WO2007066715A1 - 一軸配向ハイドロゲル - Google Patents
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- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
Definitions
- a technique using a strong magnetic field has been reported as a technique for achieving the dimensional dimension of 4,000 (4).
- the use of cell lines was limited due to the fact that the fibers were imperfect and the presence of strong magnetic fields required later cell types.
- Another problem is that the location of the magnetic field is indispensable.
- 0006 that is, is composed of or, and is arranged in one direction.
- 0007 Also, the process of extending the id toward
- the present invention provides a cell method, which comprises a step of infiltrating a proliferated id in a nutrient solution.
- 000 9 A Inge Microscope (35 f)
- such a polymer derived from a living body for example, in the case of N, it can be obtained by preparing a solution obtained by mixing an inulin solution and a Tonbin solution.
- the reason why the water is used is that water is used as both the ingen solution and the tonbin, and the water is used as a dispersion. It can be obtained by adjusting the acidity of Lagen to 7.4 and adjusting the temperature to C. It is obtained by cooling a gelatin solution of gelatin and keeping it at 2 C. Even if there is a gap, it may be possible to dissolve water it can.
- the obtained id is subjected to a process of extending it, so that its durability is imparted.
- preparing an id it is possible to give different strengths by constructing or varying the degree of. , Preferably to prepare a tolerant id over 3. Otherwise, it is not possible to distribute by.
- 001 contains cells, lyse the previous cells. For example, let it exist in the liquid on the floor.
- the stage is not particularly limited, but for example, the following may be performed. Pour the solution into it. Insert the gage (, stick, etc.) to the end like this. Entirely, the mold is taken out, the material is utilized (for example, by pulling out the edge of the material protruding from the edge of the material), and the material is extended for a certain period of time. If you get it, you can hold it with a clamp and extend it for a certain period.
- the load of 0 15 causes a crack in the direction parallel to the direction, and a crack in the direction, resulting in a unidirectional array of ge (ie, the ge or ge is three-dimensional).
- the load is such that it can be above, preferably three. By doing so, it is possible to confirm almost uniformly.
- the cells When the cells are placed at about 016, they are oriented in the same direction as the target.
- the cell culture can be carried out by using the light cell containing 017 cells.
- the dimension of cells means that they are arranged in a line (coalescence) but are arranged in the same direction with a spatial separation.
- Myodonoid can also be applied. It is only possible to use the clear ids that make up or are arranged in the dimensional dimension of this cell.
- the following nutrient solution can be used and is not particularly limited.
- the following nutrient solution can be used and is not particularly limited.
- During feeding it is preferable to load the id continuously or periodically. It is effective to maintain the well-balanced distribution by continuously increasing the load.
- suppressing shrinkage associated with cell growth and maintaining a high degree of growth is also synonymous with clearly loading.
- the cells can be more three-dimensionally added.
- the composition By changing the composition, it is possible to give to cells. For example, cell breeding occurs under various conditions, and the cell gene and cell gene expression change. 002 Moreover, even if the cell culture is carried out with a periodic load, it becomes possible to control the cell fraction, the cell and the motile cell function, and the molecular biological
- the solution obtained by mixing the non-stain solution and the s-thombin solution was poured into a template (size (6)) to form C.
- 002 shows the image of the ibunge child microscope (4 f). Inn (It is understood that it is unstructured because it has not been formed.
- Figure 3 shows the microscope of this lens. 3, the upper photo is 4, and the lower photo is taken at double magnification. Fins or cells are found to be disordered and non-distributed.
- the cell culture was carried out in the same manner as in Example 2 except that the cell culture was carried out in 255 with the interval of 25 5 and between 8 and 8, and after 3, 3, 5 and 7 were measured. The results are shown in Fig. 4. It can be seen that it is possible to adjust the cell ratio by changing the combination of the above four.
- the cell culture was carried out in the same manner as in Example 2 except that the cell culture was carried out by setting the target in 255 for 5 5 and the interval between 8 and 8, and the gene expression was examined by RT PCR. The results are shown in Fig. 5. It is understood that the gene combination can be controlled by changing the combination of the five.
- the 0 031 light dimension can be used as cell 3.
- it can be applied to the construction of a tissue that has a three-dimensional arrangement of muscles and bones at nVo, and by reproducing the environment close to the body, a new functional method becomes possible.
- Ming 3 can also be applied to the construction of three-dimensional weaves, and further studies on the physical properties of weaves, for example, the mechanics of cells and the ashing mechanism of weaves. Can be applied to.
- the above-mentioned polymer is n, collagen or gelatin, and the above-mentioned 2 003 4.
- a cell comprising the step of infiltrating the prolonged id in a nutrient solution.
Abstract
ゲル構成繊維が三次元的かつ一軸配向したハイドロゲルおよびその製法、用途を提供する。 ゲルを構成する繊維または繊維束が一軸方向に配向したハイドロゲル；ゲルを構成する繊維または繊維束からなるハイドロゲルを調製する工程、およびハイドロゲルを一軸方向に延伸する工程を経て調製される、ゲルを構成する繊維または繊維束が一軸方向に配向したハイドロゲルの製造方法；該ハイドロゲルでの細胞培養方法。
Description
明 細 書
一軸配向ハイド口ゲル
技術分野
[0001] 本発明は、ゲルを構成する細繊維または繊維束が一軸方向に配向したハイドロゲ ルおよびその製造方法に関する。
背景技術
[0002] より生体に近 、環境での細胞動態を検討するため、三次元ゲルは in vitroでの細胞 培養実験に広く利用されている。その中で筋肉や血管、神経など配向性の高い組織 を検討するために細胞配向を制御した三次元培養系の構築が望まれて 、る。
[0003] これまでの三次元ゲル培養では次のような問題点があった。
ゲル構成繊維はランダムな走行をしており、このようなゲル内で細胞培養した場合、 細胞は不規則な配向を示す。この手法は様々な細胞に対する三次元環境の影響を 検討するうえで有効である一方、いくつかの生体組織、例えば筋肉や血管、神経な どに見られる高度に配向した細胞群を作製することはできな力つた。
[0004] ゲル構成微細繊維の三次元的配向を達成する技術として、強磁場を用いた技術が 報告されている（非特許文献 1)。しかし、その技術は、繊維配向が不完全であり、ま た、強磁場の影響があるため繊維配向後に細胞播種をする必要があるため、細胞培 養系への利用には限界があった。強磁場を発生させるための特殊装置の設置が不 可欠であることも問題点の一つである。
非特許文献 l : Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.80, pp. 1616-1620, March 1983. 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は上記事情に鑑みなされたもので、ゲル構成繊維が三次元的かつ一軸配 向したノ、イド口ゲル、その製法および用途を提供するものである。
課題を解決するための手段
[0006] すなわち、本発明は、ゲルを構成する繊維または繊維束が一軸方向に配向したハ イド口ゲルを提供するものである。
[0007] また、本発明は、ハイド口ゲルを一軸方向に延伸する工程、
を経て調製される、ゲルを構成する繊維または繊維束が一軸方向に配向したハイド 口ゲルの製造方法を提供するものである。
[0008] 本発明は、さらに、ゲルを構成する繊維または繊維束および細胞を含む混合溶液 からハイド口ゲルを調製する工程、および
得られたハイド口ゲルを一軸方向に延伸する工程、および
一軸方向に延伸されたハイド口ゲルを培養液中に浸漬し細胞を培養する工程 を含む、細胞培養方法を提供するものである。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1A]—軸配向フイブリンゲルの走査型電子顕微鏡写真（3500倍)。
[図 1B]—軸配向フイブリンゲルの走査型電子顕微鏡写真（3500倍)。
[図 1C]無配向フイブリンゲルの走査型電子顕微鏡写真（10000倍)。
[図 2A]細胞含有一軸配向フイブリンゲルの顕微鏡写真。
[図 2B]細胞含有一軸配向フイブリンゲルの顕微鏡写真。
[図 2C]細胞含有一軸配向フイブリンゲルの顕微鏡写真。
[図 3]細胞含有無配向フイブリンゲルの顕微鏡写真。
[図 4]異なるゲル延伸条件下での細胞増殖度合いを示すグラフ。
[図 5]異なるゲル延伸条件下での遺伝子発現の変化を示すグラフ。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明においてゲルを構成する繊維または繊維束が生体由来高分子、例えばフィ ブリン、コラーゲンまたはゼラチンなど、特にフイブリンである。
[0011] そのような生体由来高分子からハイド口ゲルを調製するには、例えばフイブリンの場 合、フイブリノ一ゲン溶液とトロンビン溶液を混合することにより得られるゾル状溶液を ゲルィ匕することにより得られる。本発明でノヽイド口ゲルというのは、フイブリノ一ゲン溶 液とトロンビン溶液は両者媒体に水を使用しており、水を分散液体として 、るためで ある。コラーゲンの場合は、酸性コラーゲン溶液の pHを 7. 4にし、温度を 37°Cに調 整することで得られる。ゼラチンの場合はゼラチン水溶液を冷却し 20°C以下に保持 することで得られる。いずれの場合もフイブリンゲル同様、水を溶媒として用いることが
できる。
[0012] ゲルを調製する際には、本発明にお 、ては得られたノヽイド口ゲルを一軸方向に延 伸する工程を経るので、その延伸に耐える固さを付与するようにする。ハイド口ゲルを 調製するに際して、ゲルを構成する繊維または繊維束の濃度を変えることで異なる固 さを与えることが可能である。数十％の延伸、好ましくは約 30%以上の延伸に耐える ノ、イド口ゲルを調製するようにする。さもないと、延伸により繊維束を一軸方向に配向 させることはできない。また固さの異なるハイド口ゲルを使用することにより、細胞分ィ匕 の制御が可能である。
[0013] ゲルに細胞を含有させる場合は、ゲル化前の溶液に予め細胞を播種する。例えば 、ゾル溶液の段階でゾル溶液中に存在させるようにする。
[0014] ノ、イド口ゲルを一軸方向に延伸するには、その手段は特に限定する意図ではない 力 例えば、以下のようにすればよい。铸型内にゾル状溶液を流し込み、ゲル化させ る。このゲルィ匕過程にゲル把持用物質 (糸、棒など）をゲル両端に挿入する。完全に ゲル化後、铸型カゝらゲルを取り出し、ゲル把持用物質を利用し (例えばゲル両端には み出させた把持用物質の両端を引張り延伸することにより）、ゲルに対して一定期間 延伸負荷する。もしくはゲルィ匕後、铸型力 取り出したゲルをクランプで把持し一定 期間延伸負荷するようにすればょ 、。
[0015] ゲルへの延伸負荷により、延伸方向に平行な方向にゲル構成繊維の延伸およびゲ ル構成繊維間の亀裂が生じ、結果的に一軸方向に配向したゲル繊維束の集合体（ すなわち、この集合体はゲル繊維あるいは繊維束が三次元的かつ一軸配向している )へと変化する。延伸負荷の程度は、ゲルが、数十％以上、好ましくは約 30%以上延 伸させることができる程度の負荷である。約 50%延伸することで、ほぼ一様に繊維束 が確認できる。
[0016] ゲルィ匕過程に細胞を存在させておくと、ゲル内細胞が繊維束方向と同方向に一軸 配向する。
[0017] 細胞を含有する本発明のノ、イド口ゲルを使用して、細胞培養を行うことができる。細 胞としては、特に限定されるものではないが、筋芽細胞、筋細胞、骨芽細胞、血管内 皮細胞、神経細胞等使用できる。本発明のハイド口ゲル中で細胞を培養すると、繊維
束間で繊維束と同一方向で細胞増殖がおこり、その結果、ゲル内細胞は、三次元的 一軸配向する。細胞の三次元的一軸配向とは、一列にならんだ細胞群 (集合体）が、 空間的距離をおいて同一方向に配列していることを意味している。従って、本発明の ノ、イド口ゲルを使用した細胞培養は、生体擬似組織の構築へも応用できる。このよう な細胞の三次元的一軸配向は、ゲルを構成する繊維または繊維束が一軸方向に配 向した本発明のハイド口ゲルを使用して初めて可能となるものである。
[0018] 細胞の培養は、上記のようにして得られたノ、イド口ゲルを培養液に浸漬しながら行う 。培養液としては、公知の培養液を使用でき、特に、限定されない。培養中、ハイド口 ゲルには、持続的にまたは周期的に延伸負荷をかけることが好ましい。持続的に延 伸負荷をかけることにより、一軸方向に配向させた繊維束の配向を維持するのに効 果的である。本発明においては、細胞増殖に伴うゲルの収縮を押さえ、ゲル収縮前 のゲルの長さを維持することも本発明に 、う延伸負荷をかけて 、ることと同義である。 しかしながら、細胞培養に先立って、ゲルを延伸付加させた状態で細胞を培養させる 方力 より効果的に細胞群を三次元的一軸配向させることができる。
[0019] ノヽイド口ゲルに持続的に延伸負荷をかけながら細胞培養を行う場合、ゲル延伸割 合を変えることで細胞培養や細胞分ィ匕に変化を与えることができる。例えば異なる伸 展条件下で細胞増殖を行うと、細胞増殖度合い、細胞の遺伝子発現が変化する。
[0020] また、細胞培養を、ゲルへ周期的延伸負荷をかけながら行なっても、細胞分化の制 御、細胞の増殖、運動といった細胞機能の制御が可能となり、分子生物学的検討や 組織工学的な生体様組織の構築に効果的である。周期的にとは、一定の時間間隔 をおいて、という意味である。負荷を周期的に変化させてもよい。時間間隔として、数 秒力 数分の範囲内で、周期を様々に設定することにより、異なる機能を示す細胞を 増殖させることが可能となる。
実施例
[0021] (実施例 1)
図 1Aおよび図 1Bに下記方法で調製したゲルを構成するフイブリン繊維または繊 維束が一軸方向に配向したノ、イド口ゲル（以下、「一軸配向フイブリンゲル」と 、う）の 走査型電子顕微鏡写真（図 1A: 3500倍，図 1B3500倍)を示す。フイブリン繊維あ
るいはフイブリン繊維束が一軸方向に配向して 、るのがわかる。
[0022] (一軸配向フイブリンゲルの調製）
濃度 3mgZmlのフイブリノ一ゲン溶液と濃度 25unitsZmlトロンビン溶液を混合す ることにより得られるゾル状溶液を、铸型（大きさ（ φ =6mm,長さ 10mm) )に流し込 み、 37°Cでゲルを形成した。
[0023] この時点の無配向フイブリンゲルの走査型電子顕微鏡写真 (4000倍）を図 1Bに示 す。フイブリン繊維は (繊維束は形成されていないので)無秩序、無配向であることが ゎカゝる。
[0024] 形成したゲルの両端にゲル把持用物質として φ =0. 25mmの縫合糸を、その両 端が形成されたゲルの両端に突出するように、ゲル化中に挿入した。培地中にて縫 合糸の両端を引張ってゲルに延伸負荷し、ゲルを約 30%延伸した状態で (6 )時間 保持後のフイブリンゲルの走査型電子顕微鏡写真が図 1Aであり、 100%延伸した状 態で（ 6)時間保持後のフイブリンゲルの走査型電子顕微鏡写真が図 1Bである。
[0025] (実施例 2)
(細胞培養）
下記方法で調製した筋芽細胞含有一軸配向フイブリンゲル中で 2日間細胞培養し たフイブリンゲルの顕微鏡写真（図 2A、 400倍）、 4日後のそれ（図 2B、 200倍）、 8日 後のそれ（図 2C、 200倍)を示す。フイブリン繊維の配向方向に細胞が増殖している のがわかる。
[0026] 濃度 3mg/mlのフイブリノ一ゲン溶液、濃度 25units/mlトロンビン溶液および筋 芽細胞 (濃度 1 X 105個 Zml)を同時に混合することにより得られるゾル状溶液を、铸 型（大きさ（Φ =6mm,長さ 10mm) )に流し込み、 37°Cでゲルを形成した。
[0027] この時点の無配向フイブリンゲルを（Dulbeco's modified eagle mediumに 10%牛胎 児血清を添加した培養液に投入し、 2日間細胞培養をおこなった。このフイブリンゲ ルの顕微鏡写真を図 3に示す。図 3中、上の写真が 40倍、下の写真が 100倍の倍率 で撮影された物である。フイブリン繊維または繊維束、細胞は無秩序、無配向である ことがわ力ゝる。
[0028] ゲル把持用物質として φ =0. 25mmの縫合糸を、ゲル化過程に挿入し、 37°C、 2
0分間保持しゲルを形成した。得られたゲルを 50%延伸し、 Dulbeco's modified eagle mediumに 10%牛胎児血清を添加した培養液中でゲルを延伸した状態で、 2日間、 4日間、 6日間細胞培養を行った。
[0029] (実施例 3)
(細胞増殖の制御）
実施例 2においてゲル延伸条件を 0%、 25%、 50%、培養期間を 1〜8日間として 細胞培養を行った以外、実施例 2と同様にして細胞培養を行い、 1日後、 3日後、 5日 後、 7日後の細胞数を測定した。結果を図 4に示す。図 4からゲルの伸展割合を変え ることで細胞増殖度合いを変化させることが可能であることがわ力る。
[0030] (実施例 4)
(遺伝子発現の制御）
実施例 2においてゲル延伸条件を 0%、 25%、 50%、培養期間を 1〜8日間とし、 細胞培養を行った以外、実施例 2と同様にして細胞培養を行い、遺伝子発現の変化 を RT- PCRにより検討した。結果を図 5に示す。図 5からゲルの伸展割合を変えること で遺伝子発現度合いを変化させることが可能であることがわかる。
産業上の利用可能性
[0031] 本発明の三次元ゲルは、細胞 3次元培養ゲルとして使用できる。例えば、筋や骨の ような三次元的に配向した生体類似組織の in vitroでの構築に応用が可能であり、よ り生体に近い環境を再現することで、新たな細胞動態、機能検討方法が可能となる。 また、本発明の 3次元培養ゲルは、三次元的生体様組織の構築にも応用可能であり 、さらには筋、骨等組織の生物学的検討、例えば筋芽細胞の融合メカニズムや、生 体硬組織の石灰化機構などの解明を目的とした研究に応用可能である。
[0032] 以上から、本明細書には少なくとも以下の発明が包含される。
1.ゲルを構成する繊維または繊維束が一軸方向に配向したハイド口ゲル。
[0033] 2.ゲルを構成する繊維または繊維束が生体由来高分子である、上記 1に記載のハ イドロゲノレ。
[0034] 3.生体由来高分子がフイブリン、コラーゲンまたはゼラチンである、上記 2に記載の ノヽイド口ゲル。
[0035] 4.細胞を含有する、上記 1〜3いずれかに記載のハイド口ゲル。
[0036] 5.細胞が培養増殖された、上記 4に記載のハイド口ゲル。
[0037] 6.細胞が生体細胞である、上記 4または上記 5に記載のハイド口ゲル。
[0038] 7.培養増殖が、ゲルへ周期的に延伸負荷をかけながら行われた、上記 5または上記
6に記載のハイド口ゲル。
[0039] 8.ゲルを構成する繊維または繊維束力もなるハイド口ゲルを調製する工程、および ノ、イド口ゲルを一軸方向に延伸する工程、
を経て調製される、ゲルを構成する繊維または繊維束が一軸方向に配向したハイド 口ゲルの製造方法。
[0040] 9.ゲルを構成する繊維または繊維束が生体由来高分子である、上記 8に記載のハ イド口ゲルの製造方法。
[0041] 10.生体由来高分子がフイブリン、コラーゲンまたはゼラチン、特にフイブリンである、 上記 9に記載のハイド口ゲルの製造方法。
[0042] 11.ゲルを構成する繊維または繊維束および細胞を含む混合溶液からハイド口ゲル を調製する工程、および
得られたハイド口ゲルを一軸方向に延伸する工程、および
一軸方向に延伸されたハイド口ゲルを培養液中に浸漬し細胞を培養する工程 を含む、細胞培養方法。
[0043] 12.ゲルを構成する繊維または繊維束が生体由来高分子である、上記 11に記載の 細胞培養方法。
[0044] 13.生体由来高分子がフイブリン、コラーゲンまたはゼラチンである、上記 12に記載 の細胞培養方法。
[0045] 14.培養を、ゲルへ周期的に延伸負荷をかけながら行なう、上記 11〜13いずれか に記載の細胞培養方法。
[0046] 15.ゲルを構成する繊維または繊維束の含有量を調整することにより、所望の硬度（ 固さ）を付与することを特徴とする上記 1〜7のノ、イド口ゲルの硬度調整方法。
16.ゲルを構成する繊維または繊維束の含有量を調整することにより、所定の硬度（ 固さ）のゲルを製造することを特徴とする、上記 8〜： LOいずれかのハイド口ゲルの製
£ Ζ£/900Ζάΐ/13ά 8 ST .990/.00Z OAV
Claims
請求の範囲
[I] ゲルを構成する繊維または繊維束が一軸方向に配向したハイド口ゲル。
[2] ゲルを構成する繊維または繊維束が生体由来高分子である、請求項 1に記載のハ イドロゲノレ。
[3] 生体由来高分子がフイブリン、コラーゲンまたはゼラチンである、請求項 2に記載の ノヽイド口ゲル。
[4] 生体由来高分子がフイブリンである、請求項 2に記載のノ、イド口ゲル。
[5] 細胞を含有する、請求項 1〜4いずれかに記載のハイド口ゲル。
[6] 細胞が培養増殖された、請求項 5に記載のハイド口ゲル。
[7] 細胞が生体細胞である、請求項 5または請求項 6に記載のハイド口ゲル。
[8] 培養増殖が、ゲルへ持続的にまたは周期的に延伸負荷をかけながら行われた、請 求項 6または請求項 7に記載のハイド口ゲル。
[9] ゲルを構成する繊維または繊維束カゝらなるハイド口ゲルを調製する工程、および ノ、イド口ゲルを一軸方向に延伸する工程、
を経て調製される、ゲルを構成する繊維または繊維束が一軸方向に配向したハイド 口ゲルの製造方法。
[10] ゲルを構成する繊維または繊維束が生体由来高分子である、請求項 9に記載のハ イド口ゲルの製造方法。
[II] 生体由来高分子がフイブリン、コラーゲンまたはゼラチンである、請求項 10に記載 のハイド口ゲルの製造方法。
[12] 生体由来高分子がフイブリンである、請求項 10に記載のハイド口ゲルの製造方法。
[13] ゲルを構成する繊維または繊維束および細胞を含む混合溶液からハイド口ゲルを 調製する工程、および
得られたハイド口ゲルを一軸方向に延伸する工程、および
一軸方向に延伸されたハイド口ゲルを培養液中に浸漬し細胞を培養する工程 を含む、細胞培養方法。
[14] ゲルを構成する繊維または繊維束が生体由来高分子である、請求項 13に記載の 細胞培養方法。
[15] 生体由来高分子がフイブリン、コラーゲンまたはゼラチンである、請求項 14に記載 の細胞培養方法。
[16] 生体由来高分子がフイブリンである、請求項 14に記載の細胞培養方法。
[17] 培養を、ゲルへ持続的にまたは周期的に延伸負荷をかけながら行なう、請求項 13 〜 15いずれかに記載の細胞培養方法。
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