CN102120033A - 促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子的胶原蛋白缓释载体材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子的胶原蛋白缓释载体材料及其制备方法。为了克服现阶段口腔及面部多种组织创伤药物效果差的缺点，本发明用脂质体、壳聚糖、糖胺多糖等改性的胶原蛋白组成生物活性胶原蛋白缓释材料，结合碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板衍生生长因子（PDGF-BB）、血管内皮生长因子（VEGF）、角质化细胞生长因子（KGF）中的一种或几种研制而成，其特征在于：所述的每克生物活性缓释材料中含有不少于10ng的生长因子，对治疗拔牙创、口腔溃疡、面神经损伤以及下颌骨缺损等面部多种组织创伤有十分显著的疗效。本发明以长时间持续投用生长因子有效量释放到伤口部位，充分发挥生长因子的诱导作用，可明显缩短伤口愈合的时间，达到治疗目的。
Description
技术领域
本发明涉及促进口腔额面部多种创伤修复，特别是促进拔牙创口、口腔溃疡、面神经损伤、颌骨缺损等创伤修复的促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子的胶原蛋白缓释载体材料及其制备方法。
背景技术
口腔颌面部位置暴露，平时不易防护。当人或动物口腔颌面部遭受各种外科手术以及交通事故带来的各种物理伤害时，常常造成神经组织、牙齿、黏膜上皮组织、软组织及骨组织的破坏和缺损，并可造成出血和感染的机会。在正常的情况下，伤口可自然愈合并修复。伤口自然愈合和修复过程包括：第一阶段，止血，即具有粘性的血小板附着在胶原蛋白上，以在破裂的血管上形成血栓。第二阶段，炎性反应，即血管和细胞应对致伤进行炎症反应。通过血管舒张，白细胞进入抵抗感染而导致血流减少。第三阶段，再生，即身体通过生成肉芽(红色粒状带血管组织)，代替伤口内的疤痕和碎片开始进行自我修复。这个阶段完成后就有上皮生成，然后伤口最终闭合。第四阶段，组织重构，即伤口内胶原蛋白的含量不断增加，使伤口强度也不断增加。最终生成疤痕组织，它相对正常皮肤较弱，弹性要差很多。在大多数情况下，自然愈合过程是有效的。但由于组织发生学上的原因，某些组织，特别是骨组织和外周神经组织，则很难愈合。而口腔溃疡、拔牙创口的产生则给人们带来痛苦，严重影响人们的生活质量。另外，有些伤口往往因为病人身体素质、严重程度及并发感染等因素的影响，特别是存在于口腔颌面部的伤口，若不及时治疗，则易产生疤痕，影响美观，探寻一种有效的途径和药物治疗创伤显得至关重要，所以大多数情况下的口腔颌面部伤口愈合需要医疗干预。例如，拔牙创口产生后的填充、止血，促愈合；口腔溃疡需创面贴膜；颌骨缺损填充和修复。另外涉及外周神经组织的损伤如面神经等如果不投用某些促神经组织修复的药物则很难恢复，导致表情肌僵硬，难以收缩或舒张。促进伤口愈合和组织修复的一种方法是在局部用包括各种生长因子在内的伤口愈合促进剂。国内外大量的研究已表明：碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能促进多种细胞增殖、促使微血管的生长和分化，使局部毛细血管的数目增加。最近的研究还表明：bFGF可刺激培养的骨细胞的DNA合成和增殖，从而增加骨细胞合成胶原和非胶原蛋白的能力，有利于骨质的生长；血小板衍生生长因子（PDGF-BB）在口腔粘膜下纤维化 (OSF)的病理生理过程中可能起重要作用；血管内皮生长因子（VEGF）不仅在正常口腔粘膜及慢性炎症组织中的表达及血管生成在机体出生前后的生理及病理过程中至关重要，还能加速创伤性骨的修复及伤口的愈合；角质化细胞生长因子（KGF）具有抑制上皮细胞凋亡、特异性刺激上皮细胞的增殖的生物学作用；神经细胞生长因子（NGF）则能有效促进神经损伤的修复。这些都为治愈口腔颌面部创伤提供充分的依据。它们对于口腔及颌面部各种组织创伤的修复具有协同作用。加入这些愈合促进剂，能有效地刺激口腔黏膜细胞增殖、下颌骨缺损的愈合、拔牙创口的修复、面神经损伤的恢复。
然而，这些生长因子最大的缺点在于不能保证药物在伤口部位以有效量长时间缓慢释放并发挥作用，而且单纯使用生长因子也往往不能真正有效地促进整个损伤组织的全面修复，其主要原因是生长因子作为蛋白药物，具有稳定性差、全身用药体内半衰期短、全身用药后局部浓度低、容易被体液降解等缺点。某些具有良好组织修复活性的药物，例如生长因子，如果不借助适当的局部投药物载体，使药物从固体或半固体载体材料中长时间持续投用的有效量释放到伤口部位，则将不能发挥其治疗价值。因此，研究此种药物具有广泛的临床意义。
发明内容
本发明的目的在于为克服现有技术的不足而提供一种能快速促口腔颌面部损伤的修复，特别是对于拔牙创口、口腔溃疡、面神经等的外周神经损伤、颌骨缺损的促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子的胶原蛋白缓释载体材料。
为实现上述目的，本发明公开了一种促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子的胶原缓释载体材料，包括主要用壳聚糖、脂质体、糖胺多糖等改性的胶原蛋白组成的缓释载体材料，其特征在于：所述的每克生物活性缓释载体材料中含有不少于10ng的生长因子。其中的糖胺多糖为透明质酸、6-硫酸软骨素、4-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸肝素的一种或多种；生长因子为碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、角质化细胞生长因子中的一种或几种。
本发明提供的复合生长因子胶原蛋白缓释载体是一类多孔载体胶原膜，其上附着的生长因子植入创伤组织后可以缓慢释放，有利于多种组织生长，具有稳定性高、全身用药体内半衰期较长、全身用药后局部浓度高等优点。它还能够充分吸收伤口渗出液，起到良好的引流作用，同时由于口腔创面湿润，具有自溶作用，其愈合可以简化清创术，促进伤口的洁净、湿润环境有利于口腔创面愈合。表现在：（1）口腔溃疡导致的炎症扩散消退；（2）伤口疼痛减轻；（3）拔牙创口的止血；（4）形成封闭的局部缺氧微环境，破坏细菌的生存条件，使细菌生长减少病原体消失；（6）利于局部生长因子的释放。此外，复合生长因子的胶原蛋白缓释载体用于创伤局部释放生长因子来促进软组织愈合的同时，还可以加快受创神经的修复，提高受损神经的预后；本发明还使骨痂和新骨体积增加，成骨细胞数量和活性增加，骨的机械强度也有所提高，整个过程按骨愈合的正常顺序进行。
本发明的另一个目的是提供制备上述生物活性胶原蛋白缓释载体材料的制备方法。
为达到上述目的，本发明提供了一种促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子胶原缓释载体材料的制备方法，其特征在于所述制备方法包括如下步骤：
（1）从动物的皮肤、软骨、肌腱等含有丰富胶原蛋白的组织中提取出胶原蛋白，并制备成一定粘度的溶液；
（2）配制交联剂水溶液，与上述胶原溶液混合使充分交联，交联剂占混合溶液重量的5%-10%；
（3）配制一定浓度的脂质体、壳聚糖、糖胺多糖水溶液，脂质体或壳聚糖质量为胶原蛋白量的10%-70%，糖胺多糖为胶原蛋白量的5%-10%（均为质量分数）；
（4）取生长因子按每克胶原蛋白缓释载体中不少于10ng的生长因子配制成水溶液与步骤（3）所得脂质体、壳聚糖或糖胺多糖溶液混合制成生长因子溶液；
（5）在温和的搅拌条件下，将步骤（4）所得的混合溶液加入到步骤（2）所得的溶液中；
（6）将步骤（5）所得的混合液分装在模具内冷冻干燥；
（7）无菌封装在医用包装袋内；
（8）用20-40KGy的伽马射线照射灭菌。
促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子胶原缓释载体材料的另一个制备方法，其特征在于所述的制备方法包括：
（1）从动物的皮肤、软骨、肌腱等含有丰富胶原蛋白的组织中提取出胶原蛋白，并制备成一定粘度的溶液；
（2）将制得的胶原溶液冷冻干燥，然后将干燥产物在pH5.4的0.05M的2N-吗啡啉-乙磺酸溶液中用1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基-碳化二亚氨/NHS交联，交联后用0.1M的Na2HPO4溶液冲洗，然后用软化水洗；
（3）将步骤（2）所得交联后的胶原蛋白海绵再次浸润到pH5.6的0.05M的2N-吗啡啉-乙磺酸溶液中，然后在2N-吗啡啉-乙磺酸溶液中使交联的胶原蛋白载体与用1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基-碳化二亚氨/NHS活化的肝素溶液反应，反应结束后用0.1M的Na2HPO4溶液冲洗，然后用软化水洗反应后的胶原蛋白海绵；再将此胶原蛋白海绵浸润在磷酸缓冲液溶液中过夜，用滤纸吸除多余的水份，把胶原片置于含有小牛血清的适量生长因子磷酸缓冲液中，每克生物海绵中不少于10ng的生长因子，在室温下反应，然后样品用PBS溶液冲洗两次除去没有结合上的生长因子，最好将结合上生长因子的胶原蛋白载体再次冷冻干燥；
（4）无菌封装在医用包装袋内；
（5）用20-40KGy的伽马射线照射灭菌。
其中交联剂可以是但不限定于戊二醛、己异二氰酸酯、碳化二亚胺、叠氮二苯基膦或京尼平中的一种；所述的生长因子包括但并不限于碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、角质化细胞生长因子中的一种或几种。
下面实施例旨在进一步说明本发明促进损伤修复复合生长因子胶原蛋白缓释载体的制备方法以及其应用，但这些实施例并不以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。
具体实施方式
实施例1：在10摄氏度以下，无菌条件下取0.4%的胶原蛋白溶液100ml与100mg戊二醛充分反应后，在搅拌的情况下缓慢加入2%的壳聚糖溶液70ml，然后再在缓慢的搅拌情况下滴加bFGF 10ng，搅拌均匀后放置12h，然后分装在适宜的模具里，冷冻干燥，医用包装袋无菌封装，用20-40KGy的伽马射线照射灭菌，得到所需的生物活性缓释载体。
实施例2：在10摄氏度以下，无菌条件下取0.4%的胶原蛋白溶液100ml与100mg己异二氰酸酯充分反应后，在搅拌的的情况下缓慢加入2%的壳聚糖溶液10ml，然后再在缓慢的搅拌情况下滴加bFGF : PDGF-BB 为1:1共15ng，搅拌均匀后放置12h，然后分装在适宜的模具里，冷冻干燥，医用包装袋无菌封装，20-40KGy的伽马射线照射灭菌，得到所需的生物活性缓释载体。
实施例3：在10摄氏度以下，无菌条件下取0.4%的胶原蛋白溶液100ml与100mg碳化二亚氨充分反应后，在搅拌的的情况下缓慢加入2%的6-硫酸软骨素溶液5ml，然后再在缓慢的搅拌情况下滴加bFGF : PDGF-BB 为1:1 共20ng，搅拌均匀后放置12h，然后分装在适宜的模具里，冷冻干燥，医用包装袋无菌封装，用20-40KGy的伽马射线照射灭菌，得到所需的生物活性缓释载体。
实施例4：在10摄氏度以下，无菌条件下取0.4%的胶原蛋白溶液100ml与100mg京尼平充分反应后，在搅拌的的情况下缓慢加入2%的硫酸皮肤素溶液8ml，然后再在缓慢的搅拌情况下滴加bFGF：VEGF为1：1共 20ng，搅拌均匀后放置12h，然后分装在适宜的模具里，冷冻干燥，医用包装袋无菌封装，用20-40KGy的伽马射线照射灭菌，得到所需的生物活性缓释载体。
实施例5：在10摄氏度以下，无菌条件下取0.4%的胶原蛋白溶液100ml与100mg叠氮二苯基膦充分反应后，在搅拌的的情况下缓慢加入2%的4-硫酸软骨素溶液10ml，然后再在缓慢的搅拌情况下滴加bFGF：NFG为1：2共 30ng，搅拌均匀后放置12h，然后分装在适宜的模具里，冷冻干燥，医用包装袋无菌封装，用20-40KGy的伽马射线照射灭菌，得到所需的生物活性缓释载体。
实施例6：在10摄氏度以下，无菌条件下取0.4%的胶原蛋白溶液100ml与100mg戊二醛充分反应后，在搅拌的的情况下缓慢加入2%的硫酸肝素溶液7ml，然后再在缓慢的搅拌情况下滴加VEGF：PDGF-BB共 30ng，搅拌均匀后放置12h，然后分装在适宜的模具里，冷冻干燥，医用包装袋无菌封装，用20-40KGy的伽马射线照射灭菌，得到所需的生物活性缓释载体。
实施例7：在10摄氏度以下，无菌条件下取0.4%的胶原蛋白溶液100ml与100mg碳化二亚氨充分反应后，在高速搅拌的的情况下缓慢加入2%的壳聚糖溶液，使最后的溶液中壳聚糖的质量为胶原蛋白的10%，然后再在缓慢的搅拌情况下滴加bFGF：VEGF为1：1共20ng，搅拌均匀后放置12h，然后分装在适宜的模具里，冷冻干燥，医用包装袋无菌封装，用20-40KGy的伽马射线照射灭菌，得到所需的生物活性缓释载体。
实施例8：在10摄氏度以下，无菌条件下取0.4%的胶原蛋白溶液100ml与100mg戊二醛充分反应后，在搅拌的情况下缓慢加入2%的脂质体溶液70ml，然后再在缓慢的搅拌情况下滴加bFGF 10ng，搅拌均匀后放置12h，然后分装在适宜的模具里，冷冻干燥，医用包装袋无菌封装，用20-40KGy的伽马射线照射灭菌，得到所需的生物活性缓释载体。
实施例9：在10摄氏度以下，无菌条件下取0.4%的胶原蛋白溶液100ml与100mg己异二氰酸酯充分反应后，在搅拌的的情况下缓慢加入2%的脂质体溶液10ml，然后再在缓慢的搅拌情况下滴加bFGF : PDGF-BB 为1:1共15ng，搅拌均匀后放置12h，然后分装在适宜的模具里，冷冻干燥，医用包装袋无菌封装，20-40KGy的伽马射线照射灭菌，得到所需的生物活性缓释载体。
实施例10：在10摄氏度以下，无菌条件下取0.4%的胶原蛋白溶液100ml与100mg叠氮二苯基膦充分反应后，在搅拌的的情况下缓慢加入2%的4-硫酸软骨素溶液10ml，然后再在缓慢的搅拌情况下滴加bFGF：KGF为1：2共 30ng，搅拌均匀后放置12h，然后分装在适宜的模具里，冷冻干燥，医用包装袋无菌封装，用20-40KGy的伽马射线照射灭菌，得到所需的生物活性缓释载体。
实施例11：在10摄氏度以下，无菌条件下取0.4%的胶原蛋白溶液100ml与100mg京尼平充分反应后，在搅拌的的情况下缓慢加入2%的硫酸皮肤素溶液8ml，然后再在缓慢的搅拌情况下滴加bFGF：VEGF：PDGF_BB为1：1：1共 30ng，搅拌均匀后放置12h，然后分装在适宜的模具里，冷冻干燥，医用包装袋无菌封装，用20-40KGy的伽马射线照射灭菌，得到所需的生物活性缓释载体。
实施例12：在10摄氏度以下，无菌条件下取0.4%的胶原蛋白溶液100ml与100mg碳化二亚氨充分反应后，在高速搅拌的的情况下缓慢加入2%的脂质体溶液，使最后的溶液中脂质体的质量为胶原蛋白的10%，然后再在缓慢的搅拌情况下滴加bFGF：VEGF为1：1共20ng，搅拌均匀后放置12h，然后分装在适宜的模具里，冷冻干燥，医用包装袋无菌封装，用20-40KGy的伽马射线照射灭菌，得到所需的生物活性缓释载体。
促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子胶原蛋白缓释载体的应用实验：
一．拔牙创
本实验选用纯种新西兰大白兔12只，体重2.5kg~3.0kg，其中雄性5只，雌性7只。实验前圈养1周，排除有全身和局部疾患者。称重按0.5ml/kg体重用3%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉后，将实验动物头部固定，张口消毒后用拔牙钳分别拔除每只兔的双侧下颌侧切牙，形成拔牙创自身对照动物模型。一边给复合生长因子胶原蛋白缓释载体，另一边为空对照。动物拔牙后，拔牙创口内血液约15min形成血凝块将创口封闭，所有观察动物无1例发生伤口感染。拔牙后3天即可观察到肉芽组织生长，伤口缩小，第5天创口基本被肉芽组织所填充，创缘已见新生上皮向心性生长，第7~11天各组动物创口基本被上皮完全覆盖，但对照组比实验组上皮覆盖要晚1~2天。从创口面积大小测量显示，实验组(用复合生长因子胶原蛋白缓释载体侧)的拔牙创口与对照侧有显著性差异(P<0.05)，说明实验侧创口愈合速度快于对照侧。
拔牙后第7天组织学检查，见复合生长因子胶原蛋白缓释载体侧创口内成纤维细胞数量明显多于对照侧，生长增殖活跃，毛细血管数目也较对照侧多，许多创口边缘已有明显可见的基底细胞层及不完整上皮，牙槽内开始有新骨形成。拔牙后14天切片观察结果发现复合生长因子胶原蛋白缓释载体侧创面完全被结构完整的上皮覆盖，对照侧有2只动物仍残留少许创面，实验侧牙槽窝血管增生，纤维成骨明显，骨小梁比对照侧多而成熟，骨基质形成也较多。说明应用复合生长因子胶原蛋白缓释载体侧比对照侧成骨速度快。具有显著促进拔牙创成纤维细胞增殖及肉芽组织和上皮细胞生长，有利于牙槽新骨形成的作用。
二．口腔溃疡
新西兰大白兔16只，4月龄、体重2.5~3 kg，雌雄各半。随机分为2组，每组8只，分为复合生长因子的胶原蛋白缓释载体组和对照组。3%戊巴比妥钠静脉麻醉，40%冰醋酸烧灼，48 h用龙胆紫标记溃疡面积。形成溃疡处死3只模型动物，光镜观察。拭干后上药，对照组不做任何治疗。涂药2次/日。分别于用药48、96 h，每组随机处死2只兔，其余兔在溃疡愈合时处死，记录愈合时间。切取溃疡标本固定于10%福尔马林液中，光镜观察并照相分析。统计学分析数据取均值，平均愈合时间用方差分析检验和SNK-q检验。
肉眼观察:①溃疡模型:凹陷性缺损，大致呈圆形，直径在5~5.5 mm，边缘整齐，表面为黄白色，假膜覆盖，周围充血水肿。②用药2 d：复合生长因子的胶原蛋白缓释载体组假膜变薄，稍缩小；对照组未见变化。③用药4 d：复合生长因子的胶原蛋白缓释载体组明显缩小达1/2，假膜脱落，充血水肿消失，其中2个溃疡愈合。
光镜观察：①正常粘膜：上皮完整，下方为疏松结缔组织。②溃疡模型：上皮破溃溶解脱落，粘膜下有大量炎细胞浸润，多为淋巴细胞和中性粒细胞。③用药2 d：4组上皮坏死脱落，大量炎细胞浸润。④复合生长因子的胶原蛋白缓释载体组炎细胞浸润减少，大量成纤维细胞增生，肉芽组织形成；对照组大量炎细胞浸润，毛细血管扩张充血。⑤溃疡愈合：鳞状上皮完整、增厚，粘膜下为疏松结缔组织。复合生长因子的胶原蛋白缓释载体组平均愈合时间（4.94±0.62天），明显短于对照组平均愈合时间（8 9.88±0.58天）。
此实验证明复合生长因子的胶原蛋白缓释载体组能明显促进口腔溃疡愈合。
三．下颌骨缺损：
将16只新西兰白兔下颌骨制成骨缺损模型，分别植入复合生长因子的胶原蛋白缓释载体组，同时设空白对照组，分别手术后第2、4、8周进行大体观察，X线检查及组织学检查。术后第8周进行骨密度测定，比较修复骨缺损的疗效。结果发现经大体观察、组织学及X线检查发现，术后第8周复合生长因子的胶原蛋白缓释载体组能有效地修复节段性骨缺损，对照组无骨愈合迹象。术后第8周骨密度测定证明复合生长因子的胶原蛋白缓释载体组组骨密度值明显高于对照组。结论复合生长因子的胶原蛋白缓释载体组组成骨速度快，成骨量多，修复骨缺损的能力明显强于对照组。
四. 神经损伤
实验组10只成年Wistar大鼠造成10 mm面神经损伤后，以复合生长因子的胶原蛋白缓释载体包裹神经两断端，以假手术组和单纯损伤组(造成10 mm面神经损伤后，不加以任何干预措施)各10只大鼠为对照。术 后3个月，通过大体观察、形态学及电生理检查观察损伤神经的再生情况。结果术后3个月，实验组大鼠新生的神经纤维已通过损伤部位，手术局部未出现明显的炎症反应，各项指标明显优于单纯损伤组。结果发现复合生长因子的胶原蛋白缓释载体组对损伤的面神经修复具有良好促进神经生长的作用。
Claims (7)
1.促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子的胶原缓释载体材料，包括主要用壳聚糖、脂质体、糖胺多糖等改性的胶原蛋白组成的缓释载体材料，其特征在于：所述的每克生物活性缓释载体材料中含有不少于10ng的生长因子。
2.根据权利要求1所述的促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子胶原缓释载体材料，其特征在于：所述的糖胺多糖为透明质酸、6-硫酸软骨素、4-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸肝素的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的促口腔额面部多种创伤修复的胶原缓释载体材料，其特征在于：所述的生长因子为碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、角质化细胞生长因子中的一种或几种。
4.一种权利要求1所述的促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子胶原缓释载体材料的制备方法，其特征在于所述制备方法包括如下步骤：
（1）从动物的皮肤、软骨、肌腱等含有丰富胶原蛋白的组织中提取出胶原蛋白，并制备成一定粘度的溶液；
（2）配制交联剂水溶液，与上述胶原溶液混合使充分交联，交联剂占混合溶液重量的5%-10%；
（3）配制一定浓度的脂质体、壳聚糖、糖胺多糖水溶液，脂质体或壳聚糖质量为胶原蛋白量的10%-70%，糖胺多糖为胶原蛋白量的5%-10%（均为质量分数）；
（4）取生长因子按每克胶原蛋白缓释载体中不少于10ng的生长因子配制成水溶液与步骤（3）所得脂质体、壳聚糖或糖胺多糖溶液混合制成生长因子溶液；
（5）在温和的搅拌条件下，将步骤（4）所得的混合溶液加入到步骤（2）所得的溶液中；
（6）将步骤（5）所得的混合液分装在模具内冷冻干燥；
（7）无菌封装在医用包装袋内；
（8）用20-40KGy的伽马射线照射灭菌。
5.根据根据权利要求4 所述的促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子胶原缓释载体材料的制备方法，其特征在于：所述的交联剂是戊二醛、己异二氰酸酯、碳化二亚胺、叠氮二苯基膦或京尼平中的一种。
6.一种权利要求1所述的促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子胶原缓释载体材料的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括：
（1）从动物的皮肤、软骨、肌腱等含有丰富胶原蛋白的组织中提取出胶原蛋白，并制备成一定粘度的溶液；
（2）将制得的胶原溶液冷冻干燥，然后将干燥产物在pH5.4的0.05M的2N-吗啡啉-乙磺酸溶液中用1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基-碳化二亚氨/NHS交联，交联后用0.1M的Na2HPO4溶液冲洗，然后用软化水洗；
（3）将步骤（2）所得交联后的胶原蛋白海绵再次浸润到pH5.6的0.05M的2N-吗啡啉-乙磺酸溶液中，然后在2N-吗啡啉-乙磺酸溶液中使交联的胶原蛋白载体与用1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基-碳化二亚氨/NHS活化的肝素溶液反应，反应结束后用0.1M的Na2HPO4溶液冲洗，然后用软化水洗反应后的胶原蛋白海绵；再将此胶原蛋白海绵浸润在磷酸缓冲液溶液中过夜，用滤纸吸除多余的水份，把胶原片置于含有小牛血清的适量生长因子磷酸缓冲液中，每克生物海绵中不少于10ng的生长因子，在室温下反应，然后样品用PBS溶液冲洗两次除去没有结合上的生长因子，最好将结合上生长因子的胶原蛋白载体再次冷冻干燥；
（4）无菌封装在医用包装袋内；
（5）用20-40KGy的伽马射线照射灭菌。
7.根据权利要求6 所述的促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子胶原缓释载体材料的制备方法，其特征在于：所述的交联剂是戊二醛、己异二氰酸酯、碳化二亚胺、叠氮二苯基膦或京尼平中的一种。
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