CN113201135B - 一种活性氧响应性材料pam-sh的制备方法与应用 - Google Patents

一种活性氧响应性材料pam-sh的制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113201135B
CN113201135B CN202110467082.0A CN202110467082A CN113201135B CN 113201135 B CN113201135 B CN 113201135B CN 202110467082 A CN202110467082 A CN 202110467082A CN 113201135 B CN113201135 B CN 113201135B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pamam
pam
synthesis
mass ratio
active oxygen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN202110467082.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113201135A (zh
Inventor
李亚鹏
沈美丽
刘顺
武小东
李少静
姚顺雨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin University
Original Assignee
Jilin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin University filed Critical Jilin University
Priority to CN202110467082.0A priority Critical patent/CN113201135B/zh
Publication of CN113201135A publication Critical patent/CN113201135A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113201135B publication Critical patent/CN113201135B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/028—Polyamidoamines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明的一种活性氧响应性材料PAM‑SH的制备方法与应用属于纳米材料制备技术领域。制备步骤包括1)‑0.5G PAMAM的合成、2)0G PAMAM的合成、3)0.5G PAMAM的合成、4)4.0G PAMAM的合成、5)PAM‑SH的合成等。本发明制备的纳米粒子具有过氧化氢特异性响应的特点，既能降低辛伐他汀酸的毒性，又能通过辛伐他汀酸消耗活性氧而提高治疗效果。

Description

一种活性氧响应性材料PAM-SH的制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米材料制备技术领域，具体涉及一种具有活性氧(ROS)响应，能特异性释药能力的纳米粒子的制备与应用。
背景技术
心血管疾病(CVDs)在中国乃至世界的发病率和死亡率都很高，被列为头号死亡原因。动脉粥样硬化(AS)是心血管疾病的重要病理基础，占心血管疾病死亡人数的61％。炎症会促进过量活性氧(ROS)的产生，因此可以利用斑块处特殊的ROS微环境设计药物传递系统，触发药物释放。
众所周知，功能纳米粒子是一种革命性的疾病治疗方法，已广泛应用于生物医学领域。阳离子聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子是第一类与蛋白质具有相似结构的商业树枝状大分子，具有独特的树状结构和三维球形结构，并且由于其良好的水溶性，单分散性，可调节的分子大小，非免疫原性，能够跨越生物屏障和容易功能化的能力已经广泛应用于生物医学纳米技术领域。
辛伐他汀是一种内酯前药，具有抑制肝细胞内源性胆固醇生物合成、促进新血管生长、抗炎、抗氧化、改善内皮功能、稳定动脉粥样硬化斑块等多种功能，是处方药中降胆固醇程度最高的药物之一，在世界范围内广泛应用于心血管疾病的一级和二级防治。然而，在辛伐他汀自由给药期间，肝毒性和肌肉疼痛是已知的严重副作用，并且由于横纹肌溶解患者不得不中止治疗。因此，寻求新的药物递送方式迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于，为解决传统响应性纳米粒子功能单一的局限，提供一种既能响应活性氧又能消耗活性氧的载药纳米粒子SA PAM(载辛伐他汀酸(SA)的交联树枝状纳米粒子)，同时还提供该材料的制备方法及其在抗血栓纳米粒子方面的应用。
本发明的技术方案如下:
一种活性氧响应性材料PAM-SH的制备方法，具有以下步骤:
1)-0.5G PAMAM的合成
在N2保护下，将丙烯酸甲酯(MA)溶于无水甲醇，在冰浴条件下缓慢滴入乙二胺(EDA)中反应30min，EDA，MA与甲醇的质量比为1:5～15:1～100，室温反应18h，最后，减压旋转蒸发除去甲醇和多余的MA，真空干燥24h，得到淡黄色粘稠液体-0.5G PAMAM；
2)0G PAMAM的合成
在冰浴条件下，将EDA的无水甲醇溶液缓慢滴入-0.5G PAMAM的甲醇溶液中反应20min，-0.5G PAMAM与EDA质量比为1:1～10，然后在35℃下搅拌反应24h，反应完成后，通过减压旋转蒸发除去甲醇和未反应的EDA，真空干燥24小时后得到淡黄色粘性液体，即0GPAMAM；
3)0.5G PAMAM的合成
在冰浴条件下，将0G PAMAM的甲醇溶液缓慢滴入MA的无水甲醇溶液中反应20min，0G PAMAM与MA的质量比为1:1～10，然后在35℃下搅拌反应24h，反应完成后，通过减压旋转蒸发除去甲醇和未反应的MA，真空干燥24小时后得到淡黄色粘性液体，即0.5G PAMAM；
4)4.0G PAMAM的合成
交替进行步骤2)和步骤3)的操作，并将前一个步骤的产物作为后一个步骤的原料，最终制备得到4.0G PAMAM；其中，制备1.5G PAMAM时反应时间为36h，制备2.0G和2.5GPAMAM时反应时间均为48h，制备3.0G和3.5G PAMAM时反应时间均为72h，制备4.0G PAMAM时反应时间为96h；
5)PAM-SH的合成
在N2和黑暗条件下，将PAMAM溶于PBS中，然后加入2-亚氨基硫烷盐酸盐，2-亚氨基硫烷盐酸盐与4.0G PAMAM的质量比为1:10～30，室温搅拌过夜，将反应液用透析膜在去离子水中透析48小时后用冻干机冻干，得到白色絮凝固体PAM-SH，在-20℃条件下保存。
作为优选，步骤5)中所述的PBS是pH＝8含0.001M EDTA的磷酸缓冲液。
一种活性氧响应性材料PAM-SH的应用，其特征在于，是用于制备具备特异性释放药物能力的纳米粒子，步骤为：将辛伐他汀溶解于乙醇中，加入NaOH，在50℃下反应2h，用盐酸调节反应溶液pH至中性，旋转蒸发除去反应溶液中的乙醇，并加入正丁醇萃取SA(辛伐他汀)，其中辛伐他汀、乙醇、NaOH和正丁醇的质量比为30～90:800～1500:1:500～5000；有机相经旋转蒸发和真空干燥后得到SA；随后，以PAM-SH与SA的质量比为1:1～10制备得到SAPAM。
所述的制备得到SA PAM，具体步骤为：在N2保护下，将NaBH4加入到含PAM-SH的去离子水中，PAM-SH与NaBH4质量比为1:500～1000，在室温下搅拌3h，将反应体系用0.1M HCl调至中性，将含有SA的DMSO溶液缓慢滴加到反应体系中，SA与DMSO质量比为1:2～10，室温反应5h，最后，用透析袋在去离子水中透析2天得到SA PAM。
本发明在阳离子4.0G PAMAM的末端引入了巯基，通过静电吸附与阴离子SA自组装，从而获得了交联型载药纳米粒子(SA PAM))，既增强了纳米粒子的稳定性，又实现了药物在特定环境中的释放。SA的加入可以中和4.0G PAMAM的部分正电荷。因此，本发明对基于动脉粥样硬化治疗提供了一种有前途的方法。
综上，本发明有以下有益效果：
1、本发明将毒副作用较大的辛伐他汀酸通过用PAM-SH包覆形成纳米粒子使其具有良好的生物相容性。
2、纳米粒子具有过氧化氢特异性响应的特点。
3、本发明的载药纳米粒子不仅具有过氧化氢响应的能力，还可以通过辛伐他汀酸消耗活性氧的能力提高治疗的效果。
附图说明
图1是实施例1中PAM-SH的合成路线图
图2是实施例1中4.0G PAMAM和PAM-SH的FTIR图。
图3是实施例2中辛伐他汀酸的合成路线图。
图4是实施例2中辛伐他汀酸和辛伐他汀的1H NMR图。
图5是实施例2中辛伐他汀酸(SA)和辛伐他汀(SV)的FTIR光谱图。
图6是实施例2中SA PAM的TEM图。
图7是实施例2中SA PAM的稳定性图。(a)为DLS图；(b)为zeta电位图。
图8是实施例3中SA PAM在含有不同浓度H2O2的PBS中的SA的体外累积释放曲线图。
图9是实施例4中PAM-SH、SA和SA PAM与RBC孵育1h后的溶血率图。(a)为PAM-SH的溶血率图；(b)为SA和SA PAM的溶血率图。
图10是实施例5中PAM-SH、SA和SA PAM的MTT图。(a)为PAM-SH的MTT图；(b)为SA和SA PAM的MTT图。
图11是实施例6中SA、PAM-SH和SA PAM对RAW 264.7的细胞内ROS含量的影响图。
图12 ApoE-/-小鼠的体内治疗效果。其中(a)为主动脉弓油红O染色；(b)为油红O染色量化。
具体实施方式
实施例1：活性氧响应性材料PAM-SH的合成
1)-0.5G PAMAM的合成
PAMAM通过发散法合成，包括两步迭代反应，利用Michael加成和酰胺化反应逐渐向外围发散，从而在中心引发剂核心周围产生分支(代)的同心壳。首先，将含有丙烯酸甲酯(MA,146mL,1.6mol)的无水甲醇(200mL)在冰浴中缓慢滴入乙二胺(EDA,13mL,0.2mol)中反应30min，然后在室温下反应18h。以上反应均在N2保护下进行。最后，减压旋转蒸发除去甲醇和多余的MA，真空干燥24h，得到淡黄色粘稠液体(-0.5G PAMAM,79g,97％)。
2)0G PAMAM的合成
在冰浴条件下，将含EDA的无水甲醇(140mL,2.1mol)缓慢滴入含-0.5GPAMAM(35g,0.087mol)的甲醇溶液(150mL)中反应20min，然后在35℃下搅拌反应24h。反应完成后，通过减压旋转蒸发除去甲醇和未反应的EDA,真空干燥24小时后得到淡黄色粘性液体，，即0GPAMAM(43g,96％)。
3)0.5G PAMAM的合成
在冰浴条件下，将含0G PAMAM(36g，0.07mol)的甲醇溶液(150mL)缓慢滴入含MA(223mL，2.4mol)的无水甲醇中反应20min，然后在35℃下搅拌反应24h。反应完成后，通过减压旋转蒸发除去甲醇和未反应的MA，真空干燥24小时后得到淡黄色粘性液体，即0.5GPAMAM(81g，97％)。
4)4.0G PAMAM的合成
1.5G、2.5G、3.5G PAMAM的制备方法与0.5G PAMAM相同，1.0G、2.0G、3.0G、4.0GPAMAM的制备方法与0G PAMAM相同。MA和EDA的剂量按比例增加，反应时间相应延长，具体如表1所示。从图2中可以看出，在3270和1554cm–1的强吸收峰归因于伯胺(-NH2)中N-H键的伸缩和弯曲振动，在1659cm-1处出现的尖锐吸收峰代表CO-NH基团中的C＝O伸缩振动，说明树枝状结构中同时存在酯基和伯胺，证实了4.0G PAMAM的成功合成。
表1.每代的比率，反应时间和产率
Figure BDA0003043591140000051
5)PAM-SH的合成
将0.04g 2-亚氨基硫烷盐酸盐加入50mL含有0.5g 4.0G PAMAM的PBS(pH＝8,0.001M EDTA)中。反应在N2和黑暗条件下进行，室温搅拌过夜。将反应液用透析膜(MWCO1.0kDa)在去离子水(9×3L)中透析48小时后用冻干机冻干，得到白色絮凝固体(PAM-SH,0.613g)，并保存在-20℃。图1为PAM-SH的合成路线。图2中578cm–1处的峰代表-S-S-而不是-SH的吸收峰，因为不稳定的巯基很容易在空气中交联成为二硫键，这也说明PAM-SH的成功制备。
实施例2：SA PAM纳米粒子的制备
将0.456g辛伐他汀溶解于11mL乙醇中，加入NaOH(17mL，0.1M)，在50℃下反应2h，用盐酸调节反应溶液pH至中性。旋转蒸发除去反应溶液中的乙醇，并加入正丁醇萃取SA。有机相经旋转蒸发和真空干燥后得到0.402g SA。随后，以PAM-SH与SA的质量比为5:10制备了SA PAM。具体步骤为：在N2保护下，将0.1M NaBH4加入到含有5mg PAM-SH的去离子水中，在室温下搅拌3h，将溶液用0.1M HCl调至中性，将含有10mg SA的2mL DMSO溶液缓慢滴加到反应溶液中，室温反应5h。最后，用透析袋(MWCO 1.0kDa)在去离子水透析2天得到SA PAM。图3是SA的合成路线图。图4和图5分别是辛伐他汀酸和辛伐他汀的1H NMR和FTIR图。1H NMR中可以看到由于内酯结构的开环，连接羟基的邻位H(e)的峰已经从原来的4.62ppm变为3.64ppm，连接羧基的邻位H(s)的峰从2.71ppm变为2.34ppm。FTIR中1583cm–1处的尖峰是羧酸基团(-COOH)中的-COO-不对称伸缩特征峰，而3363cm–1处的宽峰是由于氢键存在的原因，为羟基(-OH)的伸缩振动吸收峰。图6和图7是SA PAM的TEM和稳定性图。TEM图像证实了SA PAM为球形纳米结构，粒径为100nm。图7说明纳米粒子在一个月内非常稳定，粒径和zeta电位几乎保持不变。
实施例3：载药与药物释放
用紫外-可见光谱仪(UV-2450，日本岛津公司)在243nm处检测含H2O2的去离子水中SA PAM中的SA含量。将SA PAM溶液冻干后，称取一定量的SA PAM粉末溶解在含有过氧化氢的去离子水中，高速离心后，将上清液转移到石英比色皿中，25℃条件下观察SA的紫外吸收峰，并根据已建立的标准曲线获得载药量。使用透析袋进行了体外药物释放的研究。简而言之，将装在透析袋(MWCO 3.5kDa)中等量的SA PAM溶液浸入含不同浓度H2O2(0，2.5，5，7.5和10mM)的PBS(pH 7.4)中，每个样品的体积为68mL。将实验置于37℃的黑暗环境中的摇床上轻轻晃动。在预定的时间点，取出3mL透析液用于紫外测定，以定量SA，同时加入等体积的新鲜透析液以保持体积恒定。图8是SA PAM在含有不同浓度H2O2的PBS(pH7.4)中的SA的体外累积释放曲线图，可以发现明显的H2O2依赖性药物释放曲线，说明SA PAM具有H2O2响应性释放药物的特性。
实施例4：血液相容性
SA PAM的溶血活性按照先前报道的方法进行了一些修改。简而言之，在含有抗凝剂柠檬酸钠的离心管中收集新鲜兔血，以2000rpm离心10min，弃去含有血浆和白细胞的上清，获得红细胞。将所得的红细胞用PBS(pH 7.4)洗涤3次，待上清液澄清后吸弃上清液，将红细胞重悬于PBS中。将红细胞悬液(100μL)与不同浓度的SA PAM在37℃共孵育1h。在这项研究中，我们测试了7种浓度(0、2、4、6、8、16、24、32、38μg/mL)的PAM-SH的溶血情况，以及另外7种浓度(0、2、4、6、8、10、16、24μg/mL)的SA和SA PAM的溶血情况。孵育后，将混合物以2000rpm离心10min，并使用紫外-可见光谱仪在540nm处分析各上清液的吸光度，以测定血红蛋白释放量。阴性对照为未经处理的红细胞(溶血率0％)，而用去离子水处理过的红细胞作为阳性对照(溶血率100％)。图9说明当PAM的浓度小于32μg/mL时，PAM组是安全的。当SA浓度达到10μg/mL时，SA组被视为溶血，而SA PAM组的溶血率仅为3.5％，说明PAM可在一定范围内降低红细胞的溶血。
实施例5：MTT
通过MTT法检测HUVECs的细胞活力。将细胞以5×103细胞/孔的密度置于96孔板中，为并在37℃和5％CO2下培养24h，然后加入20μL不同浓度的SA PAM处理细胞。培养24h后，在黑暗条件下向每个孔中加入20μL MTT，再次培养4h。小心弃掉培养基，加入150μLDMSO溶解甲瓚晶体。使用酶标仪(SpectraMax 340PC，美国分子仪器公司)获得每孔在492nm处的吸光度。图10中PAM-SH组的细胞存活率在各浓度之间无显著差异，且细胞存活率均不低于80％，说明具有良好的细胞相容性。
实施例6：细胞内ROS的检测
采用DCFH-DA法检测RAW 264.7细胞内的ROS水平。乙酸酯基团被细胞内酯酶水解后被ROS氧化，DCFH-DA转化为带有绿色荧光的2'，7'-二氯荧光素(DCF)，其荧光强度与ROS的含量成正比。简而言之，将RAW 264.7以每孔1×105个细胞的密度接种在激光共聚焦培养皿中，并在37℃，5％CO2下用LPS(4μg/mL)处理36h。用PBS缓冲液洗涤细胞3次后，加入含有SA或SA PAM的新鲜培养基作用一段时间后，洗涤细胞3次，并在黑暗中与10μM DCFH-DA培养30分钟，然后除去荧光探针溶液，并用PBS洗涤细胞。RAW 264.7用Hoechst 33342(1mM)染色5分钟后，用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM,Zeiss LSM 780，德国)测量细胞的共聚焦荧光成像。图11说明SA和SA PAM能有效抑制ROS水平。
实施例7：ApoE-/-小鼠模型
经过正常饮食喂养三天之后，ApoE-/-小鼠被随机分为3组:空白对照组，SA组和SAPAM组。小鼠连续24周接受高脂喂养，并在最后8周内每3天接受80mg/kg剂量的治疗。高胆固醇喂养24周后，末次治疗24h后处死所有小鼠。图12说明SA PAM的治疗效果优于游离SA。

Claims (3)

1.一种活性氧响应性材料PAM-SH的应用，其特征在于，用于制备具备特异性释放药物能力的纳米粒子，步骤为：将辛伐他汀溶解于乙醇中，加入NaOH，在50℃下反应2h，用盐酸调节反应溶液pH至中性，旋转蒸发除去反应溶液中的乙醇，并加入正丁醇萃取SA，其中辛伐他汀、乙醇、NaOH和正丁醇的质量比为30～90:800～1500:1:500～5000；有机相经旋转蒸发和真空干燥后得到SA；随后，以PAM-SH与SA的质量比为1:1～10制备得到SA PAM；
所述的活性氧响应性材料PAM-SH是按以下方法制备的:
1)-0.5G PAMAM的合成
在N2保护下，将丙烯酸甲酯MA溶于无水甲醇，在冰浴条件下缓慢滴入乙二胺EDA中反应30min，EDA与MA的质量比为1:5～15，室温反应18h，最后，减压旋转蒸发除去甲醇和多余的MA，真空干燥24h，得到淡黄色粘稠液体-0.5G PAMAM；
2)0G PAMAM的合成
在冰浴条件下，将EDA的无水甲醇溶液缓慢滴入-0.5G PAMAM的甲醇溶液中反应20min，-0.5G PAMAM与EDA质量比为1:1～10，然后在35℃下搅拌反应24h，反应完成后，通过减压旋转蒸发除去甲醇和未反应的EDA，真空干燥24小时后得到淡黄色粘性液体，即0GPAMAM；
3)0.5G PAMAM的合成
在冰浴条件下，将0G PAMAM的甲醇溶液缓慢滴入MA的无水甲醇溶液中反应20min，0GPAMAM与MA的质量比为1:1～10，然后在35℃下搅拌反应24h，反应完成后，通过减压旋转蒸发除去甲醇和未反应的MA，真空干燥24小时后得到淡黄色粘性液体，即0.5G PAMAM；
4)4.0G PAMAM的合成
交替进行步骤2)和步骤3)的操作，并将前一个步骤的产物作为后一个步骤的原料，最终制备得到4.0G PAMAM；其中，制备1.5G PAMAM时反应时间为36h，制备2.0G和2.5G PAMAM时反应时间均为48h，制备3.0G和3.5G PAMAM时反应时间均为72h，制备4.0G PAMAM时反应时间为96h；
5)PAM-SH的合成
在N2和黑暗条件下，将PAMAM溶于PBS中，然后加入2-亚氨基硫烷盐酸盐，2-亚氨基硫烷盐酸盐与4.0G PAMAM的质量比为1:10～30，室温搅拌过夜，将反应液用透析膜在去离子水中透析48小时后用冻干机冻干，得到白色絮凝固体PAM-SH，在-20℃条件下保存。
2.根据权利要求1所述的一种活性氧响应性材料PAM-SH的应用，其特征在于，在制备活性氧响应性材料PAM-SH的步骤5)中所述的PBS是pH＝8含0.001M EDTA的磷酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种活性氧响应性材料PAM-SH的应用，其特征在于，所述的制备得到SA PAM，具体步骤为：在N2保护下，将NaBH4加入到含PAM-SH的去离子水中，PAM-SH与NaBH4质量比为1:500～1000，在室温下搅拌3h，将反应体系用0.1M HCl调至中性，将含有SA的DMSO溶液缓慢滴加到反应体系中，SA与DMSO质量比为1:2～10，室温反应5h，最后，用透析袋在去离子水中透析2天得到SA PAM。
CN202110467082.0A 2021-04-28 2021-04-28 一种活性氧响应性材料pam-sh的制备方法与应用 Expired - Fee Related CN113201135B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110467082.0A CN113201135B (zh) 2021-04-28 2021-04-28 一种活性氧响应性材料pam-sh的制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110467082.0A CN113201135B (zh) 2021-04-28 2021-04-28 一种活性氧响应性材料pam-sh的制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113201135A CN113201135A (zh) 2021-08-03
CN113201135B true CN113201135B (zh) 2022-03-22

Family

ID=77029228

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110467082.0A Expired - Fee Related CN113201135B (zh) 2021-04-28 2021-04-28 一种活性氧响应性材料pam-sh的制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113201135B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114246861B (zh) * 2021-11-25 2024-02-02 吉林大学 一种具有剪切应力响应的载药纳米粒子的制备方法
CN114106321B (zh) * 2021-11-25 2023-03-14 吉林大学 一种活性氧响应性材料pei-sh的制备方法与应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6020457A (en) * 1996-09-30 2000-02-01 Dendritech Inc. Disulfide-containing dendritic polymers
CN112574415B (zh) * 2020-12-09 2021-10-12 吉林大学 一种活性氧响应性材料及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113201135A (zh) 2021-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Redox-sensitive micelles self-assembled from amphiphilic hyaluronic acid-deoxycholic acid conjugates for targeted intracellular delivery of paclitaxel
CN113201135B (zh) 一种活性氧响应性材料pam-sh的制备方法与应用
CN103435718B (zh) Peg修饰的透明质酸胆固醇酯
WO2006041613A2 (en) Nanoparticles for targeting hepatoma cells
JPH11335267A (ja) 水難溶性薬物を含有するポリマーミセル系
CN110408047B (zh) 纳米配位聚合物及其制备方法和应用
WO2009152691A1 (zh) 聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物及制备方法和应用
FR2809112A1 (fr) Materiaux a base de polymeres biodegradables et son procede de preparation
CN113264906B (zh) 多西他赛二聚体小分子前药及其自组装纳米粒的构建
CN102114246A (zh) 生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖衍生物载体及其药学组合物的制备和应用
Joshy et al. Core–shell nanoparticles of carboxy methyl cellulose and compritol-PEG for antiretroviral drug delivery
CN106729727A (zh) 靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体及其制备方法
CA2492995A1 (en) Nanoparticles for the administration of active ingredients, method of producing said particles and composition containing same
Yang et al. Multifunctional mesoporous silica nanoparticles with different morphological characteristics for in vitro cancer treatment
WO2008007932A1 (en) Chitosan complex containing ph sensitive imidazole group and preparation method thereof
CN114796513B (zh) 二硒键桥连多西他赛二聚体前药及其自组装纳米粒
CN114106321B (zh) 一种活性氧响应性材料pei-sh的制备方法与应用
KR101323102B1 (ko) 글리콜키토산-담즙산 복합체에 항암제가 봉입된 나노입자 및 그 제조방법
CN113278092B (zh) 一种聚合物载体材料及其制剂和应用
CN107519496B (zh) 一类l-肉毒碱两亲性衍生物及其修饰的纳米粒及其用途
Mansouri et al. Design and synthesis of aptamer AS1411-conjugated EG@ TiO 2@ Fe 2 O 3 nanoparticles as a drug delivery platform for tumor-targeted therapy
ES2654429T3 (es) Método para tratar la deficiencia de hierro
CN114146188A (zh) 一种修饰型LMSNs纳米药物载体的制备方法
CN114432264A (zh) 一种基于二茂铁和金丝桃素的复合纳米材料、制备方法及应用
CN107334733B (zh) 一种含藤黄酸的还原敏感型复合物及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20220322

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee