CN113832108A - 一种脐带间充质干细胞外泌体及其抗皮肤衰老用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脐带间充质干细胞外泌体及其抗皮肤衰老用途。皮肤抗衰老医学美容研究具有重要意义。间充质干细胞外泌体具有多种活性，比如组织修复、免疫调节和疾病治疗，越来越被重视。本发明发现，与正常人脐带间充质干细胞分泌的外泌体相比，miR‑328‑3p表达上调的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体一方面可以更有效地提高人真皮成纤维细胞的增殖活性，另一方面可以更有效地提高人真皮成纤维细胞的细胞外基质中Ⅰ型胶原蛋白和弹性蛋白的含量，具有开发成抗皮肤衰老的护肤品或药品的前景。

Description

一种脐带间充质干细胞外泌体及其抗皮肤衰老用途
技术领域
本发明属于干细胞领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞外泌体及其抗皮肤衰老用途。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有高度自我更新、多向分化及独特免疫调节能力特性的细胞，其可以通过与先天免疫和适应性免疫系统的细胞相互作用以及分泌细胞调节性因子发挥免疫调节作用。间充质干细胞外泌体(exosomesfrommesenchymal stem cells，MSCs-Exo)就是MSCs发挥功能的一种分泌物质。研究表明，MSCs-Exo具有多种活性，比如组织修复、免疫调节和疾病治疗，越来越被重视。
脐带间充质干细胞(umbilical cord-mesenchymal stem cells，UC-MSCs)具有来源充足、取材方便、培养简单等特点，也不存在伦理学问题，因而得到广泛研究。脐带间充质干细胞外泌体(UC-MSCs-Exo)也较其他干细胞外泌体更易被应用和推广。
皮肤抗衰老医学美容研究是一项长期而艰巨的课题。随着不断加深的老龄化问题，人类对年轻健康外貌的强烈需求，未来对于抗衰老的需求将会越来越大，研究有效的抗衰老技术和抗衰老产品，有助于提高人类的生活质量，尤其对老龄化的严重问题具有重要意义。
现有技术已经表明，UC-MSCs-Exo具有抗皮肤衰老的活性，但是活性尚待提高，这样才能克服UC-MSCs-Exo量少的不足，实现少量高效，易于被应用和推广。
发明内容
本发明旨在克服现有技术不足，第一目的是提供一种脐带间充质干细胞外泌体，第二目的是提供该脐带间充质干细胞外泌体的抗皮肤衰老用途。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种脐带间充质干细胞外泌体，该脐带间充质干细胞外泌体为miR-328-3p表达上调的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
上述脐带间充质干细胞外泌体的抗皮肤衰老用途。实验研究发现，与正常人脐带间充质干细胞分泌的外泌体相比，miR-328-3p表达上调的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体一方面可以更有效地提高人真皮成纤维细胞的增殖活性，另一方面可以更有效地提高人真皮成纤维细胞的细胞外基质中Ⅰ型胶原蛋白和弹性蛋白的含量。
进一步的，所述用途为用于制备抗皮肤衰老的护肤品或药品。
更进一步的，所述护肤品为精华液、乳液、面膜或面霜。
技术效果：
真皮成纤维细胞增殖活性的降低导致皮肤更新、代谢能力降低，是皮肤衰老的重要表现之一。细胞外基质的降解是皮肤衰老的另一重要表现，以Ⅰ型胶原蛋白为主的胶原蛋白是细胞外基质中最主要的结构蛋白，对维持皮肤的机械强度发挥关键作用；细胞外基质中另一种重要蛋白弹性蛋白在保持皮肤弹性、防止变形方面发挥关键作用。因此，提高真皮成纤维细胞的增殖活性、通过提高细胞外基质中胶原蛋白和弹性蛋白的含量抑制细胞外基质的降解可以有效抑制皮肤衰老。上调或下调改变部分基因表达水平是调节、改进细胞功能的重要研究方法。本发明实验表明，与正常人脐带间充质干细胞分泌的外泌体相比，miR-328-3p表达上调的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体一方面可以更有效地提高人真皮成纤维细胞的增殖活性，另一方面可以更有效地提高人真皮成纤维细胞的细胞外基质中Ⅰ型胶原蛋白和弹性蛋白的含量，具有开发成抗皮肤衰老的护肤品或药品的前景。
附图说明
图1中A为UC-MSCs的倒置显微镜观察图，B为UC-MSCs的流式细胞仪检测图，C为各组UC-MSCs中miR-328-3p的含量比较，D为各组UC-MSCs-Exo的透射电镜观察图，E为各组UC-MSCs-Exo的Western Blot检测结果；
图2中A为各组HDF-a的增殖活性比较，B为COL I、Elastin含量比较。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
实施例1：UC-MSCs-Exo的制备
一、实验材料
胎牛血清、DMEM/F12培养基购自Gibco公司，双抗、PBS和胰蛋白酶购自碧云天生物。miR-328-3p mimic、miR-328-3p NC mimic购自上海生工生物工程有限公司。FITC或PE标记的小鼠抗人CD90、CD105、CD73、CD14、CD34和CD45抗体及各相关同型对照购自美国eBioscince公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen。TRIzol试剂盒购自赛默飞世尔。Western blot相关试剂材料购自碧云天生物等。
二、实验方法
1、UC-MSCs分离培养
按照常规方法在无菌条件下取健康足月顺产新生儿脐带组织，用含1％双抗的PBS洗涤多次以去除残血，并剔除脐动静脉，留下Wharton胶样组织，将其剪碎，形成约1mm3的小块，然后用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM/F12培养基于37℃、5％CO2、饱和湿度条件培养，每3～4d换液1次。在倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况。待细胞长至90％融合时，胰蛋白酶消化传代培养。取第3代UC-MSCs用于流式检测表面标志物。流式检测方法为：取第3代UC-MSCs，0.25％胰酶消化并调整细胞密度为1×106个/mL，每离心管中加入1mL细胞悬液，无菌PBS洗涤2次，1000×g离心5min，弃上清，100μLPBS重悬细胞后，向各管单细胞悬液中加入适量CD90、CD105、CD73、CD14、CD34和CD45抗体以及各同型对照，室温避光孵育30min，1000×g离心5min，PBS洗涤2次，加入500μLPBS重悬，制成单细胞悬液，流式细胞仪检测。
2、UC-MSCs分组、转染和检测
实验分为空白对照组(Blank)、阴性对照组(Negative Control，NC)和阳性实验组(Positive group，PG)。取生长状态良好的UC-MSCs，用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM/F12培养基于37℃、5％CO2、饱和湿度条件培养，接种于6孔板中，并分组如下：
Blank组：未转染；
NC组：转染miR-328-3p NC mimic，miR-328-3p正常表达；
PG组：转染miR-328-3p mimic，miR-328-3p高表达。
24h后，按Lipofectamine 2000说明和上述分组进行细胞转染，将miR-328-3p的模拟物(mimic)及阴性对照模拟物(NC mimic)分别转染至对应组别的UC-MSCs中，48h后洗涤收集各组细胞进行后续实验。
RT-PCR法检测转染后miR-328-3p基因表达水平：收集转染后的细胞用TRIzol试剂盒提取各组细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度，反转录试剂盒合成cDNA，PCR扩增，以U6为内参，按照试剂盒操作方法根据公式miR-328-3p/U6计算各组miR-328-3p相对表达水平，并以Blank组miR-328-3p相对表达水平计为1.00。
miR-328-3p和U6的引物如下：
miR-328-3p上游引物：5'-GATAGCCGTACTCTCGAGG-3'；
miR-328-3p下游引物：5'-GTAGAGGCTAGAGGGAACCC-3'；
U6上游引物：5'-CCCGGACACGTGGGCTCCC-3'；
U6下游引物：5'-CACATCCCTGGACACAGTCCTAG-3'。
3、UC-MSCs-Exo收集和检测
按照常规离心法收集外泌体。具体方法为：取转染后的UC-MSCs用DMEM/F12培养基制成细胞悬液并接种于培养皿中，72h后收集上清并转移至离心管中，4℃条件下300×g离心10min去除残余细胞，上清于4℃条件下2000×g离心10min去除死细胞，上清于4℃条件下10000×g离心30min去除细胞碎片，上清于4℃条件下100000×g离心70min收集沉淀即得外泌体。用无菌PBS将沉淀重悬，再次于4℃条件下100000×g离心70min收集沉淀即得经过洗涤的外泌体。最后用无菌PBS将经过洗涤的外泌体重悬，取少量用于BCA法测定外泌体浓度、透射电镜观察以及Westernblot检测，其余-80℃冻存备用。
Western blot检测方法为：各组外泌体取适量并调整蛋白浓度一致后，加入5×上样缓冲液，100℃煮沸10min，10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭2h，加入CD9、CD63、CD81一抗，4℃孵育过夜。TBST反复洗膜后，HRP标记二抗孵育1h，洗膜后化学发光试剂显色，用凝胶成像系统拍照，Image J软件分析灰度值。
4、统计学分析
采用GraphPad Prism 5软件对数据进行统计分析，采用配对t检验对数据进行显著性分析，P<0.05认定为差异显著。
三、实验结果
1、UC-MSCs倒置显微镜下观察结果
图1中A为UC-MSCs的倒置显微镜观察图，可见细胞呈梭形，大小较均等，呈平行或旋涡状生长，符合UC-MSCs细胞生物学特点。
图1中B为流式细胞仪检测图，CD73、CD90、CD105阳性表达，CD14、CD34和CD45阴性表达，符合UC-MSCs表面标记特点。
2、UC-MSCs转染结果
表1和图1中C为各组UC-MSCs中miR-328-3p的含量比较，PG组miR-328-3p含量显著高于Blank组、NC组，说明高表达miR-328-3p的UC-MSCs造模成功。
表1各组UC-MSCs中miR-328-3p相对表达水平
Figure BDA0003277755930000041
*代表与Blank、NC组相比差异显著。
3、UC-MSCs-Exo检测结果
图1中D为各组UC-MSCs-Exo的透射电镜观察图(100×)，图1中E为各组UC-MSCs-Exo标志蛋白CD9、CD63、CD81的Western blot检测图，各组外泌体的形态和标志物都符合UC-MSCs-Exo的特点，说明各组均制备得到了外泌体。
实施例2：抗皮肤衰老测试
一、实验材料
人真皮成纤维细胞(HDF-a)购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司。胎牛血清、DMEM高糖培养基购自Gibco公司，双抗、MTT和胰蛋白酶购自碧云天生物。兔抗人Ⅰ型胶原蛋白抗体、兔抗人弹性蛋白抗体购自Abcam，驴抗兔荧光二抗购自上海雅吉生物科技有限公司。
二、实验方法
1、HDF-a的培养
将HDF-a用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM高糖培养基于37℃、5％CO2、饱和湿度条件培养，每2～3d换液1次。
2、HDF-a增殖活性测定
采用常规的MTT法测定HDF-a的增殖活性，分为空白对照组和外泌体A、B、C组，其中外泌体A、B、C组添加的外泌体分别对应为实施例1中Blank组、NC组、PG组的外泌体。
具体方法为：取生长状态良好的对数生长期HDF-a细胞，调整细胞浓度至1×105个/mL，混匀后接种于96孔板中，每孔100μL，每组设6个复孔。待细胞完全贴壁后，实验组更换为含有不同浓度外泌体(低浓度为2μg/mL、高浓度为5μg/mL)的完全培养基培养，空白对照组的培养基中不含有外泌体。继续培养24h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，培养4h，去上清液，加入150μL DMSO轻轻震荡，用酶标仪检测其在490nm处的吸光度(OD值)，通过OD值按照如下公式计算实验组增殖活性，空白对照组增殖活性计为100％：实验组增殖活性＝实验组OD值/空白对照组OD值×100％。吸光度越高代表增殖活性越强。
3、Ⅰ型胶原蛋白(COL I)和弹性蛋白(Elastin)分泌能力测定
按照“2、HDF-a增殖活性测定”中的分组和培养方法，外泌体A、B、C组采用含有5μg/mL不同外泌体的完全培养基培养，空白对照组的培养基中不含有外泌体。干预24h后，收集HDF-a细胞并用PBS洗涤3～5次，使用不含胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，细胞浓度1×105个/mL。使用不含有胎牛血清的培养基培养是为了降低胎牛血清中蛋白对目标蛋白检测的影响。培养24h后，收集细胞培养上清液，按照BCA试剂盒说明书提取总蛋白并计算蛋白浓度，以空白对照组蛋白浓度为标准调整实验组蛋白浓度。调整蛋白浓度一致后，加入5×上样缓冲液，100℃煮沸10min，10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭2h，加入COL I、Elastin、GAPDH一抗，4℃孵育过夜。TBST反复洗膜后，HRP标记二抗孵育1h，洗膜后化学发光试剂显色，用凝胶成像系统拍照，Image J软件分析灰度值。
4、统计学分析
采用GraphPad Prism 5软件对数据进行统计分析，采用配对t检验对数据进行显著性分析，P<0.05认定为差异显著。
三、实验结果
1、HDF-a增殖活性测定结果
图2中A为各组HDF-a的增殖活性比较，外泌体A、B、C组的HDF-a增殖活性均显著高于空白对照组，且外泌体C组的HDF-a增殖活性显著高于外泌体A、B组，外泌体A组与B组HDF-a增殖活性无显著性差异。
表2各组HDF-a的增殖活性
Figure BDA0003277755930000061
#代表与空白对照组相比差异显著；*代表与外泌体A、B组相比差异显著。
2、COL I、Elastin含量测定结果
图2中B为各组COL I、Elastin含量比较。外泌体A、B、C组COL I、Elastin含量均显著高于空白对照组，且外泌体C组的COL I、Elastin含量显著高于外泌体A、B组，外泌体A组与B组COL I、Elastin含量无显著性差异。
真皮成纤维细胞增殖活性的降低导致皮肤更新、代谢能力降低，是皮肤衰老的重要表现之一。细胞外基质的降解是皮肤衰老的另一重要表现，以Ⅰ型胶原蛋白为主的胶原蛋白是细胞外基质中最主要的结构蛋白，对维持皮肤的机械强度发挥关键作用；细胞外基质中另一种重要蛋白弹性蛋白在保持皮肤弹性、防止变形方面发挥关键作用。因此，提高真皮成纤维细胞的增殖活性、通过提高细胞外基质中胶原蛋白和弹性蛋白的含量抑制细胞外基质的降解可以有效抑制皮肤衰老。上述实验表明，与正常人脐带间充质干细胞分泌的外泌体相比，miR-328-3p表达上调的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体一方面可以提高人真皮成纤维细胞的增殖活性，另一方面可以提高人真皮成纤维细胞的细胞外基质中Ⅰ型胶原蛋白和弹性蛋白的含量，具有开发成抗皮肤衰老的护肤品或药品的前景。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (4)

1.一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：该脐带间充质干细胞外泌体为miR-328-3p表达上调的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
2.权利要求1所述脐带间充质干细胞外泌体的抗皮肤衰老用途。
3.根据权利要求2所述的用途，用于制备抗皮肤衰老的护肤品或药品。
4.根据权利要求3所述的用途，所述护肤品为精华液、乳液、面膜或面霜。
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Address after: 211198 life science and Technology Town, Jiangning high tech Zone, 568 longmian Avenue, Jiangning District, Nanjing City, Jiangsu Province

Applicant after: Zhou Guiying

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Applicant before: Huaian taikairui Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.

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