CN110974974B - 交联人源干细胞因子的胶原蛋白、及其制备方法、在美容和皮肤修复领域的应用 - Google Patents

交联人源干细胞因子的胶原蛋白、及其制备方法、在美容和皮肤修复领域的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了交联人源干细胞因子的胶原蛋白，包括利用具有胶原蛋白亲和性的人源细胞因子与胶原蛋白利用交联剂交联固化得到的胶原蛋白。本发明同时公开了交联人源干细胞因子的胶原蛋白的制备方法和在美容、皮肤修复领域的应用。本发明可促进伤口愈合、改善皮肤质量和皮肤松弛、减少皮肤皱纹和条纹、改善皮肤紧致性、美白肌肤、减少皮肤暗沉和皮肤斑点、祛痘。

Description

交联人源干细胞因子的胶原蛋白、及其制备方法、在美容和皮 肤修复领域的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及交联人源干细胞因子的胶原蛋白、制备方法及其应用。
背景技术
干细胞是一种未分化完全的细胞，具有自我复制，以及分化成多种功能细胞的能力。干细胞因子是干细胞生存微环境中一群重要组成成分，在干细胞治愈人体免疫性疾病治疗，组织创伤修复以及抗衰老过程中被证明起到了重要的作用。不同来源干细胞可分泌不同类群干细胞因子，同种干细胞在不同培养体系中分泌的干细胞因子数量也会不同，如果使用脐带来源间充质干细胞体外培养可获得大量免疫原性低的干细胞因子。干细胞及干细胞因子在许多疾病治疗中证明了其有效性，但依然遇到了许多的临床应用问题，其中很重要的一项便是如何保证干细胞及其分泌的细胞因子在疾病发生部位起作用，而不会在正常部位或非治疗需求部位浪费，影响最终的治疗结果。
因此，开发一种交联人源干细胞因子的胶原蛋白、制备方法及其应用，实现低排异或无排异人源干细胞因子与胶原蛋白材料的规模化生产，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和大规模医疗应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
发明内容
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供交联人源干细胞因子的胶原蛋白、制备方法及其应用，使胶原蛋白具有无免疫排斥或低免疫排斥，修复皮肤创伤等特点。
第一方面，本发明提供了交联人源干细胞因子的胶原蛋白，包括利用具有胶原蛋白亲和性的人源细胞因子与胶原蛋白利用交联剂交联固化得到的胶原蛋白。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述交联人源干细胞因子的胶原蛋白中，人源细胞因子的含量5-15wt％，胶原蛋白的含量为80-150IU/ml。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述具有胶原蛋白亲和性的人源细胞因子从脐带间充质干细胞培养过程获得的人源细胞中提取得到。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述具有胶原蛋白亲和性的人源细胞因子需要用ELISA试剂盒确定因子浓度。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述胶原蛋白包括多种种类的胶原蛋白，优选I-型胶原蛋白。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述交联剂采用2.5wt％的戊二醛。
第二方面，本发明提供了交联人源干细胞因子的胶原蛋白的制备方法包括：
S1、接种、培养脐带间充质干细胞，并收集上清液；
S2、过滤、浓缩上清液，得到干细胞因子，并用ELISA试剂盒确定因子浓度；
S3、将干细胞因子与胶原蛋白进行交联固化。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述步骤S1中，第一步：使用I型胶原蛋白进行包被培养瓶，常温放置2h或4℃过夜；第二步：将干细胞按1-3×104/cm2密度进行接种；第三步：细胞生长融合度在85-90％的时候，收集上清液。
在第一步中，生产不同亲和型胶原蛋白可使用不同胶原蛋白进行包被。
本发明人源细胞因子从脐带间充质干细胞培养过程获得，脐带间充质干细胞具有低免疫排斥性，同时分泌干细胞因子具有创伤修复和免疫调节功能。选取第3至5代间充质干细胞进行培养，这种代次细胞既能维持干细胞的特性，还具有脱离了原始种子细胞的亲缘性。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述步骤S2中，将收集的干细胞培养上清经0.45um的细胞滤器过滤，然后使用超滤法浓缩上清内干细胞因子。根据ELISA试剂盒检测的因子浓度再对干细胞因子用水进行稀释。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述步骤S3中，干细胞因子含量5-15wt％，胶原蛋白的含量为80-150IU/ml,使用2.5％戊二醛4℃度过夜进行交联固化；然后利用2％硼氢化纳浸泡进行脱醛处理，再用去离子水冲洗6次，将清洗后的交联物置于-80℃冰箱中过夜后，于冷冻干燥器中冻干，制备得到交联人源干细胞因子的胶原蛋白。
第三方面，本发明提供了交联人源干细胞因子的胶原蛋白的在美容和皮肤修复领域的应用。
本发明中，作为一种优选的技术方案，在应用中，本发明的交联干细胞因子的胶原蛋白包括化妆品或药物。
本发明中，作为一种优选的技术方案，在应用中，所述化妆品包括冻干粉、美容针、面霜、乳剂等。
由于采用以上技术方案，本发明具有如下有益效果：
本发明得到的交联人源干细胞因子的胶原蛋白使胶原蛋白具有无免疫排斥或低免疫排斥，修复皮肤创伤等特点。
由于如何保证干细胞及其分泌的细胞因子在疾病发生部位起作用，而不会在正常部位或非治疗需求部位浪费，影响最终的治疗结果，本发明通过采用交联胶原蛋白确保干细胞体内研究达到预期效果，而且胶原蛋白本身是一种良好的具有可降解性的细胞培养骨架。胶原蛋白是一种大分子蛋白质，普遍分布于细胞外基质中，胶原蛋白在生物体内不仅仅发挥生物力学的功能，它在截留、贮存、运输细胞因子上也有很大作用，它还充当了生物体细胞信号转导过程中配体的角色，在细胞通讯过程中起重要作用。胶原蛋白是一个庞大的家族，种类繁多，其中I型胶原蛋白由编码α链的COLIA1基因和COLIA2基因表达的，哺乳动物组织中含量最丰富的胶原蛋白，在许多人源干细胞培养中得到了广泛运用。
本发明通过大量反复的实验，采用的人源细胞因子从脐带间充质干细胞培养过程获得，脐带间充质干细胞具有低免疫排斥性，同时分泌干细胞因子具有创伤修复和免疫调节功能。选取第3至5代间充质干细胞进行培养，这种代次细胞既能维持干细胞的特性，还具有脱离了原始种子细胞的亲缘性，从而实现了最终交联人源干细胞因子的胶原蛋白的无免疫排斥或低免疫排斥，这对于交联人源干细胞因子的胶原蛋白应用于皮肤修复领域至关重要。
胶原蛋白是机体自然蛋白，具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。脐带间充质干细胞因子中含有丰富的IL-10、VEGF、HGF、TGF-β等，与胶原蛋白交联后，可促进伤口愈合、改善皮肤质量和皮肤松弛、减少皮肤皱纹和条纹、改善皮肤紧致性、美白肌肤、减少皮肤暗沉和皮肤斑点、祛痘。
附图说明
图1为间充质干细胞流式CD105指标图；
图2为间充质干细胞流式CD34指标图；
图3为间充质干细胞流式Anti-HLA-DR指标图；
图4为间充质干细胞流式CD90指标图；
图5为间充质干细胞流式CD73指标图；
图6为胶原蛋白美容针注射脸部后试验者效果图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
获取具有胶原蛋白亲源性的人源干细胞因子
用胶原蛋白包被细胞培养瓶底部，包被方法：按10mg collagen I、99.167mL H2O、0.833mL 6M HCl进行试剂配制，常温静置3小时候使用0.45um滤器过滤，细胞瓶内铺板浓度0.5ml/cm2，底部自然干燥，包被后的培养瓶或培养板可在4度低温下保存一年时间。
从细胞库中获取P3脐带间充质干细胞，接种在包被胶原蛋白I型的培养瓶中，按1-3×104/cm2进行接种，放入37℃，5％CO2培养箱中培养2-3d，细胞融合度达到85-90％的时候，收集细胞上清。
实施例2
人源干细胞因子浓缩
将收集的干细胞培养上清经0.22μm的滤膜过滤，然后通过分子量为50KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器进行干细胞上清液的浓缩，接着将浓缩液通过分子量为3KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器，收集截留液，即为细胞因子浓缩液。
实施例3
ELISA检测浓缩后的人源干细胞因子浓度
采用ELISA定量试剂盒，分别检测干细胞因子中的SCF、VEGF、IL-10、TGF-β的含量，以TGF-β为例，阐述ELISA试剂盒测定的详细步骤。
(1)使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
(2)根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔、样本均做三次重复。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50uL于反应孔内。
(3)加入稀释好后的标准品50uL于反应孔、加入待测样品50uL于反应孔内。立即加入50uL的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
(4)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。
(5)每孔加入80uL的亲和链霉素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
(6)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。
(7)每孔加入底物A、B各50uL，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟，避免光照。
(8)取出酶标板，迅速加入50uL终止液，加入终止液后应立即测定结果。
(9)在450nm波长处测定各孔OD值。
如图2所示，本发明中检测的TGF-β浓度为500ng/L，VEGF浓度为ng/L，IL-10的浓度为250ng/L，SCF浓度为150ng/L。
实施例4
人源干细胞因子与胶原蛋白交联
原料配比：人源干细胞因子含量10wt％，胶原蛋白的含量为100IU/mL。
交联方法：使用2.5％戊二醛4℃过夜进行交联固化。2％硼氢化纳浸泡进行脱醛处理，再用去离子水冲洗6次，将清洗后的交联物加入冻干保护剂，置于-80℃冰箱中过夜，于冷冻干燥器中冻干，制备得到交联人源干细胞因子的胶原蛋白冻干粉。
实施例5
制备溶媒：将透明质酸、甘油、茶多酚和超纯水在超净台内按比例配置，放入恒温振荡器，振荡10min，振荡均匀后进行分瓶包装，每瓶10mL；溶媒中含有0.5％的透明质酸，3％的甘油，0.1％的茶多酚。
将1瓶交联人源干细胞因子的胶原蛋白冻干粉中加入1瓶溶媒，充分溶解，制作成美容针，用水光针仪器注射到脸部各个部位，以痘痘的形式有效排除脸部的毒素。如图2所示，该试验者由于脸部长期长痘痘，使用了一个疗程，每次注射美容针后，都会排出毒素。而经过一个疗程的注射后，脸部大有改观，不在暗黄，且痘痘的缓解率达到90％，脸色红润。
实施例6
选取50名受试者使用冻干粉，早晚各使用一次，测定4周内的皮肤角质层含水量以及皮肤弹性、皱纹深度、毛孔、色素沉积。测定方法如下：使用韩国恩盛的A-ONE SMART面部诊断系统测量左右脸颊部位皮肤。测定结果为：受试者使用产品4周后，均出现了不同程度的毛孔缩小、皮肤含水量增加、皱纹减少、色斑变淡、皮肤有弹性。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (1)

1.交联人源干细胞因子的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、接种、培养脐带间充质干细胞，并收集上清液；
S2、过滤、浓缩上清液，得到干细胞因子，并用ELISA试剂盒确定因子浓度；
S3、将人源干细胞因子与胶原蛋白进行交联固化；
所述步骤S1的具体操作为用胶原蛋白包被细胞培养瓶底部，包被方法：按10mgcollagen I、99.167mL H2O、0.833mL 6M HCl进行试剂配制，常温静置3小时后使用0.45μm滤器过滤，细胞瓶内铺板浓度0.5mL/cm2 ，底部自然干燥；
从细胞库中获取P3脐带间充质干细胞，接种在包被胶原蛋白I型的培养瓶中，按1-3×104 /cm2 进行接种，放入37℃，5%CO2 培养箱中培养2-3d，细胞融合度达到85-90％的时候，收集细胞上清；
所述步骤S2的具体操作为将收集的干细胞培养上清经0.22μm的滤膜过滤，然后通过分子量为50KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器进行干细胞上清液的浓缩，接着将浓缩液通过分子量为3KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器，收集截留液，即为细胞因子浓缩液；
所述步骤S3中，人源干细胞因子含量10wt％，胶原蛋白的含量为100IU/mL，交联方法为使用2.5%戊二醛4℃过夜进行交联固化；然后利用2%硼氢化纳浸泡进行脱醛处理，再用去离子水冲洗6次，将清洗后的交联物加入冻干保护剂，置于-80℃冰箱中过夜后，于冷冻干燥器中冻干，制备得到交联人源干细胞因子的胶原蛋白。
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