CN109276755B - 基于自组装纳米多肽和干细胞的3d打印组织工程血管及其制备方法 - Google Patents

基于自组装纳米多肽和干细胞的3d打印组织工程血管及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于自组装纳米多肽和干细胞的3D打印组织工程血管及其制备方法，组织工程血管采用自组装纳米多肽和干细胞作为材料通过3D打印而成，组织工程血管具有空间网格的微观结构。本发明提供的组织工程血管不仅具有更稳定的宏观结构，并且在结构相似度、机械应力、生物活性等方面与人体正常血管更为相似，生物兼容性好，在生物体内排异反应小。在本发明的组织工程血管3D打印时加入了活体干细胞，免去了后期接种细胞的一系列问题；通过打印后将干细胞诱导分化为内皮细胞、肌细胞，避免了后期接种出现的细胞接种不均匀，诱导分化不完全，内膜不完整导致血栓形成等问题。

Description

基于自组装纳米多肽和干细胞的3D打印组织工程血管及其制 备方法
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，具体涉及一种基于自组装纳米多肽和干细胞的3D打印组织工程血管及其制备方法。
背景技术
Charles W.Hull在1986年第一阐述3D打制技术。他用薄层紫外线扫描技术循环制造出坚实的3D结构，并把这种技术叫做增材制造。随后3D打印技术开始迅速应用于工程、制造、艺术、教育等领域，近几年，3D打印技术在医学领域有了较大进展。3D生物打印所使用的方法包括仿生学，自治自组装和微型组织构建块。这项技术后来被应用于生物材料构建三维树脂模具。3D打印技术的最新进展技术、细胞生物学和组织材料学使得3D生物打印应用于组织工程学。3D生物打印技术的生物材料分层精确定位、生化药剂和活细胞，与空间位置的控制功能组件，共同造就组织工程材料的精准三维结构。
1993年张曙光教授等发现一种可以自组装的离子互补型多肽，并用其合成了水凝胶，这种水凝胶被称为自组装多肽水凝胶。自组装多肽水凝胶是多肽分子之间通过氢键、静电相互作用、疏水相互作用等非共价键自发形成的稳定的聚集体，由此可得到不同结构和功能的材料。其溶解于去离子水后，遇盐溶液自发完成组装，形成孔隙均匀的、含水丰富的三维框架材料。这种三维框架材料具有以下的特点和优势：(1)随着多肽的合成和分离技术的发展和进步，自然多肽非常容易通过人工设计、合成而获得；(2)多肽序列本身来源于自然界，与生物体作用无免疫反应和毒副作用；(3)通过多肽序列上的氨基或羧基，很容易对多肽序列进行修饰与修改；(4)具备非常好的表面活性和生物相容性；(5)易于被生物降解，且降解后产物是氨基酸单体，非但无毒，而且还可以作为生物体的营养物质。自组装纳米多肽的这些优势和特点使其成为优良的组织工程框架材料。然而，如何将自组装纳米多肽和干细胞作为材料制备组织工程框架材料，是值得研究的课题。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种基于自组装纳米多肽和干细胞的3D打印组织工程血管及其制备方法，该组织工程血管不仅具有更稳定的宏观结构，并且在结构相似度、机械应力、生物活性等方面与人体正常血管更为相似，生物兼容性好，在生物体内排异反应小。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
本发明提供了一种组织工程血管，组织工程血管采用自组装纳米多肽和干细胞作为材料通过3D打印而成，组织工程血管具有空间网格的微观结构。
优选地，干细胞为脂肪间充质干细胞。
优选地，干细胞为活体干细胞。
优选地，空间网格的直径为100～300μm。
本发明还提供了组织工程血管的制备方法，包括步骤：将多肽RADA、KLT、RGD分别加到蔗糖溶液中，超声，分别得到多肽RADA蔗糖溶液、多肽KLT蔗糖溶液和多肽RGD蔗糖溶液；将多肽RADA蔗糖溶液、多肽KLT蔗糖溶液和多肽RGD蔗糖溶液混合，然后进行盐离子诱发，得到自组装纳米多肽水凝胶；将干细胞加入到自组装纳米多肽水凝胶中，制成生物墨水；将生物墨水通过3D打印得到血管管腔；将血管管腔进行体外培养，诱导干细胞向内皮细胞及肌细胞分化，得到组织工程血管。
优选地，蔗糖溶液为蔗糖去离子水溶液。
优选地，蔗糖溶液的质量百分数为8％～12％，优选为10％。
优选地，多肽RADA蔗糖溶液中多肽RADA的质量浓度为0.9％～1.1％，优选为1％；多肽KLT蔗糖溶液中多肽KLT的质量浓度为0.9％～1.1％，优选为1％；多肽RGD蔗糖溶液中多肽RGD的质量浓度为0.9％～1.1％，优选为1％。
优选地，多肽RADA蔗糖溶液、多肽KLT蔗糖溶液和多肽RGD蔗糖溶液的体积比为(1.8～2.2)：(0.95～1.05)：1。
进一步优选地，多肽RADA蔗糖溶液、多肽KLT蔗糖溶液和多肽RGD蔗糖溶液的体积比为2：1：1。
本发明基于自组装纳米多肽和干细胞的3D打印组织工程血管，三种多肽的水溶液与人脂肪间充质干细胞为“生物墨水”打印而成。打印出的血管除外形与正常血管接近外，其微观结构则是由空间网状结构组成。含有空间网状结构的组织工程学血管在结构力学上有更好的延展性和牵拉性以及更稳定的宏观结构，当其内的脂肪间充质干细胞充分完成增值分化，则会形成与正常血管相似的内膜、肌层，在结构相似度、机械应力、生物活性等方面与人体正常血管更为相似。而打印中所用的“生物墨水”同时还具有低免疫原性的特征，对于人体的副反应小，是组织工程学领域的一大创新和发现。本发明既能促进细胞粘附，又能促进内皮细胞增殖迁移成血管，且空间结构稳定。
本发明将自组装纳米多肽与3D生物打印技术结合，打印时混入活体干细胞，利用打印机相关软件进行编程设计，制造出含有直径约为100～300μm空间网格结构的人工血管，打印出的血管结构具有如下特征：(1)含有空间网状结构的组织工程学血管在结构力学上有更好的延展性和牵拉性以及更稳定的宏观结构，当其内的脂肪干细胞充分完成增值分化，则会形成与正常血管相似的内膜、肌层，在结构相似度、机械应力、生物活性等方面与人体正常血管更为相似。(2)良好的生物兼容性，自组装纳米多肽在生物体内排异反应小，而同样取自于患者的间充质干细胞又有免疫原性低的特点。两者结合可以把生物排异反应将至最低。(3)打印时活体干细胞的加入，免去了后期接种细胞的一系列问题，只需打印后将干细胞诱导分化为内皮细胞、肌细胞即可，避免了后期接种出现的细胞接种不均匀，诱导分化不完全，内膜不完整导致血栓形成等情况。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明中纳米多肽RADA、KLT和RGD混合溶液的分辨率为1μm的原子力显微镜图谱；
图2为本发明中纳米多肽RADA、KLT和RGD混合溶液的分辨率为300nm的原子力显微镜图谱；
图3为本发明中由纳米多肽RADA、KLT、RGD混合溶液与脂肪间充质干细胞组成混合溶液经盐离子诱发自组装后得到的固态水凝胶图；
图4为本发明中纳米多肽RADA、KLT和RGD混合溶液经盐离子诱发自组装后得到的固态水凝胶；
图5为本发明中固态水凝胶脱水制作样本后的(放大400倍)扫描电镜图；
图6为本发明中固态水凝胶脱水制作样本后的(放大1500倍)扫描电镜图；
图7为本发明中A组固态水凝胶接种内皮细胞后的生长形态图；
图8为本发明中B组固态水凝胶接种内皮细胞后的生长形态图；
图9为本发明中A组固态水凝胶后被消化后对细胞进行染色得到的图谱；
图10为本发明中B组固态水凝胶后被消化后对细胞进行染色得到的图谱；
图11为本发明中打印结构可变性图；
图12为本发明中组织工程血管的效果图；
图13为本发明中空间网状结构效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
本发明提供一种组织工程血管，组织工程血管采用自组装纳米多肽和干细胞作为材料通过3D打印而成，组织工程血管具有空间网格的微观结构。
在本发明的进一步实施方式中，干细胞为脂肪间充质干细胞。
在本发明的进一步实施方式中，干细胞为活体干细胞。
在本发明的进一步实施方式中，空间网格的直径为100～300μm。
另外，本发明还提供了组织工程血管的制备方法，包括如下步骤：
将多肽RADA、KLT、RGD分别加到蔗糖溶液中，超声，分别得到多肽RADA蔗糖溶液、多肽KLT蔗糖溶液和多肽RGD蔗糖溶液；
将多肽RADA蔗糖溶液、多肽KLT蔗糖溶液和多肽RGD蔗糖溶液混合，然后进行盐离子诱发，得到自组装纳米多肽水凝胶；
将干细胞加入到自组装纳米多肽水凝胶中，制成生物墨水；
将生物墨水通过3D打印得到血管管腔；
将血管管腔进行体外培养，诱导干细胞向内皮细胞及肌细胞分化，得到组织工程血管。
在本发明的进一步实施方式中，蔗糖溶液为蔗糖去离子水溶液。
在本发明的进一步实施方式中，蔗糖溶液的质量百分数为8％～12％，优选为10％。
在本发明的进一步实施方式中，多肽RADA蔗糖溶液中多肽RADA的质量浓度为0.9％～1.1％，优选为1％；多肽KLT蔗糖溶液中多肽KLT的质量浓度为0.9％～1.1％，优选为1％；多肽RGD蔗糖溶液中多肽RGD的质量浓度为0.9％～1.1％，优选为1％。
在本发明的进一步实施方式中，多肽RADA蔗糖溶液、多肽KLT蔗糖溶液和多肽RGD蔗糖溶液的体积比为(1.8～2.2)：(0.95～1.05)：1，优选为2：1：1。
下面结合具体实施例对本发明提供的组织工程血管及其制备方法作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种组织工程血管，其是采用自组装纳米多肽和脂肪间充质干细胞作为材料通过3D打印而成，组织工程血管具有空间网格的微观结构，空间网格的直径为100～300μm。
实施例2
本实施例提供一种组织工程血管，制备方法包括步骤：
通过常规的方法分别合成多肽RADA、KLT、RGD，将多肽RADA、KLT、RGD分别加到10wt％的蔗糖去离子水溶液中，超声30min，分别得到质量浓度为1％的多肽RADA蔗糖溶液、质量浓度为1％的多肽KLT蔗糖溶液和质量浓度为1％的多肽RGD蔗糖溶液；
将质量浓度为1％的多肽RADA蔗糖溶液、质量浓度为1％的多肽KLT蔗糖溶液和质量浓度为1％的多肽RGD蔗糖溶液按2：1：1的体积比混合，然后进行盐离子诱发，得到自组装纳米多肽水凝胶；
将干细胞加入到自组装纳米多肽水凝胶中，制成生物墨水；
将生物墨水通过3D打印得到血管管腔；
将血管管腔进行体外培养，诱导干细胞向内皮细胞及肌细胞分化，得到组织工程血管。
图1为本发明中纳米多肽RADA、KLT和RGD混合溶液的分辨率为1μm的原子力显微镜图谱；图2为本发明中纳米多肽RADA、KLT和RGD混合溶液的分辨率为300nm的原子力显微镜图谱；图3为本发明中由纳米多肽RADA、KLT、RGD混合溶液与脂肪间充质干细胞组成混合溶液经盐离子诱发自组装后得到的固态水凝胶图；图4为本发明中纳米多肽RADA、KLT和RGD混合溶液经盐离子诱发自组装后得到的固态水凝胶；图5为本发明中固态水凝胶脱水制作样本后的(放大400倍)扫描电镜图；图6为本发明中固态水凝胶脱水制作样本后的(放大1500倍)扫描电镜图；图7为本发明中A组固态水凝胶接种内皮细胞后的生长形态图；图8为本发明中B组固态水凝胶接种内皮细胞后的生长形态图(图7的A组和图8的B组为平行组)；图9为本发明中A组固态水凝胶后被消化后对细胞进行染色得到的图谱；图10为本发明中B组固态水凝胶后被消化后对细胞进行染色得到的图谱(图9的A组和图10的B组为平行组)；图11为本发明中打印结构可变性图；图12为本发明中组织工程血管的效果图；图13为本发明中空间网状结构效果图。
采用原子力显微镜对多肽混合溶液进行观察，原子力显微镜图谱如图1所示。从图1中可见，多肽混合溶液具有纳米纤维性质。然后将多肽混合溶液与成人间充质干细胞混合，得到由混合物组成的“生物墨水”。利用3D打印技术将上述“生物墨水”进行打印，打印时计算机软件处理数据，建立具有空间网状结构的血管管腔，体外培养诱导脂肪间充质干细胞向内皮细胞及肌细胞分化(见图7)，形成更为完善的血管结构。
由于纳米多肽水凝胶可以促进内皮细胞增殖迁移和细胞粘附，含有空间网状结构的人工血管具有更为稳定的宏观结构更为稳定。此种人工血管更容易用于科研及临床当中。
本发明将自组装纳米多肽与3D生物打印技术结合，打印时混入活体干细胞，利用打印机相关软件进行编程设计，制造出含有直径约为100～300μm空间网格结构的人工血管，打印出的血管结构具有如下特征：(1)含有空间网状结构的组织工程学血管在结构力学上有更好的延展性和牵拉性以及更稳定的宏观结构，当其内的脂肪干细胞充分完成增值分化，则会形成与正常血管相似的内膜、肌层，在结构相似度、机械应力、生物活性等方面与人体正常血管更为相似。(2)良好的生物兼容性，自组装纳米多肽在生物体内排异反应小，而同样取自于患者的间充质干细胞又有免疫原性低的特点。两者结合可以把生物排异反应将至最低。(3)打印时活体干细胞的加入，免去了后期接种细胞的一系列问题，只需打印后将干细胞诱导分化为内皮细胞、肌细胞即可，避免了后期接种出现的细胞接种不均匀，诱导分化不完全，内膜不完整导致血栓形成等情况。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种组织工程血管的制备方法，其特征在于：
所述组织工程血管采用自组装纳米多肽和干细胞作为材料通过3D打印而成，所述组织工程血管具有空间网格的微观结构；
所述干细胞为活体脂肪间充质干细胞；
所述空间网格的直径为100～300μm；
所述制备方法包括步骤：
将多肽RADA、KLT、RGD分别加到蔗糖溶液中，超声，分别得到多肽RADA蔗糖溶液、多肽KLT蔗糖溶液和多肽RGD蔗糖溶液；
将所述多肽RADA蔗糖溶液、所述多肽KLT蔗糖溶液和所述多肽RGD蔗糖溶液混合，然后进行盐离子诱发，得到自组装纳米多肽水凝胶；
将干细胞加入到所述自组装纳米多肽水凝胶中，制成生物墨水；
将所述生物墨水通过3D打印得到血管管腔；
将所述血管管腔进行体外培养，诱导干细胞向内皮细胞及肌细胞分化，得到组织工程血管。
2.根据权利要求1所述的组织工程血管的制备方法，其特征在于：
所述蔗糖溶液为蔗糖去离子水溶液。
3.根据权利要求1所述的组织工程血管的制备方法，其特征在于：
所述蔗糖溶液的质量百分数为8％～12％。
4.根据权利要求1所述的组织工程血管的制备方法，其特征在于：
所述蔗糖溶液的质量百分数为10％。
5.根据权利要求1所述的组织工程血管的制备方法，其特征在于：
所述多肽RADA蔗糖溶液中多肽RADA的质量浓度为0.9％～1.1％；
所述多肽KLT蔗糖溶液中多肽KLT的质量浓度为0.9％～1.1％；
所述多肽RGD蔗糖溶液中多肽RGD的质量浓度为0.9％～1.1％。
6.根据权利要求5所述的组织工程血管的制备方法，其特征在于：所述多肽RADA蔗糖溶液中多肽RADA的质量浓度为1％。
7.根据权利要求5所述的组织工程血管的制备方法，其特征在于：所述多肽KLT蔗糖溶液中多肽KLT的质量浓度为1％。
8.根据权利要求5所述的组织工程血管的制备方法，其特征在于：所述多肽RGD蔗糖溶液中多肽RGD的质量浓度为1％。
9.根据权利要求1所述的组织工程血管的制备方法，其特征在于：
所述多肽RADA蔗糖溶液、所述多肽KLT蔗糖溶液和所述多肽RGD蔗糖溶液的体积比为(1.8～2.2)：(0.95～1.05)：1。
10.根据权利要求9所述的组织工程血管的制备方法，其特征在于：
所述多肽RADA蔗糖溶液、所述多肽KLT蔗糖溶液和所述多肽RGD蔗糖溶液的体积比为2：1：1。
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