CN102505184A - 一种组织工程纤维束结构体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织工程纤维束结构体及其制备方法。本发明提供了制备含有细胞组分的水凝胶纤维丝的方法,为如下A或B:A所示的方法包括如下步骤:1)将用于成形的水凝胶材料作为基质复合细胞组分得到内含细胞组分的混合物,2)再将步骤1)得到的所述内含细胞组分的混合物放入所述基质对应的交联液中交联,即得到含有细胞组分的水凝胶纤维丝;本发明的实验证明,本设计可以综合满足组织工程中的细胞高密度复合、良好血管化发展趋势和实现定向有序结构的特殊仿生要求。因此本发明的纤维束结构体具有很好的血管化发展前景,很有希望突破组织工程目前“无法做大做厚”的发展瓶颈。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种组织工程纤维束结构体及其制备方法。
背景技术
20世纪80年代提出的“组织工程(Tissue Engineering)”(Langer R,VacantiJ P.Tissue engineering.Science,1993,260(5110):920-926.),旨在体外构建细胞和材料的三维结构体,通过适当的培养和训练后发展成具有和天然组织类似结构和初步功能的可移植替代物。近年来,组织工程一直是国内外研究的热点,发展迅速并取得了诸多成果,其主要产品集中在骨组织工程和皮肤组织工程等少数几个领域。目前的组织工程结构体体外构建已涉及多种方法,如水凝胶模铸、电纺丝、细胞打印、细胞三维受控组装等,但同时存在着明显的问题,这些方法构建的结构体有效厚度(即细胞存活层厚度)一般只能达到100-150μm,结构体内部的细胞存活率低,难以实现大块组织的构建。究其原因,主要是未能构建具有天然组织类似的血管网络结构。对于一些具有特殊结构的组织(如肌腱组织、心肌组织和神经组织等),其体外构建过程也有特殊的要求。
为了突破组织工程面临的困难,以仿生的路线设计与构建具有类似天然组织形态和功能的结构体,是一个必然的趋势。以心肌组织工程为例,美国Harald等人(Ott HC,Matthiesen T S,Goh S K,et al.Perfusion-decellularized matrix:usingnature’s platform to engineer a bioartificial heart.Nature Medicine,2008,14(2):213-221.)在2008年利用天然去细胞的细胞外基质(Extracellular Matrix,简称ECM)支架成功重构了大鼠心脏,初步实现一致跳动和泵血功能。该研究表明,天然组织的细胞外基质具有很好的结构和生物学特性,为组织工程支架的研究提供了启发。进一步地,组织工程心肌结构体和其他组织工程结构体的体外构建中,除了细胞成分的仿生之外,还有支架的结构和仿血管网络结构的构建等,其中的难点可概括为细胞的有效种植、氧与营养物质的有效输送和组织生成的良好诱导。
1)细胞的有效种植。传统的组织工程遵循“细胞-支架复合”的“自上而下(Top-down)”构建思路,即先成形支架,再把细胞种植到支架上。但是,当支架尺寸和复杂度提高到一定程度时,细胞复合的难度将大大增加,细胞难以长入支架内部,细胞密度和分布均匀性难以控制。尤其是对于心肌细胞等终末分化细胞,由于不能进一步增殖分化,细胞初始种植密度将决定了结构体的细胞密度。细胞三维受控组装技术(Wang X H,Yan Y N,Zhang R J.Rapid prototyping as a tool for manufacturingbioartificial livers.Trends in Biotechnology,2007,25(11):505-513.)遵循“支架-细胞”一体化构建的思路,将细胞直接混合在材料之中一起成形,其特点是可以保证细胞密度和分布的均匀性,并且可以实现多种细胞的共同组装和定点排布。但是,由于细胞参与到成形的过程之中,成形过程和成形环境可能会对细胞产生损伤;另一方面,成形后细胞嵌在材料内部,仅依靠有限的渗透作用,氧与营养物质的供给也很难达到内部细胞存活的需求,因此这一工艺有待进一步的改进与优化。
2)氧与营养物质的有效输送。国内外研究通过构建多通道支架并结合体外灌流培养可以大大改善供氧效果,但组织工程心肌中始终没能形成真正的供氧系统,“血管化问题”仍然是影响心肌组织再生与发育的技术瓶颈。作为组织工程的一大难题,血管化问题对于心肌、肝脏等具有复杂血管系统的高耗氧脏器组织尤其突出,目前的研究已经积累了一些成果,可以归纳为三个方面:细胞选择、支架设计和体外生物反应器设计(即培养过程),但大多研究仍处在基础研究阶段。近年来,美国的Oren Caspi和Stevens等人(Caspi O,Lesman A.Basevitch Y,et al.Tissue engineering ofvascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells.CirculationResearch,2007,100(2):263-272.Stevens K R,Kreutziger K L,Dupras S K,etal.Physiological function and transplantation of scaffold-free andvascularized human cardiac muscle tissue.Proceedings of the National Academyof Sciences(PNAS),2009,106(39):16568-16573.)已经成功培养出原始毛细血管或类血管结构,但是他们的研究集中在细胞共同培养上,尤其是针对内皮细胞自组装形成血管的多方面探究。除此之外,结构体的材料与微观结构以及适当的培养方式对血管生成和发育也有十分重要的影响。
3)组织生成的良好诱导。天然组织中细胞连接排列的方式与组织的功能有很紧密的关系,例如心肌的复合定向结构与心脏周期胀缩产生的拉压应力环境相适应,神经细胞的首尾连接结构是为了实现信号的定向传导等。因此,尤其是对于心肌组织工程和神经组织工程来说,细胞连接排列的良好诱导具有十分重大的意义。例如,清华大学生物制造工程研究所构建的心肌组织工程定向支架(Xiong Z,Zhang T,Jin L,ZhangR J,Yan Y N.Fabrication of Oriented Porous Scaffold for Engineering MyocardialTissue.USA:Society For Biomaterials 2010Annual Meeting and Exposition,2010.),采用“胶原-壳聚糖-Matrigel”复合材料通过热致相分离法(TIPS)构建出具有“取向大孔-贯通小孔”的分级孔隙结构的支架,实验结果表明能够促进心肌细胞沿取向伸长和铺展,初步呈现天然心肌细胞的形态。此外,体外训练和刺激(包括灌流、力学训练、电刺激等)对细胞的定向排列和伸展都有不同的促进作用,应在设计中充分考虑并加以利用。
近年来,微单元体组装技术(Nichol J W,Khademhosseini A.Modular TissueEngineering:Engineering Biological Tissues from the Bottom Up.Soft Matter.2009,5(7):1312-1319.)提出了“自下而上(Bottom-up)”的新型构建思路,可以简单描述成:制备微单元体,组装成三维结构体,体外培养后成为统一体。微单元体(Modules)是指可用于组装的单元,可以是细胞团簇、细胞层片、含细胞的液滴和具有一定结构的组织工程单元。而组装(Assembly)目前分为任意堆垛和有序排布两种,前者工艺简单,但内部结构很难控制;后者虽然能形成规律的结构,但成形工艺过程十分复杂,仍需进一步的探索。值得一提的是,微单元体组装起来后,单元体之间的孔隙可以构成贯通的网络。微通道分布密集,贯通交错,可以为营养液输送提供通道,保证结构体内各处细胞的存活。这种构建思路可以构造出更适合细胞生长发育的微环境,尤其是为构建具有复杂结构的组织工程结构体提供了另外一种思路,对于推动组织工程的发展有着十分深远的启发作用和借鉴意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备水凝胶纤维丝的方法。
本发明提供的方法,包括如下步骤:先以水凝胶材料为基质与细胞组分复合,得到材料-细胞复合物,再将所述材料-细胞复合物成形为丝状结构并在所述水凝胶材料对应的交联剂中交联固化,即得到水凝胶纤维丝。
上述水凝胶材料为可快速或瞬时交联的水凝胶材料,上述交联液为可使所述水凝胶材料快速或瞬时交联的溶液。
上述水凝胶材料和上述水凝胶材料对应的交联剂为具体为如下1)或2):
1)、所述水凝胶材料为海藻酸钠,其对应的所述交联剂为含二价阳离子的盐溶液,所述含二价阳离子的盐溶液具体为氯化钙水溶液;
2)、所述水凝胶材料为海藻酸钠和如下3种中的至少一种:纤维蛋白原、壳聚糖和胶原;所述纤维蛋白原对应的交联剂为凝血酶;
上述细胞组分为如下3种组分中的至少一种,但不局限于以下三种:离体细胞A、细胞培养液和生长因子。
在上述的方法中,在将所述“材料-细胞”复合物在所述水凝胶材料对应的交联剂中交联的步骤后还包括将所述交联得到的产物外包裹离体细胞B或涂覆改性材料的步骤;
上述将所述交联得到的产物外包裹离体细胞B具体为将所述交联得到的产物浸泡在含有所述离体细胞B的悬浮液中;
上述步骤中的改性材料为胶原蛋白、层连蛋白或纤连蛋白;
上述方法中,所述离体细胞A和所述离体细胞B为同一种或者不同种;
上述方法中,所述离体细胞A具体为离体的功能细胞,所述离体的功能细胞具体为离体心肌细胞、离体肝细胞、离体神经细胞、离体成纤维细胞或离体C2C12细胞;
上述方法中,所述离体细胞B具体为离体内皮细胞;
上述方法中,所述细胞培养液为细胞培养液A或细胞培养液B;
上述方法中,所述细胞培养液B为高糖细胞培养液或普通细胞培养液,所述高糖细胞培养液具体为DEME高糖培养液,所述普通细胞培养液具体为DEME培养液;
上述方法中,所述细胞培养液A按照如下方法制备:将胎牛血清、青霉素、链霉素和所述细胞培养液B混合得到,所述胎牛血清在所述细胞培养液中的浓度为10%(体积百分含量),所述青霉素和链霉素在所述细胞培养液中的浓度均为100U/ml。
上述的方法具体可为如下A)-D)中任一一种:
在一个实施例中,A)所示的方法包括如下步骤:
1)将海藻酸钠、水、所述细胞培养液B混匀,得到复合物,
2)将步骤1)得到的所述复合物挤压成丝状并置于氯化钙水溶液中交联,得到成形纤维丝,即得到水凝胶纤维丝(内含细胞组分);
在另一个实施例中,B)所示的方法包括如下步骤:
1)将海藻酸钠、水、所述离体细胞A、所述细胞培养液A混匀,得到复合物,
2)将步骤1)得到的所述复合物挤压成丝状并置于氯化钙水溶液中交联,得到成形纤维丝,
3)将步骤2)得到的成形纤维丝浸泡在含有离体细胞B的悬浮液中,得到水凝胶纤维丝(内含细胞组分和表面裹有细胞);
在又一个实施例中,C)所示的方法包括如下步骤:
1)将海藻酸钠、水、纤维蛋白原、所述细胞培养液B混匀,得到复合物,
2)将步骤1)得到的所述复合物挤压成丝状并置于氯化钙水溶液中交联,得到成形纤维丝,
3)将步骤2)得到的成形纤维丝浸泡在含有凝血酶的溶液中,得到水凝胶纤维丝(内含细胞组分);
在又一个实施例中,D)所示的方法包括如下步骤:
1)将海藻酸钠、水、纤维蛋白原、离体细胞A、所述细胞培养液A混匀,得到复合物,
2)将步骤1)得到的所述复合物挤压成丝状并置于氯化钙水溶液中交联,得到成形纤维丝,
3)将步骤2)得到的成形纤维丝浸泡在含有凝血酶的溶液中,得到再次交联纤维丝;
4)将步骤3)得到的再次交联纤维丝浸泡在含有离体细胞B的悬浮液中,得到水凝胶纤维丝(内含细胞组分和表面裹有细胞)。
在上述A)所示的方法中,
其中步骤1)中,所述海藻酸钠、所述水与所述细胞培养液B的配比为0.01g-0.1g∶1ml∶1ml;
其中步骤2)中,所述氯化钙水溶液的浓度为0.01g/ml-0.1g/ml;
在该方法中,所述挤压采用注射器,所述挤压的方式为连续挤压,所述氯化钙水溶液为处于旋转状态的氯化钙水溶液;
上述注射器的针头内径为50μm-500μm;
上述挤压的速度为2.0mm/s-20.0mm/s;
上述处于旋转状态的氯化钙水溶液通过磁力搅拌或轴转实现;
在上述B所示的方法中,
其中步骤1)中,所述海藻酸钠、水、所述离体细胞A、所述细胞培养液A的配比为0.01g-0.1g∶1ml∶(1.0-50.0)×106个∶1ml;
上述离体细胞A为离体心肌细胞;
其中步骤2)中,所述氯化钙水溶液的浓度为0.01g/ml-0.1g/ml;
在该方法中,所述挤压采用注射器,所述挤压的方式为连续挤压,所述氯化钙水溶液为处于旋转状态的氯化钙水溶液;
上述处于旋转状态的氯化钙水溶液通过磁力搅拌或轴转实现;
上述注射器的针头内径为50μm-500μm;
上述挤压的速度为2.0mm/s-20.0mm/s;
其中步骤3)中,所述含有离体细胞B的悬浮液为将所述离体细胞B与所述细胞培养液A混合得到,所述离体细胞在所述含有离体细胞B的悬浮液中的浓度为(1.0-50.0)×106个/ml;
上述浸泡时间为3h-10h;所述浸泡的温度为37℃;
上述离体细胞B具体为离体内皮细胞;
在上述C)所示的方法中,
其中步骤1)中,所述海藻酸钠、水、纤维蛋白原、所述细胞培养液B的配比为0.01g-0.1g∶1ml∶0.01g-0.1g∶1ml;
其中步骤2)中,所述氯化钙水溶液的浓度为0.01g/ml-0.1g/ml;
在该方法中,所述挤压采用注射器,所述挤压的方式为连续挤压,所述氯化钙水溶液为处于旋转状态的氯化钙水溶液;
上述处于旋转状态的氯化钙水溶液通过磁力搅拌或轴转实现;
上述注射器的针头内径为50μm-500μm;
上述挤压的速度为2.0mm/s-20.0mm/s;
其中步骤3)中,所述浸泡时间为2-30min,所述浸泡时间具体为10min;
上述含有凝血酶的溶液为将凝血酶与所述细胞培养液B混合,得到含有凝血酶的溶液,所述含有凝血酶的溶液在所述凝血酶溶液中的浓度为30U/ml;
在上述D)所示的方法中,
其中步骤1)中,所述海藻酸钠、水、纤维蛋白原、离体细胞A、细胞培养液A的配比为0.01g-0.1g∶1ml∶0.01g-0.1g∶(1.0-50.0)×106个∶1ml;
上述离体细胞A为离体心肌细胞;
其中步骤2)中,所述氯化钙水溶液的浓度为0.01g/ml-0.1g/ml;
在该方法中,所述挤压采用注射器,所述挤压的方式为连续挤压,所述氯化钙水溶液为处于旋转状态的氯化钙水溶液;
上述处于旋转状态的氯化钙水溶液通过磁力搅拌或轴转实现;
上述注射器的针头内径为50μm-500μm;
上述挤压的速度为2.0mm/s-20.0mm/s;
其中步骤3)中,所述浸泡时间为3-10min,所述浸泡时间具体为5min;所述含有凝血酶的溶液为将凝血酶与所述细胞培养液B混合,得到含有凝血酶的溶液,所述含有凝血酶的溶液在所述凝血酶溶液中的浓度为30U/ml;
其中步骤4)中,所述含有离体细胞B的悬浮液为将离体细胞B与细胞培养液A混合得到,所述离体细胞在所述含有离体细胞B的悬浮液中的浓度为(1.0-50.0)×106个/ml;
上述浸泡时间为3h-12h;上述浸泡的温度为37℃;
上述离体细胞B具体为离体内皮细胞;
由上述的方法得到的水凝胶纤维丝也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种组织工程纤维束结构体。
本发明提供的组织工程纤维束结构体,包括若干所述的含有细胞组分的水凝胶纤维丝,所述若干水凝胶纤维丝之间间隙连接且形成微通道。
上述若干条外包裹内皮细胞的水凝胶纤维丝之间的间隙连接且形成有内皮细胞内衬微通道。
上述若干条水凝胶纤维丝定向排列;
上述微通道的方向与所述水凝胶纤维丝的方向平行,此处微通道的方向为主要方向。
本发明的第三个目的是提供一种制备组织工程纤维束结构体方法。
本发明提供的制备组织工程纤维束结构体方法,包括如下步骤:将所述水凝胶纤维丝进行裁切与堆垛,得到组织工程纤维束结构体。
上述的纤维丝直径可以达到很小,具体为30-500μm,可组装成为纤维束结构体,组装方式可以是随意式、定向式、交叉式或其他特殊编织方式。
该水凝胶纤维丝或该组织工程纤维束结构体在构建组织工程移植物、病理研究和/或药物筛选中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明,本发明与现有技术相比,具有以下优点及突出性效果:
第一、本发明提供一种组织工程纤维束结构体,由内含细胞的水凝胶纤维丝组合而成,与天然组织中的定向排列纤维束结构类似,达到很好的仿生效果,纤维丝的直径可以到达为150-200μm或更小,很好地适应氧扩散距离限制,即100-150μm;
第二、本发明采用新型的“自下而上”构建思路,细胞直接复合到纤维丝中,种植密度可以控制,有效解决了组织工程结构体内部细胞种植的困难,进一步改变纤维丝内外细胞的种类可以做出不同的单元体,从而实现多种细胞的复杂组装;
第三、所述的纤维丝采用可快速或瞬时交联的水凝胶材料,具有良好生物相容性,其中纤维蛋白具有很好的生物性能,一方面可以对细胞的生长与分泌起到一定调控作用,更有利于ECM重构,另一方面作为天然血管修复的基质材料,在凝血酶和生长因子等作用下可以有效向血管成分发展转化;
第四、本发明提供一种心肌纤维束的新型构建工艺方法,成形过程迅速,纤维丝成形后呈缠绕状,便于收集与转移,通过有序组装着实可行地构建出心肌特殊的定向有序结构,并且已有研究表明,这种纤维束结构或纤维丝编织结构具有良好的力学强度和透析性;
第五、在结构体内,纤维丝之间存在大量间隙构成了微通道,并且可以形成内皮细胞内衬,传质效果良好,与天然微血管的尺寸结构相似。
本设计可以综合满足组织工程中的细胞高密度复合、良好血管化发展趋势和实现定向有序结构的特殊仿生要求。因此本发明的纤维束结构体具有很好的血管化发展前景,很有希望突破组织工程目前“无法做大做厚”的发展瓶颈。
附图说明
图1为组织工程纤维束结构体构建示意图
其中,a.整体图;b.横截面剖视图;1.纤维丝;2.水凝胶材料;3.内嵌丝内的细胞成分;4.间隙微通道;5.表面改性涂层;6.外包裹细胞成分层。
图2为心肌纤维束的组装成形工艺流程图
图3为水凝胶纤维丝制备工艺原理图
其中,a.侧视图;b.俯视放大图;1.注射器(内装成形材料);2.针头;3.纤维丝;4.成形容器;5.交联液;6.转子;7.磁搅拌仪;8.转子;9.纤维丝。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
如图1所示,本发明的组织工程纤维束结构体,包括多条按下述方法制备的水凝胶纤维丝1,所述多条水凝胶纤维丝间隙连接且形成微通道4。所述多条水凝胶纤维丝定向排列;所述微通道的方向与所述纤维丝的方向平行。
所述水凝胶纤维丝内复合细胞组分3,所述水凝胶纤维丝外表面复合所述细胞组分6;所述水凝胶纤维丝还涂覆改性涂层5。
如图2和图3所示,首先将细胞成分均匀混合在可快速或瞬时交联的水凝胶材料之中,制备成设定浓度的溶胶状混合物,充分混合后装入注射器1中,在安装到成形装置中的挤压器上,注射器推杆在滑块上牢固装夹,针头2处于交联液5液面之上,投影点偏离旋转中心点,不接触交联液;另一方面,制备与成形水凝胶材料相对应的交联液,使用前进行高温高压灭菌处理,成形时取适量装入成形容器4中,并打开磁搅拌仪7,使转子6搅拌起来,产生旋转流场,液面形状为抛物线;接下来连续挤压出丝的运动过程为,先推动整个注射器沿导孔向下运动直到针筒部分卡住,这时针头插入交联液中一定深度,此后继续推动注射器推杆下压,材料被连续挤出,挤出后在交联液中瞬时交联固化,成为连续的纤维丝3,其中挤压速度可以根据需要进行改变调整;纤维丝在旋转流场的带动下,沿液流方向盘旋运动,期间还会受到流场的拉伸作用,最后纤维丝将缠绕在转子周围,形成规律有序的形态;然后把纤维丝收集转移到培养液中,有选择性地进行后续处理,例如浸泡凝血酶溶液让纤维丝中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白,或在纤维丝表面涂覆胶改性材料成分和复合上内皮细胞层等;最后,将纤维丝按照一定方式进行裁切与堆垛,组装成具有定向有序结构的三维结构体。
在成形中,挤压后材料会产生膨胀效应,在交联反应后会迅速定型,在流场还会受到拉伸作用,因此纤维丝的直径、均匀度和可连续性等受到三者作用的综合影响,影响成形的工艺参数包括成形材料配比和各自浓度、交联液离子浓度、针头尺寸与形状、挤压速度、搅拌强度等,各参数配合得当才能获得高质量的纤维丝。总体来说,当可交联的材料成分浓度越小,针头内径越小,挤压速度越慢,交联液浓度越大,搅拌强度适当强一些时,交联迅速,膨胀效应得到控制,因此纤维丝的直径越小。进一步地说,当可交联的材料成分浓度小到一定程度时,流场拉伸效应凸显,此时纤维丝直径会小于针头内径;但同时搅拌不能太剧烈,否则流场将变得十分紊乱,成丝质量将大大下降,直径变化幅度很大,无法获得好的均匀性。
以下实施例为制备上述水凝胶纤维丝的方法。
实施例1、基质材料为海藻酸钠/细胞培养液的水凝胶纤维丝的成形构建
1、基质材料为海藻酸钠/细胞培养液的水凝胶纤维丝的成形构建
1)溶液准备
制备0.05g/ml的海藻酸钠水溶液,置于60℃中使其完全溶解,灭菌处理。
制备0.05g/ml的氯化钙水溶液,灭菌处理。
制备细胞培养液A:将胎牛血清、青霉素、链霉素和高糖DEME培养液混合得到,所述胎牛血清在所述细胞培养液中的浓度为10%(体积百分含量),所述青霉素和链霉素在所述细胞培养液中的浓度均为100U/ml。
制备细胞培养液B:高糖DEME培养液,Invitrogen英杰公司Cat.No.12800-017),置于4℃备用。
2)、复合物的获得
将上述制备的步骤1)得到的海藻酸钠水溶液与步骤1)得到的细胞培养液B按照体积比1∶1混合,充分搅匀,得到复合物;
所述海藻酸钠、所述水与所述细胞培养液B的配比为0.05g∶1ml∶1ml。
3)、成形
将步骤2)得到的复合物吸入1ml注射器中,安装到挤压装置上,套上4号针头(对应国际通用标准规格:27G,内径为210μm),取约40ml步骤1)得到的氯化钙水溶液转入100ml烧杯中,放入转子,置于磁搅拌仪凸台的合适位置,打开搅拌,调节强度以产生稳定的旋转流场,启动步进电机,开始挤压运动(挤压速度8mm/s),注射器针头伸入交联液中,材料被连续挤出,迅速交联成纤维丝,在流场带动下呈盘旋状,在转子上缠绕起来,得到水凝胶纤维丝(海藻酸钠/细胞培养液纤维丝,内含细胞培养液B)。
成形结束后,将海藻酸钠/细胞培养液纤维丝转移到细胞培养液A中,进行清洗与存放。
2、检测海藻酸钠/细胞培养液纤维丝
由肉眼所见和通过显微镜观察,海藻酸钠/细胞培养液纤维丝的直径平均为210μm,呈盘旋状,定向排列;说明纤维丝全部位置均在氧的扩散距离之内(具体为100-150μm),内部细胞可以得到充分的营养供给,保证存活;并且纤维丝具有与天然组织中的神经、肌纤维、细胞外基质中的各种纤维等类似的结构,能作为相关组织工程的生物支架或细胞载体。
实施例2、内含心肌细胞外包裹内皮细胞的海藻酸钠水凝胶纤维丝的成形构建
1、内含心肌细胞外包裹内皮细胞的海藻酸钠水凝胶纤维丝的成形构建
1)溶液准备
同实施例1制备2.5%的海藻酸钠水溶液和0.05g/ml的氯化钙水溶液。
制备心肌细胞悬浮液,离体心肌细胞从处死的新生乳鼠(购自北京大学医学部实验动物中心,Sprague-Dawley大鼠)上提取,细胞培养液A培养,置于37℃二氧化碳培养箱中备用。使用时将长满心肌细胞的75cm2细胞培养瓶中的细胞培养液吸除,加入2ml细胞消化液后轻轻摇晃使其铺满瓶底后迅速吸除消化液,而后加入新的4ml消化液,静置2-10min,将其置于倒置光学显微镜下观察,待细胞变圆后再加入4ml消化终止液,轻轻吹打至细胞脱壁悬浮。将瓶内液体转移至15ml离心管中,在180g的速度下离心5min。小心吸除离心管内上层清液,以避免管底部细胞浮起,再加入适量细胞培养液A,轻轻吹打使其与细胞均匀混合,制备成细胞密度约为5×106个/ml的心肌细胞悬浮液。
制备内皮细胞悬浮液,购买原代人脐带内皮细胞(购自Cascade Biologic),培养传代至第4代使用,使用时将长满内皮细胞的75cm2细胞培养瓶中的细胞培养液A吸除,加入2ml细胞消化液后轻轻摇晃使其铺满瓶底后迅速吸除消化液,而后加入新的4ml消化液,静置2-10min,将其置于倒置光学显微镜下观察,待细胞变圆后再加入4ml消化终止液,轻轻吹打至细胞脱壁悬浮。将瓶内液体转移至15ml离心管中,在180g的速度下离心5min。小心吸除离心管内上层清液,以避免管底部细胞浮起,再加入适量细胞培养液A,轻轻吹打使其与细胞均匀混合,制备成细胞密度约为5×106个/ml的内皮细胞悬浮液。
2)、复合物的获得
将步骤1)得到的海藻酸钠水溶液和心肌细胞悬浮液体积比为1∶1混匀,得到复合物;
所述海藻酸钠、水、离体心肌细胞、细胞培养液A的配比为0.05g∶1ml∶5×106个∶1ml。
3)、成形
将步骤2)得到的复合物吸入1ml注射器中,安装到挤压装置上,套上4号针头(对应国际通用标准规格:27G,内径为210μm)。取约40ml步骤1)得到的氯化钙水溶液转入100ml烧杯中,放入转子,置于磁搅拌仪凸台的合适位置,打开搅拌,调节以产生稳定的旋转流场,启动步进电机,开始挤压运动(挤压速度为8mm/s),注射器针头伸入交联液中,材料被连续挤出,迅速交联成纤维丝,在流场带动下呈盘旋状,在转子上缠绕起来,得到成形纤维丝(内含心肌细胞)。
4)外包裹细胞组分
将步骤3)得到的成形纤维丝用PBS溶液(配方:4gNaCl、1.042gNa2HPO4·12H2O、0.1gKCl和0.1gKH2PO4溶于500ml高纯水配置而成,pH≈7)清洗成形纤维丝3次,再转移到步骤1)得到的内皮细胞悬浮液中浸泡,置于细胞培养箱中37℃浸泡3h,得到水凝胶纤维丝(内含心肌细胞和表面裹有内皮细胞的海藻酸钠水凝胶纤维丝)。
悬浮的内皮细胞会贴附在纤维丝表面上,生长增殖,最后在纤维丝表面形成一层内皮细胞层。
2、检测外包裹内皮细胞的海藻酸钠水凝胶纤维丝
1)纤维丝直径检测
由肉眼所见和通过显微镜观察外包裹内皮细胞的海藻酸钠水凝胶纤维丝,纤维丝直径平均为210μm,呈盘旋状,定向排列;
2)外包裹内皮细胞检测
将上述获得的水凝胶纤维丝(外包裹内皮细胞的海藻酸钠水凝胶纤维丝)体外静态培养3-5天后(温度37℃),进行免疫荧光检测(检测内皮细胞的特征蛋白连接蛋白Cx43),在荧光显微镜下,纤连蛋白呈绿色荧光,可观察到纤维丝表面覆盖着一层内皮细胞,细胞之间彼此连接,将纤维丝表面划分成众多板块状的小区域。
3)细胞存活率检测
A:内含心肌细胞存活情况通过AO-PI荧光染色检测,检测在步骤4)之前进行。具体过程如下:在避光条件下,先用PBS配置储存液AO吖啶橙(670μmol/L,约0.3mg/mL)和PI(750μmol/L,约0.5mg/mL),于4℃暗处保存;使用时将0.01mL AO与1mL PI混合,再稀释10倍,0.22μm滤膜过滤,成为工作液;用PBS清洗上述1的步骤3)得到的成形纤维丝(内含心肌细胞),吸除液体;加入工作液,置于37℃培养箱中静置10min,取出后PBS多次清洗;最后在荧光显微镜下观察,活细胞被AO染成绿色荧光,死细胞被PI染成红色荧光。检测结果表明,纤维丝成形过程没有对细胞造成严重的损伤,心肌细胞存活率平均约为90%,在培养过程中细胞能够继续存活,存活率并无出现大幅降低情况。
B:外包裹内皮细胞存活率检测
方法如下:
(1)步骤2)中用细胞培养液A替代心肌细胞悬浮液,制备不含有心肌细胞的纤维丝,方法同上述1,不同的是不加入心肌细胞,得到外包裹内皮细胞纤维丝;
(2)将上述获得的外包裹内皮细胞纤维丝按照上述A所示的方法检测,结果为内皮细胞的存活率约为95%。
说明海藻酸钠水凝胶纤维丝表面可复合上内皮细胞,当纤维丝组装在一起时,形成的间隙通道将有内皮细胞内衬,与天然微血管结构类似。
实施例3、基质材料为海藻酸钠/纤维蛋白的水凝胶纤维丝的成形构建
1、基质材料为海藻酸钠/纤维蛋白的水凝胶纤维丝的成形构建
1)溶液准备
同实施例1制备5%(0.05g/ml)的海藻酸钠水溶液和0.05g/ml的氯化钙水溶液。
制备5%的纤维蛋白原溶液:将纤维蛋白原(购自Sigma公司,产品编号F8630)溶于的DEME高糖培养液中,置于37℃中使其完全溶解。
制备30U/ml凝血酶溶液:以DEME高糖培养液配置凝血酶(购自Sigma公司,产品编号T4648)溶液,浓度为30U/ml,置于4℃中备用。
制备细胞培养液A:将胎牛血清、青霉素、链霉素和高糖DEME培养液混合得到,所述胎牛血清在所述细胞培养液中的浓度为10%(体积百分含量),所述青霉素和链霉素在所述细胞培养液中的浓度均为100U/ml。
2)、复合物的获得
将上述制备的步骤1)得到的海藻酸钠水溶液与纤维蛋白原溶液按照体积比1∶1混合,充分搅匀,得到复合物;
所述海藻酸钠、水、纤维蛋白原、细胞培养液A的配比为0.05g∶1ml∶0.05g∶1ml;
3)、成形
将步骤2)得到的复合物吸入1ml注射器中,安装到挤压装置上,套上4号针头(对应国际通用标准规格:27G内径为210μm)。取约40ml步骤1)得到的氯化钙水溶液转入100ml烧杯中,放入转子,置于磁搅拌仪凸台的合适位置,打开搅拌,调节以产生稳定的旋转流场,启动步进电机,开始挤压运动(挤压速度8mm/s),注射器针头伸入交联液中,材料被连续挤出,迅速交联成纤维丝,在流场带动下呈盘旋状,在转子上缠绕起来,得到成形纤维丝。
4)再次交联
成形结束后,将步骤3)得到的成形纤维丝转移到步骤1)得到的凝血酶溶液中浸泡5min,纤维蛋白原在催化作用下转化成纤维蛋白,得到的水凝胶纤维丝(海藻酸钠/纤维蛋白纤维丝,内含细胞培养液B),然后转移到细胞培养液A中,进行清洗与存放。
2、检测海藻酸钠/纤维蛋白纤维丝
由肉眼所见和通过显微镜观察,海藻酸钠/纤维蛋白纤维丝的直径平均为210μm,呈盘旋状,定向排列,微观结构包括薄片状的海藻酸钠和纤维丝状的纤维蛋白。说明纤维丝全部位置均在氧的扩散距离之内(具体为100-150μm),内部细胞可以得到充分的营养供给,保证存活;并且纤维丝具有与天然组织中的神经、肌纤维、细胞外基质中的各种纤维等类似的结构,能作为相关组织工程的生物支架或细胞载体。
实施例4、含心肌细胞的海藻酸钠/纤维蛋白水凝胶纤维丝的成形构建
1、含心肌细胞的海藻酸钠/纤维蛋白水凝胶纤维丝的成形构建
1)溶液准备
同实施例1制备5%的海藻酸钠水溶液和0.05g/ml的氯化钙水溶液。
同实施例2制备5%的纤维蛋白原溶液和30U/ml的凝血酶溶液。
制备内皮细胞悬浮液,购买原代人脐带内皮细胞(购自Cascade Biologic),培养传代至第4代使用,使用时将长满内皮细胞的75cm2细胞培养瓶中的细胞培养液A吸除,加入2ml细胞消化液后轻轻摇晃使其铺满瓶底后迅速吸除消化液,而后加入新的4ml消化液,静置2-10min,将其置于倒置光学显微镜下观察,待细胞变圆后再加入4ml消化终止液,轻轻吹打至细胞脱壁悬浮。将瓶内液体转移至15ml离心管中,在180g的速度下离心5min。小心吸除离心管内上层清液,以避免管底部细胞浮起,再加入适量细胞培养液A,轻轻吹打使其与细胞均匀混合,制备成细胞密度约为5×106个/ml的内皮细胞悬浮液。
制备细胞培养液A:将胎牛血清、青霉素、链霉素和高糖DEME培养液混合得到,所述胎牛血清在所述细胞培养液中的浓度为10%(体积百分含量),所述青霉素和链霉素在所述细胞培养液中的浓度均为100U/ml。
2)、复合物的获得
A、准备心肌细胞-纤维蛋白原悬浮液
离体心肌细胞从处死新生乳鼠(购自北京大学医学部实验动物中心,Sprague-Dawley大鼠)上提取,细胞培养液A培养,置于37℃二氧化碳培养箱中备用。使用时将长满心肌细胞的75cm2细胞培养瓶中的细胞培养液吸除,加入2ml细胞消化液后轻轻摇晃使其铺满瓶底后迅速吸除消化液,而后加入新的4ml消化液,静置2-10min,将其置于倒置光学显微镜下观察,待细胞变圆后再加入4ml消化终止液,轻轻吹打至细胞脱壁悬浮。将瓶内液体转移至15ml离心管中,在180g的速度下离心5min。小心吸除离心管内上层清液,以避免管底部细胞浮起,再加入适量步骤1)得到的5%的纤维蛋白原溶液,轻轻吹打使其与细胞均匀混合,制备成细胞密度约为5×106个/ml的心肌细胞-纤维蛋白原悬浮液。
B、复合物的获得
将步骤1)得到的海藻酸钠水溶液与步骤A得到的心肌细胞-纤维蛋白原悬浮液按照体积比1∶1混合,迅速搅匀后,得到复合物;
所述海藻酸钠、水、纤维蛋白原、心肌细胞、细胞培养液A的配比为0.05g∶1ml∶0.05g∶5×106个∶1ml;
3)、成形
将步骤2)得到的复合物吸入1ml注射器中,安装到挤压装置上,套上4号针头(对应国际通用标准规格:27G内径为210nm)。取约40ml步骤1)得到的氯化钙水溶液转入100ml烧杯中,放入转子,置于磁搅拌仪凸台的合适位置,打开搅拌,调节以产生稳定的旋转流场,启动步进电机,开始挤压运动(挤压速度8mm/s),注射器针头伸入交联液中,材料被连续挤出,迅速交联成纤维丝,在流场带动下呈盘旋状,在转子上缠绕起来,得到成形纤维丝。
4)再次交联
成形结束后,将步骤3)得到的成形纤维丝转移到步骤1)得到的凝血酶溶液中浸泡5min,纤维蛋白原在催化作用下转化成纤维蛋白,得到再次交联水凝胶纤维丝。
5)外包裹细胞组分
将步骤4)得到的再次交联水凝胶纤维丝用PBS溶液(配方:4gNaCl、1.042gNa2HPO4·12H2O、0.1gKCl和0.1gKH2PO4溶于500ml高纯水配置而成,pH≈7)清洗成形纤维丝3次,再转移到上述得到的内皮细胞悬浮液中浸泡,置于细胞培养箱中37℃浸泡3h,得到水凝胶纤维丝(内含心肌细胞和表面裹有内皮细胞的海藻酸钠/纤维蛋白水凝胶纤维丝)
悬浮的内皮细胞会贴附在纤维丝表面上,生长增殖,最后在纤维丝表面形成一层内皮细胞层。
2、检测含心肌细胞的海藻酸钠/纤维蛋白水凝胶纤维丝
1)内径检测
将步骤1得到的含心肌细胞的海藻酸钠/纤维蛋白水凝胶纤维丝转移到细胞培养液A中进行体外静态培养。宏观形态方面,由肉眼所见和通过显微镜观察,纤维丝直径平均为210μm,呈盘旋状,定向排列。
2)外包裹内皮细胞检测
将外包裹内皮细胞的海藻酸钠水凝胶纤维丝体外静态培养3-5天后(温度37℃),进行免疫荧光检测(检测内皮细胞的特征蛋白连接蛋白Cx43),在荧光显微镜下,纤连蛋白呈绿色荧光,可观察到纤维丝表面覆盖着一层内皮细胞,细胞之间彼此连接,将纤维丝表面划分成众多板块状的小区域。
3)细胞存活率检测
A:内含心肌细胞存活情况通过AO-PI荧光染色检测,检测在步骤4)之前进行。具体过程如下:在避光条件下,先用PBS配置储存液AO吖啶橙(670μmol/L,约0.3mg/mL)和PI(750μmol/L,约0.5mg/mL),于4℃暗处保存;使用时将0.01mL A0与1mL PI混合,再稀释10倍,0.22μm滤膜过滤,成为工作液;用PBS清洗上述1的步骤4)得到的再次交联水凝胶纤维丝,吸除液体;加入工作液,置于37℃培养箱中静置10min,取出后PBS多次清洗;最后在荧光显微镜下观察,活细胞被AO染成绿色荧光,死细胞被PI染成红色荧光。检测结果表明,纤维丝成形过程没有对细胞造成严重的损伤,心肌细胞存活率平均约为90%,在培养过程中细胞能够继续存活,存活率并无出现大幅降低情况。
B:外包裹内皮细胞存活率检测
方法如下:
(1)步骤2)中用细胞培养液A替代心肌细胞悬浮液,制备不含有心肌细胞的纤维丝,方法同上述1,不同的是不加入心肌细胞,得到外包裹内皮细胞纤维丝;
(2)将上述获得的外包裹内皮细胞纤维丝按照上述A所示的方法检测,结果为内皮细胞的存活率平均为95%。
说明海藻酸钠水凝胶纤维丝表面可复合上内皮细胞,当纤维丝组装在一起时,形成的间隙通道将有内皮细胞内衬,与天然微血管结构类似。
实施例5、水凝胶纤维丝有序组装成三维的纤维束结构体
将上述实施例1得到的水凝胶纤维丝成形后,将线圈状的水凝胶纤维丝从培养液中取出,置于干净的玻璃片上,用镊子工具将纤维丝沿一定方向铺开,用医用棉花或轻轻吸干,直至纤维丝处于约15-20%的润湿状态,再用刀片将纤维丝裁切成约1cm的微段,以这些微丝为组装单元进行堆砌,对堆成的纤维束结构体轻轻压实,得到三维的纤维束结构体。将得到的三维的纤维束结构体转移到体外培养环境中,或装入相应的生物反应器中,进行进一步的培养。
观察看出得到的结构体是直径在210μm左右的由水凝胶纤维丝组成的纤维丝束,同时纤维丝之间存在大量间隙构成了有内皮细胞内衬的贯通微通道,观察可得微通道的等效直径平均为25μm,这与天然微血管的尺寸十分接近。
从上述可以看出,本发明的三维结构体由纤维丝组合而成,材料组成含有纤维蛋白,是具有良好性能的生物水凝胶材料,与细胞外基质类似,生物相容性优越,并且利用ECM重构和血管化。发明采用的纤维束结构,具有较好的力学性能,
因此,本发明的纤维束结构体可以实现很好的灌流,保证内部的氧与营养物质的传输供给,解决以往技术构建的组织工程结构体大小无法做大,结构体内细胞存活层无法做厚的难题。
Claims (10)
1.一种制备水凝胶纤维丝的方法,包括如下步骤:先以水凝胶材料为基质与细胞组分复合,得到材料-细胞复合物,再将所述材料-细胞复合物成形为丝状结构并在所述水凝胶材料对应的交联剂中交联固化,即得到水凝胶纤维丝。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
所述水凝胶材料和所述水凝胶材料对应的交联剂为如下1)或2):
1)、所述水凝胶材料为海藻酸钠,其对应的所述交联剂为含二价阳离子的盐溶液,所述含二价阳离子的盐溶液具体为氯化钙水溶液;
2)、所述水凝胶材料为海藻酸钠和如下3种中的至少一种:纤维蛋白原、壳聚糖和胶原;所述纤维蛋白原对应的交联剂为凝血酶;
所述细胞组分为如下3种组分中的至少一种:离体细胞A、细胞培养液和生长因子。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:
在所述再将复合物在所述水凝胶材料对应的交联剂中交联的步骤后还包括将所述交联得到的产物外包裹离体细胞B或涂覆改性材料的步骤;
所述将所述交联得到的产物外包裹离体细胞B具体为将所述交联得到的产物浸泡在含有所述离体细胞B的悬浮液中;
所述改性材料为胶原蛋白、层连蛋白或纤连蛋白;
所述离体细胞A和所述离体细胞B为同一种或者不同种;
所述离体细胞A具体为离体的功能细胞,所述离体的功能细胞具体为离体心肌细胞、离体肝细胞、离体神经细胞、离体成纤维细胞或离体C2C12细胞;
所述离体细胞B具体为离体内皮细胞;
所述细胞培养液为细胞培养液A或细胞培养液B;
所述细胞培养液B为高糖细胞培养液或普通细胞培养液,所述高糖细胞培养液具体为DEME高糖培养液,所述普通细胞培养液具体为DEME培养液;
所述细胞培养液A按照如下方法制备:将胎牛血清、青霉素、链霉素和所述细胞培养液B混合得到,所述胎牛血清在所述细胞培养液A中的浓度为10%(体积百分含量),所述青霉素和链霉素在所述细胞培养液A中的浓度均为100U/ml。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于:
所述方法为如下A)-D)中任一一种:
A)所示的方法包括如下步骤:
1)将海藻酸钠、水、所述细胞培养液B混匀,得到复合物,
2)将步骤1)得到的所述复合物挤压成丝状并置于氯化钙水溶液中交联,得到成形纤维丝,即得到水凝胶纤维丝;
B)所示的方法包括如下步骤:
1)将海藻酸钠、水、所述离体细胞A、所述细胞培养液A混匀,得到复合物,
2)将步骤1)得到的所述复合物挤压成丝状并置于氯化钙水溶液中交联,得到成形纤维丝,
3)将步骤2)得到的成形纤维丝浸泡在含有离体细胞B的悬浮液中,得到水凝胶纤维丝;
C)所示的方法包括如下步骤:
1)将海藻酸钠、水、纤维蛋白原、所述细胞培养液B混匀,得到复合物,
2)将步骤1)得到的所述复合物挤压成丝状并置于氯化钙水溶液中交联,得到成形纤维丝,
3)将步骤2)得到的成形纤维丝浸泡在含有凝血酶的溶液中,得到水凝胶纤维丝;
D)所示的方法包括如下步骤:
1)将海藻酸钠、水、纤维蛋白原、离体细胞A、所述细胞培养液A混匀,得到复合物,
2)将步骤1)得到的所述复合物挤压成丝状并置于氯化钙水溶液中交联,得到成形纤维丝,
3)将步骤2)得到的成形纤维丝浸泡在含有凝血酶的溶液中,得到再次交联纤维丝;
4)将步骤3)得到的再次交联纤维丝浸泡在含有离体细胞B的悬浮液中,得到水凝胶纤维丝。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于:
A)所示的方法中,
步骤1)中,
所述海藻酸钠、所述水与所述细胞培养液B的配比为0.01g-0.1g∶1ml∶1ml;
B所示的方法中,
步骤1)中,所述海藻酸钠、水、离体细胞A、所述细胞培养液A的配比为0.01g-0.1g∶1ml∶(1.0-50.0)×106个∶1ml;
所述离体细胞A为离体心肌细胞;
步骤3)中,所述含有离体细胞B的悬浮液为将所述离体细胞B与所述细胞培养液A混合得到,所述离体细胞在所述含有离体细胞B的悬浮液中的浓度为(1.0-50.0)×106个/ml;
所述浸泡时间为3h-10h;所述浸泡的温度为37℃;
所述离体细胞B具体为离体内皮细胞;
C)所示的方法中,
步骤1)中,所述海藻酸钠、水、纤维蛋白原、所述细胞培养液B的配比为0.01g-0.1g∶1ml∶0.01g-0.1g∶1ml;
步骤3)中,所述浸泡时间为2-30min,所述浸泡时间具体为10min;
所述含有凝血酶的溶液为将凝血酶与所述细胞培养液B混合,得到含有凝血酶的溶液,所述含有凝血酶的溶液在所述凝血酶溶液中的浓度为30U/ml;
D)所示的方法中,
步骤1)中,所述海藻酸钠、水、纤维蛋白原、离体细胞A、细胞培养液A的配比为0.01g-0.1g∶1ml∶0.01g-0.1g∶(1.0-50.0)×106个∶1ml;
所述离体细胞A为离体心肌细胞;
步骤3)中,所述浸泡时间为3min-10min,所述浸泡时间具体为5min;所述含有凝血酶的溶液为将凝血酶与所述细胞培养液B混合,得到含有凝血酶的溶液,所述含有凝血酶的溶液在所述凝血酶溶液中的浓度为30U/ml;
步骤4)中,所述含有离体细胞B的悬浮液为将离体细胞B与细胞培养液A混合得到,所述离体细胞在所述含有离体细胞B的悬浮液中的浓度为(1.0-50.0)×106个/ml;
所述浸泡时间为3h-12h;所述浸泡的温度为37℃;
所述离体细胞B具体为离体内皮细胞;
A-D所示的方法中,所有的所述步骤2)中,所述氯化钙水溶液的浓度为0.01g/ml-0.1g/ml;
所述挤压采用注射器,所述挤压的方式为连续挤压,所述氯化钙水溶液为处于旋转状态的氯化钙水溶液;
所述注射器的针头内径为50μm-500μm;
所述挤压的速度为2.0mm/s-20.0mm/s。
6.权利要求1-5中任一所述的方法得到的水凝胶纤维丝。
7.一种组织工程纤维束结构体,包括若干条权利要求6所述水凝胶纤维丝,所述若干条水凝胶纤维丝之间的间隙连接且形成微通道。
8.根据权利要求7所述的纤维束结构体,其特征在于:
所述若干条水凝胶纤维丝定向排列;
所述微通道的方向与所述水凝胶纤维丝的方向平行。
9.一种制备组织工程纤维束结构体的方法,包括如下步骤:将权利要求6所述的水凝胶纤维丝进行裁切与堆垛,得到组织工程纤维束结构体。
10.权利要求6所述的水凝胶纤维丝或权利要求8所述的组织工程纤维束结构体在构建组织工程移植物、病理研究和/或药物筛选中的应用。
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