CN105085927B

CN105085927B - 一种三元嵌段共聚物及其制备方法和利用其制成的滴眼液

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Publication number: CN105085927B
Application number: CN201510510461.8A
Authority: CN
Inventors: 李景果; 张俊杰; 王丽娅; 周天洋; 夏慧芸; 何继军; 李恒; 栗占荣; 贺司宇
Original assignee: INST OF OPHTHALMOLOGY HENAN PROV
Current assignee: INST OF OPHTHALMOLOGY HENAN PROV
Priority date: 2015-08-19
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2017-08-04
Anticipated expiration: 2035-08-19
Also published as: CN105085927A

Abstract

本发明属于高分子化学与生物医学工程技术领域，具体涉及一种三元嵌段共聚物及其制备方法和利用其制成的滴眼液。分子式为：PEG‑PCL‑PEI。制备步骤：先合成PEG‑PCL‑OH，再合成PEG‑PCL‑COOH，最终合成PEG‑PCL‑PEI。本发明三元嵌段共聚物可以自组装形成胶束体系进而制成滴眼液，克服了角膜障碍传送药物，具有较高的角膜渗透性，延长了药物在眼部的停留时间。

Description

一种三元嵌段共聚物及其制备方法和利用其制成的滴眼液

技术领域

本发明属于高分子化学与生物医学工程技术领域，具体涉及一种三元嵌段共聚物及其制备方法和利用其制成的滴眼液。

背景技术

由于其易用性、低侵袭和简单的配方，局部点眼是眼用药物给药的首选方法，特别是在治疗与角膜、眼表和眼前节相关疾病方面。然而，角膜特殊的生理结构和生化特征限制了药物的透过性。另外，局部给药后眼睛特定的防御机制，例如，流泪、泪液稀释和泪液替换可以使药物溶液在前角膜区域的驻留时间减少至5~6分钟，仅1-3%的药物溶液可以渗透入角膜并到达眼内组织。

低渗透的主要原因是点药后药物进入眼内时角膜屏障的存在，主要表现在角膜上皮细胞排列紧密，以及存在的具有亲脂性上皮层和亲水性基质层的相反的物理化学性质。上皮和基质呈现不同的理化性质，亲水性化合物仅能通过上皮层，而亲脂性化合物的移动则被限制在基质层内。因此，角膜的相反的极性结构严重地阻碍药物通过角膜进入眼球。因此，增强滴眼液的角膜穿透性是一个在眼科药物开发中极具有挑战性的研究方向之一。

在过去的几十年中，两亲性嵌段共聚物自组装的聚合物胶束作为药物传输体系有效地增溶难溶性药物已引起越来越多的关注。聚合物胶束是具有众多优良性能的药物传输体系，例如动力学和热力学稳定性好，尺寸分布均匀（20 ~100nm），可调的表面电位，良好的生物相容性，组织内有效聚集和渗透，优越的控制释放性能，低毒性。最近，为了提高药物的释放性能，研究者已经将聚合物纳米颗粒用于眼部给药系统的开发研究中。聚合物纳米颗粒载药系统具有优越的生物性能，例如可生物相容性，可生物降解性，粘膜粘附性，无毒性和药物控制释放。聚合物胶束载药系统用于眼部药物的局部给药具有良好的应用前景。

聚合物胶束的粒径和表面电位是影响其在眼科药物应用的两个主要因素。小粒径并且表面带正电的纳米粒子有助于增加药物在眼部的通过性。小粒径的纳米胶束易于通过角膜屏障。表面带有正电的聚合物胶束与眼表带负电的粘蛋白存在静电相互作用，在眼表表现出粘附性质。而且，正电聚合物胶束与带负电的细胞之间的具有非特异性静电相互作用，可以促进细胞对纳米粒子的摄取。因此，具有正表面电荷的聚合物胶束可以延长在眼部的停留时间，增强聚合物胶束药物的角膜渗透。两亲性嵌段共聚物聚（乙二醇）-聚（ε-己内酯）（PEG-PCL）已经吸引越来越多的关注，已有自组装核壳结构的纳米级胶束用于药物传送。PEG是生物相容聚合物，作为聚合物胶束壳，形成亲水性嵌段。因为具有亲水性、电中性、链柔性，不具有免疫原性，PEG被广泛应用于两亲嵌段共聚物的设计。PEG在水性和油性溶剂中均具有优越的溶解性能，从而使得高分子胶束能有效地通过角膜屏障，增加药物的角膜通透性。而聚己内酯的降解产物具有生物相容性，被美国食品和药物管理局批准可应用用于人体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三元嵌段共聚物及其制备方法和利用其制成的滴眼液。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种三元嵌段共聚物，分子式为：PEG-PCL-PEI，结构式为：

，

其中，m、n、x、y为正整数。

制备方法，合成路线如下：

；

即包括以下步骤：

S1. 合成PEG-PCL-OH：以PEG-OH为引发剂，Sn(Oct)₂为催化剂，催化引发ε-己内酯开环聚合；反应结束后，后处理得PEG-PCL-OH；

S2. 合成PEG-PCL-COOH：PEG-PCL-OH与琥珀酸酐，于惰性气氛下，羟基酯化反应；反应结束后，后处理得PEG-PCL-COOH；

S3. 合成PEG-PCL-PEI：PEG-PCL-COOH、NHS、DCC和PEI在氯仿中，于惰性气氛下，室温搅拌反应；反应结束后，后处理得PEG-PCL-PEI；

S1-S3中，PEG-PCL-OH、PEG-PCL-COOH、PEG-PCL-PEI的结构式分别为：

、、

。

具体地，步骤为：

S1. 合成PEG-PCL-OH：首先，将PEG-OH和ε-己内酯放入烧瓶中，减压干燥；接着，在惰性气氛下向烧瓶中加入Sn(Oct)₂，然后密封烧瓶并浸渍在油浴中，110~120℃开环聚合20~28h；分离反应液，将固体物溶解在THF中，加入乙醚，收集沉淀，干燥后即得PEG-PCL-OH；

S2. 合成PEG-PCL-COOH：将PEG-PCL-OH和马来酸酐溶解在事先干燥好的氯仿中，在惰性气氛下，60~80℃搅拌回流反应60~84h；分离反应液，固体物经乙醚沉淀纯化得到粗品，重新溶解在DCM中；将DCM溶液先用盐酸洗涤，再用饱和NaCl溶液洗涤；然后，分离出有机相，用硫酸镁干燥，并过滤，加入乙醚，收集沉淀，干燥后即得PEG-PCL-COOH；

S3.合成PEG-PCLPEG-PCL-PEI：将PEG-PCL-COOH和NHS溶解在氯仿中，并放置在配有磁力搅拌棒的烧瓶中，烧瓶置于冰水浴中，加入DCC，然后将烧瓶在惰性气氛下密封后，搅拌均匀，加入PEI的氯仿溶液，继续搅拌均匀，再在室温下搅拌20~28h；过滤，将滤液加入到过量的乙醚中，收集沉淀物，干燥后即得PEG-PCL-PEI。

利用所述的三元嵌段共聚物制成的滴眼液，按下法制备：将10~20mg的PEG-PCL-PEI与0.5~1mg的治疗眼科疾病常用药物溶解在1~2mL由甲醇与乙腈以体积比1:1~3组成的混合溶剂中；然后，在超声搅拌下，将混合液滴加到20~30mL的PBS中，真空蒸馏除去有机溶剂，重复洗涤浓缩除去游离的药物，过滤得载药聚合物胶束；该载药聚合物胶束和生理盐水以1:9~11的体积比混合，即制成滴眼液。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明三元嵌段共聚物可以自组装形成胶束体系进而制成滴眼液，克服了角膜障碍传送药物，具有较高的角膜渗透性，延长了药物在眼部的停留时间。

附图说明

图1：PEG-OH，PEG-PCL-OH，PEG-PCL-COOH以及PEG-PCL-PEI的¹H NMR 谱图。

图2：PEG-PCL-COOH (a) 和PEG-PCL-PEI (b)的红外谱图。

图3：聚合物胶束载药过程示意图。

图4：（a）聚合物胶束的电镜图片（标尺200nm）；（b）载药聚合物胶束的体外释放曲线。

图5：C57BL/6鼠局部给药后的角膜透过行为双光子显微镜检测图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

实施例1 三元嵌段共聚物的合成

三元嵌段共聚物，分子式为：PEG-PCL-PEI，结构式为：

。

合成步骤：

S1. 合成PEG-PCL-OH：首先，将10.0g PEG-OH（MW:2000）和20.6g ε-己内酯放入烧瓶中，70℃减压干燥2h；接着，在氩气气氛下向烧瓶中加入占ε-己内酯0.1mol％的Sn(Oct)₂，然后密封烧瓶并浸渍在油浴中，115℃开环聚合24h；分离反应液，将固体物溶解在THF中，加入乙醚沉淀两次进行纯化，收集沉淀，40℃真空干燥后即得PEG-PCL-OH，产率：>96％；

S2. 合成PEG-PCL-COOH：1mmol PEG-PCL-OH和10mmol马来酸酐溶解在100ml事先干燥好的氯仿中，置于装有磁力搅拌棒和回流冷凝器的两颈烧瓶中，将混合物在氩气气氛下，70℃搅拌回流反应72h；过滤反应液，固体物经乙醚沉淀纯化得到粗品，重新溶解在DCM中；将DCM溶液先用盐酸（10%， v/v）洗涤3次，再用饱和NaCl溶液洗涤4次；然后，分离出有机相，用硫酸镁干燥，并过滤，加入乙醚，收集沉淀，50℃下真空干燥至恒重，以消除水和马来酸酐残基，即得PEG-PCL-COOH，产率：> 90％；

S3.合成PEG-PCL-PEI：将1.84g PEG-PCL-COOH和85mg NHS溶解在20ml氯仿中，并放置在配有磁力搅拌棒的烧瓶中，烧瓶置于冰水浴中，加入148mg DCC，然后将烧瓶在氩气气氛下密封后，在0℃搅拌1小时，然后加入含1.26g PEI（MW:1800）的氯仿溶液10ml，在0℃继续搅拌1小时，再在室温下搅拌24小时；过滤，将滤液加入到过量的乙醚中，收集沉淀物，室温下真空干燥后即得PEG-PCL-PEI，产率: >85%；

S1-S3中，PEG-OH，PEG-PCL-OH，PEG-PCL-COOH以及PEG-PCL-PEI的¹H NMR 谱图见图1；PEG-PCL-COOH 和PEG-PCL-PEI的红外谱图见图2（a）和（b）。

图1中：出现在3.64 ppm的尖峰归因于PEG嵌段的亚甲基质子；PCL嵌段的亚甲基质子的典型信号出现在1.32，1.56，2.31，4.06 ppm；在2.5~2.9 ppm中观察到的强而宽的吸收峰被归属于到PEI的亚甲基。¹ H NMR结果表明，成功地合成了三元嵌段共聚物PEG-PCL-PEI。

图2中：PEG和PCL的特征吸收峰分别在1190 cm^-1（S，VC-O）和1726 cm^-1（S，VC =O），显然，这两个PEG和PCL嵌段存在于中间预聚物PEG-PCL-COOH和最终的共聚物PEG-PCL-PEI中；两个大约在1644cm^-1、1562 cm^-1处新的、强的吸收归属于酰胺键（S，vamide，C = O）的特征吸收峰；此外，3300 cm^-1处强而宽的吸收归属于胺（S，VN-H）的特征吸收峰。

三元嵌段共聚物PEG-PCL-PEI的嵌段组成通过¹ H NMR的峰的积分强度计算得出，三个嵌段分别具有2000，2500和1800的分子量，聚合物可以表示为PEG₂₀₀₀-PCL₂₅₀₀-PEI₁₈₀₀。

性能测试

0、药物准备

空白聚合物胶束：将10mg 实施例1 PEG-PCL-PEI溶解在2mL由甲醇与乙腈以体积比1:1组成的混合溶剂中；然后，在超声搅拌下，将混合液滴加到20mL的PBS(pH 7.2)中，通过旋转蒸发设备真空蒸馏除去有机溶剂，再通过超滤离心过滤装置（截留分子量: 100,000Da）重复洗涤浓缩3次，进一步过滤除去大的聚合物，得空白聚合物胶束。

FDA聚合物胶束及FDA聚合物胶束滴眼液：将10mg实施例1 PEG-PCL-PEI与0.5mgFDA（荧光素二乙酸酯Fluorescein diacetate）溶解在2mL由甲醇与乙腈以体积比1:1组成的混合溶剂中；然后，在超声搅拌下，将混合液滴加到20mL的PBS(pH 7.2)中，通过旋转蒸发设备真空蒸馏除去有机溶剂，再通过超滤离心过滤装置（截留分子量: 100,000 Da）重复洗涤浓缩3次以除去游离的FDA，进一步过滤除去大的聚合物或FDA聚集体，得负载FDA的聚合物胶束；该聚合物胶束和生理盐水以1:9的体积比混合，即制成FDA聚合物胶束滴眼液。

环孢素A聚合物胶束及环孢素A聚合物胶束滴眼液：制备方法基本同负载FDA的聚合物胶束及FDA聚合物胶束滴眼液，只需用环孢素A替换FDA即可。

FDA纳米颗粒或微米颗粒滴眼液：将0.5mg FDA纳米颗粒或微米颗粒（现有技术制备）溶解在2mL由甲醇与乙腈以体积比1:1组成的混合溶剂中；然后，在超声搅拌下，将混合液滴加到20mL的PBS(pH 7.2)中，通过旋转蒸发设备真空蒸馏除去有机溶剂，再通过超滤离心过滤装置（截留分子量: 100,000 Da）重复洗涤浓缩3次以除去游离的FDA，进一步过滤除去大的FDA聚集体，得FDA纳米颗粒或微米颗粒滴眼液。

1、聚合物胶束的粒径和表面电位测定

用Zeta-Plus 电位粒径仪（Brooken Haven）测定空白聚合物胶束的粒径，入射激光波长λ＝532nm，入射角θ＝90°，温度为 25℃；取三次测量值的平均值。ζ表面电位使用Brookhaven专用的微量检测样品池，以增加检测数据的准确性；每组样品，均取 5 次测量的平均值。

测量结果表明：本发明聚合物胶束具有相对小的粒径（为27.74 nm）和12.12mv的表面正电位。正电聚合物胶束可以负载疏水性药物，如图3所示。

聚合物胶束的形态通过扫描电镜测定，结果见图4a，为均匀的球形结构。

2、载药聚合物胶束载药量的测定

载药聚合物胶束中药物环孢素A的载药量被定义为药物在胶束中的重量百分比。为了确定载药量，预称重冻干胶束，重新溶解在乙腈/甲醇（1/1，体积比）。用 HPLC 检测样品的浓度。其中 HPLC 所用的色谱柱型号为 Waters 2695公司，配有X-BridgeTM C18column (3.5 µm, 3.0 mm × 150 mm, Waters, USA) and UV/vis 检测器，流动相为乙腈和水（V:V = 79:21），流速为0.8 mL/ min，柱温为50 ℃，注射样品量为 20μL。根据事先做好的环孢素A标准曲线来计算。载药量（DLC，重量％）和载药效率（DLE，重量％）根据下列公式计算：

DLC =（所负载的药物质量/聚合物胶束质量）×100％；

DLE =（所负载的药物质量/药物原始投料质量）×100％。

结果表明：本发明环孢素A聚合物胶束的载药量（DLC）为3.47％和载药效率（DLE）为75.37％。

3、体外药物释放行为研究

利用本体平衡反向透析技术研究载药聚合物胶束的体外药物释放行为。具体过程如下：将环孢素A聚合物胶束分别加入到预定数目的1ml的透析袋中，然后将透析袋浸泡到200 ml磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液的PBS（pH7.2）中，在35℃的培养箱摇床（中国上海亿恒科技公司）震荡。在预定的时间点，取出透析袋，高效液相色谱测量药物环孢素A的含量，计算出不同时间点的累积释放量。在分析环孢素A 释放形为时，以时间对环孢素A累积释放量作图，得到体外环孢素A从聚合物胶束中释放的曲线。

载药聚合物胶束的体外释放曲线见图4b，可知：释放曲线具有典型的双相释放模式：初始快速释放，随后持续缓慢释放可延长时间长达数小时。药物释放，在12小时内达到44.8%，在2小时药物释放可以达到31.7%。

4、动物准备和体内双光子显微镜成像

通过腹膜内注射戊巴比妥钠（85毫克/公斤体重）（Sigma-Aldrich公司，美国）将C57BL/6小鼠麻醉。利用塑料眼杯罩在小鼠的眼睛上，利用凡士林进行密封。接着将FDA聚合物胶束滴眼液滴入眼杯，静置半小时，然后用0.9%的食盐水漂洗三次角膜，将小鼠放置在一个塑料板上，用胶带将头部和四肢固定，眼杯用0.9％盐水溶液浸泡然后进行体内双光子3D成像。使用蔡司LSM 780 NLO 荧光成像系统(Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena,Germany)，该系统利用蔡司操作系统(Zen 2010; Carl Zeiss MicroImaging GmbH)。

所有的成像均是使用×20(Plan-Apochromat, NA = 1.0; Carl Zeiss)在水膜浸泡下进行。采用二重反射光非退探测器分别检测到双光子成像信号。所用的激光功率为最大激光功率的24~28％。利用小孔为该应用程序设置最大的开放的环境，并且将样品用2毫米z轴的步长，以产生从角膜内皮到上皮表面延伸的三维数据集进行扫描。图像序列分别记为12位，512×512像素的图像。研究中使用的扫描速率为每帧968.14毫秒。角膜三维数据被从中心收集到旁区域。

以FDA 纳米颗粒和FDA 微米颗粒滴眼液作为对照药物，局部点眼后，药物在老鼠的眼内分布双光子显微镜检测图见图5。当滴加过FDA聚合物胶束滴眼液后，可以观察到荧光药物的深角膜渗透行为，并且具有时间依赖性，点药后15分钟时，荧光仅仅存在于角膜上皮层，而在30分钟时荧光从上皮向角膜的基质层扩散；在60分钟时，基质层的荧光强度比上皮层强。而对照组滴眼液（FDA 纳米颗粒和FDA 微米颗粒）的荧光仅仅存在于角膜上皮层，并且随着时间的延长没有改变。对照结果表明：聚合物胶束能有效克服角膜障碍，释放模型药物到角膜深层。

Claims

1.一种三元嵌段共聚物，其特征在于分子式为：PEG-PCL-PEI，结构式为：

，

其中，m、n、x、y为正整数。

2.一种制备如权利要求1所述的三元嵌段共聚物的方法，其特征在于包括以下步骤：

S1-S3中，PEG-PCL-OH、PEG-PCL-COOH、PEG-PCL-PEI的结构式分别为：

、、。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于具体步骤为：

4.利用如权利要求1所述的三元嵌段共聚物制成的滴眼液，其特征在于按下法制备：将10~20mg的PEG-PCL-PEI与0.5~1mg的治疗眼科疾病常用药物溶解在1~2mL由甲醇与乙腈以体积比1:1~3组成的混合溶剂中；然后，在超声搅拌下，将混合液滴加到20~30mL的PBS中，真空蒸馏除去有机溶剂，重复洗涤浓缩除去游离的药物，过滤得载药聚合物胶束；该载药聚合物胶束和生理盐水以1:9~11的体积比混合，即制成滴眼液。