CN101184450A - 由基质和血清组成的无细胞移植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及无细胞移植物，包括(i)由生物学和药用可接受材料制成的具有开放多孔性的粘合性、结构形成性基质和(ii)血清。在一个特别优选的实施方式中，基质额外地包含凝胶。本发明还涉及制备这种无细胞移植物的方法，其中将基质和凝胶(如果提供)与血清接触。移植物可以任选地与血清一起干燥。或者，基质和凝胶(如果提供)与血清接触之前是干燥状态。最后，本发明还涉及无细胞移植物用于再生组织且特别是用于再生软骨和/或骨的用途。

Description

由基质和血清组成的无细胞移植物
本发明涉及用于再生组织，特别是用于再生软骨的无细胞移植物，涉及生产所述无细胞移植物的方法以及所述移植物用于再生组织的用途。
背景技术
软骨是一种源自结缔组织的中胚层组织形式，其是由多能的、未分化的、间充质前体细胞生成的。三种类型的软骨即透明软骨、弹力软骨和纤维软骨之间有所不同。透明软骨是最常见的软骨形式，例如其存在于关节表面。磨损或损伤所引起的软骨缺损是非常普遍的医学问题。因为软骨被隔离于人体的传统的炎症和修复系统之外，所以软骨只有非常弱的自我愈合的能力。因此，在过去(特别是在过去的数年里)已经开发出了多种方法和技术，用作替代关节软骨的软骨和骨软骨区域的手段。例如，已经用骨膜、软骨膜、异体的和自体的骨软骨移植物、异体的半月板或由合成材料制成的假体替代关节软骨。
在涉及软骨细胞的自体移植的情况中，将从患者中取得的软骨细胞在细胞培养基中生长，将其再重新放回到患者体内。可以通过各种不同的移植物形式将所述软骨细胞放回到患者体内，实例包括别注射到关节内的注射溶液、与软骨细胞一起注射的基质等等。
例如，专利说明书WO 97/15655描述了人工组织，其包括三维细胞外基质和经遗传学加工处理过的细胞，基质能够释放免疫抑制因子或细胞分化因子。这些基质优选地是聚合物绒状物形式，通过所述基质可以分布细胞悬浮液，所述悬浮液可以被悬浮于纤维蛋白原溶液内。也可以向基质中加入生长和/或分化过程所必需的相应细胞外基质的因子或组分。为了将细胞保持于基质内，可以通过添加凝血酶固化细胞悬浮液，据此形成最终的移植物。
专利说明书DE 44 31 598描述了生产细胞培养物植入物的方法，其中首先包裹其中被施加了细胞的三维支持结构，然后灌注营养液。可再吸收的微体被掺入到支持结构内，当它们被再吸收时，其可释放出影响组织形成的因子。
专利说明书DE 43 06 661描述了一种三维支持结构，优选地是由聚合物绒状物制成，细胞被掺入于其中。然后向支持物结构灌注营养液，以便促进细胞生长以及促进细胞生成细胞外基质。为了阻止细胞迁移或流出，用琼脂糖包裹支持结构。
专利说明书DE 101 39 783也阐述了基质细胞在滑液中的用途。如果需要，该组合物也可以被施加于支持物例如绒状物或塑料，并以这种形式用作移植物。另外，滑液中的细胞悬浮液被照此注射到相关的关节内。
或者，合成事实上不含有任何细胞的基质结构。例如，专利说明书US 2003/0003153描述了含有一种或多种适合于细胞生长的结构形成性蛋白的硬基质膜。合适的蛋白例如是胶原。所形成的膜形式的基质可以与细胞一起被注射或它们自身可以被移植。在后一种情况中，推测来自机体自身组织的细胞可以迁移到基质结构内。例如通过传统的Pridie穿刺或微破损方式可以实现这一点。利用这些技术，对关节骨进行深达骨髓的小穿刺或破损。流经穿刺处的血液流入到缺损处，因此缺损处填充满了血液移植物。所述移植物含有经合适动员物刺激的间充质前体细胞，其能形成软骨类型的替代组织即所谓的纤维软骨。如果基质材料被放置到Pridie穿刺处之上，血细胞能够迁移到该基质材料内，并在该处存活。
专利说明书DE 199 57 388和WO 2005/014027利用了这种作用并通过在基质结构中掺入生长和分化因子(DE 199 57 388)或趋化因子(WO 2005/014027)作为募集工具可以强化这种作用。所有因子预期都能造成对软骨形成间充质前体细胞的强化募集，最终的目标是更快地再生出软骨。
最后，专利说明书WO 02/00272阐述了从血液和聚合物成分生成合适的移植物的可能性。该文件所解决的潜在问题是利用Pridie穿刺形成的标准的血液移植物在凝血时收缩并因此会改变其形状的事实。所添加的聚合物阻止了这种形状变化，并因此容许其真正地愈合成形。为了生成所述移植物，将聚合物和血液或血液组分例如红细胞、白细胞、单核细胞、血小板、纤维蛋白原、凝血酶和富含血小板的血浆混合，并将其引入到缺损处。但是如果使用血液组分，能够凝血的材料的存在是实现所需作用的重要因素。
由壳聚糖(Chitosan)和软骨细胞制成的移植物可以作为另一种选择。当如上所述将细胞引入到缺损处时，可以无需添加用于吸引目的的物质和/或生长和分化因子。
上面所述的技术也有缺点，因为如果移植物本身含有细胞，它们常常会因为操作期间的加工处理收到损伤，而如果细胞特别是自体细胞被用于移植物，它们必须通过长时间的培养过程进行生产，并且必须被仔细地控制避免污染，最后还没有储存的可能性。相似的，通过Pridie穿刺募集间充质细胞的无细胞移植物(有或没有用于吸引目的的物质)已经证实是令人不满意的。由少数细胞所启动的定植(colonization)是缓慢的，也是非特异的。这意味着不同的细胞类型从离开Pridie穿刺处的血液中被冲到了移植物内并保留于此。但是，只有能分化成软骨细胞的间充质前体细胞的定植是需要的。但是，在传统的移植物中，这一点并不能得到保证。
因此，本发明的目的之一是提出能简单生产的、能容易储存的和简单施用的移植物。此外，需要通过移植物的方式增加募集率，获得更好的对移植物所募集和沉积的细胞类型的选择性，以及尽可能地免除给机体使用外源的生长因子，任选地甚至是重组生长因子，所述生长因子都是潜在的过敏原。
发明内容
本发明克服了现有技术已知的这些问题和其他问题。为此，提出了无细胞移植物，其包括(i)由生物学和药用可接受材料制成的具有开放多孔性的粘合性、结构形成性基质和(ii)血清。在一个特别优选的实施方式中，基质额外地包含凝胶。
在第二个方面，提出了生产这种无细胞移植物的方法，其中将基质和凝胶(如果提供)与血清接触。任选地，将移植物与血清一起干燥。或者，在与血清接触之前，基质和凝胶(如果提供)可以是干燥状态。
根据第三个方面，本发明最终涉及无细胞移植物用于再生组织且特别是用于再生软骨和/或骨的用途。
附图说明
图1显示了CDMP1、CDMP2、SDF1-α和IL8在体外对人间充质干细胞的趋化作用。
图2显示了人体血清在体外对人间充质干细胞的趋化作用。
具体实施方式
如上所述，本发明涉及无细胞移植物，包括(i)由生物学和药用可接受材料制成的具有开放多孔性的粘合性、结构形成性基质和(ii)血清。令人惊讶的是，在本发明的无细胞移植物中使用血清使得从流经骨髓的血液中募集间充质干细胞的效率增加了数倍。募集效率的这种令人惊讶的增加反过来消除了分别向移植物中引入分化细胞或前体细胞的需要，这促进并缩短了移植物的处理过程，也容许储存移植物。
用传统方式可以容易地得到血液血清。优选地，可以在移植期间直接从患者体内取得血清。自体材料因此可以被植入到患者体内，不需要添加其他的、潜在过敏的和/或免疫活性的因子。
本发明所提出的无细胞移植物的基质是具有开放多孔性的粘合性、结构形成性基质。术语“粘合性”在此上下文中应当被解释为表示基质使得移植物能够被加工处理而不会分散为各个部分或小块。并不需要基质的所有部分都通过化学键或相互作用彼此被结合在一起。交织、缩绒(fulling)、扭曲等形式的机械连接足矣。
术语“结构形成性”在此上下文中应当被解释为表示基质作为用于细胞迁移到所要生成的组织基质中的结构形成物的特性。基质也可以作为细胞所能够定植的框架或格栅，所述细胞在该处能够得到支持，使得它们不会被例如滑液或血液带到基质外。
最后，“开放多孔性.”在本发明的上下文中应当被解释为表示基质的框架结构之间的空间可以出入物质，特别是可以进行与基质周围区域的液体交换。孔的孔径的大小优选地被设定为使得细胞也能够穿透或循环。但是，在本发明的上下文中所用的术语开放多孔性也打算表示例如存在于凝胶中的结构。基质的框架结构在此是由结构形成物的骨架提供的。排列于基质的框架结构之间的是水合物袋和液体，其中细胞能够穿透并使得能够进行液体交换。在本发明的上下文中，合适的凝胶结构因此也应当被解释为具有开放多孔性的基质。
具有开放多孔性的框架结构优选地选自交织型或非交织型织物(特别是绒状结构和毡状结构)、膜、海绵、填充物、开孔泡沫、羊毛、编织物、有序的和无序的纤维束、多孔陶瓷材料、松质和凝胶，以及这些材料的组合。基质优选地具有绒状结构或毡状结构。不同材料的组合，例如分层排列的形式，也是可能的，并在本发明的范围之内。
原则上，基质材料可以是任一合适的、生物学和药用可接受的材料。在本发明提出的基质中所用的基质材料可以是可再吸收的或不可再吸收的。可再吸收的材料是优选的。基质优选地是选自由天然和合成聚合物组成的组中的材料，例如胶原、透明质酸、壳聚糖、壳多糖(Chitin)、多糖、纤维素及其衍生物、蛋白、多肽、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯乳酸酯共聚物(poly(glycolide，lactate))、己内酰胺；陶瓷材料例如金属的氧化物、碳化物、氮化物和碳氮化物，特别是氧化硅、氧化钛和氧化钙；矿物质例如金属的卤化物特别是氟化物、金属的氢氧化物、金属的硫酸盐、优选为生理学无毒害的金属例如磷酸钙、appatite、hydroxyl appatite；金属例如钛、铝、金、银、不锈钢及其混合物。更特别优选的是聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸、胶原或透明质酸。
对于聚乙醇酸而言，优选地使用分子量＞20,000g/mol的纯聚乙醇酸，优选地分子量为30,000到70,000g/mol，更优选地约为50,000g/mol。基质材料可以是聚乙醇酸绒状物，例如Alpha ResearchSwitzerland GmbH所售的商标为PGA-Soft Felt7的聚乙醇酸。在这种产品中，体内的再吸收时间约为40到60天。在体外7天之后，由于水解的原因，机械强度仍约为初始值的50％。
在一个特别优选的实施方式中，无细胞移植物除了基质外还包含凝胶。凝胶被施加于基质的至少一侧或者至少部分渗透基质。优选地凝胶完全渗透基质。如果基质含有这种凝胶，基质本身优选地具有不同于凝胶的结构。更特别优选地，除了凝胶以外，还使用上面明确指定的更硬的结构。因此，凝胶优选地具有比基质更低的硬度。最优选地使用其中引入了凝胶的绒状结构和毡状结构。
凝胶可以是天然的或合成的水凝胶。其优选地具有比基质更低的硬度。例如，凝胶可以选自多糖、多肽、透明质酸、纤维蛋白、胶原、藻酸盐、琼脂糖和壳聚糖、以及它们的盐、衍生物和混合物。合适的盐例如是所述凝胶的碱金属盐和碱土金属盐。最优选的是透明质酸或透明质酸盐例如透明质酸钠。
就透明质酸品种而言，可以使用经发酵生产的品种。或者，可以使用从动物中获得的透明质酸。所用品种的平均分子量一般是在250和6,000kDa之间，优选地是在1,000到2,000kDa之间，最优选地是大约1,200kDa。可以商品化获得合适的透明质酸产品。合适的透明质酸品种例如是以商标Ostenil出售的TRB Chemedika AG。该材料是经EC认证的，因此适用于药用目的。
可以自多种来源，通过在合适的凝胶形成物的生理学合适的溶液中沉淀或聚合作用而获得凝胶。这种合适的溶液的实例是水例如水性盐溶液(例如碱金属和碱土金属卤化物(Cl、Br、I)、碳酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等)、有机酸、缓冲剂及其混合物。或者，可以使用更为复杂的溶液，例如培养基或体液或源自体液的溶液例如滑液或血清。选择所用的凝胶形成物的量，以便获得合适的凝胶粘度。对于透明质酸而言，它们通常是在0.5-50mg/ml范围内，优选地是0.5-20mg/ml，最优选地是10mg/ml。
最优选的移植物是具有由PGA绒状物或毡状物制成的基质且其中掺入有透明质酸凝胶的移植物。
本发明提出的无细胞移植物的大小一般取决于所治疗的缺损的尺寸和移植物的必需尺寸。其大小可以适合于实施治疗的医生的需要。对于软骨组织的病变，特别是膝关节的病变，这些尺寸一般是长度范围为10到50mm，宽度范围为10到50mm以及厚度范围为0.5到3mm，优选地是长度范围为10到30mm，宽度范围为10到30mm以及厚度范围为1.1到2mm。尺寸可以适合于非正方形的形状例如矩形、圆形、椭圆形、多面体形等。
本发明提出的无细胞移植物中的基质和凝胶的组合的优点是，对于除渗透过Pridie穿刺处或相似破损的血液的非间充质前体细胞以外的其他细胞而言，凝胶形成了机械屏障。这使得间充质前体细胞选择性地迁移到移植物内。只有这些细胞才能存在于基质内，并分化成所需的组织细胞。因此阻止或显著减少了除所需的组织形成细胞以外的其他细胞的生长。
同时，在机械应激下，凝胶促进了所需细胞的停留，然后在后者周围形成软骨的天然的生物基质。这样一旦患者已经接受移植物，便能够更早地解除应激。
本发明提出的无细胞移植物所必需的第二个成分是血清，通常是人体血清。这可以是自体的、同种异体的或异种的。用于本发明的血清是指在血液已经凝血后仍保持为液态的血液部分。血清不含任何血细胞，与血浆不同的是其不不含纤维蛋白原。在血清中也能找到血浆的其他成分，它们是脂肪、脂肪酸、甘油、糖、盐、蛋白、酶、酶原、酶抑制物、补体系统、免疫蛋白、炎症介质等。
通过加入至少一种成分和/或去除至少一种血清组分都可以修饰本发明所用的血清。在一个优选的实施方式中，血清没有被修饰。更特别优选的是自体血清。通过从患者体内取血以及用传统方法获得血清就可以实现这一点。任选地实施治疗的医生可以将通过这种方式获得的血清直接放置在移植物的位置上，与基质和凝胶(如果提供)接触，并因此掺入到移植物内。
或者，使用修饰血清。如果修饰包括添加至少一种成分，后者优选地选自包括生长因子、分化因子(对于这种情况，见专利说明书DE 19957 388，在此通过引用将其并入本申请)、激素、细胞因子、细胞粘附分子、趋化因子类包括趋化因子例如在专利说明书WO 2005/014027中所述的趋化因子(在此通过引用的方式将其并入本申请)、酶、酶抑制物、辅酶、矿物质、脂质、糖、药用物质例如抗生素、镇痛药、炎症抑制剂和免疫抑制剂、缓冲剂、稳定剂(特别是低温稳定剂)和维生素的组，优选地是激素、趋化因子、生长因子和分化因子。激素、趋化因子、生长和分化因子优选地选自胰岛素、PDGF、IGF、GMCSF、GDF5、GDF6、FGF、BMP2、BMP4、BMP7、IL8、SDF1-α和EGF。最优选地是胰岛素。通过掺入上面所列的组分或其混合物也可以修饰基质和/或凝胶。
或者，例如通过亲和层析的方式可以选择性地去除特殊组分例如酶、免疫蛋白、酶原、糖等。也可以稀释血清。至此，血清可以与所需量的生理学可接受液体例如柠檬酸缓冲液、PBS等混合。
通过所述方法可以产生上面所需的无细胞移植物，其中将基质和凝胶(如果提供)与血清接触。通过点滴、软化、浸渗或浸泡而施加可以实现所述接触。如果提供了凝胶，优选地首先将其掺入到基质内和/或施加于基质，之后进行与血清接触的过程。如果无细胞移植物包含例如上面所列的其他组分，它们可以被掺入到基质、凝胶和血清中的其中一种或多种内。
本发明提出的方法可以包括干燥步骤。实施干燥步骤的优点是移植物可以以干燥的形式保存得更长。如果基质和凝胶(如果提供)在与血清接触之前被干燥，当该结构与血清接触时，其通过浸泡或软化可以被重建，据此将其转变成待用状态。或者，如果包括基质、凝胶(如果提供)和血清的结构被干燥，其通过浸泡或软化于血清或一些其他合适的药用和生理学可已接受的溶液(例如在形成凝胶部分中所述的溶液)可以被重建，并因此转化成待用状态。如果本发明提出的移植物包含其他组分，这些组分也可以被掺入到用于重建无细胞移植物为待用状态的溶液中。如果其他组分是蛋白或不稳定的辅助因子时，这可能是特别令人需要的。
在由上面所述的聚乙醇酸绒状物和透明质酸凝胶制成的无细胞移植物的优选的实施方式中，使用20mm×20mm×1.1mm大小的绒状物和被掺入到生理学合适的溶液中的材料中或者已经被掺入到血清中的约400μl透明质酸溶液(10mg/ml)。在绒状物为20mm×20mm×2mm大小时，使用约730μl透明质酸溶液。如果通过低压冻干法干燥这些大小的移植物，它们通过浸泡于1到2ml溶液中可以被重建。对于没有血清的干燥基质，优选地用血清或稀释血清重建所述基质，而含有血清的干燥基质则优选地在生理盐水中重建。
合适的血清浓度是基质中所含凝胶和液体的体积的1到100％(体积)。优选地，对于没有凝胶的基质，可以使用10到100％，优选地是50到100％，以及最优选地是100％液体体积的血清浓度，血清通过毛细管力等掺入于其中。为了将血清浓度降低到100％以下，可以使用经生理学可接受的盐溶液稀释的血清。
对于具有凝胶的基质，根据凝胶、血清和任选的药用可接受液体的总体积，可以使用0.01到50％(体积)或更高的血清含量，优选地0.5到20％(体积)和最优选地1到10％(体积)的血清。
本发明提出的无细胞移植物可用于再生组织，特别是用于再生软骨和/或骨。其优选地被用于再生间充质组织。最优选地，其被用于再生软骨和/或骨，特别是用Pridie穿刺法或微破损法。移植物作为智能覆盖层，其在Pridie穿刺或微破损后被精确吻合地引入到软骨内，以便重塑关节表面。基质材料(优选地是毡状材料)提供机械稳定性并起到传导结构的作用，其促进了从骨髓和松质骨(spongious bone)中迁移过来的患者细胞的均匀的、三维的分布。凝胶例如透明质酸作用为屏障，以便阻止红细胞和白细胞向内迁移。血清(优选地是自体血清)促进了细胞(特别是间充质前体细胞)迁移到移植物内，并因此迁移到缺损处。透明质酸、血清和关节所含的滑液诱导已经迁移到移植物内的间充质前体细胞的成熟或分化，以形成软骨细胞并因此建立软骨的再生组织。令人惊讶的是，已经发现使用血清会显著地增加募集数目。
下面给出的实施例只打算举例说明本发明，而不应当解释为以任何形式对发明加以限制。
实施例1：通过生长和分化因子、趋化因子和人血清在体外募集人间充质干细胞
A.人间充质干细胞的分离和培养
已经描述了从骨髓中分离出人间充质干细胞(MSC)的方法(DE103 33 901)。将最大3ml骨髓穿刺液与10ml PBS混合，并在室温、310g下离心10分钟。重悬细胞沉淀并再次用PBS洗涤。将细胞放置于20ml DME培养基(10-20％FBS、2％HEPES、4mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素)内。将5ml这种细胞悬浮液引入到20ml Percoll密度梯度(密度为1.073g/ml)之上。将细胞在900g下离心32分钟。将上层转移到新的离心管内。在加入2.5倍体积PBS之后，将其在310g下离心6分钟。将细胞沉淀放置于DME培养基内。将1.5*105-3.5*105个细胞/cm2转移到细胞培养瓶的培养基中，并在37℃、5％CO2下进行培养。在72个小时后首次更换培养基，然后每3到4天更换1次。按此方式分离的细胞在2到3周后融合生长，然后通过胰蛋白酶消化的方式将其转移到新的培养管内，细胞密度为6,000个细胞/cm2培养表面(传代1)。在约1周后，再次用胰蛋白酶消化细胞(传代2)。用FACS分析验证这种人间充质干细胞培养的均质性，其中鉴定到表面抗原Endoglin和ALCAM，没有鉴定到CD34、CD45和CD14。
B.测试生长和分化因子(CDMP1、CDMP2)和趋化因子(SDF1-α、IL8)在体外对人间充质干细胞的趋化活性
已经描述了生长和分化因子例如软骨衍生型形态形成蛋白-1(CDMP1或生长和分化因子-5，GDF5)和软骨衍生型形态形成蛋白-2(CDMP2或生长和分化因子-6，GDF6)对间充质干细胞和前体细胞的趋化作用(DE 199 57 388)。也已经描述了趋化因子例如基质衍生因子-1α(Stromal derived Factor-1α，SDF1-α)或白介素-8(IL8)用于募集间充质干细胞或前体细胞的趋化作用或用途(DE 103 33 901)。
用所谓的96孔趋化板(ChemoTx system，Neuroprobe，USA)测试趋化活性。测试原理依据于将给定数量和浓度的所测定的物质溶液转移到孔内。然后用带有孔隙的膜(孔径在此为8μm)覆盖孔，使得膜的下表面被含有趋化溶液的溶液所湿化。
将给定量的不含所测试物质的细胞悬浮液放置于远离孔的膜的上表面上。在数小时后，自下方的孔至膜产生了所测试物质的浓度梯度。如果所测试的物质是有趋化活性的，细胞悬浮液中的细胞会迁移经过膜的孔隙，到达膜的下表面并到达下方的孔中。对所迁移的细胞进行染色，并借助于显微镜测定出其数目。
为了控制的目的，给下方的孔提供所测试物质的溶剂，用膜覆盖并用细胞悬浮液覆盖。通过用显微镜计数膜的下表面(面积为25mm2)和下方的孔内的细胞数目，测定出在没有刺激物时由于趋化物质而发生自发迁移的细胞。为了测定出趋化物质所募集的细胞数目，要减去自发迁移的细胞数目。
在开始测试上面所提及的生长和分化因子及趋化因子之前，将来自骨髓的人间充质干细胞在营养培养基(DME培养基+1％青霉素/链霉素+0.5％牛血清白蛋白(BSA))中放置24个小时。将不同量的生长和分化因子及趋化因子放置于营养培养基中，以获得浓度分别为250nM、500nM、750nM和1000nM因子的指定溶液。将3份36μl相应溶液放置于96孔趋化板的孔内，用膜覆盖，使得膜的下表面被溶液湿化。营养培养基用作对照。
将40μl含30,000个人间充质干细胞的营养培养基放置于膜的上表面。在37℃、5％CO2的育种箱内培育20个小时后，取出膜并将其在冰冷的乙醇/丙酮(1∶1体积/体积)中放置3分钟，以便固定细胞。用棉签充分地清洗膜的上表面，以去除所粘附的细胞。用Hemacolor溶液(Merck，Darmstadt)染色膜的下表面上的细胞。在下方的孔中没有检测到细胞。
通过在显微镜底下的计数可以计数出沉积于膜的下表面上的细胞数目。在减去对照组(没有趋化因子类)中的迁移细胞数目，可以确定出不同浓度的CDMP1、CDMP2、SDF1-α和IL8所募集到的干细胞的数目。图1给出了相应因子所募集到的细胞数目的平均值和标准差。CDMP1最多能够诱导每25mm2 156个MSC(750mM CDMP1)发生迁移，CDMP2最多募集了每25mm2 38个MSC(500nM CDMP2)，SDF1-α最多募集了每25mm2 79个MSC(750nM SDF1-α)和IL8最多募集了每25mm2 814个MSC(500nM IL-8)。
C.测试人血液的血清在体外对人间充质干细胞的趋化活性
令人惊讶的是，通过在B中所述的测试方法测定人血清发现人血清具有比生长和分化因子及趋化因子更强的在体外对人间充质干细胞和前体细胞的趋化作用。图2给出了不同配方的人血清(营养培养基或透明质酸)所募集到的人间充质干细胞和前体细胞的细胞数目以及相应的标准差。根据配方的不同，人血清所募集到的人间充质干细胞和前体细胞的最低值是2,135个(PGA-HA lyo.+HS)以及最大值是10,332个(5％HS-HA-培养基)。对没有人血清的透明质酸营养培养基作为趋化因子类的测试显示所募集到的人间充质干细胞和前体细胞的平均值分别是24(HA培养基)和48个(PGA-Ha lyo.+NaCl)。
在所述的测试方法中用下面的不同配方的人血清募集人间充质干细胞和前体细胞。在自然凝血下，从无抗凝剂的全血样品(n＝5)中获得人血清，将其等量混合并用于制备不同的血清配方。为了制备测试组“5％HS培养基”和“10％HS培养基”，用人血清置换营养培养基，生成5％和10％溶液。“HA培养基”测试组包括等量的营养培养基和经发酵获得的平均分子量为1,200kDa的透明质酸(Ostenil，TRB ChemedicaAG)。“1％HS-HA培养基”、“5％HS-HA培养基”、“5％HS-HA培养基”和“20％HS-HA培养基”测试组包含其中加入了人血清的“HA培养基”，生成了1％、5％和10％浓度的溶液。
为了获得“PGA-10％Hs-HA，lyo.”测试组，将270μl经发酵获得的透明质酸(Ostenil，TRB Chemedica AG)与30μl人血清混合，并将其施加于包括聚乙醇酸(PGA)的20mm×15mm×1.1mm大小的绒状物(PGA-Soft Felt，Alpha Research Switzerland GmbH)。将经透明质酸-血清混合物浸泡过的绒状物在-20℃冷冻1个小时，然后在冷冻干燥器中冷冻干燥16个小时。为了重建所述溶液，将冷冻干燥的绒状物在1ml生理盐水中放置10分钟，以便通过在2,000rpm离心10分钟的方式获得近80到100μl透明质酸-血清溶液。通过用等量营养培养基稀释溶液，制备配方“PGA-10％HS-HA，lyo.”并将其直接用于测试趋化活性。
为了制备“PGA-Ha，lyo.+HS”，将300μl经发酵获得的透明质酸(Ostenil，TRB Chemedica AG)施加于包括聚乙醇酸(PGA)的20mm×15mm×1.1mm大小的绒状物(PGA-Soft Felt，Alpha ResearchSwitzerland GmbH)。将经透明质酸浸泡过的绒状物在-20℃冷冻1个小时，然后在冷冻干燥器中冷冻干燥16个小时。为了重建所述溶液，将冷冻干燥的绒状物在1ml人血清中放置10分钟，以便通过在2,000rpm离心10分钟的方式获得近80到100μl透明质酸-血清溶液。通过用等量营养培养基稀释溶液，制备配方“PGA-HA，lyo.+HS”并将其直接用于测试趋化活性。
为了制备“PGA-Ha，lyo.+NaCl”测试组，将300μl经发酵获得的透明质酸(Ostenil，TRB Chemedica AG)施加于包括聚乙醇酸(PGA)的20mm×15mm×1.1mm大小的绒状物(PGA-Soft Felt，Alpha Research Switzerland GmbH)。将经透明质酸浸泡过的绒状物在-20℃冷冻1个小时，然后在冷冻干燥器中冷冻干燥16个小时。为了重建所述溶液，将冷冻干燥的绒状物在1ml生理盐水中放置10分钟，以便通过在2,000rpm离心10分钟的方式获得近80到100μl透明质酸溶液。通过用等量营养培养基稀释溶液，制备配方“PGA-HA，lyo.+NaCl”并将其直接用于测试趋化活性。
实施方式2的实施例
将Alpha Research Switzerland GmbH所售的商标为PDA-Soft Felt的商品化可获得的聚乙醇酸绒状物切割成20mm×15mm×1.1mm大小。如实施例1所述的那样，用含有10％血清的透明质酸混合物浸渍材料，然后干燥。最初在-20℃进行干燥，然后在冷冻干燥器中干燥16个小时。通过用1到2ml生理盐水浸泡10分钟可以重建绒状物。
在另一个测试组中，用10mg/ml溶解于生理盐水的纯透明质酸浸渍绒状物。如上所述干燥经这种方式制备出的材料。通过将其在1到2ml血清中浸泡10分钟重建所述材料。两种绒状物都可以直接用于移植。

Claims (18)

1.无细胞移植物，包括(i)由生物学和药用可接受材料制成的具有开放多孔性的粘合性、结构形成性基质和(ii)血清。
2.权利要求1的无细胞移植物，其中基质材料是可再吸收的或不可再吸收的。
3.权利要求1或2的无细胞移植物，其中基质具有的结构选自交织型或非交织型织物(特别是绒状结构和毡状结构)、膜、海绵、填充物、开孔泡沫、羊毛、编织物、有序的和无序的纤维束、多孔陶瓷材料、松质和凝胶、以及这些结构的组合。
4.前述权利要求中任一项的无细胞移植物，其中基质是选自如下一组中的材料：天然和合成聚合物例如胶原、透明质酸、壳聚糖、壳多糖、多糖、纤维素及其衍生物、蛋白、多肽、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯乳酸酯共聚物、己内酰胺；陶瓷材料例如金属的氧化物、碳化物、氮化物和碳氮化物，特别是氧化硅、氧化钛和氧化钙；矿物质例如金属的卤化物特别是金属的氟化物、金属的氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐、磷酸钙、Appatite、Hydroxyl appatite；金属例如钛、铝、金、银、不锈钢及其混合物。
5.前述权利要求中任一项的无细胞移植物，其额外地包含凝胶，所述凝胶被施加于基质的一侧和/或至少部分渗透基质。
6.权利要求5的无细胞移植物，其中凝胶是天然的或合成的水凝胶。
7.权利要求5或6的无细胞移植物，其中凝胶具有比基质更低的硬度。
8.权利要求5到7中任一项的无细胞移植物，其中凝胶选自多糖、多肽、透明质酸、纤维蛋白、胶原、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、及其混合物，且优选地是透明质酸。
9.前述权利要求中任一项的无细胞移植物，其中血清是自体的、同种异体的或异种的，且任选地通过添加至少一种成分和/或去除至少一种血清组分而修饰。
10.前述权利要求中任一项的无细胞移植物，额外地含有一种或多种成分，所述成分选自包括生长因子、分化因子、激素、趋化因子、细胞因子、细胞粘附分子、趋化因子类、酶、酶抑制物、辅酶、矿物质、脂肪、脂质、糖、药用物质例如抗生素、镇痛药、炎症抑制物和免疫抑制剂、缓冲剂、稳定剂特别是低温稳定剂、和维生素的组，所述组分优选地选自激素、生长因子和分化因子。
11.权利要求10的无细胞移植物，其中激素、生长和分化因子是胰岛素、PDGF、IGF、GMCSF、GDF5、GDF6、FGF、BMP2、BMP4、BMP7、IL8、SDF1-α和EGF、及其组合。
12.制备前述权利要求中任一项的无细胞移植物的方法，其中将基质和凝胶(如果提供)与血清接触。
13.权利要求12的方法，其中通过施加点滴、软化、浸渍或浸泡实现所述接触。
14.权利要求12或13的方法，其中凝胶首先被掺入于基质和/或施加于基质，然后与血清接触。
15.权利要求12到14中任一项的方法，其中在接触之前或之后干燥凝胶(如果提供)和基质以及其他任选组分的组合物。
16.权利要求15的方法，其中从干燥状态中重建移植物。
17.权利要求1到11中任一项的无细胞移植物用于再生组织的用途。
18.权利要求17的用途，其中所述用途是用于再生间充质组织，特别是用于再生软骨和/或骨。
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