CN106237383B - 一种功能胶原微丝及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种功能胶原微丝及其制备方法与应用，制备方法包括如下步骤：将胶原微丝和功能活性分子结合，使功能活性分子负载在所述胶原微丝上，得到功能胶原微丝。该制备方法简单，功能活性分子的选择范围广泛，能精确控制功能活性分子的释放行为，将所述功能胶原微丝用于3D生物打印中，可构建类似活体的细胞生存所需的三维空间构架，并通过生长因子促进细胞的生长和分化，有效引导组织再生。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种功能胶原微丝及其制备方法与应用。
背景技术
细胞生存微环境是一个非常复杂的开放体系，其内部和环境之间进行着复杂的物质、能量和信息的传输和交换。体内的特殊物理环境使全部细胞都处于三维空间结构之中，为组织细胞的三维生长提供了极为有利的条件，从而使其接受来自周围的立体信号。目前大量研究证实细胞生长在三维纳米纤维框架内。细胞通过粘着斑与细胞外基质信息互动，细胞粘附在细胞外基质内，纳米纤维的弹性模量及纤维分布对细胞骨架组装、细胞黏着斑组装及细胞分化、增殖有直接影响。
三维环境不仅为细胞的生存提供空间构架，而且提供了一系列物理、化学、生物等信号。细胞在这个环境中与周围的细胞外基质、其它细胞相互作用，接受各种信号，指导其增殖、分化或迁移等行为。如何体外构建细胞培养的三维微环境，并在此基础上实现一定程度的体外组织重建，对细胞的基础研究和应用研究都具有极其重要的意义。但是，目前细胞研究因缺乏能够高效实现细胞微环境三维重建的途径而难以更有效深入地开展。例如，干细胞在二维平面上的行为与其在真实的三维干细胞生存环境中存在较大差异。干细胞在体内的自我更新和定向分化受到周围微环境的精确调控。这种微环境包括干细胞的物理环境、化学环境以及三维空间内细胞之间的联系等，其中各种生长因子等调控因素的分布呈现梯度。但是，现有的研究设备无法提供高效的细胞三维重建技术。通过基于细胞二维培养展开的研究，干细胞科学家无法有效获得真实的干细胞分化及调控信息，严重阻碍了干细胞基础研究及其临床应用进展。
3D生物打印技术是一种与细胞相容性高且功能多样的三维制造技术。该技术可利用细胞、生物分子与软硬材料来建构一个与组织器官相仿的三维结构材料，使组织工程在类似活体(in vivo)的环境中实现。3D生物打印技术可以更真实地反映组织工程构建过程中的细胞行为、相互作用及分化过程。例如，根据血管的组织解剖知识，理论上3D生物打印技术可以准确地复制出与天然血管结构相似的小口径组织工程化人工血管，该技术可以数字化地控制血管支架的强度、细胞的数量及种植的密度、层次等。
作为组织工程中关键的功能调控活性分子之一，生长因子是细胞分泌的、具有诱导和刺激细胞增殖、维持细胞存活等生物效应的水溶性蛋白质，对细胞增殖、组织或器官的修复和再生都具有重要的促进作用。例如，许多生长因子均具有促进血管形成的能力，包括血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)、血小板衍生生长因子(Platelet-Derived GrowthFactor,PDGF)等。其中，VEGF是调节血管新生的最重要的细胞因子，它是作用于血管内皮细胞的特异性促有丝分裂剂。在胚胎发育的血管发生(vasculogenesis)和组织损伤修复的血管形成(angiogenesis)中，VEGF都发挥重要作用，可促进血管内皮细胞的存活、迁移和增殖。在四肢缺血及心脏缺血治疗过程中，VEGF可促进内皮细胞的存活迁移，促进血管生成和侧支循环的建立，改善缺血区血供。
一般来讲，生长因子在水中及室温环境下很容易失去活性，因此直接使用生长因子会因为环境因素而失活，达不到预期的生物效应。将药物控释技术引入组织工程，即由适宜的生物材料负载各种生长因子，在准确的时间和部位按一定剂量向种子细胞持续释放，从而促进细胞的生长和分化，能有效引导组织再生。
以凝胶负载生长因子的方法为例，Lee等(Kuen Yong Lee,Martin C.Peters,DavidJ.Mooney.Comparison of vascular endothelial growth factor and basicfibroblast growth factor on angiogenesis in SCID mice.Journal of ControlledRelease,2003,87,49-56.)将不同量的血管内皮生长因子(VEGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)加入海藻酸钠的溶液中，搅拌均匀后加入硫酸钙水溶液中，由于Ca2+与海藻酸盐中带有负电的羧酸基团发生离子间相互作用使体系凝胶化，得到负载生长因子的水凝胶支架。
上述凝胶法负载并释放生长因子的缺点在于：
1.生长因子的负载量无法控制。在生长因子负载过程中，仅通过改变生长因子的加入量来调控其负载量，由于生长因子的可溶性，无法准确控制凝胶形成过程中生长因子的负载量。生长因子负载量过少会无法获得特定的生物效应，而负载量过多可能会引起细胞生长失控、组织畸形、甚至肿瘤生成等不良后果。
2.破坏生长因子的活性。水凝胶形成过程中Ca2+浓度，交联度等因素可能影响生长因子分子上的活性位点，导致其活性降低。
3.无法精确控制生长因子的释放行为。由于海藻酸盐水凝胶的降解速率缓慢且难以控制，而生长因子与海藻酸钠分子之间不存在特殊的相互作用，因此，生长因子的释放行为由水凝胶的交联度和分子扩散作用决定。然而这两种决定因素无法精确控制，造成生长因子的释放行为无法精确调控，降低生长因子的时效性。
发明内容
本发明的目的是提供一种功能胶原微丝及其制备方法。
本发明所提供的功能胶原微丝的制备方法，包括如下步骤：将胶原微丝和功能活性分子结合，使功能活性分子负载在所述胶原微丝上，得到功能胶原微丝。
上述制备方法中，所述结合通过共价键、静电作用、氢键、范德华力、疏水作用和分子特异性识别作用中的至少一种来实现。
所述功能活性分子为生长因子。
所述生长因子选自成纤维细胞生长因子、转化生长因子、骨形成蛋白、血管内皮生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、胰岛素、血小板衍生生长因子和类胰岛素生长因子中的至少一种。
所述结合通过分子特异性识别作用来实现时，方法如下：先将所述胶原微丝通过EDC/NHS反应结和中间分子，再通过中间分子特异性识别并结合所述功能活性分子，得到所述功能胶原微丝。
所述中间分子能够与所述功能活性分子特异性识别并结合，如：所述中间分子为肝素分子，特异性识别并结合成纤维细胞生长因子；所述中间分子为硫酸软骨素分子，特异性识别并结合转化生长因子。
所述结合通过共价键、静电作用、氢键、范德华力或疏水作用来实现时，方法如下：将所述胶原微丝分散在所述功能活性分子的水溶液中，负载所述功能活性分子，得到所述功能胶原微丝，其中，所述胶原微丝的长度25-75μm，直径为0.5-2μm，其中，所述功能活性分子的水溶液的浓度为50-300ng/mL；所述分散的时间为1-2h。
如：所述功能活性分子为血管内皮生长因子时，使其通过静电作用、氢键和范德华力中的至少一种结合方式而负载于所述胶原微丝上；
所述功能活性分子为血小板衍生生长因子时，使其通过静电作用、氢键和范德华力中的至少一种结合方式而负载于所述胶原微丝上。
上述制备方法中，所述胶原微丝是通过对胶原原材料进行粉碎处理后而收集得到。
所述胶原原材料为冻干胶原材料，其中，所述冻干胶原材料的制备方法如下：将离体的牛皮肤，剥离真皮，在体积分数为1-4％的SDS溶液中处理24-72h，用体积分数为1-8％的Triton处理24-72h；再用含有0.5-1.5mol/L NaCl的25-100mmol/L、pH为7.6-8.5的Tris-HCl缓冲液处理24-72h，用去离子水清洗后，冻干得到冻干胶原材料；
所述粉碎处理通过粉碎机进行处理，所述粉碎机的的转速为10000～40000r/min；
所述收集胶原微丝按如下步骤进行：将粉碎处理后所得胶原微丝粗产品分散在水中，得到悬浊液；将所得悬浊液通过不同网孔的尼龙过滤网筛选含有特定尺寸的胶原微丝的悬浊液；对所得到的含有特定尺寸的胶原微丝的悬浊液进行离心，得到沉淀物，并对沉淀物冻干，得到特定尺寸的胶原微丝，其中，所述尼龙过滤网的网孔为14～1250目；所述胶原微丝粗产品和水的质量比为1：(5-20)。
上述步骤中，还包括将所得到的沉淀物重新分散在水中，得到悬浊液，并对悬浊液进行离心，如此重复至少三次，得到清洗后的沉淀物的步骤；
所述冻干的冷阱温度为-30--40℃，时间为24-48h；
上述步骤中，还包括对所述胶原微丝进行杀菌处理的步骤，步骤如下：将所述胶原微丝在8-16KGy射线下辐照12-24h，进行杀菌处理；
所述胶原微丝的长度为10～1000μm，直径为0.5-2μm。
本发明所制备得到的功能胶原微丝也属于本发明的保护范围。
此外，本发明所制备得到的功能胶原微丝在3D生物打印技术中的应用亦属于本发明的保护范围。
本发明通过胶原微丝的制备和胶原微丝的功能化两个步骤制备得到功能胶原微丝，根据功能调控需要负载相应的功能活性分子。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)制备工艺简单：通过简单的高速粉碎和过滤网筛选即可制备符合3D生物打印技术要求的胶原微丝，将功能活性分子与胶原微丝结合即可制备功能调控单位，根据功能调控需要应用于3D生物打印技术中。
2)功能活性分子的选择范围广泛：胶原分子含有-OH、-COOH、-NH2等活性基团，同时含有许多分子间相互作用位点，功能活性分子只要可以和这些活性基团或活性位点结合，都可以负载在胶原微丝上。
3)精确控制功能活性分子的释放行为：3D生物打印过程中，功能活性分子结合的胶原微丝通过打印技术精确定位，功能活性分子的含量通过功能胶原微丝的用量进行调控。负载于胶原微丝表面的功能活性分子，除扩散作用外，分子间结合作用直接影响其释放行为，因此功能活性分子的释放行为可以精确控制。
4)功能胶原微丝中引入的功能活性分子，如生长因子，可以避免生长因子无法定量负载、无法控制释放、释放浓度不稳定等问题。
5)将功能胶原微丝用于3D生物打印中，可构建类似活体的细胞生存所需的三维空间构架，并通过生长因子促进细胞的生长和分化，有效引导组织再生。
附图说明
图1为实施例1中3D生物打印过程的示意图及3D生物打印过程中的功能胶原微丝。
图2为实施例1中通过高速粉碎和过滤网筛选制备的胶原微丝的形貌图：a)为显微镜下观察的胶原微丝，b)为胶原微丝的长度分布曲线；c)为扫描电子显微镜下观察的胶原微丝。
图3为实施例1中负载BMP的胶原微丝及其控制释放功能：a)为荧光显微镜下观察的功能胶原微丝；b)为BMP和CBD-BMP2在胶原微丝上的释放行为。
图4为实施例1中负载BMP的胶原微丝及其中活细胞染色情况：a)为显微镜下观察的干细胞和功能胶原微丝；b)为支架中活细胞染色情况。
图5为实施例1中3D生物打印支架材料中干细胞分化为骨细胞情况，a)为ALP染色；b)为茜素红染色；c)为不同微环境下细胞分泌Ca2+浓度情况；d)为不同微环境下细胞分泌ALP浓度情况。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所用含有胶原结合位点的骨形成蛋白(Collagen BandingDomain-Bone Morphogenetic Protein 2，CBD-BMP2)制备方法如下：
1)常规培养，将表达骨形成蛋白的菌株(参考专利：活化胶原蛋白支架材料及其专用融合活性修复因子，申请号为：200510132792.9，申请日为2005年12月26日)用1mM IPTG诱导4h，8000rpm，4℃收集菌体，并用PBS洗涤2次；
2)超声破碎后，4℃，离心20min，收集沉淀(包含体)；
3)将包含体(即步骤2)中的沉淀)溶于8M尿素，接着进行稀释复性；
4)将复性后的蛋白样品用肝素柱进行纯化，冻干，最终得到纯化的蛋白，即含有胶原结合位点的骨形成蛋白。
下述实施例中，所用含有胶原结合位点的血管内皮生长因子(Collagen BandingDomain/Vascular Endothelial Growth Factor，CBD-VEGF)制备方法如下：
1)常规培养，将表达血管内皮生长因子的菌株(参考专利：与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子及其应用，申请号为200810222219.0，申请日为2008年09月11日)1mMIPTG诱导4h，8000rpm，4℃收集菌体，并用PBS洗涤3次；
2)超声破碎后，4℃，离心20min，收集沉淀(包含体)；
3)将包含体(即步骤2)中的沉淀)溶于8M尿素，接着进行稀释复性；
4)将复性后的蛋白样品用Ni柱进行纯化，冻干，最终得到纯化的蛋白，即含有胶原结合位点的血管内皮生长因子。
实例1、制备功能胶原微丝及其在3D生物打印中的应用：
(一)制备功能胶原微丝：
1)制备胶原微丝：
a)将10g冻干胶原材料用碎纸机剪切成厘米尺寸的胶原碎片；
b)将胶原碎片通过转速为20000r/min高速粉碎机进一步粉碎成胶原微丝粗产品，粉粹时间为50s；
c)将胶原微丝粗产品按质量比为1：10充分分散在100g水中，形成悬浊液；
d)根据3D生物打印中打印针头的规格(27G，内径210μm)，将胶原微丝悬浊液依次通过100目(150μm)、200目(75μm)、400目(38μm)的尼龙过滤网筛选含有38μm胶原微丝的悬浊液；
e)离心悬浊液收集38μm胶原微丝；
f)加水重新分散38μm胶原微丝；
g)重复e-f步骤三次清洗胶原微丝；
h)冻干38μm胶原微丝；
i)将38μm胶原微丝通过Co60射线在8KGy下照射24h，进行杀菌处理，以便用于3D生物打印中。
制备的用于3D生物打印技术的胶原微丝见图2，由图2可知，胶原微丝的长度为22.31±12.69μm，直径为0.5μm，可以通过27G的打印针头。
2)制备功能胶原微丝：将步骤1)中得到的长度为38μm、直径为0.5μm的胶原微丝分散在100ng/mL的骨形成蛋白2(Bone Morphogenetic Protein 2，BMP2)(购自欣博盛生物科技有限公司)或含有胶原结合位点的骨形成蛋白(Collagen Banding Domain-BoneMorphogenetic Protein 2，CBD-BMP2，本实验室自制)水溶液中2h负载具有分化功能活性分子。因分子间相互作用(静电作用、氢键、范德华力)，具有分化功能活性分子BMP2或CBD-BMP2可以结合胶原分子，最终得到功能胶原微丝。
负载BMP的胶原微丝(即功能胶原微丝)的形貌及其控制释放功能如图3所示，从图3可得知：图3a为功能胶原微丝在荧光显微镜下的形貌，图3b为功能胶原微丝控制释放功能曲线，通过使用human BMP2 ELISA kit(欣博盛生物科技有限公司，EHC172)测得。结果可以看出：胶原微丝可以控制释放BMP或CBD-BMP2，3天后，BMP的释放量为100％，5天后，CBD-BMP2的释放量为50％，释放速度相对较慢，释放曲线相对平缓稳定。
(二)功能胶原微丝在3D生物打印中的应用：
实验组：将功能胶原微丝与含有鼠骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal StemCells,BMSCs)(发明单位原代分离自四周龄SD大鼠，雄性)的10％明胶溶液按照质量比为1：1000混合均匀，按图1中所示的示意图进行3D生物打印。其中，3D生物打印中打印针头的规格为27G(内径210μm)，所得打印的支架在F-12培养基中培养14天，观察干细胞存活情况和干细胞分化为骨细胞情况。3D生物打印的支架材料如图4所示，其中，图4a中观察到干细胞和功能胶原微丝，其中，箭头所指处为干细胞，圆形所指处为功能胶原微丝。图4b中绿色活细胞染色表明：打印过程中细胞存活率为91.79±0.86％。
实验分别使用两个对照组，分别为对照组1：空白F-12培养基样品组和对照组2：含有相应的分化因子样品组。其中，“空白F-12培养基样品组”是仅将含有鼠骨髓间充质干细胞的10％明胶溶液进行3D生物打印，然后在不含分化因子或生长因子的F-12培养基中培养。“含有相应的分化因子样品组”是仅将含有鼠骨髓间充质干细胞的10％明胶溶液进行3D生物打印，然后在骨分化培养基(L-DMEM、10％胎牛血清、100nmol/L地塞米松、10mmol/L甘油磷酸钠、0.05mmol/L L-抗坏血酸-2-磷酸酯，全部购自Sigma)中培养，
3D生物打印支架材料中干细胞分化为骨细胞情况如图5所示，其中，图5a中碱性磷酸脢(Alkaline Phosphatase，ALP)染色细胞呈深蓝色，图5b中茜素红染色细胞呈深红色，图5a和图5b均表明实验组的干细胞已分化为成骨细胞(箭头所指处的细胞)，图5c为不同微环境下细胞分泌Ca2+浓度情况，图5d为不同微环境下细胞分泌ALP浓度情况，图5c和图5d的结果表明，与对照组1和对照组2相比，负载CBD-BMP2的功能胶原微丝可以诱导干细胞向骨细胞分化，并提高干细胞成骨分化的效率。
实施例2、制备功能胶原微丝及其在3D生物打印中的应用：
(一)制备功能胶原微丝：
1)制备胶原微丝：
a)将5g冻干胶原材料用碎纸机剪切成厘米尺寸的胶原碎片；
b)将胶原碎片通过转速为30000r/min高速粉碎机进一步粉碎成尺寸不均匀的胶原微丝粗产品，粉粹时间为60s；
c)将胶原微丝粗产品按质量比为1：100充分分散在100g水中，形成悬浊液；
d)根据3D生物打印中打印针头的规格(30G，内径160μm)，将胶原微丝悬浊液依次通过100目(150μm)、200目(75μm)、400目(38μm)、500目(25μm)的尼龙过滤网筛选含有25μm胶原微丝的悬浊液；
e)离心悬浊液收集25μm胶原微丝；
f)加水重新分散25μm胶原微丝；
g)重复e-f步骤三次清洗胶原微丝；
h)冻干25μm胶原微丝；
i)将25μm胶原微丝通过Co60射线在12KGy下照射18h，进行杀菌处理，以便用于3D生物打印中。
2)制备功能胶原微丝：将步骤1)中得到的25μm、直径为1.5μm的胶原微丝分散在200ng/mL的血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)(购自欣博盛生物科技有限公司)或含有胶原结合位点的血管内皮生长因子(Collagen BandingDomain/Vascular Endothelial Growth Factor，CBD-VEGF)水溶液中1h负载功能活性分子。因分子间相互作用(静电作用、氢键、范德华力)，功能活性分子VEGF或CBD/VEGF可以结合胶原分子。
胶原微丝的尺寸是和打印针头的内径相匹配的，打印过程中，胶原微丝可以通过打印针头进行3D打印，即可将其用于3D生物打印中。
实施例3、制备功能胶原微丝及其在3D生物打印中的应用：
(一)制备功能胶原微丝：
1)制备胶原微丝：
a)将25g冻干胶原材料用碎纸机剪切成厘米尺寸的胶原碎片；
b)将胶原碎片通过转速为10000r/min高速粉碎机进一步粉碎成尺寸不均匀的胶原微丝粗产品，粉粹时间为40s；
c)将胶原微丝粗产品按质量比为1：200充分分散在100g水中，形成悬浊液；
d)根据3D生物打印中打印针头的规格(25G，内径260μm)，将胶原微丝悬浊液依次通过50目(270μm)、100目(150μm)、200目(75μm)的尼龙过滤网筛选含有75μm胶原微丝的悬浊液；
e)离心悬浊液收集75μm胶原微丝；
f)加水重新分散75μm胶原微丝；
g)重复e-f步骤三次清洗胶原微丝；
h)冻干75μm胶原微丝；
i)将75μm胶原微丝通过Co60射线在16KGy下照射12h，进行杀菌处理，以便用于3D生物打印中。
2)制备功能胶原微丝：将步骤1)中得到的75μm、直径为1.0μm的胶原微丝通过EDC/NHS反应结合硫酸软骨素分子(购自Sigma)，硫酸软骨素分子可以特异性结合转化生长因子(Transforming Growth Factor，TGF)，然后将结合硫酸软骨素分子的胶原微丝分散在50ng/mL的TGF水溶液中1h，负载TGF。
胶原微丝的尺寸是和打印针头的内径相匹配的，打印过程中，胶原微丝可以通过打印针头进行3D打印，即可将其用于3D生物打印中。
实施例4、制备功能胶原微丝及其在3D生物打印中的应用：
(一)制备功能胶原微丝：
a)将50g冻干胶原材料用碎纸机剪切成厘米尺寸的胶原碎片；
b)将胶原碎片通过转速为40000r/min高速粉碎机进一步粉碎成尺寸不均匀的胶原微丝粗产品，粉粹时间为40s；
c)将胶原微丝粗产品按质量比为1：20充分分散在100g水中，形成悬浊液；
d)根据3D生物打印中打印针头的规格(32G，内径110μm)，将胶原微丝悬浊液依次通过100目(150μm)、200目(75μm)、400目(38μm)、500目(25μm)的尼龙过滤网筛选含有25μm胶原微丝的悬浊液；
e)离心悬浊液收集25μm胶原微丝；
f)加水重新分散25μm胶原微丝；
g)重复e-f步骤三次清洗胶原微丝；
h)冻干25μm胶原微丝；
i)将25μm胶原微丝通过Co60射线在8KGy下照射24h，进行杀菌处理，以便用于3D生物打印中。
2)制备功能胶原微丝：将步骤1)中得到的25μm、直径为2μm的胶原微丝通过EDC/NHS反应(EDC/NHS激活肝素分子中的-COOH与胶原分子的-NH2反应形成稳定的共价键)结合肝素分子(购自Sigma)，肝素分子可以特异性结合成纤维细胞生长因子(FibroblastGrowth Factor,FGF)，然后将结合肝素分子的胶原微丝分散在300ng/mL的FGF水溶液中2h，负载FGF。
胶原微丝的尺寸是和打印针头的内径相匹配的，打印过程中，胶原微丝可以通过打印针头进行3D打印，即可将其用于3D生物打印中。
实施例5、制备功能胶原微丝及其在3D生物打印中的应用：
(一)制备功能胶原微丝：
a)将100g冻干胶原材料用碎纸机剪切成厘米尺寸的胶原碎片；
b)将胶原碎片通过转速为28000r/min高速粉碎机进一步粉碎成尺寸不均匀的胶原微丝粗产品，粉粹时间为30s；
c)将胶原微丝粗产品按质量比为1：100充分分散在1000g水中，形成悬浊液；
d)根据3D生物打印中打印针头的规格(23G，内径340um)，将胶原微丝悬浊液依次通过50目(270μm)、100目(150μm)、200目(75μm)、400目(38μm)的尼龙过滤网筛选含有38μm胶原微丝的悬浊液；
e)离心悬浊液收集38μm胶原微丝；
f)加水重新分散38μm胶原微丝；
g)重复e-f步骤三次清洗胶原微丝；
h)冻干38μm胶原微丝；
i)将38μm胶原微丝通过Co60射线在12KGy下照射18h，进行杀菌处理，以便用于3D生物打印中。
2)制备功能胶原微丝：将步骤1)中得到的38μm、直径为1.5μm的胶原微丝分散在50ng/mL的血小板衍生生长因子(Platelet-Derived Growth Factor，PDGF)水溶液中1.5h负载功能活性分子。因分子间相互作用(静电作用、氢键、范德华力)，功能活性分子PDGF可以结合胶原分子。
胶原微丝的尺寸是和打印针头的内径相匹配的，打印过程中，胶原微丝可以通过打印针头进行3D打印，即可将其用于3D生物打印中。
Claims (9)
1.一种功能胶原微丝的制备方法，包括如下步骤：将胶原微丝和功能活性分子结合，使功能活性分子负载在所述胶原微丝上，得到功能胶原微丝；
所述胶原微丝是通过对胶原原材料进行粉碎处理后而收集得到；
所述胶原原材料为冻干胶原材料，其中，所述冻干胶原材料的制备方法如下：将离体的牛皮肤，剥离真皮，在体积分数为1-4％的SDS溶液中处理24-72h，用体积分数为1-8％的Triton处理24-72h；再用含有0.5-1.5mol/L NaCl的25-100mmol/L、pH为7.6-8.5的Tris-HCl缓冲液处理24-72h，用去离子水清洗后，冻干得到冻干胶原材料；
所述粉碎处理通过粉碎机进行处理，所述粉碎机的转速为10000～40000r/min；
所述收集胶原微丝按如下步骤进行：将粉碎处理后所得胶原微丝粗产品分散在水中，得到悬浊液；将所得悬浊液通过不同网孔的尼龙过滤网筛选含有特定尺寸的胶原微丝的悬浊液；对所得到的含有特定尺寸的胶原微丝的悬浊液进行离心，得到沉淀物，并对沉淀物冻干，得到特定尺寸的胶原微丝；
所述尼龙过滤网的网孔为14～1250目；
所述胶原微丝的长度为10～1000μm，直径为0.5-2μm。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述结合通过共价键、静电作用、氢键、范德华力、疏水作用和分子特异性识别作用中的至少一种来实现；
所述功能活性分子为生长因子；
所述生长因子选自成纤维细胞生长因子、转化生长因子、骨形成蛋白、血管内皮生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、胰岛素、血小板衍生生长因子和类胰岛素生长因子中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述结合通过分子特异性识别作用来实现时，方法如下：先将所述胶原微丝通过EDC/NHS反应结和中间分子，再通过中间分子特异性识别并结合所述功能活性分子，得到所述功能胶原微丝；
所述中间分子能够与所述功能活性分子特异性识别并结合。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述中间分子为肝素分子，特异性识别并结合成纤维细胞生长因子；
或，所述中间分子为硫酸软骨素分子，特异性识别并结合转化生长因子。
5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述结合通过共价键、静电作用、氢键、范德华力或疏水作用来实现时，方法如下：将所述胶原微丝分散在所述功能活性分子的水溶液中，负载所述功能活性分子，得到所述功能胶原微丝，其中，所述胶原微丝的长度25-75μm，直径为0.5-2μm。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述功能活性分子的水溶液的浓度为50-300ng/mL；
所述分散的时间为1-2h；
所述功能活性分子为血管内皮生长因子时，使其通过静电作用、氢键和范德华力中的至少一种结合方式而负载于所述胶原微丝上；
所述功能活性分子为血小板衍生生长因子时，使其通过静电作用、氢键和范德华力中的至少一种结合方式而负载于所述胶原微丝上。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述胶原微丝粗产品和水的质量比为1：(5-20)；
所述收集胶原微丝的步骤中，还包括将所得到的沉淀物重新分散在水中，得到悬浊液，并对悬浊液进行离心，如此重复至少三次，得到清洗后的沉淀物的步骤；
所述冻干的冷阱温度为-30--40℃，时间为24-48h；
所述收集胶原微丝的步骤中，还包括对所述胶原微丝进行杀菌处理的步骤，步骤如下：将所述胶原微丝在8-16KGy射线下辐照12-24h，进行杀菌处理。
8.权利要求1-7中任一项所述的制备方法而得到的功能胶原微丝。
9.权利要求8所述的功能胶原微丝在3D生物打印技术中的应用。
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