CN101962409A - 胶原材料与生长因子的交联物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶原材料与生长因子的交联物及其制备方法。该方法包括如下步骤:将胶原材料与2-亚氨基硫烷盐酸盐交联,得到交联物I;将生长因子与sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate交联,得到交联物II;将所述交联物I与所述交联物II混合,反应,得到胶原材料与生长因子交联物。实验表明,本发明通过化学交联的方法将生长因子交联到胶原材料上,有效的提高了胶原材料的表面活性,能明显的提高胶原材料细胞化和血管化的程度,使胶原材料能更为有效的应用于组织工程等医学领域。因此,本发明交联物及其制备方法在组织工程等领域将有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及胶原材料与生长因子的交联物及其制备方法。
背景技术
骨胶原,即脱钙骨基质(Demineral bone matrix,DBM),是一种生物支架材料,其由于具有较高的孔径率、良好的机械可塑性和机械耐受性、生物可降解性和良好的生物相容性,目前已经被广泛应用于骨损伤修复等组织修复。但在大面积组织修复中,仅仅用DBM是不够的,所以一般将其与生长因子结合,来增强DBM的表面活性,促进DBM本身的细胞化和血管化,实现组织修复和重建。
血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)是一种多功能性生长因子,它通过结合细胞膜上的受体蛋白,促进其磷酸化进行信号传递,发挥其生物学功能。PDGF-BB是一种趋化性生长因子,它可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移和分化,募集壁细胞,从而促进植入材料的血管化。还有研究表明,PDGF-BB可以促进碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的表达,而bFGF是一种促进血管发生的生长因子,从而进一步促进材料在体内的血管化。然而用传统的方法将PDGF-BB直接注射到体内或者涂抹到伤口上,不仅使PDGF-BB的作用效果大大降低,而且PDGF-BB还有可能会通过血液循环运输到其它组织,引起副作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备可用于组织修复的交联物的方法,具体是制备胶原材料与生长因子交联物的方法。
本发明所提供的制备胶原材料与生长因子交联物的方法,可包括如下步骤:将胶原材料与2-亚氨基硫烷盐酸盐交联,得到交联物I;将生长因子与sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate交联,得到交联物II;将所述交联物I与所述交联物II混合,反应,得到胶原材料与生长因子交联物。
本发明方法中,所述将胶原材料与2-亚氨基硫烷盐酸盐交联的方法可包括如下步骤:将所述胶原材料置于所述2-亚氨基硫烷盐酸盐的溶液中,在20-30℃的温度下浸泡;所述温度具体可为25℃。
上述制备交联物I过程中,所述浸泡的时间可1.5-2.5小时,具体可2小时。
上述制备交联物I过程中,所述胶原材料与2-亚氨基硫烷盐酸盐的投料配比为0.2-0.7μmol 2-亚氨基硫烷盐酸盐/16mm2的胶原材料;所述投料配比具体可为0.4μmol 2-亚氨基硫烷盐酸盐/16mm2的胶原材料。
本发明方法中,所述将生长因子与sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate交联的方法包括如下步骤:将所述生长因子溶液与所述sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate的溶液混合,在20-30℃的温度下反应;所述温度具体可为25℃。
上述制备交联物II过程中,所述反应的时间为0.5-1小时,具体可为0.5小时。
上述制备交联物II过程中,所述生长因子与sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate的投料摩尔比为1∶(40-80);具体可为1∶50。
本发明方法中,所述将所述交联物I与所述交联物II混合,反应中,所述反应的温度为20-30℃,具体可为25℃。
上述交联物I与交联物II混合反应过程中,所述反应的时间为40分钟-1.5小时,具体可为1小时。
上述任一过程中,所述胶原材料可以为含有伯氨基的、能进行骨组织修复的胶原,如胶原凝胶、脱钙骨基质、胶原膜、胶原海绵,其中较佳的为脱钙骨基质。
上述任一过程中,所述生长因子可为含有伯氨基、但所含的伯氨基不在生长因子的活性部位或者在活性部位但是交联后不影响生长因子活性、任何促进血管生成的生长因子,如碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、内皮细胞生长因子,其中较佳的为血小板源性生长因子。
由上述任一所述方法得到的胶原材料与生长因子交联物也属于本发明的保护范围。
本发明是通过化学交联的方法直接将血小板源性生长因子(PDGF-BB)共价交联到脱钙骨基质(DBM)上,选用的化学交联剂是sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC)和2-亚氨基硫烷盐酸盐(Traut’s Reagent))。Sulfo-SMCC是一种异双功能交联剂,在分子的两端分别含有一个反应的官能团,即羟基琥珀酰亚胺基(N-hydroxysuccinimideester group,NHS)和马来酰亚胺基(maleimide group)。NHS可以和伯氨基(-NH2)反应,而马来酰亚胺基可以和巯基(-SH)反应,这样Sulfo-SMCC就可以将含有伯氨基(-NH2)和巯基(-SH)的两个分子共价交联在一起。Traut’s Reagent是一种环形的交联剂,能与伯氨基(-NH2)发生化合反应,同时释放出巯基(-SH2),从而向目标分子上添加巯基(-SH2)。
本发明的胶原材料与生长因子交联物是通过交联剂Traut’s Reagent和Sulfo-SMCC将胶原材料与生长因子进行化学交联实现的。实验证明,在相同的实验条件下,与直接交联方法相比,本发明方法能使更多的生长因子结合到胶原材料上上,实验还表明相同条件下脱钙骨基质比胶原凝胶更易结合生长因子。
体外细胞增殖实验证明,化学交联组得到的成纤维细胞的数量明显比直接交联组和对照组多,说明化学交联有PDGF-BB的胶原材料的促进成纤维细胞增殖的活性明显增强。体内血管化实验证明,与直接交联组(PDGF-DBM)和空白对照组(DBM)相比,化学交联组(PDGF-C-DBM)的细胞化程度、血管密度和血管化程度均显著提高;包埋第7天时,化学交联组、直接交联组、对照组每个视野内形成的血管数目依次为30.00±5.19、20.10±2.52、15.29±1.50;第14天时,化学交联组、直接交联组、对照组每个视野内形成的血管数目依次为32.40±5.36、20.13±3.48、13.03±3.16。
综合上述实验结果,表明通过化学交联的方法(即本发明方法)将生长因子交联到胶原材料上,有效的提高了胶原材料的表面活性,能明显的提高胶原材料细胞化和血管化的程度,使胶原材料能更为有效的应用于组织工程等医学领域。因此,本发明交联物及其制备方法在组织工程等领域将有广阔的应用前景。
附图说明
图1为脱钙骨基质与血小板源性生长因子的交联物的制备过程图。
图2为胶原凝胶和DBM吸附PDGF-BB的量。
图3显示的是各个处理组成纤维细胞增殖的情况。
图4为包埋7天后体内细胞化和血管化的结果。
图5为包埋14天后体内细胞化和血管化的结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
脱钙骨基质(DBM)购自山东正海生物技术公司,Sulfo-SMCC和Traut’sReagent购自Sigma公司。成纤维细胞购自上海翔升生物科技有限公司。
血小板源性生长因子(PDGF-BB)的构建方法:将编码PDGF-BB的基因(Genbank号为CU013138.1)连接于pET28a(+)表达载体,使其与his-tag标签融合,在E.coli菌株BL21(DE3)系统中进行诱导表达,所得菌体低温离心收集,经超声破碎后低温高速离心,弃上清,收集包涵体沉淀。洗涤溶解包涵体,将得到的溶于8M尿素的包涵体蛋白进行复性,并经Ni层析柱(GE公司,美国)进行纯化,得到PDGF-BB。
实施例1、脱钙骨基质与血小板源性生长因子的交联物的制备与活性检测
一、交联物的制备
DBM的准备:将DBM切成4mm×4mm×1mm的小块,然后放在96孔板内,辐射灭菌。然后将无菌的DBM放在含有4mM 乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲液(PBS,pH 8.0)中浸泡过夜。
1、化学交联制备DBM与血小板源性生长因子的交联物
化学交联制备方法如图1所示,1表示DBM,2表示2-亚氨基硫烷盐酸盐,3表示2-亚氨基硫烷盐酸盐修饰的DBM;I表示PDGF-BB,II表示sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC),III表示PDGF-SMCC;IV表示脱钙骨基质与血小板源性生长因子的交联物。
(1)2-亚氨基硫烷盐酸盐修饰的DBM的制备:用PBS缓冲液(pH值8.0,EDTA4mM)37.5倍稀释2-亚氨基硫烷盐酸盐(即Traut’s Reagent),得到2-亚氨基硫烷盐酸盐工作溶液(其中,2-亚氨基硫烷盐酸盐的浓度为0.365mg/mL);然后将DBM置于2-亚氨基硫烷盐酸盐工作溶液中,室温(25℃)浸泡2小时(DBM与2-亚氨基硫烷盐酸盐的投料比为0.4μmol 2-亚氨基硫烷盐酸盐/16mm2DBM),得到2-亚氨基硫烷盐酸盐修饰的DBM,然后用PBS缓冲液(pH 7.2,EDTA 4mM)清洗。
(2)PDGF-SMCC的制备:用4mL的PBS缓冲液(pH 7.2,EDTA 4mM)溶解2mg的sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC),60℃溶解5分钟,然后将其加入PDGF-BB溶液中(Sulfo-SMCC与PDGF-BB的投料摩尔比50∶1),室温(25℃)条件下反应0.5小时,生成化合物PDGF-SMCC。
(3)将2-亚氨基硫烷盐酸盐修饰的DBM分别放入96孔板中(每孔中1块2-亚氨基硫烷盐酸盐修饰的DBM),然后将PDGF-SMCC 100μL加入到该96孔板中(其中,每孔中PDGF-BB的量分别为:0-24μg不等),室温(25℃)反应1个小时。PBS缓冲液(pH值7.2,EDTA 4mM)冲洗。加入含有5%(质量百分含量)甘氨酸的PBS(pH 7.2,EDTA 4mM)1小时,以封闭只与2-亚氨基硫烷盐酸盐修饰的DBM参加化学交联反应而未与PDGF-BB发生化学交联反应的Sulfo-SMCC。
得到脱钙骨基质(DBM)与血小板源性生长因子的交联物,其结构示意图如图1中IV所示。
2、直接交联法制备DBM与血小板源性生长因子的交联物
将DBM加到酶标板上,将PDGF-BB直接加到DBM上(每孔中1块DBM,每孔中PDGF-BB的量分别为:0-24μg不等),25℃反应2个小时,PBS缓冲液(pH值7.2,EDTA 4mM)冲洗。加入含有5%(质量百分含量)甘氨酸的PBS(pH 7.2,EDTA4mM)1小时。
3、化学交联法制备胶原凝胶与血小板源性生长因子的交联物
胶原凝胶:采用通用的鼠尾胶原制备方法制备得到。
将胶原凝胶加到酶标板上,150μL/孔,放在超净台内室温过夜,吸去未吸附的胶原凝胶,吹干,然后用PBS缓冲液(pH值8.0,EDTA 4mM)清洗3遍。将稀释好的2-亚氨基硫烷盐酸盐工作液取150μL加入到胶原凝胶上,25℃反应2个小时,然后用PBS缓冲液(pH 7.2,EDTA 4mM)清洗。然后向胶原凝胶上加入100μL PDGF-SMCC溶液(其中,每孔中PDGF-BB的量分别为:0-24μg不等),室温(25℃)反应1个小时。PBS缓冲液(pH值7.2,EDTA 4mM)冲洗。加入含有5%(质量百分含量)甘氨酸的PBS(pH 7.2,EDTA 4mM)1小时。PDGF-SMCC按照本实施例中实验1(2)中所述方法制备得到。
4、直接交联法制备胶原凝胶与血小板源性生长因子的交联物
将胶原凝胶加到酶标板上,150μL/孔,放在超净台内室温过夜,吸去未吸附的胶原凝胶,吹干,然后将PDGF-BB直接加到胶原凝胶上(其中,每孔中PDGF-BB的量分别为:0-24μg不等),25℃反应2个小时,PBS缓冲液(pH值7.2,EDTA 4mM)冲洗。加入含有5%(质量百分含量)甘氨酸的PBS(pH 7.2,EDTA 4mM)1小时。
ELISA检测胶原材料上结合的生长因子的量:首先将交联物用200μL BSA(2.5mg/mL)封闭1小时,PBS清洗3遍,然后向材料中加入100μL一抗(用PBS 3000倍稀释)37℃孵育1小时,然后PBS清洗3遍。再向材料上滴加100μL二抗(用PBS 10000倍稀释)37℃孵育1小时,PBS清洗3遍。向材料中滴加200μL2mg/mLp-NPP显色20分钟,然后抽提出80μL有色相转入酶标板中,酶标仪上度数,然后根据标准曲线计算PDGF-BB的结合量。一抗为anti-mouse-his(Aliquots of mouseanti-polyhistidine monoclonal antibody),购自Sigma-Aldrich公司;二抗为anti-mouse-IgG(Sheep anti-mouse-alkaline phosphatase antibody),购自Sigma-Aldrich公司。
实验设3次重复。
结果如图2所示。A为胶原凝胶与PDGF-BB的交联结果,其中1表示胶原凝胶与PDGF-BB化学交联的结果,2表示胶原凝胶与PDGF-BB直接交联的结果;B为DBM与PDGF-BB的交联结果,其中1表示DBM与PDGF-BB化学交联的结果,2表示DBM与PDGF-BB直接交联的结果。
结果表明,在相同的实验条件下,对于DBM,用化学交联法交联上的生长因子的量要明显高于直接交联法;同样,在相同条件下,对于胶原凝胶,用化学交联法交联上的生长因子的量要明显高于直接交联法;例如当PDGF-BB的加入量是11和22μg时,DBM化学交联组对PDGF-BB的吸附量分别是0.32±0.02μg和0.37±0.02μg,DBM直接交联组(即自然吸附组)的吸附量仅仅为0.13±0.02μg和0.15±0.02μg,胶原凝胶化学交联组对PDGF-BB的吸附量分别是0.119±0.007μg和0.128±0.008μg,胶原凝胶自然吸附组的吸附量仅仅为0.046±0.008μg和0.053±0.004μg。相同条件下,DBM比胶原凝胶结合的PDGF-BB要多,是它的2.89倍。
二、交联物活性检测
(一)体外活性实验
PDGF-BB有促进成纤维细胞增殖的活性,所以选择成纤维细胞去检测发生交联反应后胶原凝胶的表面活性。
实验设3个处理:
化学交联组(PDGF-C-collagen+成纤维细胞):按照实验一中实验3所示方法制备得到胶原凝胶与血小板源性生长因子的交联物(对应每孔中PDGF-BB的量为22μg组的交联物);将培养好的成纤维细胞加入上述交联物的孔中,培养3天。将培养好的细胞用FDA染色,然后在显微镜下观察计数,根据成纤维细胞的数量来确定PDGF-BB的活性。
直接交联组(自然吸附组)(PDGF-collagen+成纤维细胞):按照实验一中实验4所示方法制备得到胶原凝胶与血小板源性生长因子的交联物(对应每孔中PDGF-BB的量为22μg组的交联物);将培养好的成纤维细胞加入上述交联物的孔中,培养3天。将培养好的细胞用FDA染色,然后在显微镜下观察计数,根据成纤维细胞的数量来确定PDGF-BB的活性。
对照组(胶原凝胶+成纤维细胞):将胶原凝胶加到酶标板上,150μL/孔,放在超净台内25℃过夜,吸去未吸附的胶原凝胶,吹干;将培养好的成纤维细胞加入上述孔中,培养3天。将培养好的细胞用FDA染色,然后在显微镜下观察计数,根据成纤维细胞的数量来确定PDGF-BB的活性。
实验设3次重复,结果如图3所示(1表示对照组,2表示直接交联组,3表示化学交联组),化学交联组、直接交联组和对照组每平方毫米内形成的细胞数目依次为181.2±16.4、117.1±16.8、84.5±5.7。表明,化学交联组的成纤维细胞的数量明显比直接交联组和对照组多,说明化学交联有PDGF-BB的胶原凝胶的促进成纤维细胞增殖的活性明显增强。
(二)体内活性实验
由于细胞化和血管化是组织再生和修复的重要特征,而且PDGF-BB有促进材料细胞化和血管化的作用,所以通过观察材料内细胞迁移的情况和血管的数量来定性和定量检测PDGF-BB修饰的DBM的生物学活性。
实验设以下3组:
将包埋材料分成以下3组:
DBM对照组(DBM):DBM大小4mm×4mm×1mm;
DBM直接交联组(PDGF-DBM):用实验一中实验2中所述方法制备得到与PDGF-BB直接交联的DBM;DBM大小4mm×4mm×1mm;
DBM化学交联组(PDGF-C-DBM):用实验一中实验1所述方法制备得到与PDGF-BB化学交联的DBM。DBM大小4mm×4mm×1mm;
将上述包埋材料分别包埋到大鼠皮下,在包埋后第7天和14天分别取出材料(包埋当天计作第1天),做石蜡切片,经过H.E.染色观察材料的细胞化和血管化程度,然后通过免疫组织化学染色,定量分析材料血管化程度,计算血管数目。
血管数目的计算方法如下:在显微镜视野下,每张切片随机拍10张400×的图片,然后对图片上的血管量进行计数,统计分析。
实验设3次重复,结果如图4和图5所示。图4表示包埋7天后包埋材料的细胞化和血管化结果,图5表示包埋14天后包埋材料的细胞化和血管化结果。(图4和图5中,1表示DBM对照组,2表示DBM直接交联组,3表示DBM化学交联组)。
H.E.染色结果(图4A和图5A)表明,化学交联组(PDGF-C-DBM)的细胞化程度明显的比直接交联组(PDGF-DBM)和空白对照组(DBM)要高。
免疫组织化学染色的结果(图4B和图5B)表明,化学交联组(PDGF-C-DBM)的血管密度也要比其它的两个处理组高。
统计结果(图4C和图5C)显示,与直接交联组(PDGF-DBM)和空白对照组(DBM)相比,化学交联组中DBM的血管化程度显著性提高。第7天时,化学交联组、直接交联组、对照组每个视野内形成的毛细血管数目依次为30.00±5.19、20.10±2.52、15.29±1.50;第14天时,化学交联组、直接交联组、对照组每个视野内形成的血管数目依次为32.40±5.36、20.13±3.48、13.03±3.16。
综合上述实验结果,表明通过化学交联的方法将PDGF-BB交联到DBM,有效的提高了DBM的表面活性,能明显的提高DBM细胞化和血管化的程度,使DBM能更为有效的应用于组织工程等医学领域。
实施例2、脱钙骨基质与血小板源性生长因子的交联物的制备与活性检测
一、制备
DBM的准备:同实施例1中所述一致。
1、化学交联制备DBM与血小板源性生长因子的交联物
(1)2-亚氨基硫烷盐酸盐修饰的DBM的制备:与实施例1中所述方法一致,不同的是浸泡的温度为20℃、时间为1.5小时,DBM与2-亚氨基硫烷盐酸盐的投料比为0.2μmol 2-亚氨基硫烷盐酸盐/16mm2DBM。
(2)PDGF-SMCC的制备:与实施例1中所述方法一致,不同的是反应的温度为20℃、时间为0.7小时,PDGF-BB与Sulfo-SMCC的投料摩尔比1∶40。
(3)2-亚氨基硫烷盐酸盐修饰的DBM与PDGF-SMCC的交联:与实施例1中所述方法一致,不同的是反应的温度为20℃、时间为40分钟。
得到脱钙骨基质(DBM)与血小板源性生长因子的交联物,其结构示意图如图1中IV所示。
2、直接交联法制备DBM与血小板源性生长因子的交联物
实验方法与实施例1中所述方法一致。
3、化学交联法制备胶原凝胶与血小板源性生长因子的交联物
与实施例1中所述方法一致,不同的是:加入2-亚氨基硫烷盐酸盐后的反应温度为20℃、时间为1.5小时,加入PDGF-SMCC后的反应温度为20℃、时间为40分钟,所用的PDGF-SMCC是按照本实施例中实验1(2)中所述方法制备的。
4、直接交联法制备胶原凝胶与血小板源性生长因子的交联物
实验方法与实施例1中所述方法一致。
ELISA检测胶原材料上结合的生长因子的量:方法与实施例1中所述一致。
实验设3次重复。结果与实施例1中所述结果差异不显著。
二、交联物活性检测
(一)体外活性实验
方法与实施例1中所述相同,不同的是所用的交联物均是用本实施例中制备的。
实验设3次重复,结果与实施例1中所述结果差异不显著。
(二)体内活性实验
方法与实施例1中所述相同,不同的是所用的交联物均是用本实施例中制备的。
实验设3次重复,结果与实施例1中所述结果差异不显著。
实施例3、脱钙骨基质与血小板源性生长因子的交联物的制备与活性检测
一、制备
DBM的准备:同实施例1中所述一致。
1、化学交联制备DBM与血小板源性生长因子的交联物
(1)2-亚氨基硫烷盐酸盐修饰的DBM的制备:与实施例1中所述方法一致,不同的是浸泡的温度为30℃、时间为2.5小时,DBM与2-亚氨基硫烷盐酸盐的投料比为0.7μmol 2-亚氨基硫烷盐酸盐/16mm2DBM。
(2)PDGF-SMCC的制备:与实施例1中所述方法一致,不同的是反应的温度为30℃、时间为1小时,PDGF-BB与Sulfo-SMCC的投料摩尔比1∶80。
(3)2-亚氨基硫烷盐酸盐修饰的DBM与PDGF-SMCC的交联:与实施例1中所述方法一致,不同的是反应的温度为30℃、时间为1.5小时。
得到脱钙骨基质(DBM)与血小板源性生长因子的交联物,其结构示意图如图1中IV所示。
2、直接交联法制备DBM与血小板源性生长因子的交联物
实验方法与实施例1中所述方法一致。
3、化学交联法制备胶原凝胶与血小板源性生长因子的交联物
与实施例1中所述方法一致,不同的是:加入2-亚氨基硫烷盐酸盐后的反应温度为30℃、时间为2.5小时,加入PDGF-SMCC后的反应温度为30℃、时间为1.5小时,所用的PDGF-SMCC是按照本实施例中实验1(2)中所述方法制备的。
4、直接交联法制备胶原凝胶与血小板源性生长因子的交联物
实验方法与实施例1中所述方法一致。
ELISA检测胶原材料上结合的生长因子的量:方法与实施例1中所述一致。
实验设3次重复。结果与实施例1中所述结果差异不显著。
二、交联物活性检测
(一)体外活性实验
方法与实施例1中所述相同,不同的是所用的交联物均是用本实施例中制备的。
实验设3次重复,结果与实施例1中所述结果差异不显著。
(二)体内活性实验
方法与实施例1中所述相同,不同的是所用的交联物均是用本实施例中制备的。
实验设3次重复,结果与实施例1中所述结果差异不显著。
Claims (9)
1.一种制备胶原材料与生长因子交联物的方法,包括如下步骤:将胶原材料与2-亚氨基硫烷盐酸盐交联,得到交联物I;将生长因子与sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate交联,得到交联物II;将所述交联物I与所述交联物II混合,反应,得到胶原材料与生长因子交联物。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述将胶原材料与2-亚氨基硫烷盐酸盐交联的方法包括如下步骤:将所述胶原材料置于所述2-亚氨基硫烷盐酸盐的溶液中,在20-30℃的温度下浸泡;所述温度优选为25℃。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述胶原材料与2-亚氨基硫烷盐酸盐的投料配比为0.2-0.7μmol 2-亚氨基硫烷盐酸盐/16mm2的胶原材料;所述投料配比优选为0.4μmol 2-亚氨基硫烷盐酸盐/16mm2的胶原材料。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于:所述将生长因子与sulfosuccinimidyl 4-(N-maieimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate交联的方法包括如下步骤:将所述生长因子溶液与所述sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate的溶液混合,在20-30℃的温度下反应;所述温度优选为25℃。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于:所述生长因子与sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate的投料摩尔比为1∶(40-80);优选为1∶50。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于:所述将所述交联物I与所述交联物II混合,反应中,所述反应的温度为20-30℃,优选为25℃。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于:所述胶原材料为含有伯氨基的、能进行骨组织修复的胶原,优选为胶原凝胶、脱钙骨基质、胶原膜或胶原海绵。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法,其特征在于:所述生长因子为含有伯氨基、但所含的伯氨基不在生长因子的活性部位或者在活性部位但是交联后不影响生长因子活性、促进血管生成的生长因子;优选为碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子或内皮细胞生长因子。
9.由权利要求1-8中任一所述方法得到的胶原材料与生长因子交联物。
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