CN106563163A - 静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜及制备方法 - Google Patents

静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜及制备方法。目的是提供的生物工程角膜具有促进角膜移植后角膜缘干细胞、角膜上皮细胞迁移，所提供的制备方法应简单易行。技术方案是：一种采用静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜，该生物工程猪角膜的表面依次反复沉积有聚阳离子层、透明质酸层及细胞趋化因子层，最外层为细胞趋化因子层。其制备方法，依次包括以下步骤：1)清洗，干燥；2)使猪角膜表面依次形成聚阳离子层、透明质酸层和趋化因子层，3)重复步骤2)，使得猪角膜表面由内而外不断地形成聚阳离子层、透明质酸层和趋化因子层，并保证最外层为趋化因子层；4)将经过修饰的生物工程猪角膜，干燥、密封包装即可。

Description

静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜及制备方法
技术领域
本发明涉及医疗领域，尤其是静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜及其制备方法。
背景技术
角膜是眼球前壁主要起屈光和屏障作用的一层透明组织。多种因素如退行性改变，营养不良，感染，炎症，损伤，眼内其他疾病累及等都可导致角膜疾病甚至失明。目前角膜病是仅次于白内障，排名第二的致盲眼病。异体角膜移植即人角膜移植目前仍然是因角膜疾病而失明患者的首选治疗方式。目前的手术方式有角膜穿透性移植，板层角膜移植，内皮细胞角膜移植等等。然而供体组织缺乏，移植物排异、失败，视力恢复可变性大等问题一定程度上限制了角膜移植手术的应用。
人工角膜适用于缺乏合适的供体而亟需替换病变角膜或者无法进行角膜移植的严重角膜疾病患者。虽然光学性能稳定，但生物相容性欠佳，术后并发症(植入物漏出/排斥，青光眼，视网膜脱离等)发生率高，细胞无法粘附，容易感染等缺点限制了人工角膜的应用。
生物工程角膜应运而生，具有生物相容性好，稳定性好，利于细胞粘附、长入、增殖等优点。生物工程角膜中最大程度保留角膜天然结构和成分的是角膜脱细胞基质，目前在国内已有上市产品——艾欣瞳，在前期临床研究中获得了不错的效果，目前已经投入临床应用，极大的帮助了缺乏角膜供体的角膜盲患者。然而，单纯角膜脱细胞基质的使用有一定限制，如严重感染，外伤、化学烧伤等损伤严重情况下自身角膜缘干细胞缺乏，严重排斥反应等情况下，受体角膜失代偿，角膜溶解等，植入的生物工程角膜无法成功存活并重建眼表。角膜脱细胞基质在移植前的修饰、表面改性可以复合生物活性趋化因子、生长因子等在局部创造一个合适的微环境，诱导、激发供体自身细胞参与修复过程，提高植片的存活和移植后效果。
目前生物工程角膜的制备有多种方法，包括Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚)、EDTA(乙二胺四乙酸)、SDS(十二烷基磺酸钠)、胰酶、DNA/RNA酶，虽能获得免疫原性和细胞残留低的脱细胞角膜支架，但反应剧烈，对角膜组织破坏性大，面临蛋白变性、GAG(糖氨聚糖)含量降低等问题。中国发明专利200710027698.6“一种脱细胞角膜基质及其制备方法”利用表面活性剂SDS(十二烷基磺酸钠)、Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚)通过化学渗透法获得去细胞的角膜基质，基质内活性蛋白部分丢失。中国发明专利201410264542X“一种脱细胞角膜基质及其制备方法”通过脱细胞试剂和水交替使用改变组织渗透压的方法去除免疫原成分和可溶性蛋白，反复脱水对组织形态影响较大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种静电层层自组装修饰的生物工程猪角膜及其制备方法，所提供的生物工程角膜具有促进角膜移植后角膜缘干细胞、角膜上皮细胞迁移，提高植片的存活率，加速植片与宿主角膜的融合，加速眼表重建，促进视功能恢复的特点，所提供的制备方法应简单易行无污染。
本发明提供的技术方案是：一种采用静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜，其特征在于：该生物工程猪角膜的表面由内而外依次反复沉积有聚阳离子层、透明质酸层及细胞趋化因子层，最外层为细胞趋化因子层。
所述聚阳离子层厚度为0.5-5nm，透明质酸层厚度为0.5-10nm，细胞趋化因子层厚度为1-10nm。
所述聚阳离子为壳聚糖或聚赖氨酸。
采用静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜的制备方法，依次包括以下步骤：
1)用碳酸氢盐混合溶液对生物工程猪角膜清洗，然后干燥；
2)将干燥后生物工程猪角膜表面浸入带正电荷的浓度为1-10mg/ml的聚阳离子水溶液中,吸附5-30分钟，经去离子水漂洗；然后将生物工程猪角膜浸入带负电荷的浓度为1-10mg/ml的透明质酸钠溶液中，吸附5-30分钟，经去离子水漂洗；再将生物工程猪角膜浸入带正电荷的浓度为10-200μg/ml的趋化因子溶液中，吸附5-30分钟，然后再用去离子水漂洗；使得生物工程猪角膜表面由内而外依次形成聚阳离子层、透明质酸层和趋化因子层，
3)重复步骤2)10-20次，使得生物工程猪角膜表面由内而外不断地形成聚阳离子层、透明质酸层和趋化因子层，并保证最外层为趋化因子层；
4)将经过修饰的生物工程猪角膜，在10-40摄氏度温度下干燥、密封包装即可。
所述的碳酸氢盐混合溶液的酸碱度为8.3，含有105mmol/L的NaCl、5.5mmol/L的KCl、1.8mmol/L的CaCl2、0.8mmol/L的MgCl2、5mmol/L的葡萄糖和35mmol/L的NaHC03；所述的聚阳离子溶液酸碱度为3.0-6.0，所述的透明质酸钠溶液的酸碱度为3.0-6.0，所述的细胞趋化因子溶液的酸碱度为5.0-8.0。
所述的干燥是超净台内通风干燥。
所述生物工程猪角膜采用新鲜约克夏猪角膜经过脱细胞处理制成。
本发明的有益效果是：利用静电层层自组装技术在生物工程猪角膜表面构建带有趋化因子SDF-1α的透明生物膜，能够促进宿主角膜缘干细胞和角膜上皮细胞的迁移，从而在生物工程角膜形成上皮细胞层，提高植片的存活率，加速植片与宿主角膜的融合，加速眼表重建，促进视功能恢复。
采用静电层层自组装方法修饰生物工程猪角膜，简单易行无污染，具有足够的生物稳定性，制备条件温和，并且组装过程采用的均为天然聚电解质或者生物分子，无细胞毒性无免疫原性；因而制成的生物工程角膜对眼内其他组织无毒副作用，拥有良好的生物相容性。该方法制造出的生物工程角膜透光性理想，生物相容性良好，可达到提高生物工程角膜移植的成功率及术后视功能恢复的目的，并使众多角膜病患者增强对抗病理环境的能力，提高角膜移植成功的概率，取得理想的视功能。
附图说明
图1是静电层层自组装过程示意图。
图2A是生物工程猪角膜大体图，图2B是经静电层层自组装技术修饰后的生物工程猪角膜大体图；图中标尺长度为5mm。
图3A是经静电层层自组装技术修饰前的生物工程猪角膜表面扫描电镜图，图3B是经静电层层自组装技术修饰后的生物工程猪角膜表面扫描电镜图。
图4是FITC标记的趋化因子在生物工程猪角膜表面分布情况扫描电镜图。
图5是修饰后的生物工程猪角膜释放趋化因子的曲线和拟合公式。
图6是趋化因子对角膜上皮细胞迁移能力的影响(transwell体系)。
具体实施方式
本发明中采用作用温和的磷脂酶A2酶解法获取脱细胞猪角膜，DNA残留低，胶原含量无显著下降，生物相容性好。目前，脱细胞角膜支架的制备技术不断完善，而对生物角膜表面的修饰改性方法尚需进一步探索研究，这对生物工程角膜在体内研究中恢复眼表功能非常重要。
静电层层自组装技术是近年来倍受关注的表面改性前沿技术，它可在室温下利用带相反电荷的聚电解质的交替吸附来构建稳定的超薄多层膜，在纳米级别上实现对生物材料表面特异性生物活性作用的精确控制；它不影响组装成分的天然构象，甚至能在干态下保持其活性；其制备方法温和，交替浸涂工艺简单，容易通过调节组装条件控制膜的结构及性质；适用于多种基体材料，可有效实现工业化生产；已被用于多种医用材料的表面改性。因此静电层层自组装技术是进行生物工程角膜表面改性的理想技术。
本发明提供的生物工程猪角膜采用新鲜约克夏猪角膜经过脱细胞处理(可外购获得)，性能优良，具有与人角膜相似的透气性、透光度、生物学稳定性和力学性能。生物工程角膜为脱细胞的猪角膜，主要成分为角膜胶原，可分为上皮面和基质面，上皮面平整，基质面略有粗糙。目前国内已有上市产品——艾欣瞳，在前期临床研究中获得了不错的效果，目前已经投入临床应用，极大的帮助了缺乏角膜供体的角膜盲患者。
本发明为了克服严重角膜病变，眼表病理环境阻碍生物工程角膜移植后的存活，在生物工程角膜表面构建了载有细胞趋化因子(SDF-1α)的生物膜；SDF-1α具有广泛的生物学效应，对多种干细胞有趋化归巢作用，部分损伤组织能释放趋化因子，促进多种干细胞参与损伤修复，多个研究已表明其可用于医学上多种创伤的治疗；角膜缘部分细胞和基底部角膜上皮细胞表达SDF-1α的受体CXCR4，具有募集血液中注射的骨髓间充质干细胞到角膜缘的作用；所以在生物工程角膜表面加载SDF-1α来可起到构建局部微环境，促进角膜缘干细胞和角膜上皮细胞的迁移，加速上皮化和修复过程。
以下结合附图所示的实施例进一步说明。
实施例1
利用静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜，具体制备过程如下：
1)用碳酸氢盐混合溶液对生物工程猪角膜清洗，然后在超净台内30摄氏度温度下干燥8min；
2)将干燥后生物工程猪角膜浸入带正电荷的浓度为1mg/ml、pH3.0的壳聚糖水溶液中,吸附5分钟，经去离子水漂洗；然后将生物工程猪角膜浸入带负电荷的浓度为10mg/ml、pH6.0的透明质酸钠溶液中，吸附30分钟，经去离子水漂洗；再将生物工程猪角膜浸入带正电荷的浓度为10μg/ml、pH5.0的趋化因子溶液中，吸附30分钟，然后再用去离子水漂洗；
3)重复步骤2)20次，使得聚阳离子、透明质酸层和细胞趋化因子层交替吸附在生物工程猪角膜表面，并保证最外层为趋化因子层；
4)将经过修饰的生物工程猪角膜，在超净台内10摄氏度温度下通风干燥、密封包装即可。
实施例2
利用静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜，具体制备过程如下：
1)用碳酸氢盐混合溶液对生物工程猪角膜清洗，然后在超净台内20摄氏度温度下干燥10min；
2)将干燥后生物工程猪角膜浸入带正电荷的浓度为10mg/ml、pH6.0的聚赖氨酸水溶液中,吸附30分钟，经去离子水漂洗；然后将生物工程猪角膜浸入带负电荷的浓度为1mg/ml、pH3.0的透明质酸钠溶液中，吸附5分钟，经去离子水漂洗；再将生物工程猪角膜浸入带正电荷的浓度为200μg/ml、pH8.0的趋化因子溶液中，吸附5分钟，然后再用去离子水漂洗；
3)重复步骤2)10次，使得聚阳离子、透明质酸层和细胞趋化因子层交替吸附在生物工程猪角膜表面，并保证最外层为趋化因子层；
4)将经过修饰的生物工程猪角膜，在超净台内40摄氏度温度下通风干燥、密封包装即可。
实施例3
利用静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜，具体制备过程如下：
1)用碳酸氢盐混合溶液对生物工程猪角膜清洗，然后在超净台内10摄氏度温度下干燥12min；
2)将干燥后生物工程猪角膜浸入带正电荷的浓度为6mg/ml、pH4.5的壳聚糖水溶液中,吸附18分钟，经去离子水漂洗；然后将生物工程猪角膜浸入带负电荷的浓度为6mg/ml、pH4.5的透明质酸钠溶液中，吸附18分钟，经去离子水漂洗；再将生物工程猪角膜浸入带正电荷的浓度为100μg/ml、pH6.5的趋化因子溶液中，吸附20分钟，然后再用去离子水漂洗；
3)重复步骤2)15次，使得聚阳离子、透明质酸层和细胞趋化因子层交替吸附在生物工程猪角膜表面，并保证最外层为趋化因子层；
4)将经过修饰的生物工程猪角膜，在超净台内25摄氏度温度下通风干燥、密封包装即可。
经前述实施例进行表面修饰改性后的生物工程猪角膜，其角膜表面由内而外依次反复沉积了聚阳离子层、透明质酸层和细胞趋化因子层，所述角膜的表面单次沉积的聚阳离子层，HA层和细胞趋化因子层厚度为2-25nm；其中聚阳离子层厚度为0.5-5nm，透明质酸层厚度为0.5-10nm，细胞趋化因子层厚度为1-10nm。
静电层层自组装技术是近年来倍受关注的表面改性前沿技术，它可在室温下利用带相反电荷的聚电解质的交替吸附来构建稳定的超薄多层膜，在纳米级别上实现对生物材料表面特异性生物活性作用的精确控制；它不影响组装成分的天然构象，甚至能在干态下保持其活性；其制备方法温和，交替浸涂工艺简单，容易通过调节组装条件控制膜的结构及性质；适用于多种基体材料，可有效实现工业化生产；已被用于多种医用材料的表面改性。因此静电层层自组装技术是进行生物工程角膜表面改性的理想技术。
静电层层自组装技术简单易行，能保持足够的生物稳定性，制备条件温和，并且组装过程所采用的均为天然聚电解质或者生物分子，无细胞毒性无免疫原性，所以本发明提供的生物工程角膜对眼内其他组织无毒副作用，拥有良好的生物相容性。该方法制造出的生物工程角膜手术创口小、手术时间短，生物相容性良好，可达到提高生物工程角膜移植的成功率的目的，并使众多角膜病患者尤其是角膜缘干细胞有缺失的角膜病患者重见光明。
为检验静电层层自组装效果，本发明对修饰后的生物工程猪角膜进行了检测，获得的数据(如图1-6)结果描述：
图1为生物工程猪角膜表面修饰具体制备流程示意图，聚阳离子、透明质酸层和细胞趋化因子层交替吸附在生物工程角膜表面，并保证最外层为趋化因子层，如此反复沉积10-20层。
图2为生物工程猪角膜表面修饰前后大体图，图2A为修饰前，图2B为修饰后，经过静电层层自组装技术修饰后生物工程角膜的透明度没有明显改变。
图3为生物工程猪角膜表面修饰前后表面扫描电镜结果，图3A为修饰前，图3B为修饰后，经过静电层层自组装技术修饰后生物工程角膜可见明显材料层沉积。
图4为生物工程猪角膜表面经静电层层自组装用FITC荧光素标记的目标蛋白后的纵切面，角膜表面可见强荧光信号带(左侧)，厚度为3μm左右，右方可见较弱荧光信号，说明有部分蛋白浸入基质内部。
图5为趋化因子释放曲线，前期释放速率较快，后期较慢，在第四天左右可达平台期，拟合曲线R2达0.96，说明静电层层自组装技术不仅可大量负载趋化因子在生物工程猪角膜表面，且释放百分率符合公式y＝51.527ln(x)+2.2172，故可准确预测趋化因子释放量。
图6为趋化因子对角膜上皮细胞(HCE)的迁移能力影响。(-/-)表示transwell中上、下小室均不含趋化因子，(-/+)表示transwell中仅下小室含趋化因子，(+/+)表示transwell中上、下小室均含趋化因子，结果发现(-/+)组HCE迁移数目明显增多，而在(+/+)组该效应消失，说明当趋化因子浓度差存在情况下HCE的定向迁移能力有明显增强。

Claims (7)

1.一种采用静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜，其特征在于：该生物工程猪角膜的表面由内而外依次反复沉积有聚阳离子层、透明质酸层及细胞趋化因子层，最外层为细胞趋化因子层。
2.根据权利要求1所述的采用静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜，其特征在于：所述聚阳离子层厚度为0.5-5nm，透明质酸层厚度为0.5-10nm，细胞趋化因子层厚度为1-10nm。
3.根据权利要求2所述的采用静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜，其特征在于：所述聚阳离子为壳聚糖或聚赖氨酸。
4.权利要求1所述的采用静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜的制备方法，依次包括以下步骤：
1)用碳酸氢盐混合溶液对生物工程猪角膜清洗，然后干燥；
2)将干燥后生物工程猪角膜表面浸入带正电荷的浓度为1-10mg/ml的聚阳离子水溶液中,吸附5-30分钟，经去离子水漂洗；然后将生物工程猪角膜浸入带负电荷的浓度为1-10mg/ml的透明质酸钠溶液中，吸附5-30分钟，经去离子水漂洗；再将生物工程猪角膜浸入带正电荷的浓度为10-200μg/ml的趋化因子溶液中，吸附5-30分钟，然后再用去离子水漂洗；使得生物工程猪角膜表面由内而外依次形成聚阳离子层、透明质酸层和趋化因子层，
3)重复步骤2)10-20次，使得生物工程猪角膜表面由内而外不断地形成聚阳离子层、透明质酸层和趋化因子层，并保证最外层为趋化因子层；
4)将经过修饰的生物工程猪角膜，在10-40摄氏度温度下干燥、密封包装即可。
5.根据权利要求4所述的采用静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜的制备方法，其特征在于：所述的碳酸氢盐混合溶液的酸碱度为8.3，含有105mmol/L的NaCl、5.5mmol/L的KCl、1.8mmol/L的CaCl2、0.8mmol/L的MgCl2、5mmol/L的葡萄糖和35mmol/L的NaHC03；所述的聚阳离子溶液酸碱度为3.0-6.0，所述的透明质酸钠溶液的酸碱度为3.0-6.0，所述的细胞趋化因子溶液的酸碱度为5.0-8.0。
6.根据权利要求5所述的采用静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜的制备方法，其特征在于：所述的干燥是超净台内通风干燥。
7.根据权利要求6所述的采用静电层层自组装技术修饰的生物工程猪角膜的制备方法，其特征在于：所述生物工程猪角膜采用新鲜约克夏猪角膜经过脱细胞处理制成。
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