗爆破性能和缝合强度，并且能够防止高顺应性组织工程血管在植入内后发生滑动，使之更易于与植入部位周围组织相结合；
6、设置防裸露层，可以防止骨架主体最内层支撑层与内芯结合过于紧密，其在用高顺应组织工程血管板制备组织工程血管时，防裸露层降解形成空隙，最终可以使脱细胞基质材料包覆于最内层的支撑层网状纤维骨架内腔表面，减少纤维裸露，从而降低对凝血反应的刺激。
附图说明
图1本发明提供的高顺应性组织工程血管制备模板的结构示意图；
图2本发明提供的高顺应性组织工程血管制备模板内芯的横截面示意图；
图3本发明提供的高顺应性组织工程血管制备模板内芯的纵截面示意图；
图4本发明提供的高顺应性组织工程血管制备模板带有防裸露层的结构示意图；
图5本发明提供的高顺应性组织工程血管制备模板带有防裸露层和外套的结构示意图；
图6本发明提供的高顺应性组织工程血管制备模板组织培养前的结构示意图；
图7本发明提供的图6所示的高顺应性组织工程血管制备模板在组织培养过程中的结构示意图；
图8本发明提供的图6所示的高顺应性组织工程血管制备模板的组织培养完毕后的结构示意图；
图9实施例3提供的高顺应性组织工程血管制备模板的横切面体式显微观察图片；
图10实施例1和对比例1所制备的组织工程血管植入大鼠腹主动脉10天后和天然大鼠腹主动脉超声检测的内径变化图；
图11实施例1和对比例1所制备的组织工程血管植入大鼠腹主动脉10天后和天然大鼠腹主动脉的顺应性统计分析数据；
图12实施例1和对比例1所制备的组织工程血管植入大鼠腹主动脉10天后的内腔的血栓形成情况；
图13实施例1和对比例1所制备的组织工程血管植入大鼠腹主动脉3个月后的管腔内膜增生情况；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开了一种高顺应性组织工程血管制备模板，包括骨架主体、内芯；所述内芯设置在所述骨架主体的内部，所述内芯外径与所述骨架主体的内径相匹配；所述骨架主体包括相间排列的支撑层与降解层，且所述骨架主体的内外表面均为支撑层；所述降解层采用可降解材料制备；所述高顺应性组织工程血管制备模板用于埋置在动物皮下或体外组织培养后，抽离所述内芯，再经脱细胞处理制备高顺应性组织工程血管。
参见图1：图1为本发明提供的高顺应性组织工程血管制备模板的结构示意图。其中1为骨架主体，2为内芯，11为支撑层，12为降解层。
本发明提供的高顺应性组织工程血管制备模板以内芯决定所制备的组织工程血管的形态；其作用是支撑骨架主体，使其在皮下或体外培养环境下能够保持管状形态；参见图2与图3，图2为内芯的横截面示意图；图3为内芯的纵截面示意图，所述内芯横截面可为实心结构，也可为空心结构，并无限制；当所述内芯为实心结构时，其可为整体的实心结构，也可为双层结构，这是由于所述内芯为高分子聚合物或硅胶或橡胶或尼龙制备时模板在组织培养时与细胞相容性好，但是由于管径较大时，压力作用易导致其变形，需要在其中加入硬质实心棒进行支撑，形成双层结构；所述内芯的纵截面可为矩形，也可为梯形，还可为与血管壁形状相匹配的任意异形，如U型、Y型、弓状带分枝型等；当内芯的纵截面为异形时，可利用如下方法获取：对需要进行血管移植部位的血管进行三维数据的获取，利用计算机软件将获取的血管尺寸三维数据构建相应的血管3D模型，打印出血管3D模型，即为所述异形内芯；所述内芯的外径优选为2～12mm，更优选为2～8mm；当所述内芯为空心管状结构时，其优选采用医用硅胶、橡胶、尼龙、聚氨酯(PU)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)(PLCL)共聚物、不锈钢、合金等材料中的一种或多种组成；当所述内芯为实心结构时，其优选采用医用硅胶、橡胶、尼龙、不锈钢、合金、聚氨酯(PU)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)等材料中的一种或多种制成；当所述内芯为双层结构时，其外层可以采用医用硅胶、橡胶、尼龙、聚氨酯(PU)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)等材料中的一种或多种组成，内层可采用医用硅胶、橡胶、尼龙、不锈钢、合金、聚氨酯(PU)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)等材料中的一种或多种组成。
所述骨架主体中包括对于一层支撑层，各个支撑层厚度可以一致，也可以不一致；所述支撑层优选由网状纤维骨架形成；所述支撑层中的网状纤维骨架具有独特的结构能够使最终制备的组织工程材料具有抗扭结，可回弹、提供必要的力学强度；其孔隙可以满足细胞向骨架内部迁移生长的需要，填充骨架孔隙；所述各支撑层厚度为30～400μm，优选为50～200μm；所述支撑层中的纤维骨架优选可通过静电纺丝、熔融纺丝、3D打印及纤维编织，湿法纺丝等方法制备得到；所述支撑层中的纤维优选由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚氨基甲酸酯(PU)、聚癸二酸甘油酯(PGS)与聚乙二醇(PEO)中一种或多种以任意比例形成；所述支撑层中的纤维直径优选为20～200μm，更优选为20～100μm；所述支撑层中的纤维交叉角度优选为30～110°。
优选地，所述支撑层的纤维直径为60±5μm，纤维间的交叉角度是50±5°。
所述骨架主体中包括降解层；所述降解层设置于支撑层之间；所述降解层厚度为20～200μm，优选为50～100μm；所述降解层由纤维形成；所述降解层中的纤维优选可通过静电纺丝、熔融纺丝、3D打印及纤维编织，湿法纺丝等方法制备得到；所述降解层中的纤维优选由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙醇酸(PGA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚癸二酸甘油酯(PGS)与聚乙二醇(PEO)、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-4HB))、胶原、明胶、透明质酸、纤维蛋白胶中一种或多种以任意比例形成。
所述骨架主体的降解层的降解速度应快于支撑层，优选地所述骨架主体的降解层的降解应在皮下埋植或体外细胞培养过程中完成，进一步优选地所述骨架主体的降解层的降解应在90天内完成。
参见图4；所述高顺应性组织工程血管制备模板还可以包括防裸露层3；所述防裸露层3设置在所述内芯2的表面；所述防裸露层采用合成高分子可降解材料、天然高分子可降解材料、水凝胶中的一种或几种复合形成；所述合成高分子材料选自聚乙二醇(PEO)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-4HB))、聚乙醇酸(PGA)、聚对二氧六环己酮(PDS)与聚癸二酸甘油酯(PGS)中的一种或多种的任意比例混合物；所述天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与纤维蛋白胶中的一种或多种的任意比例混合物；所述内芯上设置的防裸露层可通过静电纺丝，浇筑，喷涂，熔融纺丝，湿法纺丝，冷冻干燥，3D打印等技术制备；设置所述防裸露层的目的在于防止所述骨架主体最内层支撑层与所述内芯贴合过于紧密，影响细胞迁移，防止最终制备的高顺应性组织工程血管内腔有部分骨架纤维裸露在外。
参见图5；所述高顺应性组织工程血管制备模板还包括外套4；所述外套4设置在所述骨架主体1的外部，所述外套内径与所述骨架主体的外径相匹配；通过设置外套能够防止动物皮下埋植操作或体外接种细胞及体外培养过程对支撑层网状纤维结构的破坏，并且能够控制组织工程血管的厚度，保证所制备组织工程血管壁厚的均一性；所述保护层的厚度优选为300～3000μm；所述外套4外壁上设置有镂空结构41；通过镂空结构裸露出支撑层；所述镂空结构的宽度优选为500～2000；所述镂空结构沿保护层的径向切面的形状可为矩形、梯形、正方形或其他任意形状；镂空结构沿着所述保护层的径向切面的形状决定着组织工程材料外壁凸起的外型；所述镂空结构沿保护层方向优选呈螺纹状、平行的直线或平行的曲线；所述保护层相对的两端不含有镂空结构，从而使保护层保持整体的一个结构；相邻平行镂空结构之间即相邻的两个螺纹之间、两条平行的直线或曲线之间的距离优选为500～3000μm；所述镂空结构能够在保证细胞有效迁移的前提下，在所制备的高顺应组织工程血管外表面形成“凸起”，能够增强组织工程血管的抗扭结性能、抗爆破强度以及缝合强度，并且能够防止组织工程血管在植入人体内后发生滑动，使之更易于与植入部位周围组织相结合。
本发明还公开了一种骨架主体的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、利用常规支架制备技术制备出支撑层；
步骤2、后在所述支撑层外部利用常规支架制备技术制备设置降解层；
步骤3、后在所述降解层外部利用常规支架制备技术再次制备出所述支撑层；
步骤4、重复步骤2-3，直至达到需要的层数。
本发明还公开了一种高顺应性组织工程血管，利用所述高顺应性组织工程血管制备模板为模板制备而成。
所述高顺应性组织工程血管，包括脱细胞基质层、支撑纤维；所述支撑纤维即为所述的模板支撑层中的纤维，所述脱细胞基质层为包裹在所述支撑纤维外部的一体形成的脱细胞基质。
当设置外套时，所制备的高顺应性组织工程血管外部还包括凸起；所述凸起为所述外套的镂空结构被细胞组织填充后，经脱细胞处理形成的凸起的脱细胞基质。
本发明专利中，利用所述高顺应性组织工程血管制备模板为模板制备高顺应性组织工程血管制备的方法优选为组织工程培养；所述组织工程培养可为皮下植入培养，也可为体外培养；所述体外培养可为体外静态培养，也可为体外动态培养；在本发明中可根据内芯的结构选择不同的培养方法，如体外动态培养，内芯需为空心结构，优选为弹性聚氨酯(PU)、聚(丙交酯-己内酯)(PLCL)、硅胶、橡胶中的一种或几种混合制成的空心结构，这些材料有弹性，能够响应液体压力而搏动；其他培养方法则无此限制；在进行皮下植入培养时，高顺应性组织工程血管的外套可保护骨架主体的纤维结构在皮下埋植过程中遭到破坏，此外，外套上的镂空结构可以满足细胞向模板内部迁移、生长的需要，从而使细胞填充生物降解层降解后产生的空隙、支撑层纤维的孔隙、防裸露层降解产生的空隙和外套上的镂空部位；对于体外细胞培养，其上的镂空结构可起到促进氧气、营养物质和细胞代谢废物交换的作用。
图6，7，8为本发明提供的高顺应性组织工程血管制备模板在组织培养过程中的变化示意图；如图6所示，皮下埋植的高顺应性组织工程血管制备模板的结构示意图，其中1为骨架主体，2为内芯，3为防裸露层，11为骨架主体的支撑层，所述模板支撑层11由支撑层纤维111组成，12为骨架主体的降解层，所述降解层12由降解层纤维121组成；如图7所示，图6中的高顺应性组织工程血管制备模板在皮下埋植或体外组织培养过程中，细胞由外向内迁移，并分泌细胞外基质填充所述高顺应性组织工程血管制备模板支撑层纤维111和降解层纤维121的纤维孔隙以及防裸露层3逐渐降解产生的空隙，形成细胞外基质层141；如图8所示，随着培养时间的推移，降解层纤维121与防裸露层3完全降解消失，细胞进一步迁移并分泌细胞外基质，填充原本由降解层纤维121与防裸露层3所占据的空间，并最终形成一体的细胞层141，组织培养结束后，所述支撑层纤维111仍然存在，并镶嵌在所述细胞层141内部，起到支撑作用。
在本发明中，优选具体采用以下方法制备：将所述高顺应性组织工程血管制备模板植入羊或猪或犬皮下，或将种植有细胞的所述高顺应性组织工程血管制备模板置于培养液中，于生物反应器中进行培养；使细胞向所述支撑层和降解层迁移生长，直至长满所述外套的镂空部位、所述降解层降解形成的空隙、所述防裸露层降解形成的空隙及所述支撑层的纤维孔隙；所述种植的细胞优选为成纤维细胞、平滑肌细胞与干细胞分化来的平滑肌细胞中的一种或多种；当采用体外动态培养时，优选调节生物反应器中培养基的流速使压力为10～200mmHg；所述培养优选在37℃，20％O2、5％CO2条件下进行培养。
进一步地，所述脱细胞处理步骤采用SDS法、液氮冻融法中至少一种。
优选地，所述SDS法包括如下步骤：将样品浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上室温摇晃12h，之后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的SDS冲洗干净，然后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/LCaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成，DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温摇晃24h，随后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的DNase和RNase冲洗干净，最后将得到的产物置于无菌的PBS中，4℃保存。
优选地，所述液氮冻融法包括如下步骤：将样品于液氮中速冻20s，室温解冻60s，重复5遍，之后用无菌的生理盐水冲洗4-5遍，将细胞残渣冲洗干净。然后将材料置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成，DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温摇晃24h，随后用无菌生理盐水将组织包裹物上残留的DNase和RNase冲洗干净，最后将制得的产物置于无菌的PBS中，4℃保存。
当所述高顺应性组织工程模板不包括防裸露层和外套时，得到高顺应组织工程血管包括脱细胞基质层和支撑纤维；所述支撑纤维即为所述的模板支撑层中纤维；所述脱细胞基质层包括填充于支撑纤维孔隙之间的脱细胞基质和填充于模板降解层降解后产生的空隙的脱细胞基质，且所述支撑纤维孔隙之间的脱细胞基质和填充于模板降解层降解后产生的空隙的脱细胞基质为一体化形成。
当所述高顺应性组织工程模板具有防裸露层，但不具有外套时，得到高顺应组织工程血管包括脱细胞基质层和支撑纤维；所述支撑纤维即为所述的模板支撑层中纤维；所述脱细胞基质层包括填充于支撑纤维孔隙之间的脱细胞基质，填充于模板降解层降解后产生的空隙的脱细胞基质和填充于模板防裸露层降解后产生的空隙的脱细胞基质，且所述填充于支撑纤维孔隙之间的脱细胞基质，填充于模板降解层降解后产生的空隙的脱细胞基质和填充于模板防裸露层降解后产生的空隙的脱细胞基质为一体化形成。
当所述高顺应性组织工程模板不具有防裸露层，但具有外套时，得到高顺应组织工程血管包括脱细胞基质层和支撑纤维；所述支撑纤维即为所述的模板支撑层中纤维；所述脱细胞基基质层包括填充于支撑纤维孔隙之间的脱细胞基质，填充于模板降解层降解后产生的空隙的脱细胞基质和填充于模板防外套镂空部位的脱细胞基质，且所述填充于支撑纤维孔隙之间的脱细胞基质，填充于模板降解层降解后产生的空隙的脱细胞基质和填充于模板防外套镂空部位的脱细胞基质为一体化形成。
当所述高顺应性组织工程模板具有防裸露层和外套时，得到高顺应组织工程血管包括脱细胞基质层和支撑纤维；所述支撑纤维即为所述的模板支撑层中纤维；所述脱细胞基质层包括填充于支撑纤维孔隙之间的脱细胞基质，填充于模板降解层降解后产生的空隙的脱细胞基质，填充于模板防裸露层降解后产生的空隙的脱细胞基质和填充于模板防外套镂空部位的脱细胞基质，且所述支撑纤维孔隙之间的脱细胞基质，填充于模板降解层降解后产生的空隙的脱细胞基质，填充于模板防裸露层降解后产生的空隙的脱细胞基质和填充于模板防外套镂空部位的脱细胞基质为一体化形成。
按照本发明，在去除内芯和/或外套后，进行脱细胞处理步骤后得到高顺应性组织工程血管还优选负载有生物活性物质，可提高高顺应性组织工程血管的通畅性；所述生物活性材料优选通过共价或物理吸附负载在高顺应性组织工程血管上；所述生物活性物质的种类优选为肝素与水蛭素中的一种或2种混合。
本发明得到的组织工程血管中支撑纤维主要起到提供良好力学性能的作用，使组织工程血管具有抗扭结性，抗爆破性能和可缝合性；包裹在所述支撑纤维外部的一体形成的脱细胞基质整体上提供了良好的生物相容性，能够促进血管组织再生和与植入部位组织的整合，根据脱细胞基质位置的不同，其作用也有所划分，填充于支撑纤维间隙和填充于降解层降解所产生空隙的脱细胞基质起到了有效阻碍血液和生物大分子渗漏作用，填充于降解层降解所产生空隙的脱细胞基质起到提高血管顺应性的作用，位于最内层覆盖网络纤维骨架上的一层脱细胞基质能够避免纤维裸露，减少凝血成分附着，位于组织工程血管最外层的凸起的脱细胞基质，提供了粗糙的表面，有利于组织工程血管在体内的稳定和促进与周围组织整合的作用，此外也能提高组织工程血管的抗扭结性，抗爆破强度和缝合强度；并且，本发明制备的组织工程血管还可负载抗凝物质，提高血管通畅性，不容易发生急性凝血。
本发明提供的高顺应性组织工程血管不仅具有良好的顺应性，能够降低内膜增生发生率，而且具有生物相容性好，有利于细胞粘附性和生长，可用于临床上的血管替换，血管旁路建立或动静脉造瘘。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种顺应性组织工程血管模板及组织工程血管进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1
本实施例中的高顺应性组织工程血管制备模板，包括骨架主体、内芯；所述内芯设置在所述骨架主体内部，所述骨架主体包括支撑层和降解层；所述降解层设置于相邻两个支撑层之间；所述降解层为3层。
模板制备过程包括如下步骤：
1.以外径为2mm，内径为1mm的硅胶管作为内芯，内芯的外径决定了制备得到的高顺应性组织工程血管的内径。
2.以聚己内酯(PCL)为原材料，利用熔融纺丝技术，在内芯表面形成第一支撑层，第一支撑层内的纤维直径为20μm，第一支撑层内纤维间的交叉角度是30°，第一支撑层内的厚度是50μm。熔融纺丝的具体方法为：向上述硅胶管中插入适宜口径的不锈钢棒上作为接收棒，将其与旋转电机相连；PCL置于热熔器包裹的封闭的不锈钢注射器中，于210℃下加热1h后进行纺丝；不锈钢注射器配以21G不锈钢针头，注射器针头与接收棒的距离为10mm，PCL熔体的流速为0.1ml/h，接收棒的旋转速度设置为300r/min，平移速度设置为7mm/s。纺丝接收厚度为50μm。
3、以胶原为原料，利用静电纺丝技术在上述支撑层的外表面制备胶原降解层，具体方法为：将胶原溶于六氟异丙醇中制备出浓度为0.15g/ml的电纺液，采用21G针头，在电纺针头施加17kV的直流电压，设置流速为6mL/h，采用接地的不锈钢板作为导电接收板，将步骤2中的接收棒置于导电接收板与针头之间，且与导电板距离1cm，导电板与针头距离为10cm，接收棒以100r/min的转速旋转，在导电板前接受静电纺丝喷出的纤维，接收厚度为20μm。
4.以PCL为原材料，利用熔融纺丝技术，在上述降解层表面继续形成后续支撑层，后续支撑层内的纤维直径为20μm，后续支撑层内纤维间的交叉角度是30°熔融纺丝的具体方法同步骤2，但是接收厚度调整为30μm。
5.交替重复步骤3和4各2次，
6.本实施例中的内芯为硅胶管，其壁厚为0.5mm，且内径为1mm，其本身支撑性较强，因此，骨架主体制备完毕后抽出硅胶管中的不锈钢棒，仅保留硅胶管作为内芯。
本实施例中，除上述模板制备过程外，还包括高顺应性组织工程血管的制备方法，具体如下：
1.将上述制备的组织工程血管制备模板整体注入羊皮下，60天后取出。
2.取出所述血管模板后，去除内芯，随后进行脱细胞处理，具体方法如下：
脱细胞处理步骤采用SDS法：将样品浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上室温摇晃12h，之后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的SDS冲洗干净，然后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成，DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温摇晃24h，随后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的DNase和RNase冲洗干净，最后将得到的产物置于无菌的PBS中，
3.脱细胞处理后进行交联肝素，即可得到相应的高顺应性组织工程血管。用去离子水配制无菌的pH5.6浓度为0.05M的MES(2-吗啉乙磺酸)缓冲溶液，然后用MES配制交联反应液，反应液中各组分浓度为：EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)2.0mg/ml；NHS(N-羟基丁二酰亚胺1.2mg/ml；肝素钠2.0mg/ml。之后进行交联反应，首先将脱细胞产物浸泡于pH5.6浓度为0.05M的MES缓冲溶液中20分钟，然后将反应液置于37℃反应10分钟以活化羧基，10分钟之后将脱细胞的产物从MES缓冲液中取出，直接放入反应液中，37℃轻轻摇动(20-40rpm/min)4小时。之后用0.1M无菌Na2HPO4(含1％PS)连续洗材料2小时，接着用无菌的4M NaCl 60-80rpm/min 4℃连续洗24小时；之后用无菌水(含1％PS)60-80rpm/min 4℃连续洗24小时。最后将制得的产物置于无菌的PBS中，4℃保存备用。
实施例1-5的具体参数汇总见表1。
实施例2
本实施例中的高顺应性组织工程血管制备模板，包括骨架主体、内芯；所述内芯设置在所述骨架主体内部，所述骨架主体包括支撑层和降解层；所述降解层设置于相邻两个支撑层之间；所述降解层为2层。
模板制备过程包括如下步骤：
1.以外径为4mm，内径为2mm的聚氨酯管作为内芯，内芯的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2.以聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)为原材料，利用熔融纺丝技术，在内芯表面形成第一支撑层(2)，第一支撑层的纤维直径为40μm，第一支撑层纤维间的交叉角度是50°，第一支撑层的厚度是100μm。熔融纺丝的具体方法为：向上述硅胶管中插入适宜口径的不锈钢棒上作为接收棒，将其与旋转电机相连；PLCL置于热熔器包裹的封闭的不锈钢注射器中，于220℃下加热1h后进行纺丝；不锈钢注射器配以20G不锈钢针头，注射器针头与接收棒的距离为13mm，PCL熔体的流速为0.25ml/h，接收棒的旋转速度设置为200r/min，平移速度设置为18mm/s。纺丝接收厚度为100μm。
3.以PDS为原料，利用静电纺丝技术，在上述第一支撑层的外表面制备降解层，具体方法为：将适量PDS溶于六氟异丙醇中制备出浓度为0.18g/ml的电纺液，采用20G针头，设定流速为6mL/h，在针头施加17kV的直流电压，采用接地的不锈钢板作为导电接收板，将步骤3中的接收棒置于导电接收板与针头之间，且与导电接收板距离1cm，导电板与针头距离为10cm，接收棒以100r/min的转速旋转，在导电接收板前接受静电纺丝喷出的纤维，收集厚度为50μm。
4.重复步骤2，制备后续支撑层。
5.在后支撑层上依次重复步骤3、步骤2。
6.将聚氨酯管中的不锈钢棒抽出，插入适宜尺寸的硅胶棒以支撑内芯。
本实施例中，除上述模板制备过程外，还包括高顺应性组织工程血管的制备方法，具体方法同实施例1。
实施例1-5的具体参数汇总见表1。
实施例3
本实施例中的高顺应性组织工程血管制备模板，包括骨架主体、内芯；所述内芯设置在所述骨架主体内部，所述骨架主体包括支撑层和降解层；所述降解层设置于相邻两个支撑层之间；所述降解层为2层。
模板制备过程包括如下步骤：
1.以外径为5mm，内径为3mm的硅胶管作为内芯，内芯的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2、以聚己内酯(PCL)为原材料，利用熔融纺丝技术，在上述防裸露层表面形成第一支撑层，第一支撑层的纤维直径为60μm，所述纤维间的交叉角度是50°，所述第一支撑层的厚度是150μm。熔融纺丝的具体方法为：将步骤2中得到的设置有P(3HB-co-4HB)/PEO防裸露层的硅胶管套在直径3.8mm的不锈钢棒上作为接收棒，并与旋转电机相连；PCL置于热熔器包裹的封闭的不锈钢注射器中，于210℃下加热1h后进行纺丝；不锈钢注射器配以17G不锈钢针头，注射器针头与接收棒的距离为15mm，PCL熔体的流速为0.7ml/h，接收棒的旋转速度设置为180r/min，平移速度设置为21mm/s。纺丝接收厚度为150μm。
3.以PGA和胶原为原料，利用静电纺丝喷涂技术在上述支撑层的外表面形成PGA和胶原的混合降解层，具体方法是：以PGA：胶原＝1:1(m：m)溶于六氟异丙醇，配制浓度为0.28g/ml的电纺液，采用20G针头，在电纺针头施加16kV直流电压，设定流速为8mL/h，采用接地的不锈钢作为导电接收板，将步骤2中的接收棒置于导电接收板与针头之间，且与导电板距离1cm，导电板与针头距离为8cm，接收棒以100r/min的转速旋转，在导电板前接受静电纺丝喷出的纤维，接收厚度为50μm。
4.重复上述步骤2和3各一次。
5.重复上述步骤2一次。
6.将硅胶管中的不锈钢棒抽出，插入适宜尺寸的硅胶棒以支撑内芯。
本实施例中，除上述模板制备过程外，还包括高顺应性组织工程血管的制备方法，具体方法同实施例1。
实施例1-5的具体参数汇总见表1。
图10为实施例3所制备的模板的横切面体式图片，其中2为内芯硅胶管，11为由PCL构成的支撑层，12为由PGA和胶原构成的降解层。由图5可看出，实施例3所制备的模板的支撑层厚度为150μm，降解层厚度为50μm，且支撑层与降解层紧密贴合，无分层情况。
实施例4
本实施例中的高顺应性组织工程血管制作模板，包括骨架主体、内芯；所述内芯设置在所述骨架主体内部，所述骨架主体包括支撑层和降解层；所述降解层设置于相邻两个支撑层之间；所述降解层为1层。
模板制备过程包括如下步骤：
1.以外径为6mm，内径为4mm的尼龙管作为内芯，内芯的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2、以聚己内酯(PCL)为原材料，利用熔融纺丝技术，在内芯(2)表面形成第一支撑层，第一支撑层的纤维直径为100μm，第一支撑层纤维间的交叉角度是60°，第一支撑层的厚度是200μm。熔融纺丝的具体方法为：向上述硅胶管中插入适宜口径的不锈钢棒上作为接收棒，将其与旋转电机相连；PCL置于热熔器包裹的封闭的不锈钢注射器中，于210℃下加热1h后进行纺丝；不锈钢注射器配以15G不锈钢针头，注射器针头与接收棒的距离为17mm，PCL熔体的流速为2.4ml/h，接收棒的旋转速度设置为150r/min，平移速度设置为27mm/s。纺丝接收厚度是200μm。
3、以PDS和明胶为原料，利用静电纺丝喷涂技术在上述支撑层的外表面制备PDS和明胶降解层，其厚度是200μm。具体方法是：以PDS：明胶原＝1:3(m：m)溶于六氟异丙醇，配制浓度为0.3g/ml的电纺液，采用19G针头，16kV电压，设定流速为9mL/h，采用不锈钢作为导电接收板，将步骤2中的接收棒置于导电接收板与针头之间，且与导电板距离1cm，导电板与针头距离为10cm，接收棒以100r/min的转速旋转，在导电板前接受静电纺丝喷出的纤维，接收厚度为200μm。
4.以PCL为原材料，利用熔融纺丝技术，在上述降解层外表面继续形成后续支撑层，后续支撑层纤维直径为100μm，后续支撑层纤维间的交叉角度是60°，熔融纺丝具体方法同步骤2，但是纺丝接收厚度调整为300μm。
5.将尼龙中的不锈钢棒抽出，插入适宜尺寸的硅胶棒以支撑内芯。
本实施例中，除上述模板制备过程外，还包括高顺应性组织工程血管的制备方法，具体方法同实施例1。
实施例1-5的具体参数汇总见表1。
实施例5
本实施例中的高顺应性组织工程血管制备模板，包括骨架主体、内芯；所述内芯设置在所述骨架主体内部，所述骨架主体包括支撑层和降解层；所述降解层设置于相邻两个支撑层之间；所述降解层为4层。
模板制备过程包括如下步骤：
1.以外径为8mm的不锈钢棒作为内芯，内芯的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2、以聚乳酸(PLA)为原材料，利用熔融纺丝技术，在内芯(2)表面形成第一支撑层，第一支撑层的纤维直径为100μm，第一支撑层纤维间的交叉角度是110°，第一支撑层的厚度是400μm。熔融纺丝的具体方法为：向上述不锈钢棒上作为接收棒，将其与旋转电机相连；PLA置于热熔器包裹的封闭的不锈钢注射器中，于240℃下加热1h后进行纺丝；不锈钢注射器配以15G不锈钢针头，注射器针头与接收棒的距离为19mm，PCL熔体的流速为10ml/h，接收棒的旋转速度设置为120r/min，平移速度设置为72mm/s。纺丝接收厚度为400μm。
3、以PEO和PGA为原料，利用静电纺丝技术在上述支撑层的外表面制备PEO和PGA混合降解层，降解层厚度为100μm。具体方法是：以PEO：PGA＝1:1(m：m)溶于六氟异丙醇，配制浓度为0.25g/ml的电纺液，采用19G针头，16kV电压，设定流速为8mL/h，采用上述不锈钢棒作为接收器，针头距离接收器距离为8cm，接收棒以100r/min的转速旋转，接收厚度为100μm。
4.利用熔融纺丝技术，以PLA为原材料，在上述降解层外表面继续形成后续支撑层，后续支撑层纤维直径为100μm，后续支撑层纤维间的交叉角度是110°，熔融纺丝的具体方法同步骤2，但纺丝接收厚度调整为300μm。
5.间隔重复步骤3和4各三次。
本实施例中，除上述模板制备过程外，还包括高顺应性组织工程血管的制备方法，具体方法同实施例1。
实施例1-5中模板参数汇总如下表1：
表1 实施例1-5模板参数表
Figure BDA0002483184410000161
注：表1中所述第一支撑层为骨架主体所有支撑层中最内侧的支撑层；后续支撑层为骨架主体中除第一支撑层外的其他支撑层。
实施例6-10
实施例6-10与实施例1-5顺序对应，区别在于增加了外套，所述外套均由PCL通过3D打印技术制备，外套内径与纤维骨架最外层的外径相当，将上述外层套置于所制备的骨架主体，并确保骨架主体处于镂空部位，将橡胶棒做成塞子，堵在外套的两端，防止皮下埋植或体外细胞培养过程中，骨架主体在外套内发生移动。
实施例6-10的模板参数见表2：
表2 实施例6-10参数表
Figure BDA0002483184410000162
Figure BDA0002483184410000171
注：表2中所述第一支撑层为骨架主体所有支撑层中最内侧的支撑层；后续支撑层为骨架主体中除第一支撑层外的其他支撑层。
实施例11-15
实施例11-15与实施例1-5顺序对应，区别仅在于增加了防裸露层，防裸露层制备在内芯表面，随后进行后续骨架主体的制备，所述防裸露层的制备方法如下：
实施例11：以PDS为原料，采用旋涂法在硅胶管表面制备PDS防裸露层。向上述硅胶管中插入适宜口径的不锈钢棒上作为接收器，将其与旋转电机相连。以六氟异丙醇作为溶剂、PDS作为溶质，配制浓度为0.3g/ml的涂覆溶液，采用14G针头，按照15ml/h的注射速度用注射器将涂覆液挤出涂覆在以转速为150r/min旋转、水平移动速度为2mm/s的硅胶管外壁上，针头到硅胶管外壁的距离为5mm，针头竖直向下正对硅胶管轴心。完成涂层后，将涂覆有PDS的硅胶管置于通风橱中待溶剂挥发完成后置于真空泵中抽除残留溶剂，即可在硅胶管表面得到50μm厚的PDS防裸露层。
实施例12：以PLGA和PEO为原材料，采用高压静电纺丝技术在聚氨酯管表面制备防裸露层，具体方法为：向上述聚氨酯管中插入适宜口径的不锈钢棒上作为接收棒，以三氯甲烷：甲醇＝5:1(体积比)作为溶剂，PLGA：PEO＝1:1(质量比)作为溶质，配制浓度为0.28g/ml的电纺液，采用20G针头，设置流速为8mL/h，在电纺针头施加16kV的直流电压，采用接地的不锈钢板作为导电接收板，将接收棒置于导电接收板与针头之间，且与导电板距离1cm，导电接收板与针头距离为8cm，接收棒以100r/min的转速旋转，在导电接收板前接收静电纺丝喷出的纤维，收集厚度为200μm的PLGA/PEO防裸露层。
实施例13：以P(3HB-co-4HB)和PEO为原材料，采用高压静电纺丝技术，在硅胶管表面制备防裸露层，具体方法为：向上述硅胶管中插入适宜口径的不锈钢棒上作为接收器，以三氯甲烷：甲醇＝5:1作为溶剂，P(3HB-co-4HB)：PEO＝1:0.5(质量比)作为溶质，配制浓度为0.3g/ml的电纺液，采用19G针头，设置流速为8mL/h，在针头施加14kV的直流电压，采用接地的不锈钢板作为导电接收板，将硅胶管置于导电接收板与针头之间，且与导电接收板距离1cm，导电板与针头距离为11cm，接收棒以100r/min的转速旋转，在导电接收板前接收静电纺丝喷出的纤维，收集厚度为250μm的P(3HB-co-4HB)/PEO防裸露层。
实施例14：以PDS和明胶为原材料，采用喷涂技术，在尼龙管表面制备防裸露层，具体方法为：向上述尼龙管中插入适宜口径的不锈钢棒上作为接收器，将上述接收器浸入到以10mM Tris缓冲液(pH8.5)配制的2mg/mL的多巴胺溶液中24h，在尼龙管表面形成粘附层。将PDS：明胶＝1:1(质量比)溶解到六氟异丙醇中，制成0.3g/ml的喷涂溶液。采用气泵喷枪以0.2mL/s的流速将溶液垂直喷涂到旋转的尼龙管上，在尼龙管表面收集厚度为100μm的PDS和明胶复合的防裸露层。
实施例15：以透明质酸为原材料，采用冷冻干燥技术，在不锈钢表面制备防裸露层，具体方法为：用蒸馏水作为溶剂，配制25mg/ml的透明质酸溶液，在不锈钢圆棒外固定模具，使不锈钢表面与模具间的距离为500μm，将透明质酸溶液灌注到不锈钢圆棒与模具之间后将其置于-80℃冷冻24h，随后真空冷冻干燥72h。去除模具后，即可在不锈钢圆棒表面获得厚度为500μm的透明质酸防裸露层。
实施例11-15的模板参数见表3：
表3 实施例11-15参数表
Figure BDA0002483184410000181
Figure BDA0002483184410000191
注：表3中所述第一支撑层为骨架主体所有支撑层中最内侧的支撑层；后续支撑层为骨架主体中除第一支撑层外的其他支撑层。
实施例16-20
实施例16-20与实施例1-5顺序对应，区别仅在于增加了防裸露层和外套。防裸露层的方法和实施例11-15相同，外套的制备与实施例6-10相同，具体的模板参数见表4。
实施例16-20的模板参数
Figure BDA0002483184410000192
Figure BDA0002483184410000201
注：表3中所述第一支撑层为骨架主体所有支撑层中最内侧的支撑层；后续支撑层为骨架主体中除第一支撑层外的其他支撑层。
对比例1-5
为了进一步说明实施例1-5的有益效果，设置对比例1-5，对比例1-5与实施例1-5区别在于采用与支撑层材质与结构相同的材料替代骨架主体多层结构，即骨架主体仅由支撑层构成。具体区别如下表5：
表5 对比例1-5参数表
Figure BDA0002483184410000202
Figure BDA0002483184410000211
对比例6-10
为了进一步说明实施例6-10的有益效果，设置对比例6-10，对比例6-10与实施例6-10区别在于采用与支撑层材质相同的材料替代骨架主体多层结构。具体区别如下表6：
表6 对比例6-10参数表
Figure BDA0002483184410000212
对比例11-15
为了进一步说明实施例11-15的有益效果，设置对比例11-15，对比例11-15与实施例11-15区别在于采用与支撑层材质相同的材料替代骨架主体多层结构。具体区别如下表7：
表7 对比例6-10参数表
Figure BDA0002483184410000213
Figure BDA0002483184410000221
对比例16-20
为了进一步说明实施例16-20的有益效果，设置对比例16-20，对比例16-20与实施例16-20区别在于采用与支撑层材质和结构相同的材料替代骨架主体多层结构，即骨架主体仅由支撑层构成。具体区别如下表8：
表8 对比例16-20参数表
Figure BDA0002483184410000222
下通过相关结果的展示与分析来充分说明本发明的有益效果。
在进行相关检测前，需要对利用模板所制备的血管进行成品检测，具体方法为：用拇指和食指从一端到另一端轻捏，并轻微揉搓血管，如果血管有部位出现易塌陷或易扭曲的情况(此类情况常由纺丝过程造成的骨架纤维孔径不均一导致)，或是肉眼可见的纤维出现不均一结构(此类情况多为皮下埋植过程造成的骨架破坏所引起，脱细胞后血管材料变白且略有透明，可以透过脱细胞基质看到骨架纤维的大致结构)即为不合格血管。以下测试均使用合格血管进行检测。
脱细胞基质填充检测：
将实施例1-20及对比例1-20所制备的高顺应性血管的脱细胞基质填充情况进行检测，具体方法如下：
1.内腔脱细胞基质覆盖检测：所制备的组织工程血管经冷冻干燥后，利用扫面电子显微镜观察血管内腔脱细胞基质覆盖和纤维裸露情况。
2.骨架主体脱细胞基质填充情况检测：所得的组织工程血管经石蜡脱水包埋后，进行石蜡切片，对切片进行H&E染色，通过显微镜观察骨架主体脱细胞基质填充情况。
3.外套镂空部位脱细胞基质填充情况检测：肉眼观察。
以上检测结果见下表9：
表9 脱细胞基质填充模板的情况分析
Figure BDA0002483184410000231
Figure BDA0002483184410000241
由上述检测数据可知：
1、设置降解层，在皮下埋植过程中会降解。随着降解的发生，产生的空腔会被细胞组织所替代，经脱细胞处理后降解层产生的空隙会被脱细胞基质所替代。
2、设置防裸露层，在皮下埋植过程中会降解。随着降解的发生，产生的空腔会被细胞组织所替代，经脱细胞处理后所得血管的内腔会被脱细胞基质所覆盖，保证最终组织工程血管内腔不会有纤维裸露；
3、设置外套，最终可以在组织工程血管外壁产生与镂空结构形状相对应的凸起的脱细胞基质。
4、设置防裸露层和降解层均没有对细胞迁移和细胞外基质的填充产生影响，所有防裸露层和降解层降解后产生的空隙以及支撑层中的纤维孔隙均被脱细胞基质所填充。
动物体内血管移植检测：
根据组织工程血管实际使用需求以及以往动物学实验的经验，实施例1、6、11、16和对比例1、6、11、16制备的血管口径为2mm，应该进行大鼠腹主动脉移植；实施例2、7、12、17和对比例2、7、12、17制备的血管口径为4mm，应该进行比格犬颈动脉移植；实施例3、8、13、18和对比例3、8、13、18制备的血管口径为5mm，应该进行羊(约30kg)颈动脉移植；实施例4、9、14、19和对比例4、9、14、19制备的血管口径为6mm；应该进行羊(约50kg)颈动脉移植；实施例5、10、15、20和对比例5、10、15、20制备的血管口径为8mm，应该进行比格犬腹主动脉移植。但是，本着动物实验的“3R”原则，在能够说明有益效果的前体下，我们仅选择大鼠腹主动脉移植和犬颈动脉移植对相关口径血管进行检测，原因及用途如下：
1.大鼠腹主动脉移植是常用小动物血管移植模型，操作简单，饲养方便，多用于初步检测血管材料的性能。
2.犬颈动脉移植是大动物血管移植实验，相比于小动物(大鼠腹主动脉移植)更具有代表性，所使用的血管尺寸也更贴近临床使用情况，所得结果更具有意义。
3.犬颈动脉移植所使用的是4mm口径的血管，是典型的小口径人工该血管，对于小口径人工血管来说，口径越小越容易出现血栓和内膜增生等问题，而导致移植失败，因此4mm口径的血管比5mm，6mm和8mm口径血管更能反应血管性能。
血管进行大鼠腹主动脉和犬颈动脉移植后的检测主要包括：体内顺应性、血栓发生率、内膜增生发生率和与周围组织整合速度，具体如下：
1.动物选择：遵循动物实验从小动物到大动物的原则，首先选用大鼠腹主动脉移植，对实施例1和对比例1所制备的血管进行初步检测，植入组织工程血管长度为1cm，实施例1与对比例1制备组织工程血管的模板不具有防裸露层和外套，最能反映本发明所述组织工程血管特有结构的本质性能；随后选用犬颈动脉移植，对实施2、7、12、17和对比例2、7、12、17所制备的组织工程血管进行检测，植入组织工程血管长度为4cm。每只比格犬双侧颈动脉均进行血管移植，植入的组织工程血管为同一实施例或对比例所制备的组织工程血管；每只大鼠大鼠腹主动脉仅能植入一个组织工程血管。每个物种，每组组织工程血管，每个时间点进行4个血管样品的重复。
2.移植10天后，麻醉动物，采用小动物多普勒超声(Vevo 2100System,Visualsonics,Canada)在体检测植入大鼠腹主动脉血管的内径变化，同时通过大鼠尾压检测仪检测大鼠血压；采用彩色多普勒超声(M9，迈瑞，中国)在体检测植入比格犬颈动脉血管的内径变化，同时使用微创导管检测犬股动脉内压力。然后根据如下公式(I)计算植入组织工程血管的顺应性：
Figure BDA0002483184410000261
其中：
P1为低压数值，P2为高压数值(单位为mmHg)；Rp1和Rp2为分别在低压和高压时血管的内径大小。
3.与周组织整合速度检测：于术后10天时间点，顺应性检测完毕后取材，并对取材过程中植入组织工程血管与周围组织的整合情况进行分析。植入组织工程血管与周围组织易于分离即为尚未整合；植入组织工程血管与周围组织不易分离，且无发炎，肿胀迹象即为整合完毕。
3.血栓情况检测：对于术后10天时间点取出的组织工程血管，通过体式显微镜检测内腔有无血栓形成。根据血栓的严重程度计算轻微血栓发生率(未堵塞血流)和堵塞血流血栓发生率。
5.内膜增生检测：于移植3个月时间点麻醉动物后，取出植入的组织工程血管，通过体式显微镜检测内腔有内膜增生情况。根据内膜增生的严重程度计算轻微内膜增生发生率(未堵塞血流)和严重内膜增生发生率(堵塞血流)。
以实施例1及对比例1制备的组织工程血管大鼠腹主动脉移植检测为例进行如下测试结果的说明：
由附图9可知：大鼠腹主动脉移植10天后，通过超声图片检测显示实施例1所制备的血管比对比例1所制备的血管在体内随血压变化所产生的内径上的变化要明显(白色尖头代表血管所在位置)，
由附图10可知：大鼠腹主动脉移植10天后，顺应性的定量分析显示，施例1所制备的血管和大鼠腹主动脉天然血管的顺应性均高于对比例1所制备的血管，
由附图11可知：实施例1所制备的血管大鼠腹主动脉移植10天后50％的血管内腔如图10所示，无任何血栓粘附，内腔干净，而对比例1所制备的血管大鼠腹主动脉移植10天后75％的血管内腔出现如图10所示轻微血栓粘附；
由附图12可知：实施例1所制备的血管顺应性佳，大鼠腹主动脉移植3个月后50％的血管如图10所示，无内膜增生情况，管腔通畅，而对比例1所制备的血管顺应性欠佳，大鼠腹主动脉移植3个月后部分血管出现了如图10所示的严重的内膜增生，管腔堵塞。
实施例1-15与对比例1-15的动物体内血管移植检测数据如下表10：
表10 体内血管移植检测数据表
Figure BDA0002483184410000271
由上述检测数据可知：
1、模板设置有降解层时所制备的高顺应性组织工程血管的顺应性优于模板不设置降解层时所制备的组织工程血管，但是高顺应性组织工程血管的顺应性与相应的天然动脉血管相比，还有待提升。
2、模板设置有降解层时所制备的高顺应性组织工程血管体内植入3个月后内膜增生发生率低于模板不设置降解层时所制备的组织工程血管，表明顺应性的提高起到了抑制内膜增生的作用。
3、即使设置外套，对于组织工程血管的顺应性无明显负面影响(本领域技术人员通常认为增加组织工程血管壁厚会降低血管顺应性。而分析本发明几乎没有影响的原因在于：本发明设置外套仅仅会在组织工程血管外壁形成螺纹凸起的结构，而并非增加全部的壁厚，并且凸起是脱细胞基质材料，其材质柔软，因而不会产生负面影响)；
4、设置防裸露层可以有效抑制血栓，并在一定程度上起到抑制内膜增生的作用(分析原因在于无纤维裸露，可降低血管内腔表面的粗糙度，减少凝血物质和炎症细胞的粘附，进而降低血栓和内膜增生发生率)；
5、设置外套可使组织工程血管外壁形成螺纹凸起结构，增加外表面的摩擦力，使血管植入体内后更加稳定，不易发生移位，增加植入组织工程血管与植入部位周围组织的整合。
物理性能检测：
对实施例1-10所制备的组织工程血管进行如下方面的物理性能检测，具体检测项目及方法如下：
1.扭结半径检测：将样品放置在半径规上，逐渐减小半径规的半径直到血管样品出现微小的管道变窄或扭结，记录此时半径规的半径即为样品的扭结半径。
2.爆破强度检测：小心地将适宜大小球囊放进所得血管样品中，球囊通过导管与三通接口连接，三通接口的另外两个接口分别连接压力记录装置和加压装置，通过加压装置向球囊加压使血管膨胀，直至血管破裂，记录血管样品破裂的压力值，并通过压力换算后以mmHg为测量结果单位。
3.缝合强度检测：沿轴向截取一段血管样品，以6-0缝线在血管一端的边缘以下2mm处穿过血管壁，缝合成一个半环，缝合线末端固定于拉力机的夹具上，血管样品的另一端固定于拉力机的另一夹具上，以50mm/min速度拉伸缝合线。记录将缝线从血管壁中拉出的拉力大小。缝合强度以N为单位计算。
上述检测具体结果请见表11。
表11 物理性能结果检测表
Figure BDA0002483184410000281
Figure BDA0002483184410000291
由上述检测数据可知：
1、设置外套使高顺应性组织工程血管外壁形成螺纹凸起结构脱细胞基质，以及防裸露层降解后填充的脱细胞基质层均能起到提高组织工程血管抗爆破能力的作用。
2、设置保护层使组织工程血管外壁形成螺纹凸起结构脱细胞基质，减少了组织工程血管的扭结半径，也就是提高了组织工程血管的抗扭结性能。
3、设置外套使高顺应性组织工程血管外壁形成螺纹凸起结构脱细胞基质，能够提高组织工程血管的缝合强度。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种高顺应性组织工程血管制备模板，其特征在于，包括骨架主体(1)、内芯(2)；
所述内芯(2)设置在所述骨架主体(1)的内部，所述内芯(2)外径与所述骨架主体(1)的内径相匹配；
所述骨架主体(1)包括相间排列的支撑层(11)与降解层(12)，且所述骨架主体的内外表面均为支撑层(11)；所述降解层(12)采用可降解材料；
所述高顺应性组织工程血管制备模板用于埋植在动物皮下或体外组织培养后，抽离所述内芯(2)，再经脱细胞处理制备高顺应性组织工程血管；
所述支撑层(11)由网状纤维构成；所述纤维直径为20-200μm，所述纤维间的交叉角度是30-110°；
所述降解层(12)采用聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)、聚对二氧六环己酮，聚癸二酸甘油酯、聚乙二醇、明胶、胶原、透明质酸、纤维蛋白胶中至少一种或几种的任意比例混合物。
2.根据权利要求1所述的高顺应性组织工程血管制备模板，其特征在于，所述降解层(12)采用静电纺丝、熔融纺丝、3D打印、湿法纺丝、编织中一种或几种技术制造。
3.根据权利要求1所述的高顺应性组织工程血管制备模板，其特征在于，还包括防裸露层(3)，所述防裸露层(3)设置在内芯(2)外表面。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的高顺应性组织工程血管制备模板，其特征在于，还包括外套(4)；所述外套(4)设置在所述骨架主体(1)的外部，所述外套(4)的内径与所述骨架主体(1)的外径相匹配，所述外套上设置有镂空结构(41)。
5.根据权利要求4所述的高顺应性组织工程血管制备模板，其特征在于，所述外套(4)厚度为300-3000μm；所述镂空结构(41)的宽度为500-2000μm。
6.一种高顺应性组织工程血管，其特征在于，利用权利要求1-5任意一项以所述高顺应性组织工程血管制备模板为模板制备而成。
7.一种高顺应性组织工程血管，其特征在于，包括脱细胞基质层、支撑纤维；所述支撑纤维即为权利要求1-5任意一项模板中所述的支撑层的纤维；所述脱细胞基质层为包裹在所述支撑纤维外部的一体形成的细胞和组织填充后，经脱细胞处理形成的脱细胞基质。
8.根据权利要求7所述的高顺应性组织工程血管，其特征在于，脱细胞基质层外部还包括凸起；所述凸起为权利要求6-7任意一项所述外套(4)的镂空结构(41)被细胞组织填充后，经脱细胞处理形成的脱细胞基质。
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