CN107308112A - 一种改性黄原胶纳米胶束的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种注射剂型改性黄原胶纳米胶束的制备方法：将邻苯二甲酸酐与黄原胶进行酯化反应，“一步法”制备两亲性改性黄原胶聚合物，再通过选择性溶剂法自组装制备改性黄原胶纳米胶束；通过对黄原胶进行酸酐改性，提高黄原胶的生物相容性和抗氧化性能。黄原胶纳米胶束具有苯环的疏水空腔和黄原胶的亲水外层，可增加纳米胶束在生物体内的循环稳定性，另外改性黄原胶含有羧酸基团，使纳米胶束具有一定的pH响应性，又可利用其电荷作用负载药物阿霉素，使载药纳米胶束具有一定的缓释功能。本发明的合成步骤简单、绿色，纳米胶束可在体内完全降解，有望作为抗癌药物载体及控制释放。

Description

一种改性黄原胶纳米胶束的制备方法

技术领域

本发明涉及一种改性黄原胶纳米胶束的制备方法，属于天然高分子材料在生物医用技术领域的应用。

背景技术

黄原胶是作为一种天然多糖，是由野油菜黄单胞菌分泌的胞外多糖，并且是一种重要的生物高聚物，其主链结构与纤维素相同，而其侧链末端甘露糖连接有丙酮酸基团。因为黄原胶侧链和主链通过氢键形成螺旋和多重螺旋高级结构，导致黄原胶在水中溶解速率下降，水溶性降低，一些活性基团被包裹在结构内部，限制了黄原胶的抗氧化活性和稳定性。由于黄原胶无毒、无害、适应性较强，所以其在生命科学领域内有着广泛的应用，如用作纳米药物载体、进行药物可控释放等发挥着重要作用。由于黄原胶自身的保水性和较强的亲水胜，使其在医疗操作方面有很多的应用，例如可以形成一个非常致密的水膜，从而可以有效的避免外部细菌对皮肤的感染，减少病人在化疗、放疗后的口渴等。

为了解决黄原胶溶解速率过慢、抗氧化性等问题，可对黄原胶进行改性，包括用邻苯二甲酸酐酯化、马来酸酐酯化和琥珀酸酐酯化等。本发明以邻苯二甲酸酐改性为例，制备得到具有两性亲结构的改性黄原胶多糖聚合物，再利用选择性溶剂法将两亲性改性黄原胶聚合物自组装成黄原胶纳米胶束，用来负载疏水药物阿霉素，可用于注射剂型。其中，邻苯二甲酸酐作为酸酐类改性剂，同时引入了疏水苯环结构和羧基，使黄原胶具有两亲性结构，疏水苯环可负载疏水药物，增加的阴离子性羧酸基团可以提高改性黄原胶纳米胶束对正电荷药物的抗吸附能力，例如在负载正电荷药物阿霉素方面具有独特的优势。该纳米胶束在体内循环稳定，药物可缓慢释放，该改性黄原胶纳米胶束作为注射剂型或口服剂型的药物载体都具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种两亲性黄原胶纳米胶束的制备方法。首先配置0.5w％～3w％黄原胶水溶液，然后加入酯化反应催化剂4-二甲氨基吡啶，再缓慢滴加邻苯二甲酸酐的丙酮溶液，搅拌均匀，反应之后用过量乙醇沉淀反应产物，沉淀再用乙醇洗涤数次，真空干燥得到粗产物。粗产物用去离子水溶解配置成0.5w％～1w％溶液，用截留分子量为14000的透析袋透析处理72h，透析除去杂质和未反应小分子，透析样品经过冷冻干燥之后得到两亲性改性黄原胶聚合物。甲酰胺溶解两亲性改性黄原胶聚合物样品配置成0.1mg/mL的聚合物溶液，取上述聚合物溶液于样品瓶中，向其中滴加一定量的超纯水，滴加完成后继续搅拌，使两亲性改性黄原胶聚合物自组装充分，形成黄原胶纳米胶束，再经过透析处理除去有机溶剂甲酰胺得到改性黄原胶纳米胶束溶液。

邻苯二甲酸酐在改性黄原胶制备纳米胶束中具有功能作用：1)苯环结构作为疏水部分，有助于形成两亲性黄原胶纳米胶束，并用于负载疏水药物；2)邻苯二甲酸酐改性既提高黄原胶的生物相容性和抗氧化能力，又提高改性黄原胶纳米胶束的循环稳定性和抗蛋白吸附性能；3)引入羧基负离子可以提高正电荷药物阿霉素的负载量，到达酸性环境时，阿霉素上的氨基被质子化之后变成游离的阿霉素分子，达到控制释放的目的。

本发明还提供一种黄原胶纳米胶束的制备方法，依次包括以下步骤：

1)配制黄原胶水溶液，加入催化剂4-二甲氨基吡啶，再滴加邻苯二甲酸酐的丙酮溶液，升温反应后冷却至室温，用乙醇沉淀、洗涤并真空干燥，得到粗产物；

2)取上述粗产物，配制成水溶液，用截留分子量为14000的透析袋中透析处理72h后，透析样品冷冻干燥，得到两亲性改性黄原胶聚合物；

3)取两亲性改性黄原胶聚合物溶于甲酰胺，用选择性溶剂方法制备改性黄原胶纳米胶束；

4)将制备得到的改性黄原胶纳米胶束进行抗肿瘤药物阿霉素的负载，得到载药改性黄原胶纳米胶束；

具体的，所述步骤1)中，配置0.5w％～3w％浓度的黄原胶水溶液，机械搅拌均匀后，加入占黄原胶质量1w％～4w％DMAP作为酯化反应催化剂，缓慢滴加0.5g、1.0g、2.0g、4.0g 和8.0g邻苯二甲酸酐的丙酮溶液，搅拌均匀，升温至60℃反应12h后冷却至室温，用3倍体积乙醇沉淀，过滤，沉淀再用乙醇洗涤三次，60℃真空干燥至恒重，得到粗产物；

具体的，所述步骤2)中，粗产物提纯方法，粗产物用去离子水溶解配置成0.5w％～1w％溶液，移至截留分子量为14000的透析袋中，去离子水为透析外液，每隔3～8h换一次透析外液，透析处理不少于72h，除去未反应的小分子和催化剂，将透析样品冷冻干燥之后得到两亲性改性黄原胶聚合物，密封保存；

具体的，所述步骤3)中，用甲酰胺溶解两亲性改性黄原胶聚合物样品，配制成0.1mg/mL 的聚合物溶液，取1mL溶液于样品瓶中，磁力搅拌下用长丝滴管控制40～60s每滴的速度缓慢滴加1～20mL超纯水，滴加完成后继续搅拌5～8h，使两亲性改性黄原胶聚合物充分形成黄原胶纳米胶束，再将上述溶液移至截留分子量为14000的透析袋中，以超纯水为透析外液，升温至30～40℃透析处理不少于24h，每隔2～4h换一次透析外液，完成后得到改性黄原胶纳米胶束溶液；

具体的，所述步骤4)中，将透析得到的改性黄原胶纳米胶束溶液装入样品瓶中，避光磁力搅拌下加入10～30μL浓度为1mg/mL阿霉素溶液，室温下避光磁力搅拌24h后，移至截留分子量为3500的透析袋中，去离子水透析外液处理不少于12h，得到载药改性黄原胶纳米胶束，紫外光谱测试载药改性黄原胶纳米胶束溶液在A₄₃₈处吸收峰，利用阿霉素标准曲线，计算改性黄原胶纳米胶束的载药率和包封率；

本发明还提供一种改性黄原胶纳米胶束，在制备化疗药物载体中的应用。将邻苯二甲酸酐通过酯化开环反应连接到黄原胶链段中，合成了具有两亲性结构的改性黄原胶，利用选择性溶剂法制备得到改性黄原胶纳米胶束，苯环结构形成的疏水内核可以负载疏水药物阿霉素，纳米胶束结构中还含有羧基，一方面可以提高药物负载，另一方面提高了纳米粒子的循环稳定性。同时利用病灶部位pH值的差异，可以使载药纳米粒子具有一定的缓释效果，提高药物的利用率，降低了生物体的抗药性。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1.利用水相体系合成方法提高了邻苯二甲酸酐在黄原胶链段上的酯化率。

2.利用酸酐酯化“一步法”制备具有两亲性结构的改性黄原胶，反应简单温和，后处理方便，绿色无毒，利用其两亲性结构能够制备得到改性黄原胶纳米胶束。

3.酸酐开环之后形成的羧基具有负电荷，赋予了改性黄原胶纳米胶束良好的生物相容性，增加药物载体在体内的循环时间。

4.改性黄原胶的抗氧化性能增强，使黄原胶纳米胶束不易被氧化降解，能够长时间保持形貌稳定，提高了释药时间。

5.改性黄原胶纳米胶束具有两亲性的核壳结构，苯环构成了疏水的内部空腔，外部包裹亲水性的黄原胶，在病灶部位酸性条件下，疏水药物阿霉素上的氨基发生质子化，从改性黄原胶纳米胶束内部结构中扩散出来，达到靶向释放药物的目的。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如下。

附图说明

图1邻苯二甲酸酐酯化改性黄原胶制备纳米胶束示意图；

图2邻苯二甲酸酐酯化改性黄原胶的取代度；

图3黄原胶原料和两亲性改性黄原胶聚合物红外谱图；图中Xan为黄原胶，XP1、XP2、 XP3、XP4和XP5分别代表黄原胶与邻苯二甲酸酐反应质量比4：1、2：1、1：1、1：2和1： 4；

图4本发明制备改性黄原胶纳米胶束的粒径分布图；

图5本发明改性黄原胶纳米胶束的扫描电镜图片；图中a、b、c、d和e分别代表黄原胶与邻苯二甲酸酐反应质量比4：1、2：1、1：1、1：2和1：4；

图6本发明中XP2载药改性黄原胶纳米胶束的体外药物释放实验；

表1改性黄原胶分别在去离子水、1％NaCl和1％CaCl ₂溶液中的粘度。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1-1)邻苯二甲酸酐改性黄原胶合成两亲性改性黄原胶聚合物：

将2g黄原胶溶于200mL去离子水中，机械搅拌均匀后，加入0.06g 4-二甲氨基吡啶，将溶有0.5g邻苯二甲酸酐的20mL丙酮溶液缓慢滴加到上述黄原胶溶液中，搅拌均匀，升温至60℃反应12h后冷却至室温，用3倍体积乙醇沉淀，过滤，沉淀再用乙醇洗涤三次，60℃真空干燥至恒重，得邻苯二甲酸酐改性黄原胶粗产物；用去离子水溶解粗产物，配置成0.5w％溶液，移至截留分子量为14000的透析袋中，去离子水为透析外液，每隔5h换一次透析外液，透析处理不少于72h，除去未反应的小分子和催化剂，将透析样品冷冻干燥之后得到两亲性改性黄原胶聚合物，密封保存。

1-2)改性黄原胶纳米胶束的制备：

取1mg冷冻干燥之后的两亲性改性黄原胶聚合物，用10mL甲酰胺溶解，配制成0.1mg/mL的两亲性黄原胶聚合物溶液；取1mL上述溶液于20mL样品瓶中，磁力搅拌下用长丝滴管控制50s每滴的速度缓慢滴加10mL超纯水，滴加完成后搅拌6h，自组装充分形成纳米胶束，再将上述溶液移至截留分子量为14000的透析袋中，以超纯水为透析外液，升温至40℃透析处理不少于24h，每隔3h换一次透析外液，完成后得到改性黄原胶纳米胶束溶液。

1-3)载药改性黄原胶纳米胶束的制备：

将透析得到的10mL改性黄原胶纳米胶束装入20mL样品瓶中，避光磁力搅拌下加入20μL浓度为1mg/mL阿霉素溶液，室温下避光磁力搅拌24h后，移至截留分子量为3500的透析袋中，去离子水透析外液处理不少于12h，得到载药改性黄原胶纳米胶束，记为XP1。

实施例2

如实施例1-1)所示，配制黄原胶水溶液，加入相同量催化剂，将溶有1.0g邻苯二甲酸酐的20mL丙酮溶液缓慢滴加到上述黄原胶溶液中，搅拌均匀，升温至60℃反应12h后冷却至室温，后处理如实施例1-1)，制备改性黄原胶纳米胶束如实施例1-2)，制备载药改性黄原胶纳米胶束如实施例1-3)，得到的改性黄原胶纳米胶束记为XP2。

实施例3

如实施例1-1)所示，配制黄原胶水溶液，加入相同量催化剂，将溶有2.0g邻苯二甲酸酐的20mL丙酮溶液缓慢滴加到上述黄原胶溶液中，搅拌均匀，升温至60℃反应12h后冷却至室温，后处理如实施例1-1)，制备改性黄原胶纳米胶束如实施例1-2)，制备载药改性黄原胶纳米胶束如实施例1-3)，得到的改性黄原胶纳米胶束记为XP3。

实施例4

如实施例1-1)所示，配制黄原胶水溶液，加入相同量催化剂，将溶有4.0g邻苯二甲酸酐的20mL丙酮溶液缓慢滴加到上述黄原胶溶液中，搅拌均匀，升温至60℃反应12h后冷却至室温，后处理如实施例1-1)，制备改性黄原胶纳米胶束如实施例1-2)，制备载药改性黄原胶纳米胶束如实施例1-3)，得到的改性黄原胶纳米胶束记为XP4。

实施例5

如实施例1-1)所示，配置黄原胶水溶液，加入相同量催化剂，将溶有8.0g邻苯二甲酸酐的20mL丙酮溶液缓慢滴加到上述黄原胶溶液中，搅拌均匀，升温至60℃反应12h后冷却至室温，后处理如实施例1-1)，制备黄原胶纳米胶束如实施例1-2)，制备载药改性黄原胶纳米胶束如实施例1-3)，得到的改性黄原胶纳米胶束记为XP5。通过对比反应前后冷冻干燥样品的红外图谱，如图3可以发现1724cm^-1处酯基峰明显增强；将得到的纳米胶束用动态激光光散射测试其粒径分布如图4，用扫描电镜观察形成的改性黄原胶纳米胶束的形貌，如图5，所得粒径与动态激光光散射测得粒径基本一致。

实施例6

两亲性改性黄原胶聚合物取代度计算：

将上述实施例中得到的两亲性改性黄原胶聚合物，通过滴定羧基的方法计算合成产物的酯化率，取1g各配比改性黄原胶改性样品和40mL75％乙醇溶液加入250mL锥形瓶中，加热至55℃，恒温搅拌30min，加入10mL0.05mol/L NaOH溶液，搅拌15min，进行皂化，然后用0.5mol/LHCl溶液滴定至酚酞指示剂红色消失，计算黄原胶邻苯二甲酸酐的羧基含量和取代度，结果如图2。

实施例7

两亲性改性黄原胶聚合物的粘度测试：

将上述实施例中得到的两亲性改性黄原胶聚合物分别用去离子水、1％NaCl溶液和 1％CaCl₂溶液配置0.5w％样品溶液，用DV-S数显粘度仪，5号转子，60rpm/min测试样品的粘度，通过粘度对比研究两亲性改性黄原胶聚合物的抗盐性能，结果如表1所示。

表1 改性黄原胶分别在去离子水、1％NaCl和1％CaCl ₂溶液中的粘度

实施例8

改性黄原胶纳米胶束的载药和释放性能：

将实施例2中得到的XP2载药改性黄原胶纳米胶束，将10mL载药改性黄原胶纳米胶束溶液装入截留分子量为3500的透析袋中，置于10mL pH2.0、pH5.0、pH7.4的磷酸盐缓冲的溶液中，置于37±0.5℃的恒温震荡器中回旋震荡，每隔一段时间取3mL透析液测试吸光度A₄₈₃，由标准曲线计算释放介质中的DOX浓度。每次取样后补加相同体积的新鲜介质保持缓冲溶液体积不变。如图6，为XP2载药改性黄原胶纳米胶束在不同pH值下药物释放进度，利用紫外测试波长为483nm处的吸光度，根据标准曲线计算出阿霉素释放量。可以看出随着 pH降低和释放时间的增长，药物释放量逐渐增多，因此基本达到在肿瘤部位靶向释放的目的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种改性黄原胶纳米胶束的制备方法，依次包括以下步骤：

1)在水相体系中合成邻苯二甲酸酐改性黄原胶：在三口烧瓶中用去离子水配制黄原胶水溶液，待黄原胶完全溶解后，加入适当4-二甲氨基吡啶的水溶液，再滴加邻苯二甲酸酐的丙酮溶液，搅拌均匀并升温反应，再冷却至室温，用乙醇沉淀粗产物，沉淀产物再用乙醇洗涤三次，过滤真空干燥至恒重，得到的改性黄原胶粗产物；

2)取上述改性黄原胶粗产物溶解在去离子水中，溶液装入截留分子量为14000的透析袋中透析处理不少于72h，以去离子水为透析液，每隔一段时间换一次透析液，将透析后的样品冷冻干燥得到纯净改性黄原胶；

3)利用选择溶剂法制备改性黄原胶纳米胶束，将纯净改性黄原胶溶于甲酰胺中配成溶液，用长丝滴管取去离子水缓慢滴加到该溶液中，使改性黄原胶自组装形成纳米胶束，将所得改性黄原胶纳米胶束溶液装入透析袋中，在去离子水透析液中透析除去甲酰胺，每隔一段时间换一次透析液，得到改性黄原胶纳米胶束溶液。

2.如权利要求1所述一种改性黄原胶纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，黄原胶水溶液的浓度为0.5w％～3w％，加入占黄原胶质量1w％～4w％的4-二甲氨基吡啶作为催化剂。

3.如权利要求1所述一种改性黄原胶纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，配制邻苯二甲酸酐的丙酮溶液时，分别将0.5g、1.0g、2.0g、4.0g和8.0g邻苯二甲酸酐溶于20mL丙酮溶液中，得到不同浓度的邻苯二甲酸酐溶液。

4.如权利要求1所述一种改性黄原胶纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的反应和后处理条件，升温至40～60℃反应6～12h后冷却至室温，用1～4倍体积的乙醇沉淀改性黄原胶产物，过滤，沉淀再用乙醇洗涤三次，60℃真空干燥至恒重。

5.如权利要求1所述一种改性黄原胶纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，用去离子水溶解各改性黄原胶粗产物，配成浓度为0.5w％～1w％的溶液，移至截留分子量为14000的透析袋中，去离子水为透析外液，每隔3～8h换一次透析外液，透析处理不少于72h，将透析样品冷冻干燥之后得到纯净改性黄原胶，密封保存。

6.如权利要求1所述一种改性黄原胶纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，用甲酰胺溶解纯净改性黄原胶，配成浓度为0.1mg/mL的溶液；取1mL该溶液于样品瓶中，在磁力搅拌下用长丝滴管滴加1～20mL超纯水，控制40～60s每滴的滴加速度，滴加完成后继续搅拌5～8h，使改性黄原胶自组装形成黄原胶纳米胶束，再将上述溶液移至截留分子量为14000的透析袋中，以超纯水为透析外液，升温至30～40℃透析处理不少于24h，每隔2～4h换一次透析外液，完成后得到黄原胶纳米胶束溶液。

7.一种载药改性黄原胶纳米胶束的制备方法，其特征是按照权利要求1所述方法制备得到改性黄原胶纳米胶束，将该纳米胶束溶液装入样品瓶中，避光磁力搅拌下加入10～30μL浓度为1mg/mL阿霉素溶液，继续室温下避光磁力搅拌24h后，移至截留分子量为3500的透析袋中，用去离子水透析外液处理不少于12h，得到载药改性黄原胶纳米胶束，紫外光谱测试载药改性黄原胶纳米胶束溶液在A₄₃₈处吸收峰，利用阿霉素标准曲线，计算改性黄原胶纳米胶束的载药率和包封率。