CN117797055A

CN117797055A - 一种改善皮肤老化的复方精油和含有其的护肤品组合物

Info

Publication number: CN117797055A
Application number: CN202410223978.8A
Authority: CN
Inventors: 缪晓; 袁利民; 赵培; 黄织雅
Original assignee: Jiangxi Ruixiu Lang Technology Co ltd
Current assignee: Jiangxi Ruixiu Lang Technology Co ltd
Priority date: 2024-02-29
Filing date: 2024-02-29
Publication date: 2024-04-02

Abstract

本发明提供了一种改善皮肤老化的复方精油和含有其的护肤品组合物，该复方精油包含以下单方精油：杜鹃花精油、白玉兰花精油、银杏叶精油和白茶精油，体积比为3:2:2:3，该护肤品组合物包含上述复方精油及护肤品可接受的辅料和/或赋形剂。本发明的复方精油具有抗皮肤衰老和美白皮肤的功效。

Description

一种改善皮肤老化的复方精油和含有其的护肤品组合物

技术领域

本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种改善皮肤老化的复方精油和含有其的护肤品组合物。

背景技术

皮肤老化是指皮肤功能衰老的状态，可分为内源性老化和外源性老化。内源性老化是指皮肤随年龄增长出现的自然老化，皮肤表现为皱纹增多、皮肤松弛、弹性减退等。外源性老化是指由环境因素导致的皮肤衰老，特别是紫外线所致的光老化，造成光老化的主要是UVA（长波紫外线，波长320-400nm）和UVB（中波紫外线，波长280-320nm），其中UVB主要被表皮层和真皮层乳头层吸收，引起皮肤红斑、皱纹的形成；UVA可穿透至皮肤基底层和真皮层，诱导黑色素细胞分泌黑色素，导致皮肤色素沉着不均、皮肤变黑。延缓皮肤老化对维持人们的心理健康和皮肤的正常生理功能具有重要意义。

氧化应激是细胞和组织中活性氧（ROS）产生和积累与生物系统对这些活性产物进行代谢的能力之间失衡引起的现象，是机体产生的一种应激反应。皮肤中存在多种抗氧化防御系统，它们集中在表皮，主要是来清除自由基，使自由基在体内保持平衡，如若自由基过量，蛋白质、酶、细胞膜、核酸等生物大分子被过氧化作用攻击，形成不饱和脂肪酸，导致生物酶活性降低，DNA发生突变，细胞功能受损。因此清除自由基可以达到缓解皮肤老化的目的。

皮肤老化时真皮层的结构发生了巨大改变，主要是真皮成纤维细胞的数量减少，细胞外基质中的胶原蛋白和弹性蛋白合成能力下降，特别是I型和Ⅲ型胶原蛋白含量降低，导致真皮层变薄，皱纹增加和弹性减弱。其中I型胶原蛋白是皮肤结构的主要组成部分，占皮肤重量的75%，对皮肤的轮廓支撑、肌肤屏障，以及皮肤紧致和弹性的维持，都起到了至关重要的作用。促进I型胶原蛋白表达可以抑制皱纹的产生。

皮肤表皮层中黑色素的含量决定了我们的肤色，黑色素是由黑素细胞产生并转运至表皮细胞，黑色素产生或累积在皮肤上，导致肤色变黑，甚至产生色斑。影响黑色素生成的关键是酪氨酸酶，体内酪氨酸在酪氨酸酶的刺激下经过一系列化学反应最终生成黑色素，黑色素由黑素体转运至角质细胞，在角质细胞积累最终呈现黑色。由此可见抑制黑色素的生成可以达到美白的目的。

精油是从植物的叶子、花朵、种子、果实、根部、树皮、树脂、木心等部位以水蒸气蒸馏法、冷压榨法、脂吸法、二氧化碳超临界萃取等方法提炼出来的。由于其天然来源，被广泛认为是比合成药物更接近自然，是一种更健康、更可持续的选择。精油是多种化学成分组成的复杂混合物，如挥发油、酚类、醇类、酯类等，赋予精油抗菌、抗炎、抗氧化、镇痛等多种功效，并共同作用来产生整体效果，使其在皮肤保健和其他外用应用中具有广泛的用途。

由于表皮屏障的存在，如何增强药物在皮肤的通透性也成为重要的研究内容，常用的化学渗透促进剂经常引起皮肤刺激(局部炎症)，使用纳米颗粒等特殊载体系统、使用电场力、激光、超声波和微针等方法给经皮给药提供了更多研究空间，但转化为临床应用的产品并不多。分子量低于500道尔顿（Dalton）的化合物通常具有较好的皮肤渗透性能，而大部分精油分子量小于250道尔顿（Dalton），可以更容易地穿透皮肤表面并渗透到皮肤的不同层次，从而达到更好的吸收效果。精油分子通常是脂溶性的，能够更好地与皮肤的脂质层相容，并更容易渗透到皮肤的深层发挥作用。另外，精油成分本身具有渗透增强的性质，可以改善其他物质的渗透性、促进其他活性成分的吸收，并增强它们在皮肤中的效果。

单方精油所含药效物质基础有限，其功效单一、治疗范围局限、气味刺激等因素导致在应用中受到极大限制。复方精油是由各种疗效确定或药效物质基础明确的精油成分经一定比例混合而成的复方精油，源于疗效确切的单方精油之间的归类组合，经过实验室安全性及药理毒理研究和临床疗效验证，可归属于组分中药。组分中药是创新中药研究的一个途径，是以中医理论为指导，遵循方剂配伍理论与原则，结合现代药物研制方法和技术，由有效组分配伍而成的中药。组分中药的特征是药效物质和作用机制相对清楚，可在治疗临床疾病或症状时，从不同的角度、多个方面发挥作用，提高疗效并减少不良反应，同时增加治疗范围。除此之外，对于气味不好但功能性却很强的精油，可以通过配方来调和气味，令其使用感更佳。总之，复方精油可使单方精油协同药理作用得到提高，应用领域也不断拓展加深。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于改善皮肤老化的复方精油，该复方精油具有优越的抗皮肤衰老和美白皮肤的功效。

本发明的复方精油包括以下组分：杜鹃花精油、白玉兰花精油、银杏叶精油和白茶精油。其中，杜鹃花精油的主要成分为派烯，具有抗菌、抗炎、抗氧化活性；白玉兰花精油的主要成分为柠檬烯，具有抗菌和抗炎作用；银杏叶精油的主要成分为芳樟醇，具有舒缓、镇静、抗氧化、抗菌等功效；白茶精油的主要成分为石竹烯，具有抗炎、止痛、舒缓等功效。

本发明的复方精油的优点：该复方精油中以杜鹃花为君，味苦辛，性温，归肺经，有活血化瘀、辛温解郁之力；以银杏叶为臣，味苦甘微涩，性平，归心、肺经，能活血化瘀，定诸经之痛，助杜鹃花祛腐生肌透散之功；佐以白茶，味苦甘，性寒，归胃、肝、大肠经，可佐清香润肺，清热解毒之力；使药白玉兰花性温、味辛，归肺、胃、肝经，可芳香开窍，助诸药畅达周身。诸药合用，共入肺经，肺主皮毛，全方可同奏芳香化浊、清热解毒、活血养血、抗衰除皱之功。

优选地，本发明的复方精油中杜鹃花精油、白玉兰花精油、银杏叶精油和白茶精油的体积比为3：2：2：3。

优选地，本发明的复方精油由杜鹃花精油、白玉兰花精油、银杏叶精油和白茶精油组成。

优选地，本发明的复方精油由杜鹃花精油、白玉兰花精油、银杏叶精油和白茶精油按照体积比为3：2：2：3组成。

优选地，杜鹃花精油、白玉兰花精油、银杏叶精油和白茶精油分别是通过下述方法制得：杜鹃花精油、银杏叶精油分别是以杜鹃花科植物杜鹃（Rhododendron simsiiPlanch.）的花、银杏科植物毛银杏叶（Ginkgo biloba Linn.）的叶片为原料，通过水蒸气蒸馏取得的挥发油；白玉兰花精油是以木兰科植物白玉兰（Michelia alba DC）的花瓣为原料，通过超临界二氧化碳萃取得到的挥发油；白茶精油是以山茶科植物毛白茶（Camellia sinensis(L .)O .Ktze）为原料，按照先后顺序分别通过超临界二氧化碳萃取和分子蒸馏提取得到的挥发油。

本发明的另一目的是提供一种护肤品组合物，包含本发明的复方精油以及护肤品可接受的各种辅料、赋形剂，将上述组分共同制备成适于皮肤使用的护肤品组合物。

本发明还提供了一种本发明的复方精油和含有其的护肤品组合物的用途，即，将本发明的复方精油或护肤品组合物用于抗皮肤衰老和美白皮肤。

优选地，在该用途中，复方精油的剂量为体积比0.001%-50%。

优选地，在该用途中，复方精油的剂量为体积比0.003%-1.5%。

本发明的复方精油具有显著的抗皮肤衰老和美白皮肤的功效，主要表现在以下方面：相比于单精油和其它的精油组合物，本发明的复方精油清除DPPH自由基的能力突出，其在15mg/mL时的DPPH自由基清除能力与242μg/mL的Vc相当，是同浓度的杜鹃花精油的80倍；本发明的复方精油对透明质酸酶活性的抑制率高达39.1%；经本发明复方精油处理的HSF细胞的存活率均高于100%且显著高于其他组的精油，即本发明的复方精油具有较强的促进皮肤成纤维细胞增殖的活性；本发明的复方精油显著促进I型胶原蛋白的合成；对酪氨酸酶活性的抑制率高达23.78%；以及经本发明的复方精油处理后的B16-F10小鼠黑色素瘤细胞的黑色素相对含量为83.9%。即，本发明复方精油具有突出的抗氧化、保湿、促进皮肤成纤维细胞增殖和合成胶原蛋白的活性、抑制黑色素生成的功效，即延缓衰老和美白皮肤的作用。

附图说明

图1：维生素C（Vc）浓度和OD值的线性关系；

图2：精油对DPPH自由基清除的作用；

图3：透明质酸酶浓度与OD值的线性关系；

图4：精油对透明质酸酶的抑制率；

图5：精油对皮肤成纤维细胞活力的影响；

图6：皮肤成纤维细胞中I型胶原蛋白的表达，其中1~5分别对应对照组、杜鹃花精油、精油组合物1、精油组合物2和本发明的复方精油处理后的皮肤成纤维细胞组的WesternBlot检测结果；

图7：精油对酪氨酸酶的抑制率；

图8：精油对黑色素生成的影响；

图9：杜鹃花精油的气质联用检测结果；

图10：白玉兰花精油的气质联用检测结果；

图11：银杏叶精油的气质联用检测结果；

图12：白茶精油的气质联用检测结果。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

下述实施例2-实施例5中所使用的精油均从牧九野(上海)科技有限公司采购或者由实施例1的方法提取而得。

杜鹃花精油：从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号为：BEO0181101202309，企业标准为：相对密度:0.935 – 0.950；折光指数:1.500 – 1.520。杜鹃花精油的化妆品原料安全信息报送码为002539-02571-5253。

白玉兰花精油：从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号为：TCM002110111，企业标准为：相对密度（20℃） 0.885~0.929；折光指数（20℃） 1.488~1.501。白玉兰花精油的化妆品原料安全信息报送码为001149-02571-9174。

银杏叶精油：从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号为：TCM0386101202306，企业标准为：相对密度:0.911 - 0.953；折光指数:1.470 - 1.496。银杏叶精油的化妆品原料安全信息报送码为007942-02571-5209。

白茶精油：从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号为：XYJY0037，企业标准为：相对密度（20℃）： 0.875~0.950；折光指数（20℃）：1.470~1.495。白茶精油原料安全信息报送码为001605-02571-4211。

【实施例1】提取单方精油

仪器为水封口式蒸馏釜，其设备构成有：

蒸馏釜：整体外观为圆柱形，球冠式釜底，上部开口为加料口；

鹅颈管：带有蒸馏釜上口的圆锥形盖子，连接冷凝器；

冷凝器：为铝质列管冷凝器，使蒸气冷凝和冷却式馏出液；

油水分离器：用铝材做成，既是接受馏出液的容器，又是精油与水的分离器。

水蒸馏法提取精油工艺流程：投料→加水→蒸馏→冷却→油水分离→精油→包装。

1.1提取杜鹃花精油

杜鹃花精油为以杜鹃花科植物杜鹃（Rhododendron simsii Planch.）的花为原料，通过水蒸气蒸馏法取得的挥发油。

在春季杜鹃花盛开期的清晨或傍晚，采摘开放完全而颜色鲜艳的、没有病虫害的花朵，并将其洗净，晾干以去除多余的水分。将蒸馏器拆开，清洗干净所有零部件，确保无油污和杂质。在蒸馏锅中加入蒸馏锅的2/3到3/4的蒸馏水，并将其放置在加热板上，将加热板加热至水开始沸腾。当蒸馏锅中的水开始煮沸时，将杜鹃花瓣放入蒸馏锅中，确保全部浸没在水中，但不要过于密实堆积，以允许水蒸气顺利通过。逐渐升温，初始阶段的加热速度应较慢，以避免过快的温度上升破坏花朵中的精油成分。等待水开始沸腾产生水蒸气，用冷凝管连接蒸馏器并将另一端的管子放入收集瓶中。水蒸气会通过冷凝管冷凝，并流入收集瓶中。蒸馏温度保持在70-90℃之间，压力保持在1-2个大气压。蒸馏时间持续1到2小时。等待24小时，精油会浮在水的上层，用滴管或分离漏斗将其从水中分离出来。收集好精油后，使用滤纸或滤布过滤以去除悬浮在精油中的颗粒或其他杂质，得杜鹃花精油。

1.2提取白玉兰花精油

白玉兰花精油是以木兰科植物白玉兰（Michelia alba DC）的花瓣为原料，通过超临界二氧化碳萃取得到的挥发油。

在清晨或黄昏选择开放程度适中的白玉兰花朵，避免过于幼小或成熟过度的花朵。在采摘后将花朵放置于通风良好、无阳光直射的干燥室内1-2天，再使用烘干机，50度加热烘干。花朵干燥后花瓣会呈脆硬状态，没有水分感。将干燥的白玉兰花朵放入粉碎机中进行处理，碎成过10～20目筛的粗粉，用砂布袋装好已秤量好的白玉兰花粗粉，并装入萃取器中，封好顶盖。开启恒温槽电源。打开二氧化碳钢瓶阀门，使气体沿管线经过干燥器，冷却冷凝器（浸在冰水浴中），柱塞泵，进入增压缓冲瓶。待增压缓冲瓶的压力大大超过实验压力后，打开阀门V1,使萃取器升压到实验压力，关阀门V1,让白玉兰花预浸润10min,超临界CO₂流体萃取。CO2流体流速5L/H，萃取温度30-50℃，萃取压力20-25ＭPa，分离温度35℃，分离压力4 .5～5 .5ＭPa，萃取时间1.～2 h，得白玉兰花精油。

1.3提取银杏叶精油

银杏叶精油是以银杏科植物毛银杏叶（Ginkgo biloba Linn.）的叶片为原料，通过水蒸气蒸馏法取得的挥发油。

在秋季的10月份的早晨或傍晚的时候采摘已经变黄色的银杏叶片，选择健康、没有病虫害的叶片，并将其洗净，晾干以去除多余的水分。将蒸馏器拆开，清洗干净所有零部件，确保无油污和杂质。在蒸馏锅中加入蒸馏锅的2/3到3/4的蒸馏水，并将其放置在加热板上，将加热板加热至水开始沸腾。当蒸馏锅中的水开始煮沸时，将白玉兰花朵放入蒸馏锅中，确保全部浸没在水中，但不要过于密实堆积，以允许水蒸气顺利通过。逐渐升温，初始阶段的加热速度应较慢，以避免过快的温度上升破坏花朵中的精油成分。等待水开始沸腾产生水蒸气，用冷凝管连接蒸馏器并将另一端的管子放入收集瓶中。水蒸气会通过冷凝管冷凝，并流入收集瓶中。保持蒸馏的温度为80-100℃，蒸馏时间可持续3到4小时。等待24小时，精油会浮在水的上层，用滴管或分离漏斗将其从水中分离出来。收集好精油后，使用滤纸或滤布过滤以去除悬浮在精油中的颗粒或其他杂质，得白玉兰花精油。

1.4提取白茶精油

白茶精油是以云南普洱地区大叶种白茶（Camellia sinensis(L .)O .Ktze）为材料。

在清晨6点到9点，手工采摘大小相当的一心二嫩叶，每株嫩芽整齐摊开，在当地白天如同有日光,在日光下晾晒，夜晚在室内阴凉处晾干，连续3天，之后置入烘干机110℃干燥。超临界CO₂萃取：将白茶叶片粉碎过10～20目筛的粗粉，用砂布袋装好已秤量好的茶叶粗粉，并装入超临界萃取器中，封好顶盖。开启恒温槽电源。打开二氧化碳钢瓶阀门，使气体沿管线经过干燥器，冷却冷凝器（浸在冰水浴中），柱塞泵，进入增压缓冲瓶。待增压缓冲瓶的压力大大超过实验压力后，打开阀门V1,使萃取器升压到实验压力，关阀门V1,让茶叶预浸润10min，超临界CO₂流体萃取。CO₂流体流速1L/min，萃取温度50℃，萃取压力25ＭPa，分离温度50℃，分离压力4 .5～5 .5ＭPa，萃取时间1 .5～2 .5h。分子蒸馏：对分子蒸馏柱进行加热并对冷凝器进行冷却，当温度分别达到60℃和4℃时，打开真空泵抽真空，当达到800-1000Pa时，将超临界萃取物从进料口加入，调节转子刮膜转速为250/min，流速2.0mL/min，蒸馏2h，得到白茶精油。

【实施例2】制备复方精油

将实施例1获得的精油或者上述从牧九野(上海)科技有限公司商购的杜鹃花精油、白玉兰花精油、银杏叶精油、白茶精油均匀混合在一起，即得本发明的复方精油。

精油组合物1：杜鹃花精油+白玉兰花精油，体积比为3:2。即精油组合物1中杜鹃花精油含量为60%，白玉兰花精油含量为40%。

精油组合物2：杜鹃花精油+白玉兰花精油+银杏叶精油，体积比为3:2:2。即精油组合物2中杜鹃花精油含量为42.85%，白玉兰花精油含量为28.57%，银杏叶精油含量为28.57%。

复方精油：杜鹃花精油+白玉兰花精油+银杏叶精油+白茶精油，体积比为3:2:2:3。即本发明的复方精油中杜鹃花精油含量为30%，白玉兰花精油含量为20%，银杏叶精油含量为20%，白茶精油含量为20%。

【实施例3】精油的抗衰老功效研究

一、实验材料

3.1.1 实验细胞

人皮肤成纤维细胞（Human skin fibroblasts，HSF）购自北京北纳创联生物技术研究院。

3.1.2试药与试剂

杜鹃花精油、精油组合物1、精油组合物2、本发明的复方精油、DMSO（上海碧云天生物技术股份有限公司）、DPPH（Sigma公司）、维生素C（Vitamin C，99%，Sigma公司）、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）、透明质酸酶（500U/mg，上海源叶科技有限公司）、透明质酸（97%，上海麦克林生化科技有限公司）、DNS显色剂（上海麦克林生化科技有限公司）、DMEM高糖培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）、胎牛血清（FBS，天杭生物科技有限公司）、CCK8（上海碧云天生物技术股份有限公司）、RIPA裂解液（上海碧云天生物技术股份有限公司）、BCA蛋白检测试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司）、COL-1抗体（Type 1 Collagen，Cell Signaling Technology公司）、GAPDH抗体（Cell Signaling Technology公司）、ECL化学发光液（Millipore 公司）。

3.1.3 仪器与设备

多功能酶标仪（Synergy2，美国，Bio-tek）、超净台（SW-CJ-2FD，中国，苏州安泰空气技术有限公司）、二氧化碳培养箱（371型，美国，ThermoFisher Scientific）、离心机（5810R，德国，Eppendorf）、垂直电泳仪（PowerPAC3000，美国，Bio-rad）、化学发光成像系统（FluorChem R，美国，Protein Simple）。

二、实验方法

3.2.1 体外DPPH自由基清除测试

1）用无水乙醇配制 0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。以维生素C（Vitamin C，Vc）为阳性对照，配制Vc标准品，蒸馏水溶解Vc，浓度分别是0μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL，将2 mL Vc标准品和2 mL DPPH 溶液加入到同一试管中摇匀，室温下暗处静置 30 min后测定其在波长517nm吸光度（OD值），根据Vc浓度和OD值绘制标准曲线。

2）将单精油和复方精油分别用DMSO稀释至浓度为15mg/mL，即分别取30mg杜鹃花精油、精油组合物1、精油组合物2和本发明的复方精油与2mL DMSO涡旋2~3min混合均匀，即得各组待测液。

3）将2 mL 稀释后的精油和2 mL DPPH 溶液加入到同一试管中摇匀，室温下暗处静置 30 min后测定其在波长517nm吸光值，根据标准曲线求出精油DPPH自由基清除能力的Vc当量。

3.2.2 体外透明质酸酶抑制作用考察

1）DNS法绘制透明质酸酶与底物HA反应的酶活性标准曲线：用去离子水（ddH₂O）将透明质酸酶配制成2000U/mL。按照表1配制反应体系，震荡混匀，37℃反应30min，沸水浴5min。取反应液200μL，加入400μL DNS溶液，震荡混匀，沸水浴5min，冷却后用酶标仪在540nm处读吸光度OD值，每个样品3复孔。以A540处OD值与透明质酸酶浓度的对应关系绘制标准曲线。

表1 透明质酸酶标准溶液与底物HA反应体系

2）待测精油样品反应体系制备：分别取杜鹃花精油、精油组合物1、精油组合物2和复方精油各6mg，与100μL DMSO涡旋2~3min混合均匀，再加入900μL ddH₂O混匀，即为待测样品浓度为6mg/mL，反应体系为：待测样品10μL +2000U/mL透明质酸酶溶液300μL + ddH₂O190μL +0.5%透明质酸500μL，震荡混匀，37℃反应30min，沸水浴5min，该反应体系下精油的浓度为60μg/mL；

3）DNS法测定待测精油样品对透明质酸酶活性影响：取200μL制备好的待测精油反应体系，加入400μL DNS溶液，震荡混匀，沸水浴5min，冷却后用酶标仪在540nm处读OD值，每个样品3复孔。根据透明质酸酶的标准曲线计算精油组的透明质酸酶活性。

3.2.3 精油促人皮肤成纤维细胞增殖检测

1）将人皮肤成纤维细胞HSF以10⁴个/孔接种于96孔板，待细胞密度约为80 %，加入不同浓度的精油干预。

2）分别取10mg杜鹃花精油、精油组合物1、精油组合物2和本发明的复方精油与100μL DMSO涡旋2~3min混合均匀，加入900μL DMEM高糖培养基，涡旋混匀为精油储备溶液（10mg/mL）。

3）细胞实验中含精油的培养基均由上述精油储备溶液（10mg/mL）按比例由含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释，浓度梯度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和50μg/ml，每组设4个复孔。

4）共同孵育24h后移除96孔板内的培养基，每孔加入100 μL含10% CCK8试液的培养基，培养箱内孵育30min 后取出，用酶标仪在450 nm处检测各孔的OD值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=( 样品组OD值-空白OD值)/(对照组OD值-空白OD值)×100%。

3.2.4精油促进皮肤成纤维细胞胶原合成检测

1）将HSF细胞按每孔2×10⁵个接种于6孔板，待细胞密度约为80%后分组处理。

2）实验设空白对照组和各精油干预组，单精油和复方精油（3.2.3中的精油储备溶液）分别稀释至浓度为30μg/mL，空白对照组加入同体积培养基。

3）共同孵育24h后收集细胞，RIPA裂解细胞提取细胞蛋白，BCA法检测细胞蛋白含量，WesternBlot检测各组细胞I型胶原蛋白（COL-1）和GAPDH蛋白的表达。

三、实验结果

3.3.1 精油对自由基清除的作用

DPPH自由基清除测试可以评价待测样本的抗氧化能力，清除率越大，抗氧化性越强。首先建立Vc浓度和OD值之间的线性关系，结果如图1所示，线性方程：y=-0.0002x+0.107，R²=0.995。根据Vc浓度和OD值之间的线性方程得到精油DPPH自由基清除能力的Vc当量。结果见表2和图2。

表2 精油对DPPH自由基清除能力

由表2可知，在15mg/mL的浓度时，杜鹃花精油、精油组合物1、精油组合物2和本发明的复方精油对DPPH自由基的清除能力分别相当于3μg/mL、28μg/mL、91μg/mL和242μg/mL的Vc对DPPH自由基的清除能力。由此可知，单方精油-杜鹃花精油几乎没有DPPH自由基的清除能力，精油组合物1对DPPH自由基的清除能力微弱，精油组合物2和本发明的复方精油对DPPH自由基的清除能力显著，其中本发明的复方精油清除DPPH自由基的能力最为突出，是相同浓度的杜鹃花单精油的80倍。

3.3.2 精油对透明质酸酶的抑制作用

透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是一种多糖类物质，是构成皮肤细胞间质和细胞外基质的主要成分，其在真皮和表皮中结合和保留水分子的独特能力决定着皮肤的水合作用。HA具有极强亲水性，能够吸附大量水分子，形成一层水分膜，有效锁住肌肤的水分，具有良好保湿性能。透明质酸合成酶合成HA，透明质酸酶降解HA。对透明质酸酶抑制率越大表明对HA的降解作用越弱，则HA含量越高，对皮肤保湿功效越明显。

根据透明质酸酶活性与OD值的对应关系绘制标准曲线，见图3。透明质酸酶溶液在400U/ml-1000U/ml范围内，透明质酸酶浓度与OD值的线性关系良好，线性方程为：y=0.0008x-0.1418, R²=0.9948。按照标准曲线的线性回归方程计算精油反应体系中对透明质酸酶活性的抑制率，并评价精油对酶活性的影响。结果见表3和图4，各组精油在60μg/mL浓度时对透明质酸酶活性均有一定的抑制作用，其中以本发明的复方精油对透明质酸酶的活性抑制率最大，高达39.1%，提示其具有突出的保湿功效。

表3精油对透明质酸酶活性的影响

3.3.3 精油对皮肤成纤维细胞增殖的影响

考察精油在0-50μg/mL浓度范围内对皮肤成纤维细胞存活率的影响。结果见表4和图5，在0.5-50μg/mL浓度范围内，只有本发明的复方精油具有较强的促进皮肤成纤维细胞增殖的活性，提示复方精油可以促进新生细胞不断产生，达到延缓衰老的作用。

表4精油对HSF细胞存活率的影响（单位：%）

3.3.4精油对皮肤成纤维细胞I型胶原蛋白表达的影响

作为皮肤蛋白质的主要成分，胶原占人体真皮蛋白质含量约90%，其中主要为I型胶原（80%）和少量III型胶原（10%），本实验通过Western Blot检测各组细胞I型胶原蛋白（COL-1）的表达，结果见图6。从图6可以看出，相比于空白对照组，经杜鹃花精油和精油组合物1处理后的细胞COL-1蛋白表达变化较小，而经精油组合物2和本发明的复方精油处理后的细胞的COL-1蛋白表达增加明显。该结果表明，精油组合物2和本发明的复方精油能够促进I型胶原蛋白的合成，使皮肤保持一定的强度和弹性，防止真皮层萎缩达到抗皱的功效。

【实施例4】精油的美白功效研究

一、实验材料

4.1.1实验细胞

小鼠皮肤黑色素瘤细胞（B16-F10），购自中国科学院细胞库。

4.1.2 试药与试剂

杜鹃花精油、精油组合物1、精油组合物2、白茶精油、本发明的复方精油、L-酪氨酸（99%，上海麦克林生化科技有限公司）、酪氨酸酶（500U/mg，上海麦克林生化科技有限公司）、PBS缓冲液（上海碧云天生物技术股份有限公司）、胎牛血清（FBS，天杭生物科技有限公司）、1640培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）、氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司）、DMSO（上海碧云天生物技术股份有限公司）。

4.1.3 仪器与设备

多功能酶标仪（Synergy2，美国，Bio-tek）、超净台（SW-CJ-2FD，中国，苏州安泰空气技术有限公司）、二氧化碳培养箱（371型，美国，ThermoFisher Scientific）、离心机（5810R，德国，Eppendorf）。

二、实验方法

4.2.1 体外酪氨酸酶活性抑制实验检测

1）用PBS缓冲液将Ｌ-酪氨酸配制成500μg/mL，酪氨酸酶配制成50 U/mL，备用。

2）将单精油和复方精油分别用PBS缓冲液稀释至浓度为30μg/mL，即分别取10mg杜鹃花精油、精油组合物1、精油组合物2和本发明的复方精油与100μL DMSO涡旋2~3min混合均匀，加入900μL PBS缓冲液，涡旋混匀浓度为10 mg/mL，再用PBS缓冲液将其稀释至30μg/mL即得待测精油溶液。

3）在96孔板中设置240μL总反应体系（见表5），分别加入120μL Ｌ-酪氨酸、40μLPBS缓冲液、40μL待测精油溶液，混匀后加入40μL酪氨酸酶溶液，37℃恒温孵育30min，492nm测定吸光度OD值。

4）对酪氨酸酶活性抑制率的计算公式为：酪氨酸酶抑制率（%）＝[(A - B)-(C -D)]／(A - B)×100% ，式中：A为仅存在酪氨酸酶时的吸光度；B为既不存在化合物也不存在酪氨酸酶时的吸光度；C为同时存在精油和酪氨酸酶时的吸光度；D为仅存在精油时的吸光度。

表5酪氨酸酶催化反应体系（μL）

4.2.2 精油对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞中黑色素生成的影响

1）取对数生长期的B16-F10细胞，消化后用含有10％胎牛血清1640 完全培养基制成细胞悬液，细胞浓度为4×10⁵个/mL，接种于6孔板，每孔2mL，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养。

2）分别取10mg杜鹃花精油、精油组合物1、精油组合物2、白茶精油和本发明的复方精油与100μL DMSO涡旋2~3min混合均匀，加入900μL 1640培养基，涡旋混匀为精油储备溶液（10mg/mL），细胞实验中含精油的培养基均由精油储备溶液（10mg/mL）按比例稀释配制。

3）适应性培养12h后，将孔板分为对照组、杜鹃花精油组、精油组合物1组、精油组合物2组、白茶精油组、复方精油组，将上述精油储备溶液（10mg/mL）用1640完全培养基稀释至干预浓度30μg/mL，置于培养箱继续培养。

4）共同培养24 h后，弃培养液，PBS洗涤，将细胞消化下来，3000 rpm离心 3-5min获取细胞沉淀。

5）加入400μL含有1 mol/L的氢氧化钠吹打均匀，80℃水浴30 min，吹打均匀后移入96孔板，每个浓度3个复孔，测定各孔405nm波长下OD值。

6）以对照组黑色素含量为100%计，根据下列公式计算精油干预组黑色素含量：黑色素含量（%）=（OD精油组/OD空白对照组）×100％。

三、实验结果

4.3.1 精油在体外对酪氨酸酶抑制作用

酪氨酸酶是黑色素生物合成中的关键酶，酪氨酸酶的活性增加，会导致体内黑色素合成过多，造成色斑形成，可见酪氨酸酶的活性与黑色素合成量相关，抑制其活力即可控制黑色素生成量。因此，待测样品抑制酪氨酸酶活性的能力可评价其抑制黑色素生成的能力。

通过构建酪氨酸酶催化反应体系，来评价精油对酪氨酸酶的抑制效果。结果见表6和图7，各组精油在30μg/mL浓度时对酪氨酸酶活性均有不同程度的抑制作用，其中精油组合物1、本发明的复方精油这两组的酪氨酸酶活性抑制作用较杜鹃花单精油尤为突出（p<0.01），提示具有较强的抑制黑色素生成的作用，可以产生美白功效。

表6 精油对酪氨酸酶活性的影响

4.3.2 精油对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞黑色素合成的影响

精油对B16-F10细胞黑色素合成的影响结果见表7和图8，实验中各组精油浓度均为30μg/mL，其中精油组合物2和白茶精油与对照组相比可以明显抑制细胞黑色素生成（p<0.01），其黑色素相对含量分别是94.8%和94.3%，提示具有降低黑色素合成的作用；在精油组合物2的基础上再添加白茶精油组成本发明的复方精油，结果显示，复方精油组与对照组相比，黑色素含量显著降低（p<0.001），黑色素相对含量为83.9%，且其黑色素相对含量明显低于精油组合物2和白茶精油组（p<0.001），提示精油组合物2和白茶精油组合后对黑色素合成抑制起到协同作用，从而大大促进复方精油对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞黑色素生成的抑制作用，以此来减少黑色素含量达到美白的作用。

表7 精油对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞黑色素合成的影响

【实施例5】利用气质联用分别检测本发明的4种单方精油

5.1供试品的制备

将待测精油移取 0.5 mL 置于 1.5mL 离心管中，离心 1 min；取上清液 50 μL，称重，加入乙酸乙酯，配成浓度为 100 mg/mL 的精油溶液；按 1 : 10 的质量比，加入无水硫酸钠粉末，混匀，静置，离心；取上清液 10 μL，以乙酸乙酯稀释 100 倍，得浓度为 1 mg/mL的待测溶液；将待测溶液离心 1 min，取上清液，气质联用检测。

5.2检测方法

色谱柱：安捷伦 HP-5 MS UI（30 m×0.25 mm×0.25 μm）

载气：高纯氦

流速：1.0 mL/min

进样口温度： 250℃

分流比： 10 : 1

进样量： 1 μL

升温程序： 50 ℃—180℃（3℃/min）—300 ℃（ 20 ℃/min, 保持 5 min）

离子源： EI+

离子源温度：230℃

扫描模式：全离子扫描

扫描范围：m/z 40 -600

溶剂延迟： 4 min。

5.3检测结果

检测结果如图9~图12所示。气质联用检测的原始数据经安捷伦MassHunter定性分析（Agilent MassHunter Qualitative Analysis，V B.07.00）软件分析，得各组分峰的信息（保留时间，积分峰面积，峰面积总和百分比，以及峰高）。

Claims

1.一种改善皮肤老化的复方精油，其特征在于，包含以下成分：杜鹃花精油、白玉兰花精油、银杏叶精油和白茶精油；所述杜鹃花精油、白玉兰花精油、银杏叶精油、白茶精油的体积比为3：2：2：3。

2.根据权利要求1所述的复方精油，其特征在于，所述复方精油具有抗皮肤衰老和美白皮肤的功效。

3.根据权利要求1所述的复方精油，其特征在于，所述杜鹃花精油、银杏叶精油分别是以杜鹃花科植物杜鹃的花、银杏科植物毛银杏叶的叶片为原料，通过水蒸气蒸馏取得的挥发油；所述白玉兰花精油是以木兰科植物白玉兰的花瓣为原料，通过超临界二氧化碳萃取得到的挥发油；所述白茶精油是以山茶科植物毛白茶为原料，依次通过超临界二氧化碳萃取和分子蒸馏提取得到的挥发油。

4.根据权利要求1所述的复方精油，其特征在于，所述复方精油由杜鹃花精油、白玉兰花精油、银杏叶精油和白茶精油按照体积比为3：2：2：3组成。

5.一种根据权利要求1~4中任意一项所述的复方精油的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备所述杜鹃花精油

以杜鹃花科植物杜鹃的花为原料，通过水蒸气蒸馏取得的挥发油；

（2）制备所述白玉兰花精油

以木兰科植物白玉兰的花瓣为原料，通过超临界二氧化碳萃取得到的挥发油；

（3）制备所述银杏叶精油

以银杏科植物毛银杏叶的叶片为原料，通过水蒸气蒸馏取得的挥发油；

（4）制备所述白茶精油

以山茶科植物毛白茶为原料，烘干后粉碎过10～20目筛的粗粉，装入萃取器中，依次采用超临界二氧化碳萃取和分子蒸馏获得所述白茶精油；

（5）制备所述复方精油

将步骤（1）~（4）获得的精油或者商售的杜鹃花精油、白玉兰花精油、银杏叶精油和白茶精油按照体积比3：2：2：3均匀混合，即获得所述复方精油。

6.一种护肤品组合物，含有权利要求1~4中任意一项所述的复方精油。

7.权利要求1~4中任意一项所述的复方精油或权利要求6所述的护肤品组合物在改善皮肤老化中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的皮肤老化包括皮肤皱纹增多、皮肤松弛、皮肤色素沉着不均和皮肤变黑。

9.权利要求1~4中任意一项所述的复方精油在制备改善皮肤老化产品中的应用，所述产品包括：1）清除DPPH自由基的产品；2）抑制透明质酸酶活性的产品；3）促进皮肤成纤维细胞增殖的产品；4）促进皮肤成纤维细胞合成胶原的产品；5）抑制酪氨酸酶活性的产品；和6）抑制细胞生成黑色素的产品。

10.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述护肤品组合物中的复方精油的含量为0.001%-50%。