CN113244377B - 可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备 - Google Patents

可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备 Download PDF

Info

Publication number
CN113244377B
CN113244377B CN202110421742.1A CN202110421742A CN113244377B CN 113244377 B CN113244377 B CN 113244377B CN 202110421742 A CN202110421742 A CN 202110421742A CN 113244377 B CN113244377 B CN 113244377B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pla
peg
pdgf
cross
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110421742.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113244377A (zh
Inventor
甘志华
蔡素素
柳朝永
秦蒙
喻青松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing University of Chemical Technology
Original Assignee
Beijing University of Chemical Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing University of Chemical Technology filed Critical Beijing University of Chemical Technology
Priority to CN202110421742.1A priority Critical patent/CN113244377B/zh
Publication of CN113244377A publication Critical patent/CN113244377A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113244377B publication Critical patent/CN113244377B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备，属于纳米胶囊领域。该纳米胶囊是通过原位自由基聚合的方法来制备的。单体和交联剂通过静电作用/氢键作用富集在单个PDGF‑BB周围，在引发剂(APS和TEMED)的作用下产生自由基，进行原位自由基聚合。我们是通过对纳米胶囊组分(交联剂)进行设计来实现可控释放。选用了两种可以响应pH值降解的交联剂，但它们降解速率不同，通过调整两者比例，能够实现PDGF‑BB的控制释放。合成的纳米胶囊将PDGF‑BB包裹起来，提高其稳定性，还能实现PDGF‑BB的控制释放，这对于伤口修复、组织再生类疾病具有重要意义，同时为其他蛋白类药物的递送提供了思路。

Description

可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备
技术领域
本发明涉及控制释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备方法，属于纳米胶囊领域。
背景技术
血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)是一种耐热耐酸以及易被蛋白酶水解的阳离子糖蛋白，可由多种细胞分泌，如：血小板、成纤维细胞、巨噬细胞等等。PDGF有四种单体PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C,PDGF-D，这些单体通过二硫键连接形成二聚体形式。其中PDGF-BB作为一种有丝分裂促进剂，可以刺激成纤维细胞和平滑肌细胞增殖和迁移、促进巨噬细胞产生和分泌生长因子。在伤口修复、组织再生骨骼和牙齿再生以及关节修复方面的作用更为显著。尤其在伤口修复方面，是美国食品药品监督管理局(FDA)唯一批准的用于糖尿病溃疡治疗的生长因子。
伤口修复和组织再生类疾病需要生长因子在患病部位长期维持一定浓度，但PDGF-BB半衰期短(＜2min)，容易被蛋白酶降解，而像慢性伤口床中存在大量蛋白酶，使得PDGF-BB更容易失活。一般会采用多次大剂量给药的方式来维持药物浓度，但这样存在致瘤的风险。所以需要设计一种载体来提高PDGF-BB稳定性，同时能够长期维持一定的药物浓度。
目前常用的控制释放的载体有水凝胶、脂质体、纳米颗粒以及纳米纤维等，但这些递送载体或多或少存在一定的缺陷，如水凝胶容易溶胀导致药物突释；纳米颗粒、纳米纤维合成过程中往往需要有机溶剂，或反应条件剧烈，对生长因子活性造成影响。所以我们设计合成了纳米胶囊来解决这些问题。
发明内容
本发明的目的在于可控释放PDGF-BB纳米胶囊的合成，是采用原位自由基聚合的方法合成的，反应条件温和，对PDGF-BB的生物活性不会产生影响；把PDGF-BB-BB包裹在纳米胶囊壳内，避免暴露在酶环境中，提高稳定性。PDGF-BB的释放是通过纳米胶囊壳的降解实现的，我们选用了响应碱性pH值降解的两种交联剂AI102和GDMA，两种交联剂的降解基于自身酯键基团，但这两种交联剂在碱性条件下降解速率不同。通过调整两者的比例，可以实现纳米胶囊不同速率的降解，可以针对不同疾病治疗窗选择合适的交联剂比例(见图1)。
为实现上述目的本发明的技术方案如下：
一种可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)交联剂PLA-PEG-PLA-双丙烯酸酯(AI102)即AC-PLA-PEG-PLA-AC的合成:首先通过PEG引发丙交酯开环聚合，合成PLA-PEG-PLA，然后使用丙烯酰氯与PLA-PEG-PLA反应，合成AC-PLA-PEG-PLA-AC；
具体包括如下：
反应管中加入PEG、纯化好的D,L-丙交酯和辛酸亚锡的无水甲苯溶液，140℃反应6h，反应完成后，冷却至室温。以二氯甲烷为溶剂溶解产物，然后缓慢滴到冰乙醚种沉析，干燥即得PLA-PEG-PLA；
PLA-PEG-PLA溶解于无水二氯甲烷中，然后滴加三乙胺和丙烯酰氯的无水二氯甲烷溶液，冰浴条件下，滴加完成后反应12h；过滤除去生成的铵盐，旋蒸除去二氯甲烷，正己烷沉析，真空干燥得AC-PLA-PEG-PLA-AC。
PEG优选为PEG1000，PEG、D,L-丙交酯和辛酸亚锡的摩尔比为1:3:0.005；
PLA-PEG-PLA、三乙胺和丙烯酰氯的摩尔比为1:3:3；
(2)PDGF-BB纳米胶囊的制备
以丙烯酰胺(AAM)和2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)为单体，AI102(交联剂1)和GDMA(交联剂2)为交联剂，将上述物质加入到PDGF-BB溶液中混匀，然后加入引发剂APS和TEMED，冰浴条件下反应2小时；反应完成后通过超滤法来进行纯化，以除去未反应的游离单体、引发剂和PDGF-BB；
具体包括如下：
取丙烯酰胺(AAM)、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)、交联剂AI102、APS分别制备成水溶液；交联剂GDMA加入DMSO制备成溶液；
将PDGF-BB溶液、AAM水溶液、AMPS水溶液、AI102水溶液、GDMA溶液在反应管中混合均匀，加入APS和TEMED，涡旋混匀，放到冰上，反应2小时；反应完后，将反应管里的混合物加入到分子量为50KD的超滤管中，加入适1×PBS稀释，配平后放入离心机中，离心，将滤液倒掉，继续加入1×PBS稀释离心，重复多次。
其中交联剂AI102：交联剂GDMA的摩尔比为(1-4):(0-2)；GDMA为二甲基丙烯酸甘油酯。
PDGF-BB：AAM：AMPS：(交联剂AI102+交联剂GDMA)：APS：TEMED的摩尔比为1:6000:100:600:480:2500。
纳米胶囊形貌表征：将合成的纳米胶囊滴在铜网上，使用磷钨酸溶液负染，用120KV透射电子显微镜来观测纳米胶囊的形貌。
纳米胶囊的粒径及Zeta电位：将纳米胶囊样品用PB缓冲液(pH7.0,10mM)透析，然后使用纳米激光粒度电位分析仪测量样品的粒径和Zeta电位。
纳米胶囊体外释放动力学：验证了不同交联剂比例下PDGF-BB具有不同的释放情况。
附图说明
图1：可控释放PDGF-BB纳米胶囊设计示意图
图2：PLA-PEG-PLA 1H-NMR谱图
图3：PLA-PEG-PLA红外光谱图
图4：AC-PLA-PEG-PLA-AC 1H-NMR谱图
图5：AC-PLA-PEG-PLA-AC红外光谱图
图6：不同交联剂比例纳米胶囊SDS-PAGE凝胶图
图7：纳米胶囊透射电镜图
图8：纳米胶囊粒径及Zeta电位
图9：不同交联剂比例纳米胶囊粒体外释放动力学
图10：不同pH条件下纳米胶囊粒体外释放动力学
具体实施方式
下面通过例子对本发明进行进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
一.PLA-PEG-PLA的合成
(1)取少量钠块切成小块和二苯甲酮一起加入甲苯中，用电加热套加热至沸腾，然后冷凝回流直至成为深蓝色，然后把甲苯蒸馏出来收集馏分，即得无水甲苯。取辛酸亚锡适量，使用无水甲苯溶解，即得。
(2)PLA-PEG-PLA的制备及表征。PLA-PEG-PLA的合成是通过丙交酯的开环聚合反应得到的。将所有要用的反应管洗净，120℃烘箱中干燥2h。反应管中加入适量PEG1000,100℃油浴条件下抽真空除去其中的水分，2h后撤去加热装置，关掉真空泵。冷却至室温后，按比例加入纯化好的D,L-丙交酯和Sn(Oct)2的甲苯溶液，140℃反应6h。反应完成后，冷却至室温。以二氯甲烷为溶剂溶解产物，然后缓慢滴到冰乙醚种沉析3次，放到真空干燥箱中进行干燥即得产物。以氘代氯仿为溶剂溶解样品，进行核磁表征。样品冷冻干燥后，取适量与溴化钾一起加入研钵中研磨，压片制样，进行红外光谱分析。
二.AC-PLA-PEG-PLA-AC的合成
(1)二氯甲烷除水：二氯甲烷中加入无水CaCl2放置2天，然后将二氯甲烷加入烧瓶中，加入固体CaH2后加热至沸腾，冷凝回流5h后收集蒸出的二氯甲烷。
(2)用适量除水二氯甲烷溶解上述合成的PLA-PEG-PLA，加入三乙胺，丙烯酰氯溶于无水二氯甲烷后使用滴液管缓慢加入，注意要在冰浴条件下。滴加完成后反应12h。反应完成后，过滤除去生成的铵盐，旋蒸除去二氯甲烷(注意不要蒸干)，正己烷沉析3次，放在真空干燥箱中干燥。以氘代氯仿为溶剂溶解样品，进行核磁表征。样品冷冻干燥后，取适量与溴化钾一起加入研钵中研磨，压片制样，进行红外光谱分析。
三.PDGF-BB纳米胶囊的制备及纯化
准备工作：
取丙烯酰胺(AAM)50mg，加入去离子水500μl，制成100mg/ml的溶液；
取2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)50mg，加入去离子水500μl，制成100mg/ml的溶液；
取AI102 50mg，加入去离子水500μl，制成100mg/ml的溶液；
取GDMA 1mg，加入DMSO 10μl，制成100mg/ml的溶液；
取APS 2mg，加入去离子水20μl，制成100mg/ml的溶液。
表1纳米胶囊合成参数(交联剂比例为AI102:GDMA)
Figure BDA0003027286980000061
按表1比例分别PDGF-BB溶液，AAM、AMPS、AI102、GDMA适量加入到1.5ml的离心管中，混匀之后，加入APS和TEMED，涡旋混匀，将制冰机制好的冰放在泡沫保温盒里，然后把离心管放在冰上，反应2小时。反应完后，将离心管里的混合物加入到分子量为50KD的超滤管中，加入适量1×PBS稀释，配平后放入离心机中，转速为5000rpm，4℃条件下，离心20min。离心完后，将滤液倒掉，继续加入1×PBS稀释离心，重复5次。最后收集超滤管里的液体，使用BCA法测浓度。
通过SDS-PAGE凝胶电泳法验证超滤法是否完全除去了未反应的单体、交联剂和PDGF-BB。因为该凝胶电泳是根据分子量大小不同来区分不同物质的，所以未包裹的PDGF-BB的条带相比于n(PDGF-BB)会迁移的更快。按照10％Express Cast PAGE试剂盒的要求配制胶。取样品与5×上样缓冲液按4:1的比例混合，然后在胶孔中分别加入Marker，nativePDGF-BB，n(PDGF-BB)，200V条件下电泳40min，通过条带来验证纯化结果。若n(PDGF-BB)孔中未出现native PDGF-BB的条带，证明纯化干净。
四.PDGF-BB纳米胶囊形貌表征
使用120KV透射电子显微镜(TEM)来观测纳米胶囊的形貌。纳米胶囊用磷钨酸溶液负染。首先配制2％磷钨酸溶液，调pH值为7.0，过0.22μm滤膜待用。取10μL浓度为0.1mg/ml的n(PDGF-BB)溶液滴在铜网上，3min后，用滤纸将溶液从网格边缘吸走。取10μL1％磷钨酸溶液(pH7.0)立即加入到网格顶部，2min后，用滤纸将溶液从网格边缘吸走，并让其在空气中干燥，用于TEM观察。
五.PDGF-BB纳米胶囊粒径及Zeta电位表征
DLS实验是通过纳米激光粒度电位分析仪来进行的。纳米胶囊样品是在PB缓冲液中(pH7.0,10mM)，浓度为0.5mg/ml条件下进行粒径和Zeta电位分析的。
六.PDGF-BB纳米胶囊体外释放动力学
为了验证不同交联剂比例下PDGF-BB的释放情况，将纯化好的不同比例的纳米胶囊稀释成浓度为2μg/ml，分别在100mM硼酸盐缓冲液(pH8.0)和1×PBS缓冲液(pH7.0)条件下，37℃水浴锅中温育，在特定时间点取样(1、2、3、4、5、7、10天)，先取出的样品放入-20℃冰箱中保存，待取样完成后，通过酶联免疫反应(ELISA)来测定PDGF-BB的浓度。
结果讨论
一：PLA-PEG-PLA表征
PLA-PEG-PLA核磁图见图2。通过PEG和辛酸亚锡引发D,L-丙交酯开环聚合制备PLA-PEG-PLA。以氘代氯仿为溶剂溶解样品进行核磁检测。如图所示，δ＝3.6ppm处是PEG中亚甲基-OCH2CH2(c)的特征氢，δ＝4.3ppm处是与PLA相连的PEG中的亚甲基PLA-COO-CH2(b)的特征氢。δ＝5.2ppm处为PLA嵌段中的次甲基-CH(d)的特征氢，δ＝1.5ppm处为甲基-CH3(a)的特征氢。我们可以看到核磁图谱上既有PEG的吸收峰，又有乳酸单元的吸收峰，证明D,L-丙交酯在PEG和辛酸亚锡的作用下成功开环聚合，得到PLA-PEG-PLA产物。
PLA-PEG-PLA嵌段聚合物的红外光谱见图3。其中酯羰基C＝O的伸缩振动峰出现在1745cm-1处，C-H的伸缩振动峰出现在2885cm-1处，PEG单元中C-O-C的伸缩振动峰出现在1124cm-1处，O-H的伸缩振动峰出现在3286cm-1处。通过红外光谱证明PEG和D,L-丙交酯反应合成了PLA-PEG-PLA嵌段聚合物。二：AC-PLA-PEG-PLA-AC表征
AC-PLA-PEG-PLA-AC核磁图见图4。本实验通过丙烯酰氯和PLA-PEG-PLA嵌段聚合物端羟基在二氯甲烷为溶剂的条件下反应，使端羟基转换为丙烯酸酯基团，两端接上双键。如图所示，δ＝3.6ppm处为PEG中亚甲基-OCH2CH2(e)的峰。还出现了PLA单元中次甲基-CH和甲基-CH3特征氢的峰，分别标为d和f。通过PLA-PEG-PLA与AC-PLA-PEG-PLA-AC的核磁对比图可以看出与AC-PLA-PEG-PLA-AC比PLA-PEG-PLA多了三个峰，这三个峰即为丙烯酸酯双键中的三个峰。其中δ＝6.5ppm处的峰为反式氢(a)的特征峰，δ＝6.2ppm处的峰为酯基同侧氢(b)的特征峰，δ＝5.9ppm处的峰为顺式氢(c)的特征峰。这说明在PLA-PEG-PLA上修饰上了丙烯酸酯基团，使其成为两侧带双键的共聚物。AC-PLA-PEG-PLA-AC的红外光谱见图5。图中可以看到C＝O和C-O-C的伸缩振动峰。不同的是在1629cm-1处出现了新峰，这个峰是C＝C的振动吸收峰。由于PLA-PEG-PLA的端羟基被丙烯酰化，所以AC-PLA-PEG-PLA-AC红外图中羟基峰消失。证明在PLA-PEG-PLA和丙烯酰氯反应成功。
三：PDGF-BB纳米胶囊纯化结果表征
纳米胶囊SDS-PAGE凝胶电泳图谱见图6。图上各个孔从左到右分别加样是marker、PDGF-BB、交联剂比例分别为1:0、4:1、1:1、1:2合成的PDGF-BB纳米胶囊。SDS-PAGE凝胶电泳中SDS使样品带上大量负电，所以是根据分子量不同实现分离的。分子量越小，迁移快，距离凝胶顶端越远，分子量越大，迁移慢，距离凝胶顶端越近，甚至有可能会留在胶孔中。PDGF-BB分子量在28KD左右，所以PDGF-BB加样孔中在28KD左右看到了清晰的PDGF-BB条带。PDGF-BB被纳米胶囊包裹后分子量明显增加，理论上n(PDGF-BB)的条带迁移距离短，如果纯化干净，则看不到PDGF-BB的条带。图中可以看到不同比例的n(PDGF-BB)条带都集中在凝胶孔中和上部，证明了n(PDGF-BB)的分子量比PDGF-BB大，且都没有观察到PDGF-BB的条带，证明纳米胶囊纯化干净。
四：PDGF-BB纳米胶囊形貌表征
交联剂比例为4:1合成的纳米胶囊的TEM图像见图7。从图中可以看出，n(PDGF-BB)的微观形貌是具有球形结构，粒径分布比较均匀，约为25nm。五：PDGF-BB纳米胶囊粒径及Zeta电位表征
不同交联剂比例(交联剂1：交联剂2)合成的纳米胶囊的粒径和Zeta电位图见图8。从粒径图谱上可以看出，native PDGF-BB的粒径在4nm左右，不同交联剂比例合成的纳米胶囊粒径均在25nm左右，与透射电子显微镜的测定结果一致，证明纳米胶囊具有均一的粒径。PDGF-BB等电点为9.8，在pH7.0的PB缓冲液中带正电。制备纳米胶囊时使用了带负电的单体(AMPS)，所以整个纳米胶囊会带负电。从Zeta电位图上可以看出native PDGF-BB为正电，而n(PDGF-BB)为负电。以上结果均可以证明PDGF-BB纳米胶囊成功合成。
六：PDGF-BB纳米胶囊释放动力学表征
不同交联剂比例合成的纳米胶囊在pH8.0的硼酸盐缓冲液，37℃条件下的体外释放动力学见图9。因为慢性伤口部位伤口微环境呈碱性，所以我们使用pH8.0的硼酸盐缓冲液模拟伤口环境进行体外释放试验。从图中可以看出当交联剂1与交联剂2比例为1:0时，PDGF-BB的浓度最高，随着交联剂1比例的下降，PDGF-BB的释放量逐渐减少，说明交联剂1比例多，纳米胶囊降解快，交联剂2比例多，纳米胶囊降解慢。与我们的设定相符。在10天的时间内，PDGF-BB的始终能维持一定的低浓度，可以减少因PDGF-BB浓度过高而产生致瘤的副作用。这个结果说明该纳米胶囊可以实现PDGF-BB的长期低浓度释放。此外我们还可以通过调整两种交联剂的比例，控制纳米胶囊壳的降解，进而控制PDGF-BB的释放。
同一交联剂比例(4:1)的纳米胶囊在不同pH条件下的释放情况见图10。图中可以看到pH8.0的条件下，PDGF-BB的释放明显高于pH7.0，这是因为交联剂中含有酯键，在碱性条件下能够快速降解，这说明了合成的纳米胶囊具有pH响应性。

Claims (5)

1.一种可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)交联剂PLA-PEG-PLA-双丙烯酸酯即AC-PLA-PEG-PLA-AC的合成:首先通过PEG引发丙交酯开环聚合，合成PLA-PEG-PLA，然后使用丙烯酰氯与PLA-PEG-PLA反应，合成AC-PLA-PEG-PLA-AC；
(2)PDGF-BB纳米胶囊的制备
以丙烯酰胺(AAM)和2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)为单体，PLA-PEG-PLA-双丙烯酸酯和GDMA为交联剂，将上述物质加入到PDGF-BB溶液中混匀，然后加入引发剂APS和TEMED，冰浴条件下反应2小时；反应完成后通过超滤法来进行纯化，以除去未反应的游离单体、引发剂和PDGF-BB。
2.按照权利要求1所述的一种可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体包括如下：
反应管中加入PEG、纯化好的D,L-丙交酯和辛酸亚锡的无水甲苯溶液，140℃反应6h，反应完成后，冷却至室温；以二氯甲烷为溶剂溶解产物，然后缓慢滴到冰乙醚种沉析，干燥即得PLA-PEG-PLA；
PLA-PEG-PLA溶解于无水二氯甲烷中，然后滴加三乙胺和丙烯酰氯的无水二氯甲烷溶液，冰浴条件下，滴加完成后反应12h；过滤除去生成的铵盐，旋蒸除去二氯甲烷，正己烷沉析，真空干燥得AC-PLA-PEG-PLA-AC。
3.按照权利要求1所述的一种可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(1)中PEG为PEG1000，PEG、D,L-丙交酯和辛酸亚锡的摩尔比为1:3:0.005；PLA-PEG-PLA、三乙胺和丙烯酰氯的摩尔比为1:3:3。
4.按照权利要求1所述的一种可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体包括如下：
取丙烯酰胺(AAM)、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)、交联剂PLA-PEG-PLA-双丙烯酸酯、APS分别制备成水溶液；交联剂GDMA加入DMSO制备成溶液；
将PDGF-BB溶液、AAM水溶液、AMPS水溶液、PLA-PEG-PLA-双丙烯酸酯水溶液、GDMA溶液在反应管中混合均匀，加入APS和TEMED，涡旋混匀，放到冰上，反应2小时；反应完后，将反应管里的混合物加入到分子量为50KD的超滤管中，加入适1×PBS稀释，配平后放入离心机中，离心，将滤液倒掉，继续加入1×PBS稀释离心，重复多次。
5.按照权利要求1所述的一种可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(2)其中交联剂PLA-PEG-PLA-双丙烯酸酯：交联剂GDMA的摩尔比为(1-4):(0-2)；
PDGF-BB：AAM：AMPS：(交联剂PLA-PEG-PLA-双丙烯酸酯+交联剂GDMA)：APS：TEMED的摩尔比为1:6000:100:600:480:2500。
CN202110421742.1A 2021-04-19 2021-04-19 可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备 Active CN113244377B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110421742.1A CN113244377B (zh) 2021-04-19 2021-04-19 可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110421742.1A CN113244377B (zh) 2021-04-19 2021-04-19 可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113244377A CN113244377A (zh) 2021-08-13
CN113244377B true CN113244377B (zh) 2022-05-27

Family

ID=77221134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110421742.1A Active CN113244377B (zh) 2021-04-19 2021-04-19 可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113244377B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113736043B (zh) * 2021-11-03 2022-05-20 北京华芢生物技术有限公司 一种pH响应型水凝胶生物载体及应用
CN117100876A (zh) * 2022-04-14 2023-11-24 上海巴久巴生物技术有限公司 一种用于脑部递送系统的纳米胶囊、其制备方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101234204A (zh) * 2008-02-28 2008-08-06 中国科学院长春应用化学研究所 高分子键合阿霉素药、其纳米胶囊及制备方法
CN102120033A (zh) * 2011-03-07 2011-07-13 温州医学院 促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子的胶原蛋白缓释载体材料及其制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007016371A2 (en) * 2005-07-28 2007-02-08 Akina, Inc. Readily shapeable xerogels having controllably delayed swelling properties
EP3463428A4 (en) * 2016-05-24 2020-01-08 The Regents of the University of California GROWTH FACTOR NANOCAPSULES WITH ADJUSTABLE RELEASE CAPABILITY FOR BONE REGENERATION

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101234204A (zh) * 2008-02-28 2008-08-06 中国科学院长春应用化学研究所 高分子键合阿霉素药、其纳米胶囊及制备方法
CN102120033A (zh) * 2011-03-07 2011-07-13 温州医学院 促口腔额面部多种创伤修复的复合生长因子的胶原蛋白缓释载体材料及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
缓释PDGF-BB的纳米珍珠层/聚乳酸/纤维蛋白胶复合支架的制备;肖文德等;《中国矫形外科杂志》;20110605(第11期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113244377A (zh) 2021-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113244377B (zh) 可控释放血小板衍生生长因子纳米胶囊的制备
Gan et al. Chitosan nanoparticle as protein delivery carrier—systematic examination of fabrication conditions for efficient loading and release
JP3887454B2 (ja) 重合体親水性ナノ粒子の製造方法
Yang et al. Formation of positively charged poly (butyl cyanoacrylate) nanoparticles stabilized with chitosan
Zhao et al. Competitive binding-accelerated insulin release from a polypeptide nanogel for potential therapy of diabetes
Oddo et al. Novel thermosensitive calcium alginate microspheres: physico-chemical characterization and delivery properties
CN111991368B (zh) 一种茶多酚涂层的大豆分离蛋白-季铵盐壳聚糖微胶囊的制备方法
CN109081927B (zh) 一种水凝胶的制备方法
Sheybani et al. Mesoporous molecularly imprinted polymer nanoparticles as a sustained release system of azithromycin
Liu et al. Self-assembly of cationic amphiphilic cellulose-g-poly (p-dioxanone) copolymers
WO2021037281A1 (zh) 具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法与应用
CN110123754B (zh) 一种靶向作用于树突细胞的苍耳亭纳米胶束及制备方法和应用
CN106692037B (zh) 大黄酸超分子水凝胶及其制备方法和应用
CN114983930A (zh) 基于高分子聚合物的ros响应型脑靶向纳米凝胶双层释药系统及其制备方法和应用
CN111407740A (zh) 一种超声可激活释放药物的白蛋白纳米粒子、其制备方法及应用
CN106995528B (zh) 一种聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物的精制方法
CN106581647A (zh) 一种pH响应胰岛素缓释纳米粒及其制备方法和应用
CN115531308B (zh) 一种纳米结晶胶束递药系统及其制备方法与应用
Körpe et al. Fabrication of monodispersive nanoscale alginate–chitosan core–shell particulate systems for controlled release studies
CN114134109B (zh) Egf间充质干细胞外泌体的纯化方法
CN109608647B (zh) 活性氧响应的聚合物、载体及其应用
CN111410757B (zh) 一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法
JP5268048B2 (ja) 遺伝子導入剤及びその製造方法
Argentiere et al. Synthesis of poly (acrylic acid) nanogels and application in loading and release of an oligothiophene fluorophore and its bovine serum albumin conjugate
Kang et al. Chitosan microgel: Effect of cross-linking density on pH-dependent release

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant