JP2017523775A - 真皮層及び表皮層を含む三次元培養皮膚モデルを製造する方法及びそれにより製造された三次元培養皮膚モデル - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の具体的な実施例により、マウス由来線維芽細胞を用いて真皮層を形成すると、ヒト線維芽細胞を用いた場合より、i)真皮層形成能に優れ、ii)初期供給したコラーゲンが保持されるので真皮層保持能に優れ、iii)表皮層形成速度が速くなることが確認された。これは、マウス由来線維芽細胞を用いると、自然皮膚組織に類似した形態となるだけでなく、三次元培養皮膚モデルを製造するのにかかる時間が短縮されることを示すものである。
ii)表皮層形成能の増加
iii)表皮層分化能の増加
iv)コラーゲン収縮現象の抑制
v)コラーゲン層分解現象の抑制
vi)基質分解酵素(Matrix Metalloproteinase)発現量の減少
vii)細胞シート(cell sheet)形成速度の増加
本発明における「コラーゲン」とは、植物と動物の両方に存在する硬タンパク質であり、動物の骨や皮膚に主に存在するが、軟骨、臓器膜、毛髪などにも分布しており、膠原質とも呼ばれる。コラーゲンは、三重螺旋構造からなるタンパク質であり、三重螺旋構造の両末端には非螺旋構造のテロペプチドを有する。本発明におけるコラーゲンは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットなどに由来するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明におけるコラーゲンは、天然コラーゲンだけでなく、生物工学的変異や生物工学的又は化学的処理が施された変形コラーゲンであってもよいが、由来及び変形の有無により限定されるものではない。
ii)表皮層分化能の増加
iii)基質分解酵素(Matrix Metalloproteinase)発現量の減少
iv)コラーゲン層分解現象の抑制
本発明における「三次元培養皮膚モデル」とは、動物などから収集したものや、得たものでなく、人工的な培養過程により作製した、自然皮膚層に類似した皮膚層モデルを意味する。それを構成する細胞の由来は限定されるものではない。本発明の目的上、本発明の三次元培養皮膚モデルは、コラーゲン及び線維芽細胞からなる真皮層と、ケラチン細胞を含む表皮層とを含むものであれば限定されるものではない。
本発明においては、マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン又は天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせを含む真皮層を用いることにより、該当する細胞シート形成期間を短縮することができる。本発明の具体的な一実施例においては、マウス由来線維芽細胞を用いると、ヒト由来線維芽細胞に比べて、細胞シート形成能に優れることが確認された(図3)。これらの結果から、ヒト由来線維芽細胞を用いて表皮層を作製すると、細胞シートを形成してエアーリフティング(air-lifting)する時点がマウス由来線維芽細胞を用いる場合より遅延し、ケラチン細胞の初期接種細胞数が多量に必要であるため、マウス由来線維芽細胞を用いる本発明のほうが優れることを確認することができる。
本発明による三次元培養皮膚モデルは、ヒトを含む動物の皮膚に関する生理学的、分子生物学的、生化学的研究を行う上で有用である。また、通常皮膚に接触することが期待される物質に対する効能又は毒性検査に用いられる。前記皮膚に接触することが期待される物質とは、医薬品(特に、外用製剤)、化粧品、繊維、洗剤などのあらゆる物質を総称するものであり、代表的には医薬品又は化粧品の効能又は毒性検査に用いられる。また、本発明による三次元培養皮膚モデルは、正常な皮膚状態における効能又は毒性検査だけでなく、化学物質、熱傷、創傷、瘢痕、潰瘍などにより皮膚が損傷した場合の病症モデルとしても用いられる。さらに、本発明による三次元培養皮膚モデルは、動物実験代替用に用いられる。さらに、本発明により製造された三次元培養皮膚モデルは、単なる実験用ではなく、移植及び創傷治療用医薬品としても用いられる。
本発明においては、真皮層と表皮層とを含み、その形態が自然皮膚層に類似するように構成された三次元培養皮膚モデルを製造するために実験を行った。三次元培養皮膚モデルの製造に用いた基本的な材料は次の通りである。
マウス由来線維芽細胞(mouse fibroblast 3T3 cell line)又はヒト由来線維芽細胞(human fibroblast)
ヒトケラチン細胞(Human keratinocytes)
コラーゲン(アテロコラーゲン及び/又は天然コラーゲン)
トランスウェルインサート−6ウェル
三次元培養専用容器
10%FBSを含むDMEM/F12培養液
表皮成長因子(Epidermal Growth Factor, EGF)
上記材料を用いて、真皮層と表皮層とを含む三次元培養皮膚モデルを次の実験により製造した。
2−1.真皮層(Collagen dermis)の作製
マウス由来線維芽細胞3T3細胞又はヒト由来線維芽細胞を2.0mg/mLコラーゲン溶液と10X Reconstruction Buffer(0.2M sodium biocarbonate, 0.2M HEPES, 0.05N NaOH)と混合して細胞数1×105/mlの濃度となるように細胞混合溶液を作製し、その後6ウェル−トランズウェルインサートに細胞混合溶液を2mlずつ添加した。37℃10%CO2インキュベータで一晩(1〜24時間)固化した。
実施例2−1で作製した真皮層上にケラチン細胞を2.5×105ずつ接種して培養した。2日間隔で10ng/mLのEGFを含む培養液に交換し、ケラチン細胞がシート(sheet)を形成するまで37℃の10%CO2インキュベータで約5日〜6日間培養した。ケラチン細胞が真皮層上にシートを形成したら、空気露出(air-lift)のために6ウェルタイプの三次元培養専用容器に移した。その後、10ng/mLのEGFを含む培養液を容器に充填し、次いで前述したように作製した真皮−表皮層を空気に露出させた。
2−3.組織染色(H&E staining)
実施例2−2で作製した真皮−表皮層三次元培養皮膚モデルにおいて、H&E(Hematoxylin & Eosin)組織染色によりその構造を確認した。
その結果、図1から分かるように、マウス由来線維芽細胞を用いた場合、ヒト由来線維芽細胞を用いた場合より真皮層形成が約2倍厚くなり、組織も均一な厚さで安定した皮膚モデルが形成されたことが確認された。ヒト由来線維芽細胞を用いた場合は、初期コラーゲンの厚さが維持されずに分解され、厚さが大幅に薄くなる現象を示す。
実施例2−3で組織染色により確認した組織学的な差異の原因を分析するために、前記マウス由来線維芽細胞又はヒト由来線維芽細胞を用いた三次元培養皮膚モデルの製造時に2日間培養した培養液において、コラーゲンなどを分解する基質分解酵素のうちMMP−1(Matrix Metalloproteinase-1)の発現量を測定した。
その結果、図2から分かるように、ヒト由来線維芽細胞を用いた場合でのみMMP−1(54kDa)の発現が観察され、マウス由来線維芽細胞を用いた場合はMMP−1の発現が観察されなかった。よって、実施例2−3で確認した真皮層の収縮現象は、MMP−1により真皮層のコラーゲンが分解されることによるものであることが確認された。
マウス由来線維芽細胞又はヒト由来線維芽細胞を共培養(co-culture)したケラチン細胞の細胞シート形成能を比較した。具体的には、容器面積58cm2の細胞培養容器に前記マウス由来又はヒト由来線維芽細胞を接種し、その後その上層に1×105のケラチン細胞を接種した。培養11日目にローダミン(rhodamine)溶液で染色して細胞シート形成の有無を確認した。
前述したように、マウス由来線維芽細胞を用いて真皮層を形成すると、ヒト線維芽細胞を用いた場合より、i)真皮層形成能に優れ、ii)表皮層形成能及び分化能に優れ、iii)初期供給したコラーゲンが保持されるので真皮層保持能に優れ、iv)表皮層形成速度が速くなることが確認された。これは、マウス由来線維芽細胞を用いると、自然皮膚組織に類似した形態となるだけでなく、三次元培養皮膚モデルを製造するのにかかる時間が短縮されることを示すものである。
実施例2においては、本発明の三次元培養皮膚モデルを製造する際にマウス由来線維芽細胞を用いることが好ましいことが確認された。本発明者らは、さらに三次元培養皮膚モデル製造を最適化するために、真皮層を形成する他の要素であるコラーゲンを最適化しようと試みた。
コラーゲンとしては、天然コラーゲンと、天然コラーゲンに比べて免疫原性が低いアテロコラーゲンとを用いた。具体的には、アテロコラーゲンのみ用いた実験群1、天然コラーゲンのみ用いた実験群2、及びアテロコラーゲンと天然コラーゲンを1:5の比率で混合して用いた実験群3を作製して比較した。
3−2.コラーゲンの種類に応じたMMP発現量の測定
コラーゲン収縮現象は、一般に基質分解酵素(Matrix Metalloproteinase, MMP)を発現するか否か又は発現量に関連するので、実施例3−1でコラーゲンの種類に応じて作製した実験群1〜3の三次元培養皮膚組織を培養した培養液において、MMP−2とMMP−9の発現量を分析した。それぞれの基質分解酵素の発現量はELISA法を用いて定量分析した。
アテロコラーゲンと天然コラーゲンの混合比率を様々に変えて三次元培養皮膚モデルを製造した。具体的には、アテロコラーゲンと天然コラーゲンの比率を1:1とした実験群A、1:5とした実験群B、及び1:10とした実験群Cを作製した。
Claims (17)
- a)マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン(Native collagen)又は天然コラーゲンとアテロコラーゲン(Atelocollagen)の組み合わせを含む組成物を培養皿に接種して固化させることにより真皮層を作製するステップと、
b)前記a)ステップで作製された真皮層の上層にケラチン細胞を接種して細胞シート(cell sheet)を形成するまで培養するステップと、
c)前記b)ステップで形成された細胞シートを空気中に露出して培養することにより表皮層を形成するステップとを含む、真皮層及び表皮層を含む三次元培養皮膚モデルを製造する方法。 - 前記a)ステップにおいて、天然コラーゲンは、配列番号1のアミノ酸配列で構成されるα1鎖(alpha-1 chain)及び配列番号2のアミノ酸配列で構成されるα2鎖(alpha-2 chain)を含み、アテロコラーゲンは、配列番号3のアミノ酸配列で構成されるα1鎖(alpha-1 chain)及び配列番号4のアミノ酸配列で構成されるα2鎖(alpha-2 chain)を含む請求項1に記載の方法。
- 前記a)ステップにおいて、真皮層は、天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせを含む請求項1に記載の方法。
- 前記天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせは、アテロコラーゲンと天然コラーゲンの組み合わせ比率が1:0.1〜1:20である請求項3に記載の方法。
- 前記マウス由来線維芽細胞を用いて真皮層を形成することにより、ヒト由来線維芽細胞を用いる場合に比べて、次の特性の少なくとも1つを有する請求項1に記載の方法:
i)真皮層形成能の増加
ii)表皮層形成能の増加
iii)表皮層分化能の増加
iv)コラーゲン収縮現象の抑制
v)コラーゲン層分解現象の抑制
v)基質分解酵素(Matrix Metalloproteinase)発現量の減少
vi)細胞シート(cell sheet)形成速度の増加。 - 前記天然コラーゲン又は天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせを用いて真皮層を形成することにより、アテロコラーゲンを単独で用いる場合に比べて、次の特性の少なくとも1つを有する請求項1に記載の方法:
i)コラーゲン収縮現象の抑制
ii)表皮層分化能の増加
iii)基質分解酵素(Matrix Metalloproteinase)発現量の減少
iv)コラーゲン層分解現象の抑制。 - 前記a)ステップにおいて、マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン(Native collagen)又は天然コラーゲンとアテロコラーゲン(Atelocollagen)の組み合わせを含む組成物は、1cm2当たりマウス由来線維芽細胞を1×104〜1×107個含む請求項1に記載の方法。
- 前記a)ステップにおいて、組成物は、線維芽細胞(Fibroblast)、毛乳頭細胞(Dermal Papillar cell)、内皮細胞(Endothelial cell)、脂肪細胞(Adipocyte)及び間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell)からなる群から選択される少なくとも1つの細胞をさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記a)ステップは、1時間〜48時間行うものである請求項1に記載の方法。
- 前記b)ステップは、a)ステップで作製された真皮層1cm2当たり1×104〜1×107個のケラチン細胞を接種するものである請求項1に記載の方法。
- 前記b)ステップにおいて、ケラチン細胞は、皮膚、粘膜、角膜、毛嚢又は上皮組織由来ケラチン細胞である請求項1に記載の方法。
- 前記b)ステップにおいて、ケラチン細胞の接種は、メラニン細胞(Melanocyte)、メルケル細胞(Merkel cell)及びランゲルハンス細胞(Langerhans cell)からなる群から選択される少なくとも1つの細胞の接種をさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記c)ステップは、7日〜21日間行うものである請求項1に記載の方法。
- マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン(Native collagen)又は天然コラーゲンとアテロコラーゲン(Atelocollagen)の組み合わせを含む組成物により作製された真皮層と、ケラチン細胞により形成された表皮層とを含む三次元培養皮膚モデル。
- 前記三次元培養皮膚モデルは、医薬品又は化粧品の毒性及び効能試験に用いられることを特徴とする請求項14に記載の三次元培養皮膚モデル。
- 前記三次元培養皮膚モデルは、動物実験代替用であることを特徴とする請求項14に記載の三次元培養皮膚モデル。
- 前記三次元培養皮膚モデルは、皮膚移植及び創傷治療用であることを特徴とする請求項14に記載の三次元培養皮膚モデル。
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