WO2016006944A1 - 진피층 및 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델을 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 삼차원 배양 피부모델 - Google Patents

진피층 및 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델을 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 삼차원 배양 피부모델 Download PDF

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전세화
김윤희
문현아
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전세화
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Definitions

  • the present invention mouse-derived fibroblasts; Dermal layer and epidermal layer comprising preparing a dermal layer using a composition comprising native collagen or a combination of native collagen and atelocollagen and forming an epidermal layer using keratinocytes. It relates to a three-dimensional cultured skin model manufacturing method comprising a.
  • the present invention is mouse-derived fibroblasts; It relates to a three-dimensional cultured skin model comprising a dermal layer made of a composition comprising a natural collagen or a combination of natural collagen and atelocollagen and an epidermal layer formed by keratinocytes.
  • Skin is the largest organ covering the entire human body surface and has various functions such as temperature control and a barrier to the external environment. In adults, the area is about 1.2 to 2.3 m 2 .
  • the skin is composed of epidermis and dermis.
  • the dermal layer is composed of collagen and fibroblast, and the epidermal layer is composed of keratinocytes and melanin forming cells.
  • the thickness of the dermal layer is known to vary greatly depending on the site, but is known to have about three times the thickness of the epidermis.
  • the epidermal layer is stratified into a basement membrane, a pore layer, a granule layer and a stratum corneum so that the final differentiated dead cells are piled up on the skin surface to perform a protective film function.
  • the basement membrane is a thin membrane in which laminin and various extracellular matrix are deposited on the collagen type 4 lattice, and the cells of the basement layer adhere to the wound when the wound is accompanied by the decomposition of the basement membrane so that the cells of the basement layer are in contact with the type 1 collagen of the dermis. In this case, epidermal cells migrate laterally to induce re-epithelialization.
  • the dermal layer is composed of a papillary dermis rich in fibroblasts and microvascular distribution and a reticulated dermis rich in thick collagen fibers.
  • the hair follicles and many skin appendages are located deep in the dermis, causing epidermal cells to grow from the hair follicles to induce re-epithelialization even when the epidermal layer is lost, such as partial thickness wounds.
  • the three-dimensional cultured skin developed so far has a disadvantage in that the basement membrane is not sufficiently formed between the collagen gel mimicking the dermis and the epidermal layer imitating the epidermis, and the dermal layer contraction phenomenon occurs in which the dermal layer contracts during the culture process.
  • the basement membrane is not sufficiently formed between the collagen gel mimicking the dermis and the epidermal layer imitating the epidermis, and the dermal layer contraction phenomenon occurs in which the dermal layer contracts during the culture process.
  • the present inventors made extensive efforts to develop a three-dimensional cultured skin model similar to the human skin layer that can be used in the toxicity and efficacy experiments of medicines and cosmetics.
  • the mouse uses 3T3 cells and mixes atelocollagen and natural collagen.
  • the present invention was completed by preparing a three-dimensional cultured skin model that can replace animal experiments by confirming that it can overcome the shrinkage phenomenon of the dermal layer.
  • One object of the present invention is mouse-derived fibroblasts; Preparing a dermal layer by inoculating a composition comprising native collagen or a combination of native collagen and atelocollagen; Inoculating keratinocytes on the upper layer of the prepared dermal layer and culturing until forming a cell sheet; And exposing the cell sheet formed in the air to incubate to form an epidermal layer, thereby providing a three-dimensional cultured skin model manufacturing method comprising the dermal layer and the epidermal layer.
  • Another object of the present invention is mouse-derived fibroblasts; It provides a three-dimensional cultured skin model comprising a dermal layer made of a composition comprising a natural collagen or a combination of natural collagen and atelocollagen and an epidermal layer formed by keratinocytes.
  • the three-dimensional cultured skin model of the present invention is excellent in the formation and differentiation of the dermal layer and epidermal layer and the collagen contraction and degradation of the dermal layer through the use of mouse-derived 3T3 cells during the preparation, and by using a mixture of atelocollagen and natural collagen. As it has a similar structure to the natural skin layer by inhibiting, it can be widely used in the field of toxicity and efficacy experiments of animal medicines and cosmetics, and alternative experiments of animal experiments.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of the three-dimensional cultured skin model prepared by using mouse-derived fibroblast 3T3 cells (B) or human-derived fibroblasts (A), respectively, by H & E (Hematoxylin & Eosin) tissue staining.
  • B mouse-derived fibroblast 3T3 cells
  • A human-derived fibroblasts
  • H & E Hematoxylin & Eosin
  • MMP-1 is a matrix degrading enzyme in a three-dimensional cultured skin model prepared using mouse-derived fibroblast 3T3 cells (MF) or human-derived fibroblasts (HF), respectively, for the preparation of the dermal layer.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating cell sheet formation ability of keratinocytes in a three-dimensional cultured skin model prepared using mouse-derived fibroblast 3T3 cells (B) or human-derived fibroblasts (A), respectively, for the preparation of the dermal layer.
  • experimental group 1 prepared using only atelocollagen
  • experimental group 2 prepared using only natural collagen
  • FIG. 6 is a diagram confirming the structure by H & E tissue staining in a three-dimensional cultured skin model prepared by mixing the ratio of atelocollagen and natural collagen at 1: 1, 1: 5, or 1:10 when preparing the dermal layer.
  • FIG. 7 is a diagram confirming the structure of the three-dimensional cultured skin model to which melanocytes were added during tissue preparation by H & E (Hematoxylin & Eosin) tissue staining.
  • FIG. 8 is a diagram confirming the structure of the three-dimensional culture model prepared with corneal derived keratinocytes by H & E (Hematoxylin & Eosin) tissue staining during epidermal layer preparation.
  • FIG. 9 is a diagram confirming the structure of the three-dimensional culture model prepared by oral mucosa-derived keratinocytes by H & E (Hematoxylin & Eosin) tissue staining.
  • the present invention is mouse-derived fibroblasts; Dermal layer and epidermal layer comprising preparing a dermal layer using a composition comprising native collagen or a combination of native collagen and atelocollagen and forming an epidermal layer using keratinocytes. It provides a three-dimensional culture skin model manufacturing method comprising a.
  • the present invention is a) mouse-derived fibroblasts; Preparing a dermal layer by inoculating a composition comprising natural collagen or a combination of natural collagen and atelo collagen; b) inoculating keratinocytes on the upper layer of the prepared dermal layer to incubate until forming a cell sheet; And c) exposing the cell sheet formed in the air to incubate to form an epidermal layer, thereby providing a three-dimensional cultured skin model manufacturing method comprising a dermal layer and an epidermal layer.
  • the present invention uses a composition comprising a mouse-derived fibroblast and natural collagen or a combination of natural collagen and atelocollagen to prepare a dermal layer in the process of preparing a three-dimensional cultured skin model including the dermal layer and the epidermal layer. Formation and differentiation was excellent, and the dermis and collagen contraction is suppressed, it is characterized by having a similar structure to the actual human skin layer.
  • fibroblasts refers to cells that constitute an important component of fibrous connective tissue and, in particular, to skin related to the present invention, refers to main cells constituting the dermal layer.
  • fibroblasts may be derived from humans, mice, rats, and the like, but is not limited thereto.
  • the fibroblasts used to prepare the dermal layer in the process of preparing the three-dimensional cultured skin model of the present invention may be, in particular, mouse-derived fibroblasts, for example, 3T3-J2, NIH3T3, 3T6, 3T12, 3T12A or 6T6.
  • Cell line typically a mouse derived fibroblast 3T3-J2 cell line.
  • the fibroblasts of the present invention may be fibroblasts derived from normal tissues or diseased tissues such as chemicals, burns, wounds, scars, ulcers, but are not limited thereto.
  • keratin cell refers to a cell having keratinizing ability among epidermal cells and occupying most of the epidermal cell, and generally refers to a cell identical to keratinocytes.
  • keratinocytes may be derived from humans, mice, rats, and the like, but are not limited thereto.
  • the keratinocytes used in the preparation of the epidermal layer in the process of preparing the three-dimensional cultured skin model of the present invention may be, for example, human-derived keratinocytes, and may be derived from normal tissues, chemicals, burns, wounds, scars, ulcers, and the like. It may be a keratinocyte derived from a diseased tissue, but is not limited thereto.
  • the dermal layer of the three-dimensional cultured skin model was prepared using mouse-derived fibroblasts (typically using 3T3-J2 cell line) or human-derived fibroblasts (Example 2-1).
  • mouse-derived fibroblasts typically using 3T3-J2 cell line
  • human-derived fibroblasts Example 2-1
  • the dermal layer was formed about twice as thick as the case when the human-derived fibroblasts were used.
  • collagen in the dermal layer was decomposed, and compared with the dermal layer prepared with mouse-derived fibroblasts, the thickness was thin, resulting in a poor formation of the dermal layer.
  • the epidermal layer should be formed basal, pores, granules, stratum corneum, when using a mouse-derived fibroblasts can determine the clear basal layer boundaries and confirmed that each layer is stably formed in the epidermal layer (Fig. 1).
  • MMP-1 (54kDa) was observed only when human fibroblasts were used, whereas expression of MMP-1 was not observed when mouse-derived fibroblasts were used (FIG. 2), when forming the dermal layer using the mouse-derived fibroblasts, it was confirmed that the cell sheet formation rate is significantly faster than when using human fibroblasts (Fig. 3).
  • the cell sheet refers to a state in which the entire culture surface is covered by tight coupling between cells with one or more layers of cells.
  • mouse-derived fibroblasts When using the mouse-derived fibroblasts to form the dermal layer through a specific embodiment of the present invention i) excellent dermal layer formation ability, and ii) collagen supplied initially is maintained and excellent dermal layer maintenance ability than when using human fibroblasts , iii) It was confirmed that the epidermal layer formation rate was increased. This suggests that the use of mouse-derived fibroblasts can reduce the time required to produce three-dimensional cultured skin models, as well as similar to natural skin tissue.
  • a three-dimensional cultured skin model is required to produce the three-dimensional cultured skin model or to require a small number of keratinocytes because mass production is often required. It can be said that the time required is reduced.
  • the three-dimensional cultured skin model prepared through the present invention can be used as a drug for skin transplantation and wound treatment as well as toxicity and efficacy experiments.
  • the method for producing a three-dimensional cultured skin model of the present invention may be a method having one or more of the following characteristics compared to the case of using human-derived fibroblasts by forming a dermal layer with the mouse-derived fibroblasts of the present invention.
  • collagen is a light protein that is present in both plants and animals, and is mainly present in the bones and skin of animals and is also distributed in cartilage, organ membranes, hair, and the like, and is also called collagen.
  • Collagen is a protein consisting of triple helix structure and has a non-helical telopeptide at both ends of the triple helix structure.
  • collagen may be derived from humans, cows, pigs, mice, rats, and the like, but is not limited thereto.
  • collagen may be modified collagen that is biotechnological or biotechnological or chemically treated as well as natural collagen, but is not limited to derived and modified.
  • Atelocollagen refers to collagen from which telopeptides are known to be the major cause of immune response in the collagen described above.
  • Collagen extracted from the colloid of cows or pigs may be produced by processing enzymes that remove telopeptides, or may be produced using recombinant technology.
  • Atelocollagen is a collagen with reduced immunogenicity, which is non- antigenic, biocompatible, and metabolized and absorbed in a short period of time. Accordingly, it is known as a biomaterial and is widely used in applications for artificial skin, artificial blood vessels, tissue culture carriers, and cosmetics.
  • Collagen included in the dermal layer of the three-dimensional culture skin model of the present invention for the purpose of the present invention may be a natural collagen or a combination of natural collagen and atelocollagen
  • the natural collagen is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: It may include an alpha-2 chain consisting of an alpha-1 chain and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • the atelocollagen is alpha 1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • It may include an alpha-2 chain consisting of a chain (alpha-1 chain) and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (alpha-2 chain).
  • the combination of atelocollagen and natural collagen may have a combination ratio of 1: 0.1 to 1:20, and preferably 1: 0.5 to 1:15.
  • the method for producing a three-dimensional cultured skin model of the present invention may be a method having one or more of the following characteristics compared to the case of using atelocollagen alone by forming a dermal layer by using natural collagen or a combination of natural collagen and atelocollagen. have.
  • the term "three-dimensional cultured skin model” refers to a skin layer model similar to a natural skin layer prepared through an artificial culture process that is not collected or obtained from an animal. The origin of the cells which constitute it is not limited.
  • the three-dimensional cultured skin model of the present invention is not limited as long as it includes a dermal layer composed of collagen and fibroblasts and an epidermal layer comprising keratinocytes.
  • Method for producing a three-dimensional culture skin model of the present invention is a mouse-derived fibroblasts in step a); Native collagen or a combination of native collagen and Atelocollagen (Atelocollagen); the composition comprising a mouse-derived fibroblasts can be 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 7 cells per 1 cm 2 And, in particular, may include 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 6 cells.
  • the composition in step a) is a group consisting of human fibroblasts, dermal papillar cells, endothelial cells, adipocytes, and mesenchymal stem cells. It may further comprise one or more cells selected from.
  • the mouse-derived fibroblasts in the step of preparing the dermal layer of the three-dimensional culture skin model manufacturing method was prepared containing 0.5 ⁇ 10 5 cells of mouse-derived fibroblasts per 1 cm 2 .
  • step a) of the three-dimensional culture skin model manufacturing method of the present invention may be performed for 1 hour to 48 hours.
  • the step of inoculating the composition comprising mouse-derived fibroblasts and collagen corresponding to step a) in 6-well plates was performed overnight (approximately 12 hours).
  • Step b) of the three-dimensional culture skin model manufacturing method of the present invention may be inoculating keratin cells in the number of 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 7 cells per cm 2 of the dermal layer prepared in step a).
  • the inoculation of keratinocytes in step c) may be keratinocytes derived from skin, mucosa, cornea, hair follicle or epithelial tissue, but is not limited thereto. Inoculation of keratinocytes may further comprise one or more cells selected from the group consisting of melanocytes, Merkel cells, and Langerhans cells, Disease-derived cells as well as normal cells can be used for three-dimensional cultured skin models of disease.
  • step c) preparing the epidermal layer and when inoculated with keratin-derived keratin cells or oral mucosa-derived keratin cells and inoculated melanocytes with keratin cells simultaneously to prepare a three-dimensional culture model of the present invention
  • a stable three-dimensional skin model could be prepared (FIGS. 7 to 9).
  • step b) may be performed for about 2 to 7 days, which may vary depending on the area of the keratinocytes and the dermal layer to be inoculated, and is not particularly limited.
  • the period of cell sheet formation can be shortened by using a dermal layer comprising a mouse-derived fibroblast and natural collagen or a combination of natural collagen and atelocollagen.
  • a dermal layer comprising a mouse-derived fibroblast and natural collagen or a combination of natural collagen and atelocollagen.
  • Step c) of the three-dimensional culture skin model manufacturing method of the present invention may be performed for 7 days to 21 days.
  • the step of culturing by exposing the cell sheet consisting of keratin cells corresponding to step c) in air to form an epidermal layer was performed for about 12 days (Example 2-2).
  • the culture conditions follow general living cell conditions, and the medium and the culture temperature may be used without particular limitation as long as possible for the living cell culture.
  • the present invention is a mouse-derived fibroblast; It provides a three-dimensional cultured skin model comprising a dermal layer made of a composition comprising a natural collagen or a combination of natural collagen and atelocollagen and an epidermal layer formed by keratinocytes.
  • Fibroblasts, collagen and three-dimensional cultured skin model in the present invention are as described above.
  • the three-dimensional cultured skin model according to the present invention can be usefully used for conducting physiological, molecular biological and biochemical studies related to skin of animals including humans. It can also be used to test efficacy or toxicity for a substance that would normally be expected to come into contact with the skin. Substances expected to come into contact with the skin are generic to all substances such as pharmaceuticals (particularly, external preparations), cosmetics, textiles or detergents, and may be typically used for the efficacy or toxicity test of the pharmaceuticals or cosmetics.
  • the three-dimensional cultured skin model according to the present invention can be used as a pathological model for the case where the skin is damaged by chemicals, burns, wounds, scars, ulcers, etc., as well as efficacy or toxicity tests in normal skin conditions.
  • the three-dimensional cultured skin model according to the present invention can be used as a substitute for animal testing.
  • the three-dimensional cultured skin model prepared according to the present invention can be used as a medicine for transplantation and wound treatment, not just a simple experiment.
  • Three-dimensional cultured skin model according to the present invention has a configuration close to the human skin layer can be used as an alternative to the skin model in the need for alternative models of animal testing worldwide.
  • the experiment was carried out to produce a three-dimensional cultured skin model comprising a dermal layer and an epidermal layer, the form of which is similarly composed in the natural skin layer.
  • the materials used to prepare the basic three-dimensional cultured skin model are as follows.
  • Human keratinocytes Human keratinocytes
  • Collagen (Atelo Collagen and / or Natural Collagen)
  • EGF Epidermal Growth Factor
  • a three-dimensional cultured skin model including a dermal layer and an epidermal layer was prepared through the following experiment.
  • Mouse-derived fibroblasts 3T3 cells or human-derived fibroblasts were mixed with 2.0 mg / mL collagen solution and 10X Reconstruction Buffer (0.2M sodium biocarbonate, 0.2M HEPES, 0.05N NaOH) to obtain a cell count of 1 ⁇ 10 5 / ml. After the cell mixture solution was prepared, 2 ml of the cell mixture solution was added to the 6 well-transwell insert. It was cured overnight (1-24 hours) in a 37 ° C. 10% CO 2 incubator.
  • 10X Reconstruction Buffer 0.2M sodium biocarbonate, 0.2M HEPES, 0.05N NaOH
  • Keratin cells were inoculated on the dermal layer by 2.5 ⁇ 10 5 on the dermal layer prepared in Example 2-1 and cultured. The culture was replaced with a culture solution containing 10 ng / mL EGF at 2 days intervals and incubated in a 37 ° C. 10% CO 2 incubator for about 5-6 days until the keratin cells formed a sheet. When keratin cells form a sheet on the dermal layer, they were transferred to a six-well type three-dimensional culture vessel for air-lift. After the container was filled with a culture solution containing 10 ng / mL EGF and the prepared dermal-epidermal layer was exposed to air.
  • the three-dimensional culture model of the present invention was prepared by inoculating melanocytes together with keratin cells and inoculated with keratin-derived keratin cells or oral mucosa-derived keratinocytes during epidermal layer preparation.
  • Example 2-2 The structure of the dermal-epidermal three-dimensional cultured skin model prepared in Example 2-2 was confirmed by H & E (Hematoxylin & Eosin) tissue staining.
  • H & E tissue staining was done through experimental procedures well known in the art.
  • mouse-derived fibroblasts were formed with a thick epidermal and dermal layer of 1: 1, and the epidermal layer was also found to have an even and stable form.
  • the epidermal layer should be formed basal, play, granules, stratum corneum, in the case of using mouse-derived fibroblasts can see a clear basal layer boundary and it can be seen that each layer is stably formed in the epidermal layer.
  • Example 2-3 In order to analyze the cause of the histological difference confirmed by the tissue staining in Example 2-3, when the three-dimensional cultured skin model was prepared using the mouse-derived fibroblasts or human-derived fibroblasts, substrate degradation that degrades collagen and the like in the culture medium cultured for two days. The expression level of MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1) in the enzyme was measured.
  • MMP-1 Microx Metalloproteinase-1
  • MMP-1 The expression level of MMP-1 was measured by western blotting, and Western blotting was performed by methods well known in the art.
  • Cell sheet formation capacity of keratinocytes co-cultured with mouse-derived fibroblasts or human-derived fibroblasts was compared. Specifically, the mouse-derived or human-derived fibroblasts were inoculated into a cell culture vessel having a container area of 58 cm 2 , and then 1 ⁇ 10 5 keratinocytes were inoculated thereon. On day 11 of culturing, staining with rhodamine solution was performed to confirm cell sheet formation.
  • the dermal layer is formed using the mouse-derived fibroblasts
  • i) the dermal layer forming ability, ii) the epidermal layer forming ability and the differentiating ability are higher than those using the human fibroblasts, and iii) the collagen initially supplied. It was confirmed that the retention of the dermal layer was excellent, and iv) the epidermal layer formation rate was increased. This suggests that the use of mouse-derived fibroblasts can reduce the time required to produce three-dimensional cultured skin models, as well as similar to natural skin tissue.
  • the three-dimensional cultured skin model for use in the toxicity and efficacy experiments of pharmaceuticals and cosmetics requires a large number of mass production, and thus requires a small number of keratin cells or the time required to prepare the three-dimensional cultured skin model. This reduction is significant.
  • Example 2 the superiority of using mouse-derived fibroblasts in preparing the three-dimensional cultured skin model of the present invention was confirmed.
  • the present inventors have sought to optimize collagen, another element that forms the dermal layer, in order to optimize the preparation of three-dimensional cultured skin models.
  • atelocollagen As collagen, native collagen and atelocollagen (Atelocollagen) having lower immunogenicity than native collagen were used. Specifically, the experimental group 1 prepared using only atelocollagen, the experimental group 2 prepared using only natural collagen, and the experimental group 3 prepared by mixing atelocollagen and natural collagen in a ratio of 1: 5 were prepared and compared.
  • Collagen contraction is generally related to the expression or expression amount of Matrix Metalloproteinase (MMP), and thus cultured three-dimensional cultured skin tissues of Experimental Groups 1 to 3 prepared according to collagen type in Example 3-1.
  • MMP-2 and MMP-9 were analyzed in one culture.
  • Expression levels of the substrate lyase were quantitatively analyzed by ELISA.
  • Three-dimensional cultured skin models were prepared by varying the mixing ratio of atelocollagen and natural collagen. Specifically, Experimental Group A, in which the ratio of atelocollagen and natural collagen was 1: 1, Experimental Group B, which was 1: 5, and Experimental Group C, which was 1:10, were prepared.

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Abstract

본 발명은 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐(Native collagen) 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐(Atelocollagen)의 조합;을 포함하는 조성물을 이용하여 진피층을 제조하는 단계 및 케라틴 세포를 이용하여 표피층을 형성하는 단계를 포함하는 진피층 및 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐의 조합;을 포함하는 조성물로 제조된 진피층과 케라틴 세포에 의해 형성된 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델에 관한 것이다. 본 발명의 삼차원 배양 피부모델은 제조시 마우스 유래 3T3 세포를 이용하고, 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐을 혼합하여 사용하는 것을 통하여 진피층과 표피층의 형성 및 분화가 우수하고 진피층의 콜라겐 수축 및 분해 현상을 억제하여 자연피부층에 유사한 구조를 가짐에 따라, 의약품이나 화장품의 독성 및 효능 실험, 동물실험 대체 실험 분야에서 널리 사용될 수 있다.

Description

진피층 및 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델을 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 삼차원 배양 피부모델
본 발명은 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐(Native collagen) 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐(Atelocollagen)의 조합;을 포함하는 조성물을 이용하여 진피층을 제조하는 단계 및 케라틴 세포를 이용하여 표피층을 형성하는 단계를 포함하는 진피층 및 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐의 조합;을 포함하는 조성물로 제조된 진피층과 케라틴 세포에 의해 형성된 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델에 관한 것이다.
피부는 인체 체표면 전체를 덮고 있는 가장 큰 장기로서 체온 조절과 외부 환경에 대한 장벽으로의 기능 등 다양한 기능을 가지고 있으며, 성인의 경우 그 면적이 약 1.2 내지 2.3 m2에 이른다. 피부는 표피(epidermis)와 진피(dermis)로 구성되어 있으며, 진피층은 콜라겐(collagen)과 섬유아세포(fibroblast)로 이루어져 있고, 표피층은 케라틴 세포와 멜라닌 형성 세포 등으로 구성되어 있다. 비교적 일률적인 두께를 가지는 표피층에 비해, 진피층의 두께는 부위에 따라 많은 차이가 있는 것으로 알려져 있으나 표피의 약 3배의 두께를 가지는 것으로 알려져 있다.
표피층은 기저막, 유극층, 과립층, 각질층으로 계층화되어 있어 피부 표면에는 최종 분화된 죽은 세포가 여러 겹으로 쌓여 보호막 기능을 수행하게 된다. 기저막은 제4형 콜라겐 lattice에 라미닌 및 여러 세포외기질이 침착된 얇은 막 형태로 기저층의 세포가 부착하고 있으며, 상처가 나면 기저막의 분해가 동반되어 기저층의 세포가 진피의 제1형 콜라겐과 접하게 되며, 이때 표피 세포가 측면으로 이동하여 재상피화(re-epithelialization)이 유도된다.
진피층은 섬유아세포가 풍부하고 미세 혈관이 분포하는 유두층(papillary dermis)와 두꺼운 콜라겐 섬유가 풍부한 세망 결합 조직(reticular dermis)으로 구성되어 있다. 모낭 및 여러 피부 부속 기관은 진피 깊숙이 위치하고 있어, 부분층 피부손상(partial thickness wound)처럼 표피층이 소실된 경우에도 모낭에서부터 표피세포가 자라 나와서 재상피화를 유도하게 된다.
한편, 인공적으로 피부조직을 구성하고자 하는 시도가 있으며, 이러한 인공피부는 일반적으로 자가 세포에 의한 재생능력을 상실한 피부손상이나, 피부 궤양 또는 의약품이나 화장품의 독성 및 효능 실험 등에 사용된다. 인공피부는 손상된 인간의 피부를 대체할 수 있는 피부 대용품으로써 피부 치료나 이를 위한 의약품 개발 또는 피부와 접촉하는 의료기기, 생활필수품, 화장품 등의 독성 및 효능을 시험하기 위한 실험 재료로 매우 중요하다.
따라서, 이와 같은 활용을 위해서는 자연 피부층을 모방한 구조를 갖는 인공피부의 개발이 요구되는데, 유럽의 경우 2013년부터 동물실험을 통해 만든 화장품의 판매가 전면 금지되었기 때문에, 유명 해외 화장품 업체들은 인공 피부 개발에 많은 투자를 하고 있는 실정이다. 예를 들면, 프랑스 로레알사가 자체 개발한 '에피스킨'은 동물 실험을 완전히 대체할 수 있는 인공피부로 유럽 표준을 통과했으며, 미국 마텍에서 개발한 '에피덤'은 실제 사람피부에 비해 너무 민감한 반응을 보여 조건부 승인만을 받은 상태이다. 현재까지 개발된 인공배양 피부 모델 중 대표적인 방법으로는 표피가 제거된 진피 위에 인체 케라틴 세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(Reconstructed epidermis on de-epidermized dermis, RE-DED)과 섬유아세포가 포함된 콜라겐 기질 위에서 인체 각질형성 세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(Living Skin Equivalent, LSE)이 있다.
그러나, 지금까지 개발된 삼차원 배양 피부의 경우 진피를 모방한 콜라겐 겔과 표피를 모방한 표피층 사이에 기저막이 충분히 형성되지 못하는 단점이 있으며, 배양과정에서 진피층이 수축되는 진피층 수축현상이 일어나 자연피부층에 유사한 삼차원 배양 피부를 제조하는 기술이 여전히 요구되고 있다.
본 발명자들은 의약품이나 화장품의 독성 및 효능 실험에 활용할 수 있는 사람의 피부층과 유사한 삼차원 배양 피부모델을 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 마우스 유래 3T3 세포를 이용하고, 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐을 혼합하여 사용하여 진피층의 수축현상을 극복할 수 있음을 확인함으로써 동물실험을 대체할 수 있는 삼차원 배양 피부모델을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐(Native collagen) 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐(Atelocollagen)의 조합;을 포함하는 조성물을 배양접시에 접종하여 굳혀 진피층을 제조하는 단계; 상기에서 제조된 진피층의 상층에 케라틴 세포를 접종하여 cell sheet를 형성할 때까지 배양하는 단계; 및 상기에서 형성된 cell sheet를 공기 중에 노출시켜 배양하여 표피층을 형성하는 단계를 포함하는, 진피층 및 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐의 조합;을 포함하는 조성물로 제조된 진피층과 케라틴 세포에 의해 형성된 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 삼차원 배양 피부모델은 제조시 마우스 유래 3T3 세포를 이용하고, 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐을 혼합하여 사용하는 것을 통하여 진피층과 표피층의 형성 및 분화가 우수하고 진피층의 콜라겐 수축 및 분해 현상을 억제하여 자연피부층에 유사한 구조를 가짐에 따라, 의약품이나 화장품의 독성 및 효능 실험, 동물실험 대체 실험 분야에서 널리 사용될 수 있다.
도 1은 진피층 제조에 마우스 유래 섬유아세포 3T3 세포(B) 또는 인간 유래 섬유아세포(A)를 각각 사용하여 제조한 삼차원 배양 피부모델을 H&E(Hematoxylin & Eosin) 조직 염색으로 그 구조를 확인한 도면이다.
도 2는 진피층 제조에 마우스 유래 섬유아세포 3T3 세포(MF) 또는 인간 유래 섬유아세포(HF)를 각각 사용하여 제조한 삼차원 배양 피부모델에서 기질분해효소인 MMP-1의 발현량을 확인한 도면이다.
도 3은 진피층 제조에 마우스 유래 섬유아세포 3T3 세포(B) 또는 인간 유래 섬유아세포(A)를 각각 사용하여 제조한 삼차원 배양 피부모델에서 케라틴 세포의 Cell sheet 형성능을 확인한 도면이다.
도 4는 진피층 제조시 아텔로콜라겐만을 이용하여 제조한 실험군 1, 천연형 콜라겐만을 이용하여 제조한 실험군 2 및 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐을 1 : 5의 비율로 혼합하여 사용한 실험군 3에서 H&E 조직 염색으로 그 구조를 확인한 도면이다. 콜라겐이 수축하는 현상은 ▶ 표시를 하였다.
도 5는 진피층 제조시 아텔로콜라겐만을 이용하여 제조한 실험군 1, 천연형 콜라겐만을 이용하여 제조한 실험군 2 및 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐을 1 : 5의 비율로 혼합하여 사용한 실험군 3의 삼차원 배양 피부조직을 배양한 배양액에서 MMP-2와 MMP-9의 발현량을 분석한 도면이다.
도 6은 진피층 제조시 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐의 혼합 비율을 1 : 1, 1 : 5, 또는 1 : 10으로 하여 제조한 삼차원 배양 피부모델에서 H&E 조직 염색으로 그 구조를 확인한 도면이다.
도 7은 표피층 제조시 멜라닌 세포가 추가된 삼차원 배양 피부모델을 H&E(Hematoxylin & Eosin) 조직 염색으로 그 구조를 확인한 도면이다.
도 8은 표피층 제조시 각막유래 케라틴 세포로 제조된 삼차원 배양 모델을 H&E(Hematoxylin & Eosin) 조직 염색으로 그 구조를 확인한 도면이다.
도 9는 표피층 제조시 구강점막유래 케라틴 세포로 제조된 삼차원 배양 모델을 H&E(Hematoxylin & Eosin) 조직 염색으로 그 구조를 확인한 도면이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐(Native collagen) 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐(Atelocollagen)의 조합;을 포함하는 조성물을 이용하여 진피층을 제조하는 단계 및 케라틴 세포를 이용하여 표피층을 형성하는 단계를 포함하는 진피층 및 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 a) 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐의 조합;을 포함하는 조성물을 배양접시에 접종하여 굳혀 진피층을 제조하는 단계; b) 상기에서 제조된 진피층의 상층에 케라틴 세포를 접종하여 cell sheet를 형성할 때까지 배양하는 단계; 및 c) 상기에서 형성된 cell sheet를 공기 중에 노출시켜 배양하여 표피층을 형성하는 단계를 포함하는, 진피층 및 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델 제조방법을 제공한다.
본 발명은 진피층 및 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델을 제조하는 과정에서 진피층 제조시 마우스 유래 섬유아세포 및 천연형 콜라겐 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐의 조합을 포함하는 조성물을 사용하여 진피층과 표피층의 형성 및 분화가 우수하였으며 진피층 및 콜라겐 수축 현상이 억제되어 실제 사람의 피부층에 유사한 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 용어, "섬유아세포"는 섬유성 결합조직의 중요한 성분을 이루는 세포로 특히 본 발명과 관련된 피부에 있어서는 진피층을 구성하는 주요 세포를 의미한다. 본 발명에서 섬유아세포는 인간, 마우스, 랫트 등에서 유래할 수 있으나, 그 유래에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 본 발명의 삼차원 배양 피부모델을 제조하는 과정에서 진피층 제조시 이용하는 섬유아세포는 특히, 마우스 유래 섬유아세포일 수 있으며, 예를 들어 3T3-J2, NIH3T3, 3T6, 3T12, 3T12A 또는 6T6 세포주 일 수 있고, 대표적으로 마우스 유래 섬유아세포 3T3-J2 세포주 일 수 있다. 또한 본 발명의 섬유아세포는 정상조직 유래 또는 화학물질, 화상, 창상, 흉터, 궤양 등의 병증 조직 유래 섬유아세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "케라틴 세포"는 표피 세포 중에서 각질화 능력을 가지고 있는 세포로 표피 세포의 대부분을 차지하고 있는 세포를 의미하며, 일반적으로 케라티노사이트와 동일한 세포를 지칭한다. 본 발명에서 케라틴 세포는 인간, 마우스, 랫트 등에서 유래할 수 있으나, 그 유래에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 본 발명의 삼차원 배양 피부모델을 제조하는 과정에서 표피층 제조시 이용하는 케라틴 세포는 특히, 인간 유래 케라틴 세포일 수 있고, 정상조직 유래 또는 화학물질, 화상, 창상, 흉터, 궤양 등의 병증 조직 유래 케라틴 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 마우스 유래 섬유아세포(대표적으로 3T3-J2 세포주 사용) 또는 인간 유래 섬유아세포를 이용하여 삼차원 배양 피부모델의 진피층을 제조하였다(실시예 2-1). 그 결과, 마우스 유래 섬유아세포를 사용한 경우 인간 유래 섬유아세포를 사용한 경우보다 진피층 두께가 2배 가량 두껍게 형성된 것을 확인하였으며, 조직도 고른 두께로 안정적인 피부모델이 형성된 것을 확인하였다. 또한, 인간 유래 섬유아세포를 사용할 경우 진피층의 콜라겐이 분해되어 마우스 유래 섬유아 세포로 제조한 진피층에 비해 두께가 얇아 진피층의 형성이 부진하였다. 아울러, 표피층은 기저, 유극, 과립, 각질층이 형성되어야 하며, 마우스 유래 섬유아세포를 사용한 경우에는 명확한 기저층 경계를 확인할 수 있고 표피층에 각 층이 안정적으로 형성되어 있는 것을 확인하였다(도 1).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 인간 유래 섬유아세포를 사용한 경우에서만 MMP-1(54kDa)의 발현이 관찰된 반면, 마우스 유래 섬유아세포를 사용한 경우에는 MMP-1의 발현이 관찰되지 않았으며(도 2), 마우스 유래 섬유아세포를 사용하여 진피층을 형성하는 경우에 인간 섬유아세포를 사용한 경우보다 cell sheet 형성 속도가 월등히 빠른 것을 확인하였다(도 3).
한편, 본 발명에서 cell sheet는 한 겹 이상의 세포로 세포간의 단단한 결합을 통하여 배양 표면이 전부 뒤덮힌 상태를 지칭한다.
본 발명의 구체적인 실시예를 통하여 마우스 유래 섬유아세포를 사용하여 진피층을 형성하는 경우에 인간 섬유아세포를 사용한 경우보다 i) 진피층 형성능이 우수하고, ii) 초기 공급한 콜라겐이 유지되어 진피층 유지능이 우수하고, iii) 표피층 형성 속도가 빨라지는 것을 확인하였다. 이는 마우스 유래 섬유아세포를 사용할 경우 자연피부조직과 유사한 형태를 가질 뿐 아니라 삼차원 배양 피부모델을 제조하는데 소요되는 시간도 감축시킬 수 있음을 보여준다.
본 발명과 관련하여, 특히 의약품 및 화장품의 독성 및 효능 실험에 사용하기 위한 삼차원 배양 피부모델은 대량 생산이 요구되는 경우가 많기 때문에 상기 적은 수의 케라틴 세포를 필요로 한다거나 삼차원 배양 피부모델을 제조하는데 소요되는 시간이 감축되는 것의 의미가 크다고 할 수 있다. 또한, 본 발명을 통해 제조된 삼차원 배양 피부모델은 독성 및 효능 실험 뿐 아니라 피부 이식 및 상처치료용 의약품으로 사용될 수 있다.
본 발명의 삼차원 배양 피부모델 제조방법은 본 발명의 마우스 유래 섬유아세포에 의해 진피층을 형성시킴으로써 인간 유래 섬유아세포를 이용하는 경우에 비교하여 하기의 특성 중 하나 이상을 가지는 방법일 수 있다.
i) 진피층 형성능 증가.
ii) 표피층 형성능 증가.
iii) 표피층 분화능 증가.
iv) 콜라겐 수축 현상 억제.
v) 콜라겐층 분해 현상 억제.
vi) 기질분해효소(Matrix Metalloproteinase) 발현량 감소.
vii) cell sheet 형성 속도 증가.
본 발명의 용어, "콜라겐"은 식물과 동물에 모두 존재하는 경단백질로, 동물의 뼈와 피부에 주로 존재하며 연골, 장기 막, 머리카락 등에도 분포되어 있으며, 교원질이라고도 불리운다. 콜라겐은 삼중나선구조로 이루어진 단백질이며 삼중나선구조의 양쪽 말단에는 비나선 구조의 텔로펩타이드를 가지고 있다. 본 발명에서 콜라겐은 인간, 소, 돼지, 마우스, 랫트 등에서 유래할 수 있으나, 그 유래에 제한되지 않는다. 본 발명에서 콜라겐은 천연형 콜라겐 뿐 아니라 생물공학적 변이나 생물공학적 또는 화학적 처리된 변형 콜라겐일 수 있으나, 유래 및 변형 여부에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "아텔로콜라겐(Atelocollagen)"은 상기 설명한 콜라겐에서 면역반응을 일으키는 주된 원인으로 알려져 있는 텔로펩타이드를 제거한 콜라겐을 의미한다. 소나 돼지의 교질에서 추출한 콜라겐을 텔로펩타이드를 제거하는 효소를 처리하여 생산할 수도 있으며, 재조합 기술을 이용하여 생산할 수도 있다. 아텔로콜라겐은 면역원성을 감소시킨 콜라겐으로 항원성이 없고, 생체적합성이 좋으며 단기간에 대사, 흡수된다. 이에 따라 생체물질로 알려져 있어 인공피부, 인공혈관, 조직배양의 담체, 화장품에 대한 응용 분야에 널리 사용되고 있다.
본 발명의 목적상 본 발명의 삼차원 배양 피부모델의 진피층에 포함되는 콜라겐은 천연형 콜라겐 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐의 조합일 수 있으며, 상기 천연형 콜라겐은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 알파 1 체인(alpha-1 chain) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 알파 2 체인(alpha-2 chain)을 포함하는 것일 수 있으며, 아텔로콜라겐은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 알파 1 체인(alpha-1 chain) 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 알파 2 체인(alpha-2 chain)을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명에서 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐의 조합은 조합 비율이 1: 0.1 내지 1: 20일 수 있으며, 바람직하게는 1: 0.5 내지 1 :15일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 아텔로콜라겐 단독, 천연형 콜라겐 단독 및 이들의 조합을 이용하여 삼차원 배양 피부모델의 진피층을 제조하였다(실시예 3-1). 구체적으로, 아텔로콜라겐만을 이용하여 제조한 실험군 1, 천연형 콜라겐만을 이용하여 제조한 실험군 2 및 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐을 1 : 5의 비율로 혼합하여 사용한 실험군 3을 제조하였다. 그 결과, 아텔로콜라겐을 단독으로 사용함에 따른 콜라겐 수축현상과 표피층 형성 및 분화 감소의 기존의 문제점을 천연형 콜라겐(아텔로콜라겐 : 천연형 콜라겐 = 1 : 5)을 첨가하는 것을 통하여 극복할 수 있다는 것을 확인하였다(도 4). 또한, 아텔로콜라겐만을 사용한 실험군 1의 경우 MMP-2와 MMP-9의 발현이 실험군 2 및 3에 비하여 2배 이상 현저히 높은 데에 비하여, 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐을 혼합한 실험군 3은 천연형 콜라겐만을 사용한 경우와 유사한 수준의 낮은 MMP-2 및 MMP-9 발현량을 보였다(도 5).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐의 혼합 비율을 여러가지로 달리하여 삼차원 배양 피부모델을 제조한 결과, 혼합비율이 1: 1 내지 1: 10에 이르도록 진피층의 수축현상 없이 인공피부조직이 안정적으로 제조되는 것을 확인하였다(도 6).
본 발명의 삼차원 배양 피부모델 제조방법은 천연형 콜라겐 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐 조합에 의해 진피층을 형성시킴으로써 아텔로콜라겐을 단독으로 이용하는 경우에 비교하여 하기의 특성 중 하나 이상을 가지는 방법일 수 있다.
i) 콜라겐 수축 현상 억제.
ii) 표피층 분화능 증가.
iii) 기질분해효소(Matrix Metalloproteinase) 발현량 감소.
iv) 콜라겐층 분해 현상 억제.
본 발명의 용어, "삼차원 배양 피부모델"은 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통하여 제조한 자연피부층에 유사한 피부층 모델을 의미한다. 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 본 발명이 삼차원 배양 피부모델은 콜라겐과 섬유아세포로 이루어진 진피층과 케라틴 세포를 포함하는 표피층을 포함하는 한 제한되지 않는다.
본 발명의 삼차원 배양 피부모델 제조방법은 상기 a) 단계에서 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐(Native collagen) 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐(Atelocollagen)의 조합;을 포함하는 조성물은 1 cm2당 마우스 유래 섬유아세포를 1 × 104 내지 1 × 107 세포수 포함하는 것일 수 있으며, 특히 1 × 105 내지 1 × 106 세포수 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 a) 단계에서 조성물은 인간 섬유아세포(Human Fibroblast), 모유두세포(Dermal Papillar cell), 내피세포(Endothelial cell), 지방세포(Adipocyte) 및 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 삼차원 배양 피부모델 제조방법의 진피층을 제조하는 단계에서 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐(Native collagen) 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐(Atelocollagen)의 조합;을 포함하는 조성물은 1 cm2당 마우스 유래 섬유아세포를 0.5 × 105 세포수 포함하여 제조하였다.
또한, 본 발명의 삼차원 배양 피부모델 제조방법의 상기 a) 단계는 1시간 내지 48시간 동안 수행하는 것일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 a) 단계에 해당하는 마우스 유래 섬유아세포와 콜라겐을 포함하는 조성물을 6웰 플레이트에 접종하여 굳히는 단계를 밤새(대략 12시간) 수행하였다.
본 발명의 삼차원 배양 피부모델 제조방법의 상기 b) 단계는 a) 단계에서 제조된 진피층 cm2당 1 × 104 내지 1 × 107 세포수의 케라틴 세포를 접종하는 것일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 b)단계에 해당하는 진피층의 상층에 케라틴 세포를 접종하여 cell sheet를 형성할 때까지 배양하는 단계에서 6웰 플레이트 1 웰당(4.7 cm2) 약 2.5 × 105 세포수의 케라틴 세포를 접종하였다.
또한, 상기 c) 단계에서 케라틴 세포의 접종은 피부, 점막, 각막, 모낭 또는 상피조직 유래 케라틴 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 케라틴 세포의 접종은 멜라닌세포(Melanocyte), 메르켈 세포(Merkel cell) 및 랑게르한스 세포(Langerhans cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 질병에 대한 삼차원 배양 피부모델을 위해 정상 세포 뿐 아니라 질병 유래 세포를 이용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 표피층 제조하는 c) 단계에서 각막 유래 케라틴세포 또는 구강점막 유래 케라틴세포로 접종한 경우와 케라틴 세포와 함께 멜라닌세포를 동시에 접종하여 본 발명의 삼차원 배양모델을 제작한 결과 안정적인 삼차원 피부모델을 제조할 수 있음을 확인하였다(도 7 내지 도 9).
또한, 상기 b) 단계는 약 2 내지 7일간 수행하는 것일 수 있으나, 이는 접종되는 케라틴 세포 및 진피층의 면적 등에 의해 달라질 수 있어 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서는 마우스 유래 섬유아세포 및 천연형 콜라겐 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐의 조합을 포함하는 진피층을 이용하여 해당 cell sheet 형성기간이 단축될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 마우스 유래 섬유아세포를 사용한 경우에는 인간 유래 섬유아세포에 비하여 cell sheet 형성능이 우수한 것을 확인하였다(도 3). 이러한 결과는 인간 유래 섬유아세포를 사용하여 표피층을 제조하는 경우 cell sheet를 형성시키고 air-lifting하는 시점이 마우스 유래 섬유아세포를 사용하는 경우보다 지연되거나, 케라틴 세포의 초기 접종 세포수로 많은 양이 필요한 바, 마우스 유래 섬유아세포를 사용하는 본 발명의 우수성을 확인할 수 있다.
본 발명의 삼차원 배양 피부모델 제조방법의 상기 c) 단계는 7일로부터 21일 동안 수행하는 것일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 c) 단계에 해당하는 케라틴 세포로 이루어진 cell sheet를 공기 중에 노출시켜 배양하여 표피층을 형성하는 단계를 약 12일간 수행하였다(실시예 2-2).
본 발명의 세포의 분리 및 배양 방법에는 특별한 제한이 없으며, 통상적으로 알려진 모든 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 케라틴 세포 배양 단계에 있어 배양 조건은 일반적인 생체 세포 조건을 따르고, 배지 및 배양 온도 또한 생체 세포배양에 가능한 것이면 특별한 제한없이 사용할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐의 조합;을 포함하는 조성물로 제조된 진피층과 케라틴 세포에 의해 형성된 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델을 제공한다.
본 발명에서 섬유아세포, 콜라겐 및 삼차원 배양 피부모델 등은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에 따른 삼차원 배양 피부모델은 인간을 포함하는 동물의 피부와 관련된 생리학적, 분자생물학적, 생화학적 연구의 수행에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 통상적으로 피부에 접촉되는 것이 기대되는 물질에 대한 효능 또는 독성 검사에 사용될 수 있다. 상기 피부에 접촉되는 것이 기대되는 물질은 의약품(특히, 외용제재), 화장품, 섬유 또는 세제 등의 모든 물질을 총칭하며, 대표적으로는 의약품 또는 화장품의 효능 또는 독성 검사에 사용되는 것일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 삼차원 배양 피부모델은 정상적인 피부상태에서의 효능 또는 독성 검사 뿐 아니라, 화학물질, 화상, 창상, 흉터, 궤양 등으로 피부가 손상된 경우에 대한 병증 모델로도 사용될 수 있다. 이에 더하여, 본 발명에 따른 삼차원 배양 피부모델은 동물실험 대체로써 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 삼차원 배양 피부모델은 단순 실험용이 아니라 이식 및 상처치료용 의약품으로도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 삼차원 배양 피부모델은 인간 피부층에 가까운 구성을 가지고 있어 전 세계적인 동물실험 대체 모델에 대한 요구에 있어서 피부 모델에 대안으로 사용될 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 진피층과 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델 제조에 사용한 재료
본 발명에서는 진피층과 표피층을 포함하고, 그 형태가 자연피부층에 유사하게 조성된 삼차원 배양 피부모델을 제조하기 위해서 실험을 진행하였다. 기본적인 삼차원 배양 피부모델을 제조하는데 사용한 재료는 하기와 같다.
※ 실험재료
마우스 유래 섬유아세포 (mouse fibroblast 3T3 cell line) 또는 인간 유래 섬유아 세포(human fibroblast)
인간 케라틴 세포 (Human keratinocytes)
콜라겐(아텔로콜라겐 및/또는 천연형 콜라겐)
트랜스웰 인서트-6웰
삼차원 배양 전용 용기
10% FBS 포함된 DMEM/F12 배양액
표피 성장 인자(Epidermal Growth Factor, EGF)
상기 재료들을 이용하여 진피층과 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델을 하기 실험을 통하여 제조하였다.
실시예 2. 진피층과 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델 제조
2-1. 진피층(Collagen dermis) 제조
마우스 유래 섬유아세포 3T3 세포 또는 인간 유래 섬유아세포를 2.0 mg/mL 콜라겐 용액과 10X Reconstruction Buffer(0.2M sodium biocarbonate, 0.2M HEPES, 0.05N NaOH)과 혼합하여 세포수 1 × 105 /ml의 농도가 되도록 세포혼합용액을 만든 후, 6웰-트랜스웰 인서트에 세포혼합용액 2ml씩 첨가하였다. 37 ℃ 10% CO2 인큐베이터에서 밤새(1~24시간) 굳혔다.
2-2. 표피층(Epidermis setting) 제조
상기 실시예 2-1에서 제조한 진피층 위에 케라틴 세포를 2.5 × 105씩 진피층 위에 접종하여 배양하였다. 2일 간격으로 10 ng/ mL EGF가 포함된 배양액으로 교체하면서 케라틴 세포가 sheet를 형성할 때까지 37 ℃ 10% CO2 인큐베이터에서 약 5 내지 6일간 배양하였다. 케라틴 세포가 진피층 위에 sheet를 형성하면, 공기 노출(air-lift)을 위해 6 웰 타입의 삼차원 배양 전용 용기로 옮겼다. 이후 10 ng/mL의 EGF가 포함된 배양액으로 용기를 채운 후 상기 제조한 진피-표피층을 공기에 노출시켰다.
한편, 표피층 제조시 각막 유래 케라틴세포 또는 구강점막 유래 케라틴세포로 접종한 경우와 케라틴 세포와 함께 멜라닌세포를 동시에 접종하여 본 발명의 삼차원 배양모델을 제작하였다.
이후 4일 간격으로 10 ng/mL EGF가 포함된 배양액으로 교체하면서 총 14일을 배양하였다.
2-3. 조직 염색 (H&E staining)
상기 실시예 2-2에서 제조한 진피-표피층 삼차원 배양 피부모델을 H&E(Hematoxylin & Eosin) 조직 염색으로 그 구조를 확인하였다.
H&E 조직 염색은 당업계에 널리 알려진 실험 과정을 통하여 이루어졌다.
그 결과 도 1에서 확인할 수 있듯이, 마우스 유래 섬유아세포를 사용한 경우 인간 유래 섬유아세포를 사용한 경우보다 진피층 형성이 2배 가량 두꺼운 것을 볼 수 있으며, 조직도 고른 두께로 안정적인 피부모델이 형성된 것을 확인할 수 있다. 이러한 인간 유래 섬유아세포를 이용한 경우에는 초기 콜라겐의 두께를 유지하지 못하고 분해되어 두께가 많이 얇아지는 현상을 보였다.
그에 비하여 마우스 유래 섬유아 세포는 표피층과 진피층의 비율이 1 : 1로 두껍게 형성되었으며, 표피층 또한 고르고 안정적인 형태를 가지는 것을 확인하였다. 아울러, 표피층은 기저, 유극, 과립, 각질층이 형성되어야 하는데, 마우스 유래 섬유아세포를 사용한 경우에는 명확한 기저층 경계를 확인할 수 있고 표피층에 각 층이 안정적으로 형성되어 있는 것을 확인할 수 있다.
또한, 표피층 제조시 각막 유래 케라틴세포 또는 구강점막 유래 케라틴세포로 접종한 경우와 케라틴 세포와 함께 멜라닌세포를 동시에 접종한 결과 상기 추가적으로 접종한 세포들을 포함하여 안정적인 삼차원 피부모델을 제조할 수 있음을 확인하였다(도 7 내지 도 9).
이는 마우스 유래 섬유아세포를 진피층 제조에 이용시 인간 유래 섬유아세포를 사용한 경우보다 고르고 안정적인 피부모델을 제조할 수 있음을 보여주는 결과이다. 이에 이러한 안정적인 진피층 두께의 차이의 원인을 확인하고자 하였다.
2-4. MMP-1 발현량 확인
상기 실시예 2-3에서 조직 염색으로 확인한 조직학적인 차이의 원인을 분석하고자 상기 마우스 유래 섬유아세포 또는 인간 유래 섬유아세포를 이용한 삼차원 배양 피부모델 제조시 2일간 배양한 배양액에서 콜라겐 등을 분해하는 기질분해효소 중 MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1)의 발현량을 측정하였다.
MMP-1의 발현량은 웨스턴 블랏팅을 통해 측정하였으며, 웨스턴 블랏팅은 당업계에서 널리 알려진 방법을 통해 수행하였다.
그 결과 도 2에서 확인할 수 있듯이, 인간 유래 섬유아세포를 사용한 경우에서만 MMP-1(54kDa)의 발현이 관찰된 반면, 마우스 유래 섬유아세포를 사용한 경우에는 MMP-1의 발현이 관찰되지 않았다. 이에 따라, 상기 실시예 2-3에서 확인한 진피층의 수축 현상은 MMP-1에 의한 진피층의 콜라겐이 분해되는 것에 의해서 이루어지는 것임을 확인할 수 있다.
2-5. 표피층 형성에 미치는 영향- Sheet 형성능 비교
마우스 유래 섬유아세포 또는 인간 유래 섬유아세포를 공배양(co-culture)한 케라틴 세포의 cell sheet 형성능을 비교하였다. 구체적으로는 용기면적 58 cm2의 세포배양용기에 상기 마우스 유래 또는 인간 유래 섬유아 세포를 접종한 후, 그 위에 1x105 의 케라틴 세포를 접종하였다. 배양 11일째 rhodamine용액으로 염색하여 Cell Sheet 형성 여부를 확인하였다.
그 결과 도 3에서 확인할 수 있듯이, 마우스 유래 섬유아세포(B)를 사용한 경우에는 배양용기 전면이 염색되어 접종 11일차에 Cell Sheet를 형성한 것으로 관찰된 반면, 인간 유래 섬유아세포(A)를 사용한 경우는 완전한 Cell Sheet를 형성하지 못하는 것을 확인할 수 있다.
이러한 결과는 인간 유래 섬유아세포를 사용하여 표피층을 제조하는 경우 Cell Sheet를 형성시키고 air-lifting하는 시점이 마우스 유래 섬유아세포를 사용하는 경우보다 지연되거나, 케라틴 세포의 초기 접종 세포수로 많은 양이 필요하다는 것을 확인할 수 있다.
2-6. 소결
상기 살펴본 바와 같이, 마우스 유래 섬유아세포를 사용하여 진피층을 형성하는 경우에 인간 섬유아세포를 사용한 경우보다 i) 진피층 형성능이 우수하고, ii) 표피층 형성능 및 분화능이 우수하며, iii) 초기 공급한 콜라겐이 유지되어 진피층 유지능이 우수하고, iv) 표피층 형성 속도가 빨라지는 것을 확인하였다. 이는 마우스 유래 섬유아세포를 사용할 경우 자연피부조직과 유사한 형태를 가질 뿐 아니라 삼차원 배양 피부모델을 제조하는데 소요되는 시간도 감축시킬 수 있음을 보여준다.
본 발명은 특히 의약품 및 화장품의 독성 및 효능 실험에 사용하기 위한 삼차원 배양 피부모델은 대량 생산이 요구되는 경우가 많기 때문에 상기 적은 수의 케라틴 세포를 필요로 한다거나 삼차원 배양 피부모델을 제조하는데 소요되는 시간이 감축되는 것의 의미가 크다고 할 수 있다.
실시예 3. 콜라겐 종류에 따른 삼차원 배양 피부모델 제조 최적화
상기 실시예 2에서는 본 발명의 삼차원 배양 피부모델을 제조함에 있어 마우스 유래 섬유아세포를 사용하는 것의 우수성을 확인하였다. 본 발명자들은 이에 더하여 삼차원 배양 피부모델 제조를 최적화하기 위하여 진피층을 형성하는 다른 요소인 콜라겐을 최적화하고자 하였다.
3-1. 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐을 이용한 최적화
콜라겐은 천연형 콜라겐(Native collagen)과 천연형 콜라겐에 비하여 면역원성이 낮은 아텔로콜라겐(Atelocollagen)을 이용하였다. 구체적으로 아텔로콜라겐만을 이용하여 제조한 실험군 1, 천연형 콜라겐만을 이용하여 제조한 실험군 2 및 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐을 1 : 5의 비율로 혼합하여 사용한 실험군 3을 제조하여 비교하였다.
그 결과 도 4에서 확인할 수 있듯이, 아텔로콜라겐만을 이용하여 진피층을 형성한 실험군 1은 육안상으로도 콜라겐 층이 수축하는 현상(▶ 표시)을 확인할 수 있었다. 그에 비하여, 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐을 혼합한 실험군 3은 콜라겐 수축 현상을 보이지 않았으며, 천연형 콜라겐만을 사용한 경우와 유사한 정도로 표피층이 형성되고 전층이 분화하는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 삼차원 배양 피부모델 제작시에 면역원성이 없는 아텔로콜라겐을 사용하는 것이 유용하나, 심한 콜라겐 수축현상과 이에 따른 표피층 형성 및 분화 감소의 기존의 문제점을 천연형 콜라겐(아텔로콜라겐 : 천연형 콜라겐 = 1 : 5)을 첨가하는 것을 통하여 상당부분 극복할 수 있다는 것을 보여준다.
상기 결과의 원인을 확인하기 위하여 이후 실험을 진행하였다.
3-2. 콜라겐 종류에 따른 MMP 발현량 측정
콜라겐 수축 현상은 일반적으로 기질분해효소(Matrix Metalloproteinase, MMP)의 발현 여부 또는 발현량과 관련이 되어 있으므로, 상기 실시예 3-1에서 콜라겐 종류에 따라 제조한 실험군 1 내지 3의 삼차원 배양 피부조직을 배양한 배양액에서 MMP-2와 MMP-9의 발현량을 분석하였다. 각각 기질분해효소의 발현량은 ELISA법을 이용하여 정량분석하였다.
그 결과 도 5에서 확인할 수 있듯이, 아텔로콜라겐만을 사용한 실험군 1의 경우 MMP-2와 MMP-9의 발현이 실험군 2 및 3에 비하여 2배 이상 현저히 높은 것을 확인할 수 있다. 그에 비해서 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐을 혼합한 실험군 3은 천연형 콜라겐만을 사용한 경우와 유사한 수준의 MMP-2 및 MMP-9 발현량을 보였다.
이러한 결과는 삼차원 배양 피부모델 제작시 사용하는 콜라겐 종류에 따라 진피층의 콜라겐 수축현상이 달라지는 것은, 단순 상이한 콜라겐이 분해되는 특이성 차이 뿐만 아니라 콜라겐이 세포에 특정 자극을 주어 기질분해효소의 발현량을 변화시키는 것을 통해서도 이루어진다는 것을 확인할 수 있다. 약간의 천연형 콜라겐을 첨가하는 것만으로 이러한 차이가 발생할 수 있다는 것은 본 발명자들이 처음 밝힌 것이다.
3-3. 콜라겐 혼합 비율에 따른 삼차원 배양 피부모델 제조
아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐의 혼합 비율을 여러가지로 달리하여 삼차원 배양 피부모델을 제조하였다. 구체적으로는 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐의 비율을 1 : 1로 한 실험군 A, 1 : 5로 한 실험군 B 및 1 : 10으로 한 실험군 C를 제조하였다.
그 결과 도 6에서 확인할 수 있듯이, 모든 실험군에서 표피층과 진피층이 1 : 1 비율로 안정적으로 구성되었음을 확인하였다. 육안적으로도 콜라겐 수축현상이 관찰되지 않았다. 따라서, 혼합비율이 1: 1 내지 1: 10에 이르도록 진피층의 수축현상 없이 인공피부조직이 안정적으로 제조되는 것을 보여준다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (17)

  1. a) 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐(Native collagen) 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐(Atelocollagen)의 조합;을 포함하는 조성물을 배양접시에 접종하여 굳혀 진피층을 제조하는 단계;
    b) 상기 a) 단계에서 제조된 진피층의 상층에 케라틴 세포를 접종하여 cell sheet를 형성할 때까지 배양하는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계에서 형성된 cell sheet를 공기 중에 노출시켜 배양하여 표피층을 형성하는 단계를 포함하는, 진피층 및 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계에서 천연형 콜라겐은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 알파 1 체인(alpha-1 chain) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 알파 2 체인(alpha-2 chain)을 포함하고, 아텔로콜라겐은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 알파 1 체인(alpha-1 chain) 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 알파 2 체인(alpha-2 chain)을 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계에서 진피층은 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐의 조합을 포함하는 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐의 조합은 아텔로콜라겐과 천연형 콜라겐의 조합 비율이 1:0.1 내지 1:20인 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 마우스 유래 섬유아세포에 의해 진피층을 형성시킴으로써 인간 유래 섬유아세포를 이용하는 경우에 비교하여 하기의 특성 중 하나 이상을 가지는, 방법;
    i) 진피층 형성능 증가;
    ii) 표피층 형성능 증가;
    iii) 표피층 분화능 증가;
    iv) 콜라겐 수축 현상 억제;
    v) 콜라겐층 분해 현상 억제;
    v) 기질분해효소(Matrix Metalloproteinase) 발현량 감소;
    vi) cell sheet 형성 속도 증가.
  6. 제1항에 있어서, 상기 천연형 콜라겐 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐 조합에 의해 진피층을 형성시킴으로써 아텔로콜라겐을 단독으로 이용하는 경우에 비교하여 하기의 특성 중 하나 이상을 가지는, 방법;
    i) 콜라겐 수축 현상 억제;
    ii) 표피층 분화능 증가;
    iii) 기질분해효소(Matrix Metalloproteinase) 발현량 감소;
    iv) 콜라겐층 분해 현상 억제.
  7. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계에서 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐(Native collagen) 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐(Atelocollagen)의 조합;을 포함하는 조성물은 cm2당 마우스 유래 섬유아세포를 1 × 104 내지 1 × 107 세포수 포함하는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계에서 조성물은 섬유아세포(Fibroblast), 모유두세포(Dermal Papillar cell), 내피세포(Endothelial cell), 지방세포(Adipocyte) 및 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 1시간 내지 48시간 동안 수행하는 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계는 a) 단계에서 제조된 진피층 cm2당 1 × 104 내지 1 × 107 세포수의 케라틴 세포를 접종하는 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계에서 케라틴 세포는 피부, 점막, 각막, 모낭 또는 상피조직 유래 케라틴 세포인 것인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계에서 케라틴 세포 접종은 멜라닌세포(Melanocyte), 메르켈 세포(Merkel cell) 및 랑게르한스 세포(Langerhans cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계는 7일 내지 21일 동안 수행하는 것인, 방법.
  14. 마우스 유래 섬유아세포; 천연형 콜라겐(Native collagen) 또는 천연형 콜라겐과 아텔로콜라겐(Atelocollagen)의 조합;을 포함하는 조성물로 제조된 진피층과 케라틴 세포에 의해 형성된 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델.
  15. 제14항에 있어서, 상기 삼차원 배양 피부모델은 의약품 또는 화장품의 독성 및 효능 시험에 사용되는 것을 특징으로 하는, 삼차원 배양 피부모델.
  16. 제14항에 있어서, 상기 삼차원 배양 피부모델은 동물실험 대체용인 것을 특징으로 하는, 삼차원 배양 피부모델.
  17. 제14항에 있어서, 상기 삼차원 배양 피부모델은 피부 이식 및 상처치료용인 것을 특징으로 하는, 삼차원 배양 피부모델.
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