ITFI20080070A1

ITFI20080070A1 - Matrice extracellulare comprendente fattori piastrinici.

Info

Publication number: ITFI20080070A1
Application number: IT000070A
Authority: IT
Inventors: Carlo Mirabella
Original assignee: Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi; Regione Toscana
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2008-04-04
Publication date: 2009-10-05
Also published as: WO2009121953A3; ES2464819T3; WO2009121953A2; EP2279014B1; US8691263B2; US20110045051A1; EP2279014A2

Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo :

Matrice extracellulare comprendente fattori piastrinici

Campo dell'invenzione

La presente invenzione si riferisce al campo della riparazione e/o rigenerazione tessutale.

Stato deH’arte

L’esigenza di influenzare i processi di riparazione tissutale sia per favorire la rimarginazione delle ferite quanto per l’induzione di una vera e propria rigenerazione dei tessuti danneggiati a seguito di eventi traumatici o patologici (esempio ferita, ustioni, asportazione chirurgica) è da sempre uno dei problemi più sentiti da coloro che si occupano della ricostruzione dei tessuti.

L’ingegneria dei tessuti è nata come tentativo di costruire tessuti ed organi al di fuori del corpo umano basata sul fatto che la quasi totalità delle cellule animali possono essere coltivate in laboratorio.

Tuttavia va tenuto presente che le cellule in coltura proliferano formando solo degli strati bidimensionali che non possono essere equiparati ai tessuti essendo quest’ultimi strutture tridimensionali aventi cellule all'interno o al di sopra di esse; è pertanto necessario utilizzare delle impalcature artificiali in modo che le cellule possano trovare un supporto adatto (matrice extracellulare) nella rigenerazione dei tessuti. E’ quindi evidente l’interesse a sviluppare matrici extracellulari capaci dì fornire un efficace mezzo per la ricostruzione di tessuti distrutti a seguito degli eventi traumatici o patologici.

Breve descrizione delle figure

Nelle Figura 1 è illustrata una matrice secondo l'invenzione appena preparata.

Nella Figura 2 è riportato un esempio di applicazione di una matrice secondo l’invenzione.

Sommario

Sono descritte matrici extracellulari comprendenti fattori piastrinici.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

La presente invenzione consente di superare i problemi suddetti grazie ad una matrice extracellulare comprendente fattori di crescita umani di derivazione piastrinica che permette di massimizzare l’efficacia terapeutica combinando i benefici delle due componenti, matrice e fattori di crescita riducendo la fase infiammatoria, anticipando quella di migrazione e di proliferazione cellulare con il risultato di una più efficace e rapida integrazione della matrice fino ad una ricostruzione strutturalmente organizzata del tessuto neoformato “in vivo”.

Secondo l’invenzione per matrice extracellulare si intende una matrice bioingegnerizzata o eterologa capace di permettere legami stabili tra cellule e matrice (in generale con la componente proteica e/o polisaccaridica di quest’ultima).

Le matrici extracellulari secondo l’invenzione devono quindi possedere: - una porosità che permetta alle cellule di ricrearsi un microambiente idoneo per sede e tipo di tessuto,

- la capacità di comunicare e scambiare segnali con le cellule deH'ospite,

- una struttura idonea, dove necessario, alla crescita di vasi e cellule, - una degradazione controllata tale da poter essere metabolizzata e sostituita con la matrice extracellulare prodotta dalle cellule stesse. Normalmente le matrici deputate alla sostituzione dermica secondo l'invenzione sono costituite da una membrana a doppio strato in cui la parte preposta alla sostituzione del derma è una struttura porosa.

In generale le matrici bioingegnerizzate sono costituite da un qualsiasi biomateriale tollerabile e biocompatibile comprendente una componente proteica e/o una polisaccaridica come ad esempio collageni, glicosamminoglicani (come l’acido ialuronico), cellulosa e/o combinazioni di tali materiali. Esistono inoltre matrici biologiche eterologhe acellulari umane come il derma deepidermizzato (DED) o di derivazione animale come ad esempio la matrice ottenuta dalla sottomucosa dell’intestino tenue del suino.

Sono preferibili le matrici tridimensionali con una porosità che permetta alle cellule di ricrearsi un microambiente idoneo per sede e tipo di tessuto:

In particolare sono preferibili le matrici aventi una porosità capace di consentire l’adsorbimento delle piastrine e delle proteine contenute nel crioprecipitato in modo da raggiungere una concentrazione piastrinica terapeutica di circa 1-2 x10<9>per mL.

Visto quanto sopra generalmente si può dire che le matrici utili secondo l’invenzione avranno pori di diametro superiore a 2 micron.

La membrana che costituisce la matrice dermica può essere dotata o meno di un film di materiale semipermeabile, ad esempio polisilossano od elastomero, che costituisce la parte che sostituisce l'epidermide. Normalmente la matrice priva del film è utilizzata per aggiungere spessore allo strato di rigenerazione del derma nel trattamento di ferite profonde.

La porzione dermica serve da struttura per l’infiltrazione di fibroblasti, macrofagi, linfociti e cellule endoteliali capillari che formano la rete neovascolare. Con il progredire della guarigione, lo strato di matrice viene riassorbito e nuova matrice extracellulare viene depositata dai fibroblasti a formare il neoderma. In presenza di adeguata vascolarizzazione del neoderma, e sempre che sia disponibile l’autoinnesto, l’eventuale film che sostituisce l’epidermide può essere rimosso e, se necessario, un sottile strato di autoinnesto epidermico viene posizionato sul neoderma. Le cellule dell’innesto epidermico crescono e formano un’epidermide matura ricostituendo un derma ed un’epidermide funzionali.

Un esempio particolare di matrice extracellulare secondo l’invenzione è la matrice Integra® (Integra Lifesciences Corp., Plainsboro, NJ, USA). Per fattori piastrinici si intendono i costituenti terapeutici del sangue che possono essere ottenuti dalla liberazione degli alfa-granuli ottenuti durante l’aggregazione di un concentrato piastrinico messo a contatto con calcio e fattori proaggreganti biologici (trombina) o farmacologici. Detti fattori piastrinici possono ovviamente essere sia autoioghi che eterologhi o ricombinanti.

In particolare secondo l’invenzione i fattori piastrinici, oltre ad altri mediatori biochimici che sono rilasciati dalle piastrine stesse, si ritrovano in un preparato costituito da colla di fibrina, gel piastrinico, trombina o loro miscele.

Tutti questi componenti sono coinvolti nella riparazione/rigenerazione tissutale e possono essere di origine sia autoioga che eterologa.

Per preparare le matrici extracellulari secondo l’invenzione si procede alla formazione “in situ”, all'interno della matrice, del gel piastrinico e della colla di fibrina per azione della trombina rispettivamente su concentrato piastrinico (PRP) e su crioprecipitato (CRIO) con cui si è precedentemente impregnata la matrice.

In particolare dopo aver preparato la matrice secondo le istruzioni per l’uso riportate nel catalogo illustrativo del costruttore la sì risciacqua con soluzione fisiologica eliminando eventuali eccessi e la si deposita in un contenitore a base piatta ad esempio una bacinella.

Tramite siringa si fa gocciolare il PRP/CRIO sulla matrice in quantità tale da permettere la completa imbibizione della matrice stessa (di norma in rapporto 2:1 in volume) e quindi si agita delicatamente e si lascia riposare ripetendo più volte. .

Si aggiunge quindi sulla matrice, facendo gocciolare tramite siringa, una miscela di calcio gluconato e trombina agitando poi delicatamente e lasciando infine riposare fino a formazione del gel.

La matrice così preparata può essere utilizzata subito oppure mantenuta a temperatura inferiore a - 25°C e scongelata al momento dell’uso.

Preferibilmente il calcio gluconato è in soluzione acquosa al 10% ed il rapporto calcio gluconato/trombina è da 1 :5 a 1 :10 in volume.

Il rapporto (miscela di calcio gluconato e trombina)/(PRP-CRIO) è preferibilmente di 1:10 ma può essere ridotto, ad esempio a 1 :5, purché non si riduca la concentrazione piastrinica e/o quella del fibrinogeno al di sotto della concentrazione terapeutica.

La trombina può essere ottenuta con metodi noti, ad esempio per ricalcificazione del plasma o del crioprecipitato.

Questa operazione viene effettuata sotto cappa sterile prelevando il plasma od il crioprecipitato dalla sacca mediante siringa aggiungendo calcio gluconato al 10% in rapporto da 1 :5 a 1 :10 in volume.

In seguito alla ricalcificazione, dopo circa 20 minuti si procede a centrifugazione ad alta velocità (3000 rpm) per 15 minuti ottenendo il siero sovranatante ricco in trombina.

Il concentrato piastrinico utilizzato per l’invenzione può essere ottenuto in modo noto da:

- piastrine da singola unità/singolo buffy-coat omologo, allestendo un pool, si connette ad una sacca transfer tramite steril connector, centrifugando a 3500 rpm per 15 minuti. Il pellet piastrìnico ottenuto viene risospeso in circa 50-60 mL di plasma;

- piastrine da aferesi multicomponent omologa, l’aferesi piastrinica viene direttamente centrifugata per procedere come sopra descritto; - sangue intero autologo in sacca quadrupla si ottiene un’unità di piastrine da singolo buffy-coat, si connette ad una sacca transfer tramite steril connector, si centrifuga a 3500 rpm per 15 minuti si elimina il sovranatante che viene utilizzato per produrre la trombina autoioga. Il pellet piastrìnico si risospende in circa 10-15 mL di plasma;

- aferesi multicomponent autoioga utilizzando un separatore cellulare ed una procedura dedicata si ottiene una aferesi piastrinica di circa 20 mL (il cui volume può essere modificato in base alle necessità del paziente senza incidere sulla concentrazione piastrinica finale) con una resa di 3,5x 10<6>piastrine per microlitro, una unità di plasma di 200 mL, ed una unità di buffy-coat di circa 30 mL con una concentrazione di globuli bianchi (contenente monociti e cellule staminali) di circa 50-60 x10<3>per microlitro ed una concentrazione di piastrine dì circa 1 ,5x10<9>per mL. L’aferesi piastrinica viene utilizzata senza ulteriori manipolazioni. Il plasma viene congelato per produrre il crioprecipitato;

- da sistemi miniaturizzati, generalmente a circuito chiuso, disponibili in commercio dedicati alla produzione di gel piastrìnico autologo partendo da un prelievo di sangue da 8 a circa 150 mL. Per ciascuno di questi sistemi è disponibile un protocollo tecnicooperativo specifico fornito dalla ditta produttrice con la strumentazione.

Il CRIO utilizzato nell’invenzione è un preparato costituito dalla frazione crioglobulinica del plasma fresco, ottenuta da una singola donazione, concentrata ad un volume finale non superiore a 40 mL.

Il prodotto contiene, oltre al fattore Vili, anche la maggior parte del fattore Von Willebrand, del fibrinogeno, del fattore XIII e della fibronectina, presenti nel plasma fresco di partenza.

Il CRIO può essere ottenuto in modo noto da plasma fresco congelato da aferesi o plasma da separazione dopo aver collegato una sacca transfer mediante steril connector e scongelato a 4°C ±2°C overnight, per decantazione si procede a risospendere il crioprecipitato in circa 40 mL di plasma esausto (ottenuto dal plasma fresco congelato privo di crioprecipitato), il contenuto di fibrinogeno non deve essere inferiore a 3,5 mg/ml.

Quindi come si vede da quanto sopra riportato, il concentrato piastrinico, il crioprecipitato e la trombina sono preparati utilizzando mezzi fisici semplici.

Per l'assemblaggio PRP e CRIO si può procedere in circuito chiuso con connessioni sterili a miscelare il PRP ed il CRIO in rapporto 1 :1 così da ottenere un emocomponente con le proprietà di entrambi.

L'uso topico della matrice così preparata, è favorito dalle sue caratteristiche di plasticità e modellabilità alla sede di applicazione, favorendo ed accelerando la riparazione tissutale.

Ovviamente le matrici secondo l’invenzione oltre che alla rigenerazione del derma, come specificamente sopra descritto e illustrato negli esempi seguenti, possono essere applicate anche alla rigenerazione di atri tipi di tessuti quali, ad esempio, tendine, cartilagine, muscolo, osso. Esempio 1

Preparazione della matrice dermica Integra® “dermal regeneration template" arricchita con PRP/CRIO

Durante tutta la preparazione matrice, PRP/CRIO e trombina devono essere maneggiate con tecniche asettiche, e vanno seguite le indicazioni del costruttore per la preparazione del prodotto.

Si utilizza una matrice Integra® “dermal regeneration template”, che, dopo lavaggio con soluzione fisiologica viene tamponata delicatamente più volte con garza sterile per assorbire la soluzione fisiologica in eccesso

Si posiziona la matrice su un contenitore sterile a base piatta, ad esempio una bacinella, con la parte in silicone a contatto con il fondo. Tramite siringa si fa gocciolare il PRP/CRIO sulla matrice in rapporto 2:1 in volume (matrice Integra® superficie 5x5 mm, spessore circa 1,5 mm, volume circa di 3,75 cc; PRP/CRIO necessario circa 7,5 cc) Si agita delicatamente il contenitore 5-6 volte lasciando poi in riposo per 10 minuti e quindi si ripete l’operazione.

Si aggiunge facendo gocciolare tramite siringa una miscela di calcio gluconato 10% e trombina (1:5) in rapporto 1:10 con PRP/CRIO utilizzato per l'arricchimento della matrice ed si agita delicatamente il contenitore 5-6 volte.

Si lascia in riposo circa 5 -10 minuti fino a formazione del gel, si controlla la gelificazione inclinando a 45° il contenitore.

La matrice è pronta per l’applicazione che può essere subito effettuata . Esempio 2

Procedura per la preparazione della matrice dermica Integra® “dermal regeneration template single layer “arricchita con PRP/CRIO Durante tutta la preparazione matrice, PRP/CRIO e trombina devono essere maneggiate con tecniche asettiche, e vanno seguite le indicazioni del costruttore per la preparazione del prodotto

Si utilizza una matrice Integra® “dermal regeneration template single layer" che dopo il lavaggio con soluzione fisiologica viene tamponata delicatamente più volte con garza sterile per assorbire la soluzione fisiologica in eccesso.

Si posiziona la matrice su contenitore sterile a base piatta, ad esempio una bacinella, a contatto con il fondo.

Tramite siringa si fa gocciolare il PRP/CRIO sulla matrice in rapporto 2:1 in volume (matrice Integra® superficie 5x5 mm, spessore circa 1 ,5 mm, volume circa di 3,75 cc; PRP/CRIO necessario circa 7,5 cc) e si agita delicatamente il contenitore 5-6 volte lasciando poi in riposo per 10 minuti.

Si capovolge la matrice dermica all’interno del contenitore e si agita delicatamente il contenitore 5-6 volte lasciando poi in riposo 10 min. Si aggiunge facendo gocciolare tramite siringa una miscela di calcio gluconato 10% e trombina (1 :5) in rapporto 1 :10 con PRP/CRIO utilizzato per rarricchimento della matrice ed si agita delicatamente il contenitore 5-6 volte.

Si lascia in riposo circa 5-10 minuti fino a formazione del gel, si controlla la gelificazione inclinando a 45° il contenitore.

La matrice è pronta per l’applicazione che può essere effettuata subito. Nella figura 1 è mostrata una matrice secondo l'invenzione appena preparata mentre nella figura 2 viene evidenziata la rapida ricostruzione del neoderma seguita da riepitelizzazione con guarigione per seconda intenzione a seguito dell’applicazione di una matrice secondo l’invenzione ad un’ulcera da insufficienza venosa.

Claims

Rivendicazioni 1. Matrice extracellulare tridimensionale costituita da una membrana a singolo o doppio strato in cui la parte preposta alla sostituzione del derma è una struttura porosa comprendente fattori piastrinici.
2. Matrice secondo la rivendicazione 1 in cui detta matrice è bioingegnerizzata o eterologa.
3. Matrice secondo la rivendicazione 2 in cui detta matrice bioingegnerizzata è costituita da un qualsiasi biomateriale tollerabile e biocompatibile comprendente una componente proteica e/o polisaccaridica.
4. Matrice secondo la rivendicazione 2 in cui detta matrice eterologa è una matrice di derivazione biologica umana e/o animale.
5. Matrici secondo le rivendicazioni 2 - 4 aventi una porosità capace di consentire l'adsorbimento delle componenti contenute in detti fattori piastrinici.
6. Matrici secondo la rivendicazione 5 in cui dette matrici extracellulari bioingegnerizzate e/o eterologhe sono capaci di permettere legami stabili tra cellule e matrice.
7. Matrici secondo le rivendicazioni 1 - 6 in cui dette matrici sono dotate di film di materiale semipermeabile che costituisce la parte che sostituisce l'epidermide.
8. Matrice secondo le rivendicazioni 1 - 7 in cui detti fattori piastrinici sono contenuti in un preparato costituito da: colla di fibrina, gel piastrinico, trombina o loro miscele.
9. Processo per la preparazione di matrici extracellulari secondo le rivendicazioni 1 — 9 in cui si procede alla formazione “in situ", all’interno della matrice, del gel piastrinico e della colla di fibrina per azione della trombina rispettivamente su concentrato piastrinico e su crioprecipitato con cui si è precedentemente impregnata la matrice.
10. Processo secondo al rivendicazione 9 in cui: - si risciacqua la matrice con soluzione fisiologica eliminando eventuali eccessi e la si deposita in un contenitore a base piatta; - tramite siringa si fa gocciolare il PRP/CRIO sulla matrice in quantità tale da permettere la completa imbibizione della matrice stessa e si lascia riposare ripetendo più volte; - si aggiunge sulla matrice, facendo gocciolare tramite siringa, una miscela di calcio gluconato e trombina agitando poi delicatamente e lasciando infine riposare fino a formazione del gel.
11. Processo secondo la rivendicazione 10 in cui il calcio gluconato è in soluzione acquosa al 10% ed il rapporto calcio gluconato/trombina è compreso fra 1:5 — 1:10 in volume.
12. Processo secondo la rivendicazione 11 in cui II rapporto (miscela di calcio gluconato e trombina)/(PRP-CRIO) è compreso fra 1:5 e 1:10 in volume.
13. Uso delle matrici secondo le rivendicazioni 1 - 8 per la rigenerazione dei tessuti.
14. Uso secondo la rivendicazione 13 in cui detti tessuti sono epidermide, derma, tendini, cartilagini, muscoli, ossa.
15. Matrice extracellulare secondo le rivendicazioni 1 - 8 contenente inoltre monociti e/o cellule staminali.