CN109620771B - 一种肌肤抗炎祛痘的化妆品组合物及其产品 - Google Patents

一种肌肤抗炎祛痘的化妆品组合物及其产品 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肌肤抗炎祛痘的化妆品组合物，其中，所述组合物包括使用白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙从组织中进行培养人T淋巴细胞，促进T淋巴细胞的不断增殖和细胞因子分泌，其培养获得的T淋巴细胞培养液，其富含细胞因子，具有肌肤抗炎祛痘的功效，成为肌肤抗炎祛痘的生物美容原料；可添加天然植物白花蛇舌草、金银花和白芍的提取物，其具有抑制皮肤炎症反应的作用，直接制备成抗炎祛痘精华液、面膜以及膏霜类化妆品等。

Description

一种肌肤抗炎祛痘的化妆品组合物及其产品
技术领域
本发明涉及一种肌肤抗炎祛痘的化妆品组合物及其制备的产品。特别地，本发明涉及使用白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙从组织中进行培养人T淋巴细胞，促进T淋巴细胞的增殖生长与细胞因子分泌，其培养获得的T淋巴细胞培养液，其富含细胞营养因子，具有肌肤抗炎祛痘的功效，可以制备成抗炎祛痘精华液、面膜、面霜和眼霜等产品，可用于皮肤青春痘、痤疮和痘印等修复和抗氧化。
背景技术
祛痘、去痤疮和痘印其实主要需要解决炎症的问题，炎症和痘痘可以说是形影不离。目前常用的药物，如外用的阿达帕林凝胶，可以改善痘印，预防痘坑的形成；夫昔地酸，有抗炎效果，可以外用减轻痘印等等；克林霉素：外用可以减轻痘印；其他：多磺酸粘多糖，可以减轻局部炎症，同时预防痘坑的形成。药物都具有见效慢，时间长等特点。根据中医辨证结合经络，给予耳尖放血治疗、夹脊穴刺络拔罐、中药熏蒸等治疗，可减轻面部炎症。痤疮病情持续周期长，不易诊治恢复，调理不当容易加重痘痘病情，造成皮肤敏感，干燥脱皮，红肿，刺痛等情况。很多祛痘产品，对于痘肤质不但没有改善修复作用，还容易刺激皮肤，引发复发痤疮。有些对青春痘及粉刺有较大改善作用的祛痘消炎产品，虽然能够轻微的改善痘痘肌肤质，但使用过量或是长期使用，就容易依赖产品，皮肤也会比从前干燥敏感。
本发明采用天然植物提取活性成分加入到人T淋巴细胞无血清培养基体系中进行扩增培养，促进了人T淋巴细胞大量表达和分泌细胞因子，而这些细胞因子为人源性T淋巴细胞表达和分泌，与人体具有很好的组织相容性，不会产生免疫排斥和过敏反应，同时具有很好生物学活性。
综上所述，本发明利用人T淋巴细胞表达和分泌的细胞生长因子，通过连续培养、浓缩后制备成化妆品原料，并添加天然植物白花蛇舌草、金银花和白芍的提取物组成化妆品组合物，制备成各类产品，将对皮肤青春痘、痤疮和痘印等产生更佳的抗炎祛痘作用。
发明内容
本发明为我们科研人员在筛选天然植物活性成分时，发现白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙能协同促进人T淋巴细胞增殖和分泌细胞生长因子；白花蛇舌草能够起到明显的抗感染作用，通过增强白细胞的吞噬功能以提升血清的杀菌力，调节炎症反应和影响白细胞分泌细胞因子水平，特别是促进了IL-27和IL-1RA的分泌；木犀草苷具有促进成体T淋巴细胞增殖和促进DNA合成和血清蛋白质合成作用，发现促进IL-4、IL-27、IL-13和MFG-E8的分泌；芍药甙是一种单萜类糖苷化合物，具有多种生物活性，如抗氧化、抗自由基损伤、抗血小板聚集、改善微循环、免疫调节等，增强了细胞因子IL-37、TGF-β1和MFG-E8的表达；三者在促进T淋巴细胞增殖与分化、细胞因子分泌具有很好的协同能力。白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙与T淋巴细胞共培养后促进表达和分泌的细胞因子，从而获得培养液。经过本发明科研人员长期人T淋巴细胞培养与美容应用的工作基础，发现人T淋巴细胞表达和分泌的细胞因子对皮肤的青春痘、痤疮和痘印等产生很好的消炎、抗氧化和修复等作用，而且联合美容物理疗法将产生更好功效。本发明通过添加白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙进行培养人T淋巴细胞的培养液经超浓缩后制备成人T淋巴细胞精华液，富含细胞因子成分，具有抗炎祛痘的功效。这些细胞生长因子主要包括：白介素1RA、白介素4、白介素10、白介素13、白介素27、白介素37、乳脂球表皮生长因子-8等，特别是含有白介素1RA和乳脂球表皮生长因子-8。
白介素1RA为机体过量分泌的炎症因子IL-1引起组织器官损伤的主要抑制剂，能够特异性地抑制炎症，截断炎症产生的途径，弱化炎症反应；维持真皮层细胞正常生理环境，抑制受损细胞与表皮细胞的粘附，防止炎症在细胞间的扩散，促进受损细胞代谢自然剥落，恢复皮肤健康；同时能够抑制皮肤组织产生可激发炎症的毒素成分(如脂多糖等)；对免疫复合物所诱导的炎症反应同样具有缓解功效。同时我们发现IL-1RA具有降低痤疮部位细胞炎性反应程度，缓解痤疮；降低皮肤敏感性，抑制已形成皮肤炎症进程；抑制皮损部位炎症进程，调理皮肤生理环境。
乳脂球表皮生长因子-8(milk fat globule EGF factor VIII，MFG-E8)是一种乳汁脂肪小球表面的亲脂性糖蛋白，广泛参与多种细胞间的相互作用，如参与肠上皮细胞的维持与修复、促进乳腺支化形成和成人组织新生血管形成、增强树突状细胞外泌体功能以及参与吞噬清除凋亡细胞的过程，研究表明MFG-E8对糖尿病皮肤损伤的愈合起到重要调节作用，另外MFG-E8可以抑制M2型抗炎巨噬细胞向M1型促炎性巨噬细胞转化，进而抑制局部炎症，减少过度炎症对伤口愈合的影响；同时MFG-E8可增强血管内皮生长因子的活性，促进血管形成，有助于伤口的愈合。
本发明提供了一种肌肤抗炎祛痘的化妆品组合物，其中，所述组合物包括使用白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙从组织中培养人T淋巴细胞，促进成体T淋巴细胞的增殖生长与分泌细胞因子，其培养获得的培养液，其富含细胞因子，具有肌肤抗炎祛痘的功效；可添加天然植物白花蛇舌草、金银花和白芍提取物，成为皮肤祛皱修复的生物美容原料。
本发明提供的人T淋巴细胞为废弃脐带来源的白细胞、自体外周血、骨髓来源T淋巴细胞，优选地，为自体外周血来源的T淋巴细胞。使用细胞培养袋进行大规模传代培养，获得大量T淋巴细胞培养液。
一种化妆品组合物，所述组合物含有培养液，其特征在于，使用白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙培养人T淋巴细胞获得所述培养液；所述培养液富含细胞生长因子。
如上所述的化妆品组合物，其特征在于，细胞生长因子包括：IL-1RA、IL-4、IL-10、IL-13、IL-27、IL-37、TGF-β1、MFG-E8。
如上所述的化妆品组合物，其特征在于，使用无血清培养基培养人T淋巴细胞获得所述培养液，所述无血清培养基含无血清添加物、白花蛇舌草提取物、木犀草苷、芍药甙和白介素10。
如上所述的化妆品组合物，所述无血清培养基含无血清添加物、0.1-200μg/ml白花蛇舌草提取物、0.1-200μg/ml木犀草苷、0.1-200μg/ml芍药甙和1-200ng/ml白介素10。
如上所述的化妆品组合物，其特征在于，所述培养液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含如下细胞生长因子：IL-1RA含量超过1000pg/ml、IL-4含量超过4000pg/ml、IL-10含量超过6000pg/ml、IL-13含量超过2000pg/ml、IL-27含量超过3000pg/ml、IL-37含量超过3000pg/ml、TGF-β1含量超过4000pg/ml、MFG-E8含量超过2000pg/ml。
一种化妆品组合物，所述组合物含有浓缩液，其特征在于，将如上所述培养液经透析浓缩获得所述浓缩液。
如上所述的化妆品组合物，其特征在于，所述浓缩液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含如下细胞因子IL-1RA含量超过10ng/ml、IL-4含量超过40ng/ml、IL-10含量超过60ng/ml、IL-13含量超过20ng/ml、IL-27含量超过30ng/ml、IL-37含量超过30ng/ml、TGF-β1含量超过30ng/ml、MFG-E8含量超过20ng/ml。
如上所述的化妆品组合物，其特征在于，所述组合物还添加天然植物白花蛇舌草、金银花和白芍提取物。
一种面膜或精华液，其特征在于，其包括如下成分组成：
1)0.1-5wt％的所述培养液的浓缩液；
2)基础乳化液，含0.1-5wt％白花蛇舌草提取物、0.1-5wt％金银花提取物、0.1-5wt％白芍提取物。
一种培养液，其特征在于，使用白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙培养人T淋巴细胞获得所述培养液；优选，所述培养液富含细胞生长因子；优选，细胞生长因子包括：IL-4、IL-10、IL-13、IL-27、IL-37、TGF-β1、IL-1RA、MFG-E8。优选，使用无血清培养基培养人T淋巴细胞获得所述培养液，所述无血清培养基含无血清添加物、白花蛇舌草提取物、木犀草苷、芍药甙和白介素10；优选，所述无血清培养基含无血清添加物、0.1-200μg/ml白花蛇舌草提取物、0.1-200μg/ml木犀草苷、0.1-200μg/ml芍药甙和1-200ng/ml白介素10；优选，所述培养液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含如下细胞因子IL-1RA含量超过1000pg/ml、IL-4含量超过4000pg/ml、IL-10含量超过6000pg/ml、IL-13含量超过2000pg/ml、IL-27含量超过3000pg/ml、IL-37含量超过3000pg/ml、TGF-β1含量超过4000pg/ml、MFG-E8含量超过2000pg/ml。
一种培养液，其制备方法包括如下步骤，
(1)通过培养人T淋巴细胞获得培养液；
优选地，进一步包括
(2)将蛋白悬液经超浓缩后制备成浓缩液；
优选地，进一步包括
(3)将浓缩液制备成人T淋巴细胞精华液；
优选地，进一步包括
(4)将所述人T淋巴细胞精华液，加入从白花蛇舌草、金银花和白芍中提取的活性成分；
其中，所述步骤(1)中使用无血清培养基，优选其含无血清添加物、0.1-200μg/ml白花蛇舌草提取物、0.1-200μg/ml木犀草苷、0.1-200μg/ml芍药甙和1-200ng/ml白介素10；
所述浓缩液或T淋巴细胞精华液可为肌肤抗炎祛痘的生物美容原料；
其中，所述人T淋巴细胞培养液、含人T淋巴细胞裂解液的培养液及其浓缩液均富含如下细胞生长因子：IL-4、IL-10、IL-13、IL-27、IL-37、TGF-β1、IL-1RA、MFG-E8等，优选地分泌IL-1RA和MFG-E8。
优选地，所述人T淋巴细胞来源人外周血，经淋巴细胞分离液分离纯化获得单个核细胞在无血清培养基培养条件下，原代培养获得T淋巴细胞，在75cm2培养瓶中从50ml体系起始增殖培养，培养3-4天后转移至细胞培养袋中，扩增到100ml进行培养；间隔3-4天继续扩增培养到第21天，收集其培养液并获得T淋巴细胞；共收集超过5L的培养液。
一次处理200ml外周血可获得4×1010的T淋巴细胞，通过上述大规模传代培养后可获得超过20L T淋巴细胞培养液。
优选地，所述的无血清培养基含无血清添加物、0.1-200μg/ml白花蛇舌草提取物、0.1-200μg/ml木犀草苷、0.1-200μg/ml芍药甙和1-200ng/ml白介素10，我们发现可以促进细胞因子的分泌和表达，提高细胞因子的含量，特别是促使了IL-1RA和MFG-E8的表达。
将获得1L培养过人T淋巴细胞的培养液通过100-1000分子量的透析袋进行透析浓缩，或者通过100-1000分子量的醋酸纤维素膜进行超滤浓缩，浓缩1-10倍，获得100ml-500ml浓缩液。
优选地，本发明制备的人T淋巴细胞培养液及其浓缩液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含细胞生长因子，即：所述人T淋巴细胞培养液含IL-1RA含量超过1000pg/ml、IL-4含量超过4000pg/ml、IL-10含量超过6000pg/ml、IL-13含量超过2000pg/ml、IL-27含量超过3000pg/ml、IL-37含量超过3000pg/ml、TGF-β1含量超过4000pg/ml、MFG-E8含量超过2000pg/ml。
优选地，所述浓缩液中所述浓缩液中IL-1RA含量超过10ng/ml、IL-4含量超过40ng/ml、IL-10含量超过60ng/ml、IL-13含量超过20ng/ml、IL-27含量超过30ng/ml、IL-37含量超过30ng/ml、TGF-β1含量超过40ng/ml、MFG-E8含量超过20ng/ml。
优选地为选择人T淋巴细胞培养液的浓缩液作为化妆品原料。
本发明所述的人T淋巴细胞培养液或浓缩液加入到人中性粒细胞中进行培养，抑制了活性氧和白三烯B4的产生，从而减轻了中性粒细胞产生的炎症损伤作用；添加到人皮肤成纤维细胞HSF2中进行培养，通过细胞增殖检测试剂盒CCK-8检测，增殖速度比未加入培养液显著提高；促进了成纤维细胞的增殖。通过蛋白印迹分析，HSF2表达胶原蛋白Iα1和胶原蛋白IIα1的量比未加入培养液的要高出1-10倍；提高了人皮肤成纤维细胞表达胶原蛋白。
本发明提供的人T淋巴细胞培养液浓缩液，可以作为生物美容原料，添加到面霜、润肤露和爽肤水等化妆品中生产成相关产品。
本发明提供的一种人T淋巴细胞来源的祛皱修复美容面膜，其特征在于，其由如下成分组成：
1)0.1-5％上述人T淋巴细胞培养液的浓缩液；
2)基础乳化液，含0.1-5％白花蛇舌草提取物、0.1-5％金银花提取物、0.1-5％白芍提取物；
3)面膜原材料：无纺布、生物纤维膜、蚕丝膜或水凝胶膜；
其制备方法为，将取T淋巴细胞浓缩液加入到面膜基础乳化液中混匀，再灌装到锡箔纸袋中，热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为1个月。
优选地，选择蚕丝膜或水凝胶膜作面膜原材料。
本发明提供的一种人T淋巴细胞来源的祛皱修复美容精华液，其特征在于，其由如下成分组成：
取如上所述0.1-5％的人T淋巴细胞培养液的浓缩液与精华液基料(含0.1-5％白花蛇舌草提取物、0.1-5％金银花提取物、0.1-5％白芍提取物)，混匀后装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤祛皱修复精华液。
装盒包装后形成产品，保存在4℃条件下，保质期为1个月。
通过本发明的方法，通过获取的人T淋巴细胞培养液及其浓缩液富含细胞生长因子，可以制备成面霜、润肤露、爽肤水、面膜和精华液等产品，能够对皮肤具有皱纹、色斑和瘢痕等除皱、祛斑和修复等美容作用。特别当联合物理美容疗法使用时，将产生更佳的美容疗效，即高温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为细胞因子进入皮肤的通道。
附图说明
图1表示由实施例1所制备人T淋巴细胞的培养液中各细胞因子分泌水平图
图2表示为人中性粒细胞在由实施例1所制备人T淋巴细胞的培养液中培养时活性氧的水平
图3表示为人中性粒细胞在由实施例1所制备人T淋巴细胞的培养液中培养时白三烯B4的水平
图4表示由实施例2所制备的T淋巴细胞培养浓缩液对人成纤维细胞HSF2CCK-8检测增殖曲线图
图5表示实施例2所制备的T淋巴细胞培养浓缩液对人成纤维细胞HSF2表达胶原蛋白Iα1和胶原蛋白IIα1的灰度结果比较图
具体实施方式
本发明提供了一种肌肤抗炎祛痘的化妆品组合物，其中，所述组合物包括使用白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙从组织中培养人T淋巴细胞，促进成体T淋巴细胞的蛋白质合成与分泌，其培养获得的培养液，其富含细胞因子，具有肌肤抗炎祛痘的功效；可添加天然植物白花蛇舌草、金银花和白芍的提取物，成为皮肤祛皱修复的生物美容原料。
所述人T淋巴细胞为废弃脐带血、外周血、骨髓来源T淋巴细胞等，优选地，为外周血的T淋巴细胞，使用细胞培养袋进行大规模扩增培养，获得大量T-LYM细胞液。
所述人T淋巴细胞来源捐献的外周血，经淋巴细胞分离液密度梯度离心，获得外周血单个核细胞在50ml无血清培养基(含无血清添加物、0.1-200μg/ml白花蛇舌草提取物、0.1-200μg/ml木犀草苷、0.1-200μg/ml芍药甙和1-200ng/ml白介素10)中，37℃、5％CO2培养箱中原代培养获得T淋巴细胞，再进行扩增培养。从在75cm2培养瓶中从50ml体系起始增殖培养，培养3-4天后转移至细胞培养袋中，扩增到100ml进行培养；间隔3-4天继续扩增培养到第21天，收集其培养液并获得T淋巴细胞；共收集超过5L的培养液。
一次处理200ml外周血可获得4×1010的T淋巴细胞，通过上述大规模传代培养后可获得超过20L T淋巴细胞培养液。
本发明使用的细胞培养基为无血清培养基，如KBM 581、X-VIVO 15TM、
Figure BSA0000175981640000081
CTSTM和GT-T551 H3等商品化产品。
优选地，所述的T-LYM无血清培养基含无血清添加物、0.1-200μg/ml白花蛇舌草提取物、0.1-200μg/ml木犀草苷、0.1-200μg/ml芍药甙和1-200ng/ml白介素10。
本发明使用细胞培养瓶为商品化产品，如美国Corning公司、美国Falcon公司和无锡耐斯特公司等，细胞培养袋为美国GiBCO公司、日本TAKARA公司和德国美天旎公司等。
将获得1L培养过人T淋巴细胞的培养液通过100-1000分子量的透析袋进行透析浓缩，或者通过100-1000分子量的醋酸纤维素膜进行超滤浓缩，浓缩1-10倍，获得100ml-500ml浓缩液。
本发明制备的人T淋巴细胞培养液及其浓缩液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含细胞生长因子，即：IL-4含量超过4000pg/ml、IL-10含量超过6000pg/ml、IL-13含量超过2000pg/ml、IL-27含量超过3000pg/ml、IL-37含量超过3000pg/ml、TGF-β1含量超过4000pg/ml，优选地，IL-1RA含量超过1000pg/ml、MFG-E8含量超过2000pg/ml。
优选地，所述浓缩液中所述浓缩液中IL-4含量超过40ng/ml、IL-10含量超过60ng/ml、IL-13含量超过20ng/ml、IL-27含量超过30ng/ml、IL-37含量超过30ng/ml、TGF-β1含量超过40ng/ml，优选地，IL-1RA含量超过10ng/ml，MFG-E8含量超过20ng/ml。
优选地为选择人T淋巴细胞培养液的浓缩液作为美容原料。
本发明的5％人T淋巴细胞培养液或1％的浓缩液加入到人中性粒细胞中进行培养，抑制了活性氧和白三烯B4的产生，从而减轻了中性粒细胞产生的炎症损伤作用。
本发明的5％人T淋巴细胞培养液或1％的浓缩液添加到人皮肤成纤维细胞HSF2中进行培养，通过细胞增殖检测试剂盒CCK-8检测，增殖速度比未加入培养液显著提高；促进了成纤维细胞的增殖。通过蛋白印迹分析，HSF2表达胶原蛋白Iα1和胶原蛋白IIα1的量比未加入培养液的要高出1-10倍；提高了人皮肤成纤维细胞表达胶原蛋白。
本发明提供的人T淋巴细胞培养液浓缩液，可以作为生物美容原料，添加到面霜、润肤露和爽肤水等化妆品中生产成相关产品，即取1ml浓缩液加入到50ml面霜、润肤露和爽肤水等中混匀即可。
本发明提供的一种人T淋巴细胞来源的祛皱修复美容面膜，其特征在于，其由如下成分组成：
1)0.1-5％所述人T淋巴细胞培养液的浓缩液；
2)基础乳化液，含0.1-5％白花蛇舌草提取物、0.1-5％金银花提取物、0.1-5％白芍提取物；
3)面膜原材料：无纺布、生物纤维膜、蚕丝膜或水凝胶膜；
其制备方法为，将取T淋巴细胞浓缩液加入到面膜基础乳化液中混匀，再灌装到锡箔纸袋中，热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为1个月。
优选地，选择蚕丝膜或水凝胶膜作面膜原材料。
本发明提供的一种人T淋巴细胞来源的祛皱修复美容精华液，其特征在于，其由如下成分组成：
取如上所述0.1-5％的人T淋巴细胞培养液的浓缩液与精华液基料(含0.1-5％白花蛇舌草提取物、0.1-5％金银花提取物、0.1-5％白芍提取物)，混匀后装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤祛皱修复精华液。
装盒包装后形成产品，保存在4℃条件下，保质期为1个月。
本发明提供了通过获取的人T淋巴细胞培养液及其浓缩液富含细胞生长因子，可以制备成面霜、润肤露、爽肤水、面膜和精华液等产品，能够对皮肤具有除皱、祛斑、填充和修复等美容作用。本发明还提供了联合物理美容疗法使用，即高温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为细胞因子进入皮肤的通道，将产生更佳的美容疗效。
以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。
实施例1 人外周血T淋巴细胞的培养
收集健康捐献者人外周血200ml(签署知情同意书)，经淋巴细胞分离液进行分离纯化获得6.1×108个单个核细胞，在150ml
Figure BSA0000175981640000101
CTSTM无血清培养基(含1倍无血清添加物、20μg/ml白花蛇舌草提取物、10μg/ml木犀草苷、10μg/ml芍药甙和20ng/ml白介素10)中，37℃、5％CO2培养箱中，50ml培养体系，75cm2培养瓶中培养T淋巴细胞。
当T淋巴细胞培养第3-4天，转移至细胞培养袋中，扩增到100ml进行培养；此后间隔3-4天继续扩增培养，补充1倍体积新鲜无血清培养基，连续培养到第21天，收集其培养液并获得T淋巴细胞；共收集5.6L的培养液。
一次处理200ml外周血可获得4.48×1010的T淋巴细胞，通过上述大规模传代培养后可获得超过22.4L T淋巴细胞培养液。
实施例2 人T淋巴细胞来源美容原料制备
将人T淋巴细胞培养液加入到500分子量的透析袋(美国光谱公司)中，放置冰箱冷藏中进行透析浓缩，体积浓缩5倍。
另外，也可以将人T淋巴细胞的培养液使用500分子量的醋酸纤维素膜(美国光谱公司)进行超滤浓缩，体积浓缩5倍。
实施例3 人T淋巴细胞中细胞因子表达与分泌水平检测
取实施例1中制备的人T淋巴细胞培养液及其浓缩液经ELISA试剂盒(美国ebioscience公司)检测其中细胞因子分泌水平，使用步骤参照使用说明书。
实验分组如下：
实验组A：使用无植物活性提取物培养人T淋巴细胞，即
Figure BSA0000175981640000111
CTSTM无血清培养基(含1倍无血清添加物和20ng/ml白介素10)，获得培养液；
实验组B：使用含白花蛇舌草提取物培养人胎盘多能T淋巴细胞，即
Figure BSA0000175981640000112
CTSTM无血清培养基(含1倍无血清添加物、40μg/ml白花蛇舌草提取物和20ng/ml白介素10)，获得培养液；
实验组C：使用含木犀草苷培养人胎盘多能T淋巴细胞，即
Figure BSA0000175981640000113
CTSTM无血清培养基(含1倍无血清添加物、40μg/m木犀草苷和20ng/ml白介素10)，获得培养液；
实验组D：使用含芍药甙培养人胎盘多能T淋巴细胞，即
Figure BSA0000175981640000114
CTSTM无血清培养基(含1倍无血清添加物、40μg/ml芍药甙和20ng/ml白介素10)，获得培养液；
实验组E：使用含芍药甙培养人胎盘多能T淋巴细胞，即
Figure BSA0000175981640000115
CTSTM无血清培养基(含1倍无血清添加物、20μg/ml白花蛇舌草提取物、20μg/m木犀草苷和20ng/ml白介素10)，获得培养液；
实验组F：使用含芍药甙培养人胎盘多能T淋巴细胞，即
Figure BSA0000175981640000116
CTSTM无血清培养基(含1倍无血清添加物、20μg/ml白花蛇舌草提取物、、20μg/ml芍药甙和20ng/ml白介素10)，获得培养液；
实验组G：使用含芍药甙培养人胎盘多能T淋巴细胞，即
Figure BSA0000175981640000117
CTSTM无血清培养基(含1倍无血清添加物、20μg/m木犀草苷、20μg/ml芍药甙和20ng/ml白介素10)，获得培养液；
实验组H：通过实施例1方法培养人胎盘多能T淋巴细胞，即
Figure BSA0000175981640000118
CTSTM无血清培养基(含1倍无血清添加物、20μg/ml白花蛇舌草提取物、10μg/ml木犀草苷、10μg/ml芍药甙和20ng/ml白介素10)，获得培养液；
表1中为实验各组中人T淋巴细胞的培养液中各细胞因子表达和分泌水平，所述单位为ng/ml。
表1
Figure BSA0000175981640000121
表1中显示人T淋巴细胞在无天然植物提取物培养下获得培养液比其他含有天然植物提取物培养获得培养液分泌的细胞因子均显著下降，而在分别含有白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙培养获得的培养液中分泌的细胞因子均比在三者均含有条件下培养要明显低下，在含有白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙三者联合培养获得培养液以及浓缩液中，均分泌高水平的细胞因子，其中细胞浓缩液中进一步提高了细胞因子浓度，表明白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙三者联合培养协同促进了细胞生长因子的分泌；将更有助于这些细胞因子在皮肤美容方面将发挥抗炎祛痘的作用。特别发现在细胞培养液中高表达细胞因子IL-1RA和MFG-E8，其在功能上具有抑制了炎症反应而增强了皮肤修复的作用。
人T淋巴细胞的培养液与对比例进行比较，即Craig T.Lefort和Minsoo Kim发表在2010年六月的《直观性实验杂志》的体外人T淋巴细胞分离、培养和迁移分析中的培养条件，即Craig T.Lefort and Minsoo Kim.Human T Lymphocyte Isolation，Culture andAnalysis of Migration In Vitro.J Vis Exp.2010；(40)：2017.所报道的方法进行培养人T淋巴细胞，获得的培养基与本发明获得人T淋巴细胞的培养液，检测分析分泌细胞因子的水平。
图1为人T淋巴细胞的培养液中各细胞因子分泌水平图，与对比例技术获得培养液相比，本发明人T淋巴细胞具有很好的细胞因子分泌水平，IL-4、IL-10、IL-13、IL-27、IL-37、TGF-β1、IL-1RA、MFG-E8均明显高于对比例培养获得的培养液，均具有显著的差异(*P≤0.05，**P≤0.01)，尤其是IL-10、IL-13、IL-1RA、MFG-E8分泌水平更为明显。
实施例4 人T淋巴细胞培养液对中性粒细胞的作用分析
取正常健康人外周血50ml(捐献者，签署知情同意书)，使用人中性粒细胞分离试剂盒(购买美国GE公司)进行分离纯化，得到人中性粒细胞，分为两组进行培养，即A组在RMPI 1640培养基(含10％胎牛血清和1μg/ml脂多糖)条件下，1×106/ml，3ml/孔6孔板中进行培养；B组为RMPI 1640培养基(含10％胎牛血清和1μg/ml脂多糖)添加5％实施例1制备的人T淋巴细胞培养液，与A组一样进行培养；C组为RMPI1640培养基(含10％胎牛血清和1μg/ml脂多糖)添加1％实施例2制备的浓缩液，与A组一样进行培养。
使用活性氧(ROS)检测试剂盒(购买南京建成生物工程研究所)进行检测活性氧水平，收集上述每组1×106个细胞，使用1×PBS(pH7.4)洗涤两次，加入含10μM DCFH-DA的RPMI 1640在37℃刺激20min，每5分钟轻轻振荡一次，1000转每分钟离心5分钟后弃上清，使用无血清的RPMI 1640洗涤三次，收集细胞后加入500μl无血清RPMI 1640培养重悬，通过流式细胞仪(FACSAria II，美国BD公司)检测DCFH荧光强度。图2所示为人中性粒细胞在本发明制备的人T淋巴细胞培养液中培养时活性氧的水平，在无添加本发明制备的人T淋巴细胞培养液或浓缩液时活性氧检测的DCFH荧光强度显著高于添加了人T淋巴细胞培养液的；结果表明人T淋巴细胞培养液抑制了活性氧的产生，而活性氧产生过度，引起中性粒细胞自身炎症反应，抵抗病菌能力紊乱而对机体产生损伤。
针对本发明制备的人T淋巴细胞培养液中分泌的细胞因子，分别分析其对中性粒细胞活性氧产生水平的影响，即在中性粒细胞培养过程中分别添加100ng/ml重组细胞因子(美国Peprotech公司购买)，通过活性氧(ROS)检测试剂盒进行检测活性氧水平，流式细胞仪检测DCFH荧光强度结果见表2。
表2
Figure BSA0000175981640000131
Figure BSA0000175981640000141
表2中结果可以发现分别添加了IL-27、IL-37、TGF-β1、IL-1RA和MFG-E8培养中性粒细胞，均抑制了活性氧的产生，具有明显的差异(*P≤0.05)，其中MFG-E8最为显著(**P≤0.01)，可以有效地抑制局部炎症，减少过度炎症对伤口愈合的影响；促进血管形成，有效地抑制了对皮肤成纤维细胞或表皮细胞凋亡和损伤的作用。
取上述每组实验中的细胞培养上清，使用白三烯B4检测试剂盒(购买上海超研生物科技有限公司)检测白三烯B4含量，实验步骤按照使用说明书进行操作，使用酶标仪(美国Bio-Rad公司)上机检测。图3所示为人中性粒细胞在本发明制备的人T淋巴细胞培养液中培养时白三烯B4的水平，在无添加本发明制备的人T淋巴细胞培养液或浓缩液时白三烯B4含量显著高于添加了人T淋巴细胞培养液的；白三烯B4是反映机体中性粒细胞炎症反应的关键指标，结果表明人T淋巴细胞培养液抑制了白三烯B4的产生，而白三烯B4产生过高反映中性粒细胞炎症反应提高，促进了炎症损伤作用。
进一步针对本发明制备的人T淋巴细胞培养液中分泌的细胞因子，分别分析其对中性粒细胞白三烯B4产生水平的影响，即在中性粒细胞培养过程中分别添加100ng/ml重组细胞因子(美国Peprotech公司购买)，通过白三烯B4检测试剂盒进行检测，酶标仪检测白三烯B4含量见表3。
表3
Figure BSA0000175981640000142
Figure BSA0000175981640000151
表3中结果可以发现分别添加了IL-13、IL-27、IL-37、IL-1RA和MFG-E8培养中性粒细胞，均抑制了白三烯B4的产生，具有明显的差异(*P≤0.05)，其中IL-1RA最为显著(**P≤0.01)，可以有效地降低细胞炎性反应程度，降低皮肤敏感性和调理皮肤生理环境。
实施例4人T淋巴细胞培养液对成纤维细胞的作用
取人成纤维细胞HSF2(来源于美国Sciencell)，分为两组进行培养，即A组在DMEM高糖培养基(含10％胎牛血清)条件下，2×103/孔，96孔板中分别进行培养；B组为DMEM高糖培养基(含10％胎牛血清)添加1％实施例2制备的浓缩液，与A组一样进行培养，然后通过细胞增殖检测试剂盒CCK-8(上海碧云天公司)进行分析，使用酶标仪(美国Bio-Rad公司)，在450nm波长下检测。
图4为人成纤维细胞HSF2在含有T淋巴细胞培养浓缩液和未含有其的DMEM高糖培养基中细胞增殖速度的对比。人成纤维细胞HSF2在连续7天CCK-8检测增殖曲线，结果所示细胞在含有本发明的T淋巴细胞培养浓缩液中增殖速度均显著高于比未加入浓缩液(**P≤0.01)；表明T淋巴细胞培养浓缩液具有促进成纤维细胞显著增殖的能力，提高了成纤维细胞生长。
同样取人成纤维细胞HSF2，分为两组进行培养，即A组在DMEM高糖培养基(含10％胎牛血清)条件下，1×105/ml，10ml，在75cm2培养瓶中分别进行培养；B组为DMEM高糖培养基(含10％胎牛血清)添加1％实施例2制备的浓缩液，与A组一样进行培养，即在37℃，5％CO2培养箱中培养3天，然后用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)进行消化，获得培养的成纤维细胞HSF2。
使用蛋白印迹分析进行检测，蛋白抽提：2-5×106个HSF2细胞悬液分别1000rpm离心10分钟，弃培养液，PBS清洗3次。根据细胞量加入相应的抽提缓冲液，冰上轻摇15min。收集裂解液到EP管中，14,000rpm离心15min。取上清到新的EP管中。蛋白样品浓度测定：参照美国Bio-RAD公司购买的BCA蛋白定量试剂盒说明书进行。将提取好样品的蛋白溶液和5×上样缓冲液按5∶1混合，煮沸5min。配制5％积沉胶，8％分离胶，每孔上样量约为10ng。电泳：80V恒压50分钟，120V恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部止，PVDF膜甲醇预处理3～5秒，放至转印液浸润半小时。取出凝胶，将其放至滤纸上，形成凝胶转印堆积层并去除气泡。低温条件下(4℃)，100V恒压60～120分钟。取出杂交膜，TBST漂洗5分钟，三次；5％脱脂奶粉溶液室温封闭1小时；TBST洗膜5min，三次。加入合适的一抗稀释浓度(Anti-Col Iα1 antibody(1∶1000)，Anti-Col IIα1 antibody(1∶1000)，ACTIN作为参照蛋白，4℃过夜。TBST洗膜5min，三次；二抗稀释液37℃孵育1h；TBST洗膜5min，三次；蒸馏水漂洗膜2min，弃去液体。共洗三次。将杂交膜置于一个透明塑料板上，用干净移液器将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，并使反应持续5min。用滤纸吸去膜表面多余的ECL发光液，暗室中用胶片显影，定影，并拍照。通过软件Image J分析蛋白印迹进行灰度分析。
图5中为通过Western blotting检测的胶原蛋白表达灰度分析结果，显示在含有本发明的T淋巴细胞培养浓缩液中培养的HSF2细胞均高表达胶原蛋白Iα1和胶原蛋白IIα1，与不含有的HSF2细胞相比，具有显著差异(**P≤0.01)。HSF2细胞在含浓缩液中表达胶原蛋白Iα1和胶原蛋白IIα1分别高于不含浓缩液的为6.17倍和4.20倍。表明本发明的T淋巴细胞培养液对人成纤维细胞均促使胶原蛋白Iα1和胶原蛋白IIα1的高表达。
实施例5 制备人T淋巴细胞培养液的美容产品
制备含人T淋巴细胞培养液的祛皱修复美容面膜，如下成分组成：
1)实施例2制备1％的人T淋巴细胞培养液的浓缩液；
2)基础乳化液，含1％白花蛇舌草提取物、0.5％金银花提取物、1％白芍提取物；
3)水凝胶膜；
将1％的人T淋巴细胞培养液的浓缩液在基础乳化液中混匀后，装入25ml锡箔纸袋中，放入1张水凝胶膜，然后热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为1个月。
制备含人T淋巴细胞培养液的祛皱修复美容精华液，由如下成分组成：
取实施例2制备的1％人T淋巴细胞养液的浓缩液，加入到精华液基料(含1％白花蛇舌草提取物、0.5％金银花提取物、1％白芍提取物、)，混匀后装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤祛皱修复精华液。
装盒包装后形成产品，保存在4℃条件下，保质期为1个月。

Claims (10)

1.一种化妆品组合物，所述组合物含有培养液，其特征在于，使用白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙协同培养人T淋巴细胞获得所述培养液；所述培养液富含细胞因子；
所述细胞因子包括：IL-1RA、IL-4、IL-10、IL-13、IL-27、IL-37、TGF-β1、MFG-E8；
所述培养液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含如下含量的细胞生长因子：IL-1RA含量超过1000pg/ml、IL-4含量超过4000pg/ml、IL-10含量超过6000pg/ml、IL-13含量超过2000pg/ml、IL-27含量超过3000pg/ml、IL-37含量超过3000pg/ml、TGF-β1含量超过3000pg/ml、MFG-E8含量超过2000pg/ml。
2.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，使用白花蛇舌草提取物、木犀草苷、芍药甙和白介素10培养人T淋巴细胞获得所述培养液。
3.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，所述培养液为无血清培养基，含无血清添加物、0.1-200μg/ml白花蛇舌草提取物、0.1-200μg/ml木犀草苷、0.1-200μg/ml芍药甙。
4.根据权利要求3所述的化妆品组合物，其特征在于，所述培养液为无血清培养基，含无血清添加物、0.1-200μg/ml白花蛇舌草提取物、0.1-200μg/ml木犀草苷、0.1-200μg/ml芍药甙和1-200ng/ml白介素10。
5.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，所述组合物含有浓缩液，将所述培养液经透析浓缩获得所述浓缩液。
6.根据权利要求5所述的化妆品组合物，其特征在于，所述浓缩液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含如下含量的细胞生长因子：IL-1RA含量超过10ng/ml、IL-4含量超过40ng/ml、IL-10含量超过60ng/ml、IL-13含量超过20ng/ml、IL-27含量超过30ng/ml、IL-37含量超过30ng/ml、TGF-β1含量超过30ng/ml、MFG-E8含量超过20ng/ml。
7.根据权利要求1-6任一项所述的化妆品组合物，其特征在于，所述组合物还添加天然植物白花蛇舌草、金银花和白芍提取物。
8.一种面膜或精华液，其特征在于，其包括如下成分组成：
1)0.1-5wt％的权利要求1-6任一项中所述培养液的浓缩液；
2)基础乳化液，含0.1-5wt％白花蛇舌草提取物、0.1-5wt％金银花提取物、0.1-5wt％白芍提取物。
9.一种培养液或浓缩液，其特征在于，
其中，使用白花蛇舌草提取物、木犀草苷和芍药甙协同培养人T淋巴细胞获得所述培养液；所述培养液富含细胞因子；
所述细胞因子包括：IL-1RA、IL-4、IL-10、IL-13、IL-27、IL-37、TGF-β1、MFG-E8；
所述培养液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含如下细胞生长因子：IL-1RA含量超过1000pg/ml、IL-4含量超过4000pg/ml、IL-10含量超过6000pg/ml、IL-13含量超过2000pg/ml、IL-27含量超过3000pg/ml、IL-37含量超过3000pg/ml、TGF-β1含量超过3000pg/ml、MFG-E8含量超过2000pg/ml；
其中，将所述培养液经透析浓缩获得所述浓缩液；
所述浓缩液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含如下细胞生长因子：IL-1RA含量超过10ng/ml、IL-4含量超过40ng/ml、IL-10含量超过60ng/ml、IL-13含量超过20ng/ml、IL-27含量超过30ng/ml、IL-37含量超过30ng/ml、TGF-β1含量超过30ng/ml、MFG-E8含量超过20ng/ml。
10.权利要求9所述培养液或浓缩液在化妆品组合物中的应用。
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