CN111410757B - 一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于高分子材料合成与生物材料技术领域，具体涉及一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法，首先制备L‑苹果酸与6‑羟基己酸的共聚物，再制备甲基化胱胺，并与上述共聚物复合制备离子交联的微凝胶，制备条件温和、不用催化剂、制备反应速度快、反应完全、无单体杂质残留，降解速度可控，降解产物酸性降低。此类微凝胶可以负载抗癌药物盐酸阿霉素，通过将羧基官能团和双硫键引入微凝胶，实现环境响应性控制释放。

Description

一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法，属于高分子材料合成与生物材料技术领域。
背景技术
目前治疗癌症的重要的方法是化疗，但是普通化疗有很多缺陷，抗癌药物不仅对癌细胞有杀灭作用，对正常细胞的也有较大的毒副作用。近年来出现的纳米载药体系给癌症治疗带来了新的希望。纳米体系能够增强渗透性和停留(EPR)效应，并能躲过人体的网状内皮质系统的识别和捕获,起到“隐形”的作用，延长了载药系统在血液中的循环时间，提高了药物的生物利用度。
肿瘤组织的环境不同于正常细胞，肿瘤细胞内的谷胱甘肽(GSH)浓度为0.5-10mM，而细胞外GSH浓度仅为2-20μM。谷胱甘肽是一种含有巯基的三肽，是生物化学反应中一类重要的还原剂，能够还原双硫键。另外，肿瘤组织的环境呈弱酸性，内涵体pH为5.0～6.5，溶酶体内pH为4.5～5.0，因此设计具有pH响应性的微凝胶，利用肿瘤组织与正常细胞的pH环境差异可以实现药物的靶向控制释放。
生物医用材料需要良好的生物相容性和生物可降解性，聚L-苹果酸具有良好的生物相容性和降解性，其降解产物能参与体内三羧酸循环而被生物体吸收。但是单纯的聚L-苹果酸降解速度过快，且降解物酸性过强，限制了其作为药物缓释载体的应用。6-羟基己酸是己内酯的水解产物，可溶于水，无毒无害。聚己内酯是一种人工合成的聚酯类生物高分子材料。其生物相容性好，对药物具有良好的相容性，聚己内酯降解速度缓慢，具有较满意的药物释放行为。
聚电解质复合微凝胶是由两种带相反电荷的组分通过静电作用形成的，此类微凝胶的一个突出优点是可以负载带电荷的药物、基因或酶，且制备条件温和、不用催化剂、制备反应速度快、反应完全、无单体杂质残留。
因此，解决聚L-苹果酸降解速度过快、降解产物酸性过强的问题，并合成一种可降解及环境响应性的复合微凝胶，将其用作抗癌药物的载体，进行药物负载和环境响应性控制释放是非常有必要的。
发明内容
本发明目的是提供一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法，首先利用L-苹果酸与6-羟基己酸的共聚物，使共聚物的降解速度可以通过调节L-苹果酸与6-羟基己酸的投料比来控制；再选用胱胺为原料，将分子中的伯胺基团甲基化，合成一种交联剂，并将此交联剂与所合成的共聚物进行复合，得到一种可降解及环境响应性复合物微凝胶。其制备步骤如下：
步骤(1)，将L-苹果酸、6-羟基己酸、催化剂加入反应器中混合均匀，连接冷凝和分水装置，油浴升高温度至85℃，反应2h后，继续升温至140℃并在减压到8-10kPa下继续反应12h，得到L-苹果酸与6-羟基己酸共聚物；
步骤(2)，将胱胺盐酸盐、25w％氢氧化钠溶液、甲醇混合，室温搅拌0.5h后，在避光条件下缓慢滴加碘甲烷，恒温25℃反应9小时后，有机溶剂萃取，分离后用去离子水洗涤有机层三次，减压蒸馏除去有机溶剂，得到N,N,N’,N’-四甲基胱胺；
步骤(3)，将步骤1所得共聚物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，配成浓度为15wt％的共聚物溶液；将步骤2所得N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶于四氢呋喃中，配成浓度为15wt％的N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液；将共聚物溶液与N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液混合均匀，然后缓缓滴入到蒸馏水中，搅拌8h后，转入截留分子量为3500的透析袋，在去离子水中、室温搅拌下透析72h，每隔8h更换透析液，最后冷冻干燥，得到一种可降解及环境响应性复合物微凝胶。
进一步地，步骤1)中，所述L-苹果酸与6-羟基己酸的摩尔比为8:1～3:1。
进一步地，步骤1)中，所述催化剂为对甲苯磺酸，其用量占L-苹果酸与6-羟基己酸重量之和的1.8～4.2wt％。
进一步地，步骤2)中，所述胱胺盐酸盐、25w％氢氧化钠溶液、甲醇的料液比为22.5g:100mL:20mL，所述胱胺盐酸盐与碘甲烷的摩尔比为1:4。
进一步地，步骤2)中，所述有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯或乙醚中的任意一种。
进一步地，步骤3)中，所述共聚物溶液与N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液的体积比为：8:1～15:1。
进一步地，步骤3)中，所述大量蒸馏水的体积为共聚物溶液与N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液的体积之和的11～25倍。
本发明的另一个目的是提供所述的可降解及环境响应性复合物微凝胶的应用，其特征在于，所述微凝胶按上述一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法制得，所述应用是将微凝胶干粉和盐酸阿霉素加入到N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，室温反应12小时；将反应液转入截留分子量为3500的透析袋，以去离子水为透析介质，室温下透析16小时后，再冷冻干燥得到载药纳米胶束；将载药纳米胶束用去离子水配成浓度为1mg/mL的溶液，取2mL该溶液装入截留分子量为3500透析袋内，置于磷酸缓冲溶液体系中，在37℃恒温震荡器中震荡释放。
进一步地，所述磷酸缓冲溶液的pH为5.0～7.4。
本发明的有益效果：
(1)采用复合方法制备离子交联的复合微凝胶，制备条件温和、不用催化剂、制备反应速度快、反应完全、无单体杂质残留，并此类微凝胶可以负载带电荷的药物，例如盐酸阿霉素。
(2)选用L-苹果酸与6-羟基己酸共聚，共聚物的降解速度可以通过调节单体的投料比来控制，共聚物水解产物的酸性比纯聚L-苹果酸水解产物的低，解决了聚L-苹果酸降解速度过快、降解产物酸性过强的问题，从而使其制备的复合物微凝胶降解速度可控，降解产物酸性降低，拓宽了其作为药物缓释载体的应用范围；同时，6-羟基己酸分子含6个碳原子，具有一定的疏水性，更有助于复合物微凝胶的药物负载和缓释。
(3)利用甲基化的胱胺作为交联剂，胱胺分子中的伯胺基转变成叔胺基团，增强了其与共聚物中羧基复合的能力，使复合物微凝胶更加稳定，更有利于负载药物和还原控制释放。
(4)胱胺分子中含双硫键，并处于交联结构中，具有还原响应性，与谷胱甘肽反应后断链，微凝胶负载的抗癌药物可以在肿瘤部位定向释放。
附图说明：
图1为实施例1可降解及环境响应性复合物微凝胶的合成示意图；
图2为实施例1～4L-苹果酸与6-羟基己酸的共聚物PBH-1、PBH-2、PBH-3和PBH-4的红外光谱图；
图3为实施例1和实施例4可降解及环境响应性复合物微凝胶的扫描电镜照片，a)NMG-1，b)NMG-4；
图4为实施例1可降解及环境响应性复合物微凝胶NMG-1在不同酸性条件下的粒径变化；
图5为实施例1可降解及环境响应性复合物微凝胶NMG-1对于阿霉素在不同条件下的控制释放；
图6为分别用实施例1～4所得复合物微凝胶，NMG-1、NMG-2、NMG-3和NMG-4对于阿霉素在相同pH和GSH浓度条件下的控制释放。
具体实施方式
实施例1：
如图1为可降解及环境响应性复合物微凝胶的合成示意图。
步骤1：称取107.2克L-苹果酸(代号：MA)和13.2克6-羟基己酸(代号：HA)，加入到250mL三颈烧瓶中搅拌均匀，然后添加对甲苯磺酸2.2克，连接冷凝和分水装置，以及时排除反应生成的水。将反应烧瓶置于油浴锅中，升高温度至85℃，反应两小时后，继续升高温度至140℃并在减压到8-10kPa下继续反应12小时，得到L-苹果酸与6-羟基己酸的共聚物，代号PBH-1。
步骤2：将22.5g胱胺盐酸盐(0.1mol)置入到250毫升三颈烧瓶中，加入100毫升25w％的氢氧化钠和20毫升甲醇的混合溶液，室温搅拌0.5小时后，缓慢添加碘甲烷56.8克(0.4mol)，恒温25℃反应9小时，再用三氯甲烷萃取产物，分离后用去离子水洗涤三氯甲烷层三次，减压蒸馏除去三氯甲烷，得到N,N,N’,N’-四甲基胱胺。
步骤3：将步骤1所得共聚物(代号PBH-1)溶于N,N-二甲基甲酰胺中，配成浓度为15wt％的共聚物溶液；另外将步骤2所得N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶于四氢呋喃中，配成浓度为15wt％的N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液；取8毫升共聚物溶液与1毫升N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液混合，搅拌均匀，然后缓缓滴入到200毫升蒸馏水中，搅拌8小时后，转入截留分子量为3500的透析袋，在去离子水中、室温搅拌下透析72小时，每隔8小时更换透析液，最后冷冻干燥得到一种可降解及环境响应性复合物微凝胶，代号为NMG-1。
实施例2：
步骤(1)、(2)同实施例1，但是在步骤(1)中，改变L-苹果酸为80.4克，其余操作相同，所得L-苹果酸与6-羟基己酸的共聚物，代号PBH-2；
步骤(3)：将所得共聚物PBH-2溶于N,N-二甲基甲酰胺中，配成浓度为15wt％的共聚物溶液；另外将所得N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶于四氢呋喃中，配成浓度为15wt％的N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液；取8毫升共聚物溶液与1毫升N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液混合，搅拌均匀，然后缓缓滴入到100毫升蒸馏水中，搅拌8小时后，转入截留分子量为3500的透析袋，在去离子水中、室温搅拌下透析72小时，每隔8小时更换透析液，最后冷冻干燥得到一种可降解及环境响应性复合物微凝胶，代号为NMG-2。
实施例3：
步骤(1)、(2)同实施例1，但是在步骤(1)中，改变L-苹果酸为53.6克，其余操作相同，所得L-苹果酸与6-羟基己酸的共聚物，代号PBH-3；
步骤(3)：将所得共聚物PBH-3溶于N,N-二甲基甲酰胺中，配成浓度为15wt％的共聚物溶液；另外将所得N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶于四氢呋喃中，配成浓度为15wt％的N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液；取8毫升共聚物PBH-3溶液与1毫升N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液混合，搅拌均匀，然后缓缓滴入到100毫升蒸馏水中，搅拌8小时后，转入截留分子量为3500的透析袋，在去离子水中、室温搅拌下透析72小时，每隔8小时更换透析液，最后冷冻干燥得到一种可降解及环境响应性复合物微凝胶，代号为NMG-3。
实施例4：
步骤(1)、(2)同实施例1，但是在步骤(1)中，改变L-苹果酸为40.2克，其余操作相同，所得L-苹果酸与6-羟基己酸的共聚物，代号PBH-4；
步骤(3)：将所得共聚物PBH-4溶于N,N-二甲基甲酰胺中，配成浓度为15wt％的共聚物溶液；另外将所得N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶于四氢呋喃中，配成浓度为15wt％的N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液；取8毫升共聚物PBH-4溶液与1毫升N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液混合，搅拌均匀，然后缓缓滴入到100毫升蒸馏水中，搅拌8小时后，转入截留分子量为3500的透析袋，在去离子水中、室温搅拌下透析72小时，每隔8小时更换透析液，最后冷冻干燥得到一种可降解及环境响应性复合物微凝胶，代号为NMG-4。
实施例5：
同实施例1，但是在步骤(3)中，改变共聚物(PBH-1)溶液的体积为12毫升，其余操作相同，得到一种可降解及环境响应性复合物微凝胶，编号为NMG-5。
实施例6：
同实施例1，但是在步骤(3)中，改变共聚物(PBH-1)溶液的体积为15毫升，其余操作相同，得到一种可降解及环境响应性复合物微凝胶，编号为NMG-6。
实施例7：
对比共聚物的合成：称取L-苹果酸为40.2克和L-乳酸9.0克(代号：LA)，加入到250mL三颈烧瓶中搅拌均匀，然后添加对甲苯磺酸2.2克，连接冷凝和分水装置。将反应烧瓶置于油浴锅中，升高温度至85℃，反应两小时后，继续升高温度至140℃并在减压到8-10kPa下继续反应12小时，得到L-苹果酸与L-乳酸的共聚物，代号PBL。
实施例8
用傅立叶红外光谱仪(FTLA2000-104，ABB BOMEN Corporation)测定L-苹果酸与6-羟基己酸共聚物的红外光谱图，扫描波长范围4000～500cm-1，分辨率为4cm-1。测定结果如图2所示，由图可以看出，四种共聚物的特征吸收峰基本相似。在3500cm-1左右的宽而散的吸收峰属于-OH和-COOH的伸缩振动峰；2950cm-1处附近的小峰是6-羟基己酸中亚甲基的伸缩振动；1720cm-1处是酯键的C＝O的伸缩振动峰，950cm-1处的吸收峰是OH...O的面外变形振动，可以确认侧链羧基的存在。红外光谱图说明L-苹果酸与6-羟基己酸共聚物发生了共聚反应。
实施例9
将复合物微凝胶溶液滴于硅片上，自然干燥后喷金，利用扫描电子显微镜(日本HITACHI公司的S-4800型)在高真空状态下观察其形貌。图3(a)、(b)分别为NMG-1和NMG-4的扫描电镜图。可以看到：制备的复合物微凝胶呈近似球形，当L-苹果酸与6-羟基己酸的摩尔比为8:1时，所得微凝胶粒径最大分布在280纳米附近；当L-苹果酸与6-羟基己酸的摩尔比为3:1时，微凝胶粒径最大分布在120纳米附近。这是由于随着共聚物中苹果酸组分减少时，微凝胶中游离羧基含量下降，在水中的溶胀性下降，因而粒径减小。
实施例10
复合物微凝胶的pH敏感性：
将实施例1中所得复合物微凝胶NMG-1分别置于不同pH值的缓冲溶液中，用激光光散射仪测试复合物微凝胶的粒径变化，结果如图4所示。可以发现，复合物微凝胶的粒径随溶液中pH的增加而变大，在pH＝5.0时，微凝胶的粒径分布在230nm左右，当pH增加到10.0时，微凝胶的粒径分布1100纳米左右。因为微凝胶分子中含有较多游离羧基，在碱性条件下脱质子转变成COO-，电荷排斥作用导致微凝胶更加溶胀，粒径颗粒增大。
实施例11
共聚物的降解性研究：取2克共聚物溶于10毫升N,N-二甲基甲酰胺中，添加去离子水4毫升，恒温25℃放置，分别经过不同的降解时间后取出1毫升溶液，测量pH值后将溶剂烘干，将残留物用四氢呋喃配成浓度约为8mg/mL的溶液，使用凝胶渗透色谱仪(Waters1515高效液相色谱仪)测共聚物的数均分子量，结果见表1。从中看出：随着投料中HA(6-羟基己酸)含量增加，共聚物分子量增大；同时，降解速率变慢，有利于缓释。另外，与对比样PBL相比，L-苹果酸与乳酸共聚物在相同的时间内分子量降低更多，说明MA与HA共聚物在溶液中稳定时间更长，且降解产物酸性降低。
表1 MA与HA共聚物在降解前后的结果
Figure GDA0002643730190000071
注：MA为L-苹果酸；HA为6-羟基己酸；LA为乳酸。
实施例12
载药纳米微凝胶的制备：
按实施例1合成复合物微凝胶干粉，将50毫克此微凝胶干粉和20毫克盐酸阿霉素加入到100毫升N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，室温反应12小时；将反应液转入截留分子量为3500的透析袋，以去离子水为透析介质，室温下透析8小时后，再冷冻干燥得到载药纳米胶束。
将载药纳米胶束用去离子水配成浓度为1mg/mL的溶液，取2mL该溶液装入截留分子量为3500透析袋内，置于250mL锥形瓶中，锥形瓶中加入20mL具有不同pH值和谷胱甘肽(GSH)浓度的磷酸缓冲溶液中，置于37±0.5℃的恒温震荡器中回旋震荡，每隔一段时间取3mL透析液测试吸光度A483，由标准曲线计算释放介质中的阿霉素浓度。每次取样后补加相同体积的新鲜介质保持缓冲溶液体积不变。最后计算出阿霉素累积释放量，结果见图5。
可以看出：在相同pH条件下，药物释放在10mM的GSH溶液环境中比不含GSH的溶液中更快，这是因为还原剂谷胱甘肽(GSH)能将载药微凝胶颗粒中的双硫键断裂，使微凝胶的交联结构被破坏，有利于阿霉素的释放。还可以看出，药物释放在pH 5.5环境中比在pH 7.4的环境中要快，这是因为酸性条件削弱了微凝胶中正负电荷的相互作用，使复合物不稳定，也导致交联结构逐渐破坏。
分别用实施例1～4所得复合物微凝胶，NMG-1、NMG-2、NMG-3和NMG-4，按照上述研究释放方法，在相同pH和GSH浓度(pH 5.5,10mMGSH)进行控制释放研究，结果见图6。可以看出：从NMG-1到NMG-4，随着复合物微凝胶中HA含量增加，释放速度减缓。

Claims (8)

1.一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法，其特征在于包括下列步骤：
步骤(1)，将L-苹果酸、6-羟基己酸、催化剂加入反应器中混合均匀，连接冷凝和分水装置，油浴升高温度至85℃，反应2h后，继续升温至140℃并在减压到8-10kPa下继续反应12h，得到L-苹果酸与6-羟基己酸共聚物；
步骤(2)，将胱胺盐酸盐、25w％氢氧化钠溶液、甲醇混合，室温搅拌0.5h后，在避光条件下缓慢滴加碘甲烷，恒温25℃反应9小时后，有机溶剂萃取，分离后用去离子水洗涤有机层三次，减压蒸馏除去有机溶剂，得到N,N,N’,N’-四甲基胱胺；
步骤(3)，将步骤1所得共聚物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，配成浓度为15wt％的共聚物溶液；将步骤2所得N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，配成浓度为15wt％的N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液；将共聚物溶液与N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液混合均匀，然后缓缓滴入到过量的蒸馏水中，搅拌8h后，转入截留分子量为3500的透析袋，在去离子水中、室温搅拌下透析72h，每隔8h更换透析液，最后冷冻干燥，得到一种可降解及环境响应性复合物微凝胶；
其中，步骤(1)中，所述L-苹果酸与6-羟基己酸的摩尔比为8:1～3:1。
2.如权利要求1所述一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法 ，其特征在于，步骤(1)中，所述催化剂为对甲苯磺酸，其用量占L-苹果酸与6-羟基己酸质量之和的1.8～4.2wt％。
3.如权利要求1所述一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法 ，其特征在于，步骤(2)中，所述胱胺盐酸盐、25w％氢氧化钠溶液、甲醇的料液比为22.5g：100mL：20mL，所述胱胺盐酸盐与碘甲烷的摩尔比为1:4。
4.如权利要求1所述一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法 ，其特征在于，步骤(2)中，所述有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯或乙醚中的任意一种。
5.如权利要求1所述一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法 ，其特征在于，步骤(3)中，所述共聚物溶液与N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液的体积比为：8:1～15:1。
6.如权利要求1所述一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法 ，其特征在于，步骤(3)中，所述蒸馏水的体积为共聚物溶液与N,N,N’,N’-四甲基胱胺溶液的体积之和的11～25倍。
7.一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的应用，其特征在于，所述微凝胶按权利要求1～6任一所述一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的制备方法制得，所述应用是将微凝胶和盐酸阿霉素加入到N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，室温反应12小时；将反应液转入截留分子量为3500的透析袋，以去离子水为透析介质，室温下透析16小时后，再冷冻干燥得到载药纳米胶束；将载药纳米胶束用去离子水配成浓度为1mg/mL的溶液，取2mL该溶液装入截留分子量为3500透析袋内，置于磷酸缓冲溶液体系中，在37℃恒温震荡器中震荡释放。
8.根据权利要求7所述一种可降解及环境响应性复合物微凝胶的应用，其特征在于，所述磷酸缓冲溶液的pH为5.0～7.4。
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