CN108852895A - 一种用于皮肤祛皱修复的化妆品组合物及其产品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于皮肤祛皱修复的化妆品组合物，其中，所述组合物包括使用铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素从组织中进行培养人成体干细胞，促进成体干细胞的蛋白质合成与分泌，其培养获得的干细胞培养液，其富含细胞生长营养因子，具有皮肤再生修复的功效，成为皮肤再生修复的生物美容原料；可添加天然植物铁皮石斛、紫草提取物、寡肽3和肌肽，其具有促进人表皮细胞和成纤维细胞增殖生长的作用，直接制备成再生修复精华液、面膜以及膏霜类化妆品等。

Description

一种用于皮肤祛皱修复的化妆品组合物及其产品
技术领域
本发明涉及一种用于皮肤祛皱修复的化妆品组合物及其制备的产品。特别地，本发明涉及使用铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素从组织中进行培养人成体干细胞，促进成体干细胞的蛋白质合成与分泌，其培养获得的干细胞培养液，其富含细胞生长营养因子，具有皮肤再生修复的功效，可以制备成再生修复精华液、面膜、面霜和眼霜等产品，可用于皮肤皱纹、瘢痕和疤痕等修复。
背景技术
目前，化妆品原料逐步摒弃化学品作为原料，崇尚天然和无污染、无激素的原料生产各类化妆品，如天然植物提取活性物和深海生物提取活性营养成分等，对皮肤发挥保湿、美白和祛斑等作用。虽然有些化妆品加入了一些植物提取物或深海生物提取物，但因其有效成分含量和有效性等问题，对皮肤再生修复还远远不足。生物技术的发展，也提供了一些制备化妆品的原料，如植物在大肠杆菌或酵母中发酵，大量获得相关营养成分；或者通过基因工程技术构建的细胞生长因子，发酵后纯化得到的细胞生长因子作为原料添加到化妆品中或直接使用，在皮肤修复、再生和美白中起到一定效果。但由于这些细胞因子是在大肠杆菌或酵母等低等生物中进行表达的，其缺少在哺乳动物细胞中蛋白转录翻译后修饰，包括糖基化、甲基化和末端修饰等过程，其功能和生物活性受到很大限制。即使在哺乳动物中发酵制备的细胞生长因子，应用到人身上仍是组织相容性差，以致皮肤造成过敏现象。
本发明采用天然植物提取活性成分加入到人成体干细胞无血清培养基体系中进行连续培养，促进了人成体干细胞大量表达和分泌细胞生长因子，而这些细胞生长因子为人源性成体干细胞表达和分泌，与人体具有很好的组织相容性，不会产生免疫排斥和过敏反应，同时具有很好生物学活性。
综上所述，本发明利用人成体干细胞表达和分泌的细胞生长因子，通过连续培养、浓缩后制备成化妆品原料，并添加天然植物铁皮石斛、人参和紫草的提取物、寡肽3和肌肽组成化妆品组合物，制备成各类产品，将对皮肤皱纹、瘢痕和疤痕等产生更佳的再生修复作用。
发明内容
本发明为我们科研人员在筛选天然植物活性成分时，发现铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素均能促进人成体干细胞增殖和分泌细胞生长因子；人参皂苷Rh1具有促进成体干细胞增殖和促进DNA合成和血清蛋白质合成作用；三者在促进干细胞增殖与分化、细胞因子分泌具有很好的协同能力。而铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素与成体干细胞共培养后促进表达和分泌的细胞生长因子，从而获得培养液。经过本发明科研人员长期人干细胞培养与美容应用的工作基础，，发现人干细胞表达和分泌的细胞生长因子对皮肤的皱纹、色斑和瘢痕等产生产生很好的修复、再生和美白等作用，而且联合美容物理疗法将产生更好功效。本发明通过添加铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素进行培养人成体干细胞的培养液经超浓缩后制备成人干细胞精华液，富含细胞生长因子成分，具有再生修复的功效。这些细胞生长因子主要包括：表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1、血管内皮生长因子、成纤维生长因子1、干细胞生长因子等，特别是含有I型前胶原蛋白C肽(PIP)。
I型前胶原蛋白C肽(PIP)为前胶原蛋白成熟过程中C端切断的多肽，分泌在血液中并稳定存在，能促进表皮细胞和成纤维细胞增殖以及胶原蛋白分泌。同时人成体干细胞分泌多种细胞生长因子能够协同作用改善皮肤微循环，能促进细胞外透明质酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增强皮肤的亲水性，保持皮肤内水分；通过促进肌肤内多种细胞的生长、分化，产生大量的新生细胞，来替代有色细胞；促进真皮层内纤维母细胞的增殖，修复老化的胶原纤维与弹性纤维；改善皮肤微循环，提供良好的营养环境，维持一定量的皮肤脂肪，还原肌肤弹性，使其均匀紧致，减少皱纹；促进细胞新陈代谢，促进细胞的增殖、分化，特别是干细胞。同时我们发现PIP具有更好地促进皮肤成纤维细胞增殖，表达胶原蛋白，对改善皮肤肤质，特别是对皮肤瘢痕和疤痕具有很好修复作用。
本发明提供了一种用于皮肤祛皱修复的化妆品组合物，其中，所述组合物包括使用铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素从组织中培养人成体干细胞，促进成体干细胞的蛋白质合成与分泌，其培养获得的培养液，其富含细胞生长营养因子，具有皮肤再生修复的功效；可添加天然植物铁皮石斛、紫草提取物、寡肽3和肌肽，成为皮肤祛皱修复的生物美容原料。
本发明提供的人成体干细胞为废弃脐带来源的间充质干细胞、废弃胎盘来源的胎盘多能干细胞(Placental stem cells，PSC)、骨髓来源间充质干细胞或内皮祖细胞和脂肪来源脂肪干细胞等，优选地，为废弃胎盘来源的胎盘多能干细胞。使用多层细胞培养器进行大规模传代培养，获得大量PSC细胞培养液。
一种化妆品组合物，所述组合物含有培养液，其特征在于，使用铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素培养人成体干细胞获得所述培养液；所述培养液富含细胞生长因子。
如上所述的化妆品组合物，其特征在于，细胞生长因子包括：PIP、EGF、bFGF、TGF-β1、VEGF、FGF1、SCF。
如上所述的化妆品组合物，其特征在于，使用无血清培养基培养人成体干细胞获得所述培养液，所述无血清培养基含无血清添加物、铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1、紫草素和抗坏血酸。
如上所述的化妆品组合物，所述无血清培养基含无血清添加物、1-500μg/ml铁皮石斛多糖、1-500μg/ml人参皂苷Rh1、1-500μg/ml紫草素和1-500μg/ml抗坏血酸。
如上所述的化妆品组合物，其特征在于，所述培养液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含如下细胞生长因子：EGF含量超过10000pg/ml，bFGF含量超过10000pg/ml，TGF-β1含量超过4000pg/ml，VEGF含量超过4000pg/ml，FGF1含量超过2000pg/ml，SCF含量超过2000pg/ml，PIP含量超过1000pg/ml。
一种化妆品组合物，所述组合物含有浓缩液，其特征在于，将如上所述培养液经透析浓缩获得所述浓缩液。
如上所述的化妆品组合物，其特征在于，所述浓缩液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含如下细胞生长因子：EGF含量超过40ng/ml，bFGF含量超过40ng/ml，TGF-β1含量超过20ng/ml，VEGF含量超过20ng/ml，FGF-1含量超过25ng/ml和SCF含量超过10ng/ml，PIP含量超过20ng/ml。
如上所述的化妆品组合物，其特征在于，所述组合物还添加天然植物铁皮石斛、紫草提取物、寡肽3和肌肽。
一种面膜或精华液，其特征在于，其包括如下成分组成：
1)0.1-5wt％的所述所述培养液的浓缩液；
2)基础乳化液，含0.1-5wt％铁皮石斛提取物、0.1-5wt％人参提取物、0.1-5wt％紫草提取物、0.1-2wt％寡肽3和0.1-2wt％肌肽。
一种培养液，其特征在于，使用铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素培养人成体干细胞获得所述培养液；优选，所述培养液富含细胞生长因子；优选，细胞生长因子包括：PIP、EGF、bFGF、TGF-β1、VEGF、FGF1、SCF。优选，使用无血清培养基培养人成体干细胞获得所述培养液，所述无血清培养基含无血清添加物、铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1、紫草素和抗坏血酸；优选，所述无血清培养基含无血清添加物、1-500μg/ml铁皮石斛多糖、1-500μg/ml人参皂苷Rh1、1-500μg/ml紫草素和1-500μg/ml抗坏血酸；优选，所述培养液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含如下细胞生长因子：EGF含量超过10000pg/ml，bFGF含量超过10000pg/ml，TGF-β1含量超过4000pg/ml，VEGF含量超过4000pg/ml，FGF1含量超过2000pg/ml，SCF含量超过2000pg/ml，PIP含量超过1000pg/ml。
优选地，所述方法包括如下步骤，
(1)通过培养人成体干细胞获得培养液；
(2)将蛋白悬液经超浓缩后制备成浓缩液；
优选地，进一步包括
(3)将浓缩液制备成人干细胞精华液；
优选地，进一步包括
(4)将所述人干细胞精华液，加入从铁皮石斛、人参和紫草中提取的活性成分，以及寡肽3和肌肽；
其中，所述步骤(1)中使用无血清培养基，优选其含无血清添加物、1-500μg/ml铁皮石斛多糖、1-500μg/ml人参皂苷Rh1、1-500μg/ml紫草素和1-500μg/ml抗坏血酸；
所述浓缩液或干细胞精华液可为皮肤再生修复的生物美容原料；
其中，所述人干细胞培养液、含人干细胞裂解液的培养液或其浓缩液均富含如下细胞生长因子：PIP、EGF、bFGF、TGF-β1、VEGF、FGF1、SCF等，优选地分泌PIP。
优选地，所述人干细胞来源废弃胎盘，经剪碎成1mm3大小在无血清培养基培养条件下，原代培养获得间充质干细胞，通过0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，从第1代25ml175cm2培养瓶增殖培养起始，传代到第2代3个25ml 175cm2培养瓶或1个三层细胞培养瓶中，再到第3代9个25ml 175cm2培养瓶或2个五层细胞培养瓶中培养，再到第4代27个25ml175cm2培养瓶或6个五层细胞培养瓶中培养，再到第5代81个251755cm2培养瓶或18个五层细胞培养瓶中培养，然后放大到第6代243个25175cm2培养瓶或42个五层细胞培养瓶中培养，每次传代培养收集其培养液并获得第6代胎盘多能干细胞；放大培养共收集培养液约7.28L。
一次处理一个人胎盘可获得50瓶以上的原代胎盘多能干细胞，通过上述大规模传代培养后可获得超过350L胎盘多能细胞培养液。
优选地，所述的无血清培养基含无血清添加物、1-500μg/ml铁皮石斛多糖、1-500μg/ml人参皂苷Rh1、1-500μg/ml紫草素和1-500μg/ml抗坏血酸，我们发现可以促进细胞生长因子的分泌和表达，提高细胞生长因子的含量，特别是促使了PIP的表达。
将获得1L培养过人胎盘多能干细胞的培养液通过100-1000分子量的透析袋进行透析浓缩，或者通过100-1000分子量的醋酸纤维素膜进行超滤浓缩，浓缩1-10倍，获得100ml-500ml浓缩液。
优选地，本发明制备的人成体干细胞培养液及其浓缩液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含细胞生长因子，即：所述人成体干细胞培养液含EGF含量超过10000pg/ml，bFGF含量超过10000pg/ml，TGF-β1含量超过4000pg/ml，VEGF含量超过4000pg/ml，FGF1含量超过2000pg/ml，SCF含量超过2000pg/ml；优选地，PIP含量超过1000pg/ml。
优选地，所述浓缩液中所述浓缩液中EGF含量超过40ng/ml，bFGF含量超过40ng/ml，TGF-β1含量超过20ng/ml，VEGF含量超过20ng/ml，FGF-1含量超过25ng/ml和SCF含量超过10ng/ml；优选地，PIP含量超过20ng/ml。
优选地为选择人成体干细胞培养液的浓缩液作为美容原料。
本发明所述的人成体干细胞培养液或浓缩液加入到人表皮细胞HaCat或人成纤维细胞3T3-L1培养液中进行培养，通过细胞增殖检测试剂盒CCK-8检测，增殖速度比未加入培养液显著提高；促进了表皮细胞和成纤维细胞的增殖。通过蛋白印迹分析，HaCat和3T3-L1表达胶原蛋白Iα1和胶原蛋白IIα1的量比未加入培养液的要高出1-10倍；提高了人表皮细胞和成纤维细胞表达胶原蛋白。
本发明提供的人成体干细胞培养液浓缩液，可以作为生物美容原料，添加到面霜、润肤露和爽肤水等化妆品中生产成相关产品。
本发明提供的一种人成体干细胞来源的祛皱修复美容面膜，其特征在于，其由如下成分组成：
1)0.1-5％的所述的人成体干细胞培养液的浓缩液；
2)基础乳化液，含0.1-5％铁皮石斛提取物、0.1-5％人参提取物、0.1-5％紫草提取物、0.1-2％寡肽3和0.1-2％肌肽；
3)面膜原材料：无纺布、生物纤维膜、蚕丝膜或水凝胶膜；
其制备方法为，将取干细胞浓缩液加入到面膜基础乳化液中混匀，再灌装到锡箔纸袋中，热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为1个月。
优选地，选择蚕丝膜或水凝胶膜作面膜原材料。
本发明提供的一种人成体干细胞来源的祛皱修复美容精华液，其特征在于，其由如下成分组成：
取如上所述0.1-5％的人成体干细胞培养液的浓缩液与精华液基料(含0.1-5％铁皮石斛提取物、0.1-5％人参提取物、0.1-5％紫草提取物、0.1-2％寡肽3和0.1-2％肌肽)，混匀后装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤祛皱修复精华液。
装盒包装后形成产品，保存在4℃条件下，保质期为1个月。
通过本发明的方法，通过获取的人成体干细胞培养液及其浓缩液富含细胞生长因子，可以制备成面霜、润肤露、爽肤水、面膜和精华液等产品，能够对皮肤具有皱纹、色斑和瘢痕等除皱、祛斑和修复等美容作用。特别当联合物理美容疗法使用时，将产生更佳的美容疗效，即高温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为细胞因子进入皮肤的通道。
附图说明
图1表示由实施例1和2所制备人胎盘多能干细胞的培养液中各细胞因子分泌水平图
图2表示由实施例2所制备的胎盘多能干细胞培养浓缩液对人表皮细胞HaCatCCK-8检测增殖曲线图，B实施例2所制备的胎盘多能干细胞培养浓缩液对成纤维细胞3T3-L1 CCK-8检测增殖曲线图
图3表示实施例2所制备的胎盘多能干细胞培养浓缩液对HaCat或3T3-L1细胞表达胶原蛋白Iα1和胶原蛋白IIα1的灰度结果比较图
具体实施方式
本发明提供了一种用于皮肤祛皱修复的化妆品组合物，其中，所述组合物包括使用铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素从组织中培养人成体干细胞，促进成体干细胞的蛋白质合成与分泌，其培养获得的培养液，其富含细胞生长营养因子，具有皮肤再生修复的功效；可添加天然植物铁皮石斛、人参和紫草的提取物、寡肽3和肌肽，成为皮肤祛皱修复的生物美容原料。
所述人干细胞为废弃脐带来源间充质干细胞、废弃胎盘来源的胎盘多能干细胞、骨髓来源间充质干细胞或内皮祖细胞和脂肪来源脂肪干细胞等，优选地，为废弃胎盘来源的胎盘多能干细胞，使用多层细胞培养器进行大规模传代培养，获得大量PSC细胞液。
所述人间充质干细胞来源废弃脐带和废弃胎盘，经剪碎成1mm3大小在10ml无血清培养基(含无血清添加物、1-500μg/ml铁皮石斛多糖、1-500μg/ml人参皂苷Rh1、1-500μg/ml紫草素和1-500μg/ml抗坏血酸)中，37℃、5％CO2培养箱中原代培养获得间充质干细胞，再进行传代培养。使用1-100ml 0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，通过0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，从第1代25ml 175cm2培养瓶增殖培养起始，传代到第2代3个25ml 175cm2培养瓶或1个三层细胞培养瓶中，再到第3代9个25ml 175cm2培养瓶或2个五层细胞培养瓶中培养，再到第4代27个25ml 175cm2培养瓶或6个五层细胞培养瓶中培养，再到第5代81个251755cm2培养瓶或18个五层细胞培养瓶中培养，然后放大到第6代243个25175cm2培养瓶或42个五层细胞培养瓶中培养，每次传代培养收集其培养液并获得第6代胎盘多能干细胞；放大培养共收集培养液约7.28L。
一次处理一个人胎盘可获得50瓶以上的原代胎盘多能干细胞，通过上述大规模传代培养后可获得超过350L胎盘多能细胞培养液。
本发明使用的细胞培养基为无血清培养基，如UltraCULTURETM、AMMS-MSC、Mesen Gro和MGro-500等商品化产品。
优选地，所述的PSC无血清培养基含无血清添加物、1-500μg/ml铁皮石斛多糖、1-500μg/ml人参皂苷Rh1、1-500μg/ml紫草素和1-500μg/ml抗坏血酸。
本发明使用细胞培养瓶为商品化产品，如美国Coming公司、美国Falcon公司和无锡耐斯特公司等，包括75cm2培养瓶、175cm2培养瓶、三层细胞培养瓶，五层细胞培养瓶和10层细胞培养工厂，可以用于传代大规模贴壁细胞培养使用。
将获得1L培养过人胎盘多能干细胞的培养液通过100-1000分子量的透析袋进行透析浓缩，或者通过100-1000分子量的醋酸纤维素膜进行超滤浓缩，浓缩1-10倍，获得100ml-500ml浓缩液。
本发明制备的人干细胞培养液及其浓缩液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含细胞生长因子，即：表所述人成体干细胞培养液含EGF含量超过10000pg/ml，bFGF含量超过10000pg/ml，TGF-β1含量超过4000pg/ml，VEGF含量超过4000pg/ml，FGF1含量超过2000pg/ml，SCF含量超过2000pg/ml；优选地，PIP含量超过1000pg/ml。
优选地，所述浓缩液中EGF含量超过40ng/ml，bFGF含量超过40ng/ml，TGF-β1含量超过20ng/ml，VEGF含量超过20ng/ml，FGF-1含量超过25ng/ml和SCF含量超过10ng/ml；优选地，PIP含量超过20ng/ml。
优选地为选择人成体干细胞培养液的浓缩液作为美容原料。
本发明的5％人成体干细胞培养液或1％的浓缩液加入到人表皮细胞HaCat或人成纤维细胞3T3-L1培养液中进行培养，通过细胞增殖检测试剂盒CCK-8检测，增殖速度比未加入培养液显著提高。
通过蛋白印迹分析，HaCat和3T3-L1表达胶原蛋白Iα1和胶原蛋白IIα1的量比未加入培养液的要高出1-10倍；提高了人表皮细胞和成纤维细胞表达胶原蛋白。
本发明提供的人成体干细胞培养液浓缩液，可以作为生物美容原料，添加到面霜、润肤露和爽肤水等化妆品中生产成相关产品，即取1ml浓缩液加入到50ml面霜、润肤露和爽肤水等中混匀即可。
本发明提供的一种人成体干细胞来源的祛皱修复美容面膜，其特征在于，其由如下成分组成：
1)0.1-5％的所述的人成体干细胞培养液的浓缩液；
2)基础乳化液，含0.1-5％铁皮石斛提取物、0.1-5％人参提取物、0.1-5％紫草提取物、0.1-2％寡肽3和0.1-2％肌肽；
3)面膜原材料：无纺布、生物纤维膜、蚕丝膜或水凝胶膜；
其制备方法为，将取干细胞浓缩液加入到面膜基础乳化液中混匀，再灌装到锡箔纸袋中，热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为1个月。
优选地，选择蚕丝膜或水凝胶膜作面膜原材料。
本发明提供的一种人成体干细胞来源的祛皱修复美容精华液，其特征在于，其由如下成分组成：
取如上所述0.1-5％的人成体干细胞培养液的浓缩液与精华液基料(含0.1-5％铁皮石斛提取物、0.1-5％人参提取物、0.1-5％紫草提取物、0.1-2％寡肽3和0.1-2％肌肽)，混匀后装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤祛皱修复精华液。
装盒包装后形成产品，保存在4℃条件下，保质期为1个月。
本发明提供了通过获取的人干细胞培养液及其浓缩液富含细胞生长因子，可以制备成面霜、润肤露、爽肤水、面膜和精华液等产品，能够对皮肤具有除皱、祛斑、填充和修复等美容作用。本发明还提供了联合物理美容疗法使用，即高温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为细胞因子进入皮肤的通道，将产生更佳的美容疗效。
以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。
实施例1 人胎盘多能干细胞的培养
收集废弃人胎盘，经剪碎成1mm3大小在10ml Mesen Gro无血清培养基(含1倍无血清添加物、50μg/ml铁皮石斛多糖、10μg/m人参皂苷Rh1、50μg/ml紫草素和20μg/ml抗坏血酸)中，37℃、5％CO2培养箱中原代培养获得胎盘多能干细胞，再进行传代培养。
通过0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，从第1代25ml 175cm2培养瓶增殖培养起始，传代到第2代1个三层细胞培养瓶中，再到第3代2个五层细胞培养瓶中培养，再到第4代6个五层细胞培养瓶中培养，再到第5代18个五层细胞培养瓶中培养，然后放大到第6代42个五层细胞培养瓶中培养，每次传代培养收集其培养液并获得第6代胎盘多能干细胞；放大培养共收集培养液约7.28L。
一次处理一个人胎盘可获得50瓶以上的原代胎盘多能干细胞，通过上述大规模传代培养后可获得超过350L胎盘多能细胞培养液。
实施例2 人胎盘多能干细胞来源美容原料制备
将人胎盘多能干细胞培养液加入到500分子量的透析袋(美国光谱公司)中，放置冰箱冷藏中进行透析浓缩，体积浓缩5倍。
另外，也可以将人胎盘多能干细胞的培养液使用500分子量的醋酸纤维素膜(美国光谱公司)进行超滤浓缩，体积浓缩5倍。
实施例3 人胎盘多能干细胞中细胞因子表达与分泌水平检测
取实施例1中制备的人胎盘多能干细胞培养液及其浓缩液经ELISA试剂盒(美国R&D系统公司)检测其中细胞因子分泌水平，使用步骤参照使用说明书。
实验分组如下：对比实验组A为使用无植物活性提取物培养人胎盘多能干细胞，即Mesen Gro无血清培养基(含1倍无血清添加物和20μg/ml抗坏血酸)，获得培养液；对比实验组B为使用含铁皮石斛多糖培养人胎盘多能干细胞，即Mesen Gro无血清培养基(含1倍无血清添加物、110μg/ml铁皮石斛多糖和20μg/ml抗坏血酸)，获得培养液；对比实验组C为使用含人参皂苷Rh1培养人胎盘多能干细胞，即Mesen Gro无血清培养基(含1倍无血清添加物、30μg/m人参皂苷Rh1和20μg/ml抗坏血酸)，获得培养液；对比实验组D为使用含紫草素培养人胎盘多能干细胞，即Mesen Gro无血清培养基(含1倍无血清添加物、100μg/ml紫草素和20μg/ml抗坏血酸)，获得培养液；实验组E为通过实施例1方法培养人胎盘多能干细胞，即Mesen Gro无血清培养基(含1倍无血清添加物、50μg/ml铁皮石斛多糖、10μg/m人参皂苷Rh1、50μg/ml紫草素和20μg/ml抗坏血酸)，获得培养液；表1中为实验各组中人胎盘多能干细胞的培养液、及其浓缩液中各细胞因子表达和分泌水平，所述单位为ng/ml。
表1
表1中显示人胎盘多能干细胞在无天然植物提取物培养下获得培养液比其他含有天然植物提取物培养获得培养液分泌的细胞生长因子均显著下降，而在分别含有铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素培养获得的培养液中分泌的细胞生长因子均比在三者也均含有条件下培养要明显低下，在含有铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素三者联合培养获得培养液以及浓缩液中均分泌高水平的细胞生长因子，其中细胞浓缩液中进一步提高了细胞因子浓度，表明铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素三者联合培养协同促进了细胞生长因子的分泌；将更有助于这些细胞因子在皮肤美容方面将发挥再生修复的作用。特别发现在细胞培养液中高表达细胞生长因子PIP，其在功能上具有促进细胞增殖和皮肤修复的作用。
人胎盘多能干细胞的培养液与对比例进行比较，即Nizyaeva NV发表在2017年二月的《实验生物学与药学期刊》的为培养多能间充质多能干细胞的胎盘组织样本收集条件，Nizyaeva NV，Nagovitsyna MN，Kulikova GV，et al.Conditions for Collection ofPlacental Tissue Samples for Culturing of Multipotent Mesenchymal StromalCells.Bull Exp Biol Med.2017 Feb；162(4)：501-506.所报道的方法进行培养人胎盘多能干细胞，获得的培养基与本发明获得人胎盘多能干细胞的培养液，检测分析分泌细胞因子的水平。
图1为人胎盘多能干细胞的培养液中各细胞因子分泌水平图，与对比例技术获得培养液相比，本发明人胎盘多能干细胞具有很好的细胞因子分泌水平，EGF、bFGF、TGF-β1、VEGF、SCF和PIP均明显高于对比例培养获得的培养液，均具有显著的差异(*P≤0.05，**P≤0.01)。
实施例4 人胎盘多能干细胞培养液对表皮细胞和成纤维细胞的作用
取人表皮细胞HaCat和人成纤维细胞3T3-L1(来源于美国ATCC)，分为两组进行培养，即A组在DMEM低糖培养基条件下，2×103/孔，96孔板中分别进行培养；B组为DMEM低糖培养基添加1％实施例2制备的浓缩液，与A组一样进行培养，然后通过细胞增殖检测试剂盒CCK-8进行分析，使用酶标仪(美国Bio-Rad公司)，在450nm波长下检测。
图2为人表皮细胞HaCat和人成纤维细胞3T3-L1在含有胎盘多能干细胞培养浓缩液和未含有其的DMEM低糖培养基中，两种细胞增殖速度的比较。A为人表皮细胞HaCat在连续7天CCK-8检测增殖曲线，B为人成纤维细胞3T3-L1在连续7天CCK-8检测增殖曲线，结果所示两种细胞在含有本发明的胎盘多能干细胞培养浓缩液中增殖速度均显著高于比未加入浓缩液(**P≤0.01)；表明胎盘多能干细胞培养浓缩液具有促进表皮细胞和成纤维细胞显著增殖的能力。
同样取人表皮细胞HaCat和人成纤维细胞3T3-L1(来源于美国ATCC)，分为两组进行培养，即A组在DMEM低糖培养基条件下，1×105/ml，10ml，在75cm2培养瓶中分别进行培养；B组为DMEM低糖培养基添加1％实施例2制备的浓缩液，与A组一样进行培养，即在37℃，5％CO2培养箱中培养3天，然后用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)进行消化，获得培养的人表皮细胞HaCat和人成纤维细胞3T3-L1。
使用蛋白印迹分析进行检测，蛋白抽提：2-5×106个HaCat或3T3-L1细胞悬液分别1000rpm离心10分钟，弃培养液，PBS清洗3次。根据细胞量加入相应的抽提缓冲液，冰上轻摇15min。收集裂解液到EP管中，14,000rpm离心15min。取上清到新的EP管中。蛋白样品浓度测定：参照美国Bio-RAD公司购买的BCA蛋白定量试剂盒说明书进行。将提取好样品的蛋白溶液和5×上样缓冲液按5∶1混合，煮沸5min。配制5％积沉胶，8％分离胶，每孔上样量约为10ng。电泳：80V恒压50分钟，120V恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部止，PVDF膜甲醇预处理3～5秒，放至转印液浸润半小时。取出凝胶，将其放至滤纸上，形成凝胶转印堆积层并去除气泡。低温条件下(4℃)，100V恒压60～120分钟。取出杂交膜，TBST漂洗5分钟，三次；5％脱脂奶粉溶液室温封闭1小时；TBST洗膜5min，三次。加入合适的一抗稀释浓度(Anti-Col Iα1antibody(1∶1000)，Anti-Col IIα1 antibody(1∶1000)，ACTIN作为参照蛋白，4℃过夜。TBST洗膜5min，三次；二抗稀释液37℃孵育1h；TBST洗膜5min，三次；蒸馏水漂洗膜2min，弃去液体。共洗三次。将杂交膜置于一个透明塑料板上，用干净移液器将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，并使反应持续5min。用滤纸吸去膜表面多余的ECL发光液，暗室中用胶片显影，定影，并拍照。通过软件Image J分析蛋白印迹进行灰度分析。
图3中为通过Western blotting检测的胶原蛋白表达灰度分析结果，显示在含有本发明的胎盘多能干细胞培养浓缩液中培养的HaCat或3T3-L1细胞均高表达胶原蛋白Iα1和胶原蛋白IIα1，与不含有的HaCat或3T3-L1细胞相比，具有显著差异(**P≤0.01)。HaCat细胞在含浓缩液中表达胶原蛋白Iα1和胶原蛋白IIα1分别高于不含浓缩液的为4.00倍和8.95倍，而3T3-L1细胞也分别高出8.70倍和3.41倍。表明本发明的胎盘多能干细胞培养液对人表皮细胞和人成纤维细胞均促使胶原蛋白Iα1和胶原蛋白IIα1的高表达。
实施例5 制备人胎盘多能干细胞培养液的美容产品
制备人胎盘多能干细胞来源的祛皱修复美容面膜，如下成分组成：
1)实施例2制备1％的人胎盘多能干细胞培养液的浓缩液；
2)基础乳化液，含1％铁皮石斛提取物、0.5％人参提取物、1％紫草提取物、0.5％寡肽3和0.5％肌肽；
3)水凝胶膜；
将1％的人胎盘多能干细胞培养液的浓缩液在基础乳化液中混匀后，装入25ml锡箔纸袋中，放入1张水凝胶膜，然后热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为1个月。
制备人胎盘多能干细胞来源的祛皱修复美容精华液，由如下成分组成：
取实施例2制备的1％人胎盘多能干细胞养液的浓缩液，加入到精华液基料(含1％铁皮石斛提取物、0.5％人参提取物、1％紫草提取物、0.5％寡肽3和0.5％肌肽)，混匀后装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤祛皱修复精华液。
装盒包装后形成产品，保存在4℃条件下，保质期为1个月。

Claims (10)

1.一种化妆品组合物，所述组合物含有培养液，其特征在于，使用铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素培养人成体干细胞获得所述培养液；所述培养液富含细胞生长因子。
2.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，细胞生长因子包括：PIP、EGF、bFGF、TGF-β1、VEGF、FGF1、SCF。
3.根据权利要求1-2任一项所述的化妆品组合物，其特征在于，使用无血清培养基培养人成体干细胞获得所述培养液，所述无血清培养基含无血清添加物、铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1、紫草素和抗坏血酸。
4.根据权利要求3所述的化妆品组合物，所述无血清培养基含无血清添加物、1-500μg/ml铁皮石斛多糖、1-500μg/ml人参皂苷Rh1、1-500μg/ml紫草素和1-500μg/ml抗坏血酸。
5.根据权利要求1-4任一项所述的化妆品组合物，其特征在于，所述培养液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含如下细胞生长因子：EGF含量超过10000pg/ml，bFGF含量超过10000pg/ml，TGF-β1含量超过4000pg/ml，VEGF含量超过4000pg/ml，FGF 1含量超过2000pg/ml，SCF含量超过2000pg/ml，PIP含量超过1000pg/ml。
6.一种化妆品组合物，所述组合物含有浓缩液，其特征在于，将权利要求1-5任一项所述培养液经透析浓缩获得所述浓缩液。
7.根据权利要求6所述的化妆品组合物，其特征在于，所述浓缩液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含如下细胞生长因子：EGF含量超过40ng/ml，bFGF含量超过40ng/ml，TGF-β1含量超过20ng/ml，VEGF含量超过20ng/ml，FGF-1含量超过25ng/ml和SCF含量超过10ng/ml，PIP含量超过20ng/ml。
8.根据权利要求1-7所述的化妆品组合物，其特征在于，所述组合物还添加天然植物铁皮石斛、紫草提取物、寡肽3和肌肽。
9.一种面膜或精华液，其特征在于，其包括如下成分组成：
1)0.1-5wt％的权利要求1-6任一项所述培养液的浓缩液或权利要求7-8任一项所述的浓缩液；
2)基础乳化液，含0.1-5wt％铁皮石斛提取物、0.1-5wt％人参提取物、0.1-5wt％紫草提取物、0.1-2wt％寡肽3和0.1-2wt％肌肽。
10.一种培养液，其特征在于，使用铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1和紫草素培养人成体干细胞获得所述培养液；优选，所述培养液富含细胞生长因子；
优选，细胞生长因子包括：PIP、EGF、bFGF、TGF-β1、VEGF、FGF1、SCF。
优选，使用无血清培养基培养人成体干细胞获得所述培养液，所述无血清培养基含无血清添加物、铁皮石斛多糖、人参皂苷Rh1、紫草素和抗坏血酸；优选，所述无血清培养基含无血清添加物、1-500μg/ml铁皮石斛多糖、1-500μg/ml人参皂苷Rh1、1-500μg/ml紫草素和1-500μg/ml抗坏血酸；优选，所述培养液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含如下细胞生长因子：EGF含量超过10000pg/ml，bFGF含量超过10000pg/ml，TGF-β1含量超过4000pg/ml，VEGF含量超过4000pg/ml，FGF1含量超过2000pg/ml，SCF含量超过2000pg/ml，PIP含量超过1000pg/ml。
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