CN102482698A

CN102482698A - 条件培养基和来自低氧含量条件下培养的细胞的胞外基质组合物

Info

Publication number: CN102482698A
Application number: CN2010800401312A
Authority: CN
Inventors: G·K·诺尔顿; F·齐格勒; M·鲍姆加特纳; K·尼克
Original assignee: Histogen Inc
Current assignee: Histogen Inc
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-07-09
Also published as: PT2451964T; KR20120089235A; DK2451964T3; AU2010271212A1; RU2012104650A; BR112012000517A2; RU2631488C2; HUE038882T2; CA2767600C; KR101834019B1; BR112012000517B1; CA2767600A1; HRP20180594T1; EP2451964A1; EP2451964A4; NO2451964T3; CA3152419A1; ES2667265T3; AU2010271212B2; WO2011006107A1

Abstract

本发明涉及产生包含胚蛋白质的组合物的方法。该方法包括在生物相容性支撑物上在低氧含量条件下体外培养细胞。培养方法同时产生可溶和不可溶部分，其可单独使用或组合使用以获得生理学上可接受的在各种应用中有用的组合物。

Description

条件培养基和来自低氧含量条件下培养的细胞的胞外基质组合物

发明背景

发明领域

本发明一般涉及胞外基质组合物或条件培养基的生产和应用，更具体而言，涉及通过在低氧含量条件下在合适的生长培养基中培养细胞而获得的组合物和/或蛋白质。

背景信息

胞外基质(ECM)是在体内发现的哺乳动物组织中围绕并支持细胞的复杂结构实体。ECM常常被称为结缔组织。ECM主要由三大类生物分子组成，包括结构蛋白，如胶原蛋白和弹性蛋白；特化蛋白(specialized proteins)，如肌原纤蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白；以及蛋白聚糖。

本领域中已经描述了ECM组合物在体外的生长及其在各种治疗和医疗应用中的用途。这样的ECM组合物的一个治疗应用包括治疗和修复软组织和皮肤缺陷，如皱纹和伤疤。

由缺陷，如痤疮、手术疤痕或老化引起的软组织缺陷的修复或增强已经被证明非常困难。一些材料已被用于矫正软组织缺陷，取得了不同程度的成功，然而，没有一种材料是十分安全和有效的。例如，硅引起各种生理学和临床问题——包括长期的副作用，如小瘤、复发性蜂窝组织炎和皮肤溃疡。

胶原蛋白组合物也被用作用于软组织增强的可注射材料。胶原蛋白是结缔组织的主要蛋白质，也是哺乳动物中最丰富的蛋白质，占总蛋白质含量的约25％。目前文献中描述了28种胶原蛋白(详细列举参见，例如以下表1和2)。然而，身体中90％以上的胶原蛋白是胶原蛋白I、II、III和IV。

不同的胶原蛋白材料已被用于治疗软组织缺陷，如重构的可注射牛胶原蛋白、交联胶原蛋白或其它异源胶原蛋白。然而，这样的胶原蛋白存在若干问题。常见问题包括生产植入材料以去除可能的免疫源性物质，避免对象中的过敏反应的复杂性和高成本。另外，利用这样的胶原蛋白治疗未被证明是持久的。

也描述了可用于软组织修复或增强的其它材料，如含水凝胶中的生物相容性陶瓷颗粒(美国专利号5,204,382)、热塑性和/或热固性材料(美国专利号5,278,202)和乳酸基聚合掺合物(美国专利号4,235,312)。另外，还描述了天然分泌的ECM组合物的应用(美国专利号6,284,284)。然而，这样的材料均被证明具有局限性。

因此，软组织修复和增强需要克服现有材料缺陷的新材料。

对提供安全的、可注射的、持久的、生物可吸收的软组织修复和增强材料存在需求。

在体外培养的ECM组合物可另外被用于治疗损伤组织，如损伤的心肌及相关组织。组合物作为可植入装置，如支架；促进器官，如心组织和相关组织中血管形成的人工血管；以及在疝修复、骨盆底修复、伤口修复和回旋套修复中有用的装置，如补片等等上的植入物或生物涂层是有用的。

冠心病(CHD)，也称为冠状动脉疾病(CAD)、缺血性心脏病和动脉粥样硬化性心脏病，其特征是向心脏供应血液和氧的小血管变窄。冠心病通常由被称为动脉粥样硬化的病症引起，所述动脉粥样硬化在脂肪物质和斑点在动脉壁上沉积时发生，致使动脉变窄。因为冠状动脉狭窄，到达心脏的血流会减缓或中止，引起胸部疼痛(稳定型心绞痛)、气促、心脏病发作和其它症状。

在美国，冠心病(CHD)是引起男性和女性死亡的主要原因。根据美国心脏学会，1500万以上的人患有某种形式的该病症。虽然冠心病的症状和征兆在该疾病的晚期状态是明显的，但由于该疾病在突然发生心脏病发作之前发展，患有冠心病的大部分个体数十年都不显示疾病征兆。该疾病是突然死亡的最常见的原因，也是20岁以上的男人和女人死亡的最常见原因。根据美国现在的趋势，一半的40岁的健康男性以及三分之一的40岁的健康女人将会患CHD。

改善患病或以其它方式受损的心脏中血流的当前方法涉及侵入性外科技术，如冠状动脉架桥外科、血管成形术和动脉内膜切除术。这样的程序自然涉及外科手术中和外科手术后高程度的固有风险，并常常仅为心脏缺血提供暂时的补救。因此，需要新的治疗选择，以增加用于治疗CHD和相关症状的、当前可利用的技术的成功。

体外培养的ECM组合物可另外被用于修复和/或使受损细胞或组织再生，如软骨或骨软骨细胞。骨软骨组织是涉及或含有骨或软骨的任何组织。本发明的组合物对于治疗由于外伤而患有软骨缺损的患者中的骨软骨缺损，如变性结缔组织疾病，如类风湿和/或骨性关节炎以及缺损是有用的。

当前对修复骨软骨缺损的尝试包括将人软骨细胞植入生物相容性和生物可降解的水凝胶移植物中，以试图提高恢复关节软骨损伤的可能性。另外，已经描述了在藻酸盐微球或含多硫酸化藻酸盐的基质中培养软骨细胞的技术来产生透明素样的软骨组织。然而，通过植入人自体软骨细胞来修复关节软骨的软骨内损伤的尝试成效有限。因此，需要新的治疗选择，以增加当前可利用的治疗骨软骨缺损的技术的成功。

体外培养的ECM组合物在产生改造的组织植入物的组织培养体系中也是有用的。组织工程领域涉及使用细胞培养技术产生新的生物组织或修复损伤组织。部分受干细胞革命的促进，组织工程技术提供组织再生并取代随后的外伤或治疗变性疾病的希望。它也可用于整容手术的背景中。

组织工程技术可用于利用各种细胞类型和培养技术产生自体和异源组织或细胞。在产生自体植入物期间，可以收获供体组织并将其解离成单个细胞，随后附着并在待被植入到功能性组织期望部位的底物上培养。可利用细胞培养技术使许多分离的细胞类型在体外增殖，然而，依赖贴壁细胞要求特定的环境，该环境常常包括三维支架的存在，以充当生长的模板。

当前的组织工程技术通常提供人工植入物。成功的细胞移植治疗取决于同时用于体外和体内组织培养的合适底物的发展。因此，仅含天然物质并适于植入的ECM的发展会具有更多内源组织的特征。因此，天然ECM物质的产生是组织工程领域正面临的挑战。

发明内容

本发明部分基于这样一个开创性发现：即在刺激早期胚胎环境的条件(例如，低氧和减小的重力)下培养(例如，按照二维或三维)的细胞产生具有胎性质的ECM组合物。通过在低氧含量条件下培养细胞而产生的含有一种或多种胚蛋白质的ECM组合物具有多种有益应用。

在一个实施方式中，本发明提供制备含有一种或多种胚蛋白质的ECM组合物的方法。该方法包括在合适的生长培养基中在低氧含量条件(例如，二维或三维生长)下培养细胞，产生可溶和不可溶部分。在各个方面，组合物包括独立的可溶和不可溶部分以及可溶和不可溶部分的组合。在各个方面，产生的组合物包括上调层粘连蛋白、胶原蛋白和Wnt因子的基因表达和产生。在其它方面，产生的组合物包括下调层粘连蛋白、胶原蛋白和Wnt因子的基因表达。在其它方面，组合物是物种特异性的，并包括来自单个动物物种的细胞和/或生物学物质。虽然体外培养的ECM组合物在治疗人中是有用的，但这样的组合物也可应用于其它动物物种中。因此，这样的组合物非常适于兽医应用。

在另一个实施方式中，本发明提供产生Wnt蛋白质和血管内皮生长因子(VEGF)的方法。该方法包括在合适的生长培养基中在低氧含量条件(例如，二维或三维生长)下培养细胞，从而产生Wnt蛋白质和VEGF。在各个方面，生长培养基不含血清，低氧含量条件为1-5％的氧。在相关方面，与在约15-20％氧的氧条件中产生的介质(media)相比，Wnt物质被上调。在一个示例性方面，Wnt物质为wnt 7a和wnt 11。在其它实施方式中，条件培养基作为含有本文所述的各种蛋白质的组合物被分离。

在另一个实施方式中，本发明包括通过使待修复或再生的细胞与本文所述的ECM组合物接触而修复和/或再生细胞的方法。在一个方面，细胞是骨软骨细胞。因此，该方法考虑骨软骨缺损的修复。

在另一个实施方式中，ECM组合物作为可植入装置上的植入物或生物涂层是有用的。在各个方面，本发明的组合物包含在植入物中或被用作可植入装置，如支架和人工血管上的生物涂层，以促进器官，如心和相关组织中的血管形成。在相关方面，组合物包含在组织再生补片(patch)或植入物中，在疝修复、骨盆底修复、伤口修复、回旋套(rotator cuff)修复等等中是有用的。

在再一个实施方式中，本发明包括改善对象中皮肤表面的方法，包括在皱纹部位给对象施用本文所述的ECM组合物或条件培养基。在再一个实施方式中，本发明包括在对象中软组织修复或增强的方法，包括在皱纹部位给对象施用本文所述的ECM组合物。

在另一个实施方式中，本发明包括组织培养体系。在各个方面，该培养体系由本文所述的ECM组合物或培养基，如包含在二维或三维支撑物材料中的那些组成。在另一个方面，本文所述的ECM组合物充当各种细胞类型生长的支撑物或二维或三维支撑物。例如，培养体系可用于支撑干细胞的生长。在一个方面，干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞。

在另一个实施方式中，本发明的组合物可用于提供联合在对象中植入装置应用的表面涂层，以促进内皮化和血管形成。

在另一个实施方式中，本发明包括通过培养细胞(例如，成纤维细胞，在低氧含量条件下)而产生干细胞，从而产生以比在含氧量正常的条件下生长时高至少3倍的水平表达干细胞基因特征的细胞。这样的基因可以包括，例如Oct4、Sox2、KLF4、NANOG和cMyc。

通过本发明方法产生的干细胞优选为多能细胞。任何基质干细胞或非干细胞均可被用作起始细胞类型。

在另一个实施方式中，本发明的组合物可用于提供治疗损伤组织的方法。该方法包括在允许治疗损伤组织的条件下使损伤组织与组合物接触，所述组合物通过在含有一种或多种胚蛋白质的二维或三维支撑物上在低氧含量条件下培养细胞而产生。

在另一个实施方式中，本发明包括生物学载体，用于细胞递送或维持在递送部位，所述生物学载体包括本文所述的ECM组合物。该载体可用于这样的应用，如将细胞，如干细胞注射到受损的心肌，或者用于腱和韧带修复。

在另一个实施方式中，本发明提供刺激或促进毛发生长的方法。该方法包括使细胞与本文所述的ECM组合物或条件培养基接触。在一个示例性方面，细胞是毛囊细胞。在各个方面，细胞可以在体内或体外被接触。

附图简述

图1显示植入涂有hECM的聚丙烯筛网后2周FBGC形成的图示。图1A显示在植入未涂覆的纤维(第一个柱)和hECM涂覆的纤维(第二个柱)之后2周每条纤维的FBGC数目。图1B显示在植入未涂覆的纤维(柱1-3)和ECM涂覆的纤维(柱4-6)之后2周每条纤维的FBGC数目。*表示p＜0.05。

图2显示植入涂有hECM的聚丙烯筛网之后2周FBGC形成的图示。图2A显示在植入未涂覆的纤维(第一个柱)和hECM涂覆的纤维(第二个柱)之后5周每条纤维的FBGC数目。图2B显示在植入未涂覆的纤维(柱1和3)和hECM涂覆的纤维(柱2和4)之后5周每条纤维的FBGC数目。

图3显示人毛囊细胞的图示。图3A是在hECM存在的情况下细胞培养四周并随后移植到小鼠中再生长4周之后人毛囊细胞的图，而图3B是对照滤泡细胞的图。

图4显示如MTT分析所示的成纤维细胞对胞外基质组合物(小鼠ECM和人ECM)的代谢反应的图示。

图5是如Pico Green分析所测量的响应人成纤维细胞暴露于hECM的细胞数目的图示。

图6是在激光治疗后第3、7和14天获取的41个人对象的红斑评估的图示。以0(无)到4(严重)的范围评估红斑的严重性。4个数据组(0.1×hECM、1×hECM、10×hECM和对照，从左到右)的每一组表示在第3(左)、7(中)和14(右)天的评估。

图7是在激光治疗后第3、7和14天获取的41个人对象的水肿评估的图示。以0(无)到2.5(严重)的范围评估红斑的严重性。4个数据组(0.1×hECM、1×hECM、10×hECM和对照，从左到右)的每一组表示在第3(左)、7(中)和14(右)天的评估。

图8是在激光治疗后第3、7和14天获取的41个人对象的结痂(crusting)评估的图示。以0(无)到3.5(严重)的范围评估红斑的严重性。4个数据组(0.1×hECM、1×hECM、10×hECM和对照，从左到右)的每一组表示在第3(左)、7(中)和14(右)天的评估。

图9是在激光治疗后第3、7和14天获取的41个人对象的经表皮失水(TWEL)值的图示。以0(无)到4(严重)的范围评估TWEL的严重性。4个数据组(0.1×hECM、1×hECM、10×hECM和对照，从左到右)的每一组表示在第3(左)、7(中)和14(右)天的评估。

图10是来自眼周区域的硅复制物的三维轮廓(profilometry)图像分析的图示。在激光治疗之前，治疗后4周和治疗后10周采取22个对象的数据点。数据系列A表示hECM施用的值；数据系列B表示对照。

图11是激光手术后矿脂应用的分析的图示。

图12是用在激光手术后第0、3、5、7、10和14天获取的数据点分析皮肤红斑的图示。

图13是用在激光手术后第0、3、5、7、10和14天获取的数据点的黑色素和血红素测量仪(mexameter)分析的图示。

图14显示植入涂有hECM的聚丙烯筛网之后2周FBGC形成的图示。图14A显示在植入未涂覆的纤维(第一个柱)和hECM涂覆的纤维(第二个柱)之后2周每条纤维的FBGC数目。图14B显示在植入未涂覆的纤维和ECM涂覆的纤维之后2周每条纤维的FBGC数目。

图15显示在植入涂有hECM的聚丙烯筛网之后5周FBGC形成的图示。图15A显示在植入未涂覆的纤维(第一个柱)和hECM涂覆的纤维(第二个柱)之后5周每条纤维的FBGC数目。图15B显示在植入未涂覆的纤维和ECM涂覆的纤维之后5周每条纤维的FBGC数目。

图16显示在植入涂有hECM的聚丙烯筛网之后2周测定的平均纤维囊厚度的图示。图16A显示在植入未涂覆的纤维(第一个柱)和hECM涂覆的纤维(第二个柱)之后2周平均纤维囊厚度。图16B显示在植入未涂覆的纤维和ECM涂覆的纤维之后2周平均纤维囊厚度。

图17显示在植入涂有hECM的聚丙烯筛网之后5周测定的平均纤维囊厚度的图示。图17A显示在植入未涂覆的纤维(第一个柱)和hECM涂覆的纤维(第二个柱)之后5周平均纤维囊厚度。图17B显示在植入未涂覆的纤维和ECM涂覆的纤维之后5周平均纤维囊厚度。

图18显示表现在施用包含wnt 7a的hECM之后毛发生长特性的柱状图的图示。

图19显示表现在开始测试包含wnt 7a的hECM的施用功效的研究之后12周2个测试对象的毛发生长特性的表格表示。

图20显示表现在开始测试包含wnt 7a的hECM的施用功效的研究之后22周2个测试对象的毛发生长特性的表格表示。

图21显示与处理对象相比对照对象的综合结果(aggregate result)的图示，两者均不包括微扰。图21A显示3月时的结果。图21B显示5月时的结果。

图22显示与hECM处理对象相比对照对象的综合结果的图示，两者均不包括微扰。图22A显示3月时的结果。图22B显示显示5月时的结果。

图23显示如通过终毛密度所测量的对象在3月时对hECM治疗的响应的分布图示。

图24显示如通过毫毛密度所测量的对象在3月时对hECM治疗的响应的分布图示。

图25显示如通过毛发厚度密度(thickness hair density)所测量的对象在3月时对hECM治疗的响应的分布图示。

图26显示如通过平均毛发厚度(thickness hair mean)所测量的对象在3月时对hECM治疗的响应的分布图示。

图27显示毛发生长测量结果的图示。

图28显示傅里叶变换红外(FTIR)光谱学的图示。

发明祥述

本发明涉及制备包含一种或多种胚蛋白质的ECM组合物或条件培养基的方法。尤其地，该组合物通过在合适的生长培养基中在低氧含量条件(例如，二维或三维生长)下培养细胞而产生。培养方法同时产生可溶和不可溶部分，可被单独或组合使用，以获得具有多种应用的生理学上可接受的组合物。

干细胞和多能祖细胞的分裂、分化和功能受微环境——包括氧利用率——中的复杂信号影响。严重缺氧(低氧)区域出现在肿瘤中，例如由于快速细胞分裂和异常血管形成。低氧诱导因子(HIF)介导对正常组织和癌中的局部化低氧的转录反应，并可通过改变细胞代谢和刺激血管生成(angiogenesis)来促进肿瘤发展。最近，已经显示HIF激活特异性信号传导途径，如Notch和控制干细胞自我更新和多潜能的转录因子，如Oct4的表达。因为许多癌症被认为由少量被转化的、自我更新的和多能“癌干细胞”所发展，这些结果表明HIF在肿瘤发展中的新角色。本实施例中显示的数据表明，在低氧含量条件下培养的细胞表达通常与多能细胞有关的基因，例如，如Oct4、NANOG、Sox2、KLF4和cMyc。

本发明的组合物具有多种应用，包括但不限于：促进修复和/或再生受损细胞或组织、应用于补片和植入物中以促进组织再生(例如，疝修复、骨盆底修复、回旋套修复和伤口修复)、应用于培养细胞，如干细胞的组织培养体系中、应用于联合可植入装置(例如，起搏器、支架、支架移植物、人工血管、心瓣膜、支路、药物递送端口或导管、疝和骨盆底修复补片)使用的表面涂层中、促进软组织修复、增强和/或改善皮肤表面，如皱纹、创伤后皮肤应用(例如，激光后)、毛发生长、用作生物学抗粘连剂或用作生物学载体，用于细胞递送或维持在递送部位。

本发明部分基于这样的发现：即，在血管生成前在刺激早期胚胎环境(低氧和减小的重力)的条件下在微球(微载体)或三维支架上培养的细胞产生具有胎性质的ECM组合物，包括产生胚蛋白质。细胞在低氧含量条件下生长表明具有胎性质的独特ECM和条件培养基以及生长因子表达。不同于在传统培养条件下培养ECM，超过5000个基因在低氧含量条件下培养的ECM中被差异表达。这产生具有不同特性和不同生物学组成的培养的ECM。例如，在低氧含量条件下产生的ECM与胎间充质组织相似，因为它相对富含胶原蛋白III型、IV型和V型以及糖蛋白，如纤连蛋白、SPARC、血小板反应蛋白和透明质酸。

低氧也增强调节伤口愈合和器官发生的因子的表达，所述因子如VEGF、FGF-7和TGF-β以及多种Wnt因子——包括wnt 2b、4、7a、10a和11。如通过提高的酶活性所测量的，培养的人胚ECM也体外刺激人成纤维细胞代谢活性的增加。另外，细胞数目响应于培养的胚ECM而增加。

在描述本发明组合物和方法之前，应该理解该发明并不限于所描述的具体组合物、方法和试验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以变化。同样应该理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，而并不意图为限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。

如本说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一(a、an)和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。因此，例如，“该方法”的指代包括一个或多个本文所述类型的方法和/或步骤，所述方法和/或步骤对于本领域技术人员来说在阅读本公开内容之后将变得显而易见，等等。

在各个实施方式中，本发明涉及制备包含一种或多种胚蛋白质的ECM组合物的方法及其应用。尤其地，该组合物通过在低氧含量条件下在合适的生长培养基中培养细胞而产生。本发明考虑作为单细胞层或在微球/微载体上的生长。此外，可以通过使细胞在产生多层细胞培养体系的三维构架上生长而衍生该组合物。根据本发明，在三维构架支撑物上生长的细胞在多个层中生长，形成细胞基质。对比在ECM和条件培养基中的传统培养，在低氧含量条件下使培养的细胞生长由于缺氧培养条件而导致差别基因表达。

ECM是蛋白质和生物聚合物的组合物，所述生物聚合物基本上包含通过培养细胞而产生的组织。基质细胞，如成纤维细胞是不依赖贴壁细胞类型，其需要生长同时附着于适于细胞培养的材料和表面。通过培养的细胞而产生的ECM材料沉积在为组织样结构的形成提供空间的三维装置(arrangement)中。

提供三维构造的培养材料被称为支架。当期望时，沉积ECM的空间的形式为孔，例如织造(编制的)筛网中的孔或者在球形微球——被称为微载体——的紧密构型中产生的间隙空间。

如本文所使用的，“胞外基质组合物”同时包括可溶和不可溶部分或其任何部分。不可溶部分包括沉积在支撑物或支架上的那些分泌的ECM蛋白质和生物学成分。可溶部分指培养基或条件培养基，并包括没有沉积在支架上的那些蛋白质和生物学成分，在所述培养基或条件培养基中细胞已经被培养并且细胞已经向其中分泌活性剂(一种或多种)。两部分均可被收集，而且任选地，被进一步加工以及在本文所述的多种应用中单独或组合使用。

用于培养基质细胞的三维支撑物或支架可以是的任何材料和/或形状，其允许细胞附着其上(或者可被修饰为允许细胞附着其上)；并允许细胞在一个以上的层中生长(即，形成与体内组织生长相似的三维组织)。在其它实施方式中，基本上二维的片或膜可用于培养形式足够三维的细胞。

使生物相容性材料形成三维结构或支架，其中该结构具有用于细胞附着并生长成三维组织的间隙空间。一些实施方式中的构架的孔和/或间隙空间具有适当的尺寸，以允许细胞跨过孔或空间伸展。维持跨过构架伸展的活跃生长的细胞似乎提高与本文所述活性有关的生长因子的所有组成成分的产量。如果孔太小，则细胞可以迅速实现汇合但不能容易地从筛网出来。这些捕获的细胞可显示接触抑制并中断支持增殖和维持长期培养所必需的适当因子的产生。如果孔太大，则细胞可能不能伸展跨过孔，这会导致支持增殖并维持长期培养所必需的适当因子的基质细胞产量降低。通常，间隙空间为至少约100um、至少140um、至少约150um、至少约180um、至少约200um或至少约220um。当使用筛网型的基质时，如本文所示例的，我们发现约100μm到约220μm范围的孔将令人满意地起作用。然而，根据三维结构和构架的复杂性，其它尺寸是允许的。根据本文的方法，允许细胞伸展和继续复制并生长长的时间段的任何形状或结构均可用以精制细胞因子。

在一些方面，三维构架由聚合物或线，所述聚合物或线是编织的(braided)、织造的、编结的(knitted)或以其它方式排列以形成构架，如筛网或织物(fabric)。材料也可以通过将材料或构造(fabrication)铸塑成泡沫、基质或海绵状支架而形成。在其它方面，三维构架的形式为并结纤维，其通过将聚合物或其它纤维挤压在一起而形成，以产生具有间隙空间的材料。三维构架可以采用任何形式或几何形状，用于培养中细胞的生长。因此，如以下进一步描述地，其它形式的构架可足以产生适当的条件培养基。

许多不同的材料可用于形成支架或构架。这些材料包括非聚合物和聚合物材料。在使用时，聚合物可以是任何类型的聚合物，如均聚物、无规聚合物、共聚物、嵌段聚合物、共嵌段聚合物(例如，二、三等)、线性或支化聚合物和交联或非交联聚合物。用作支架或构架的材料的非限制性实例包括玻璃纤维、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺(例如，尼龙)、聚酯(例如，涤纶)、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯化合物(例如，聚氯乙烯；PVC)、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE；TEFLON)、thermanox(TPX)、硝基纤维素、多糖(例如，纤维素、脱乙酰壳多糖、琼脂糖)、多肽(例如，丝、明胶、胶原蛋白)、聚乙醇酸(PGA)和葡聚糖等等。

在一些方面，构架或微载体/微球可以由在使用条件下随着时间降解的材料制成。生物可降解也指在体内或在体外条件下施用时化合物或组合物的可吸收性或降解。生物降解可通过生物剂直接或间接的作用而发生。生物可降解材料的非限制性实例包括聚交酯、聚乙醇酸交酯、聚(碳酸亚丙基酯)、聚交酯-乙交酯共聚物(即，PLGA)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚己酸内酯、肠线结构材料、胶原蛋白(例如，马胶原蛋白泡沫)、聚乳酸或透明质酸等等。例如，这些材料可被织造成三维构架，如胶原蛋白海绵或胶原蛋白凝胶。

在其它方面，在培养物将被长期维持、低温保藏的情况下和/或在期望额外的结构完整性的情况下，三维构架可由非生物可降解材料组成。如本文所使用的，非生物可降解材料指在培养基中的条件下并不明显降解或分解的材料。示例性的不可降解的材料包括——作为非限制性实例——尼龙、涤纶、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、膨胀型PTFE(ePTFE)和纤维素。示例性的不可降解三维构架包括尼龙筛网，可以商品名

获得，其是一种尼龙过滤筛网，平均孔径为140μm和平均尼龙纤维直径为90μm(#3-210/36，Tetko，Inc.，N.Y.)。

在其它方面，微球、支架或构架是生物可降解和非生物可降解材料的组合。非生物可降解材料在培养期间为三维支架提供稳定性，而生物可降解材料允许形成足以产生细胞网络的间隙空间，所述细胞网络产生足以用于治疗应用的细胞因子。生物可降解材料可涂覆于非生物可降解材料上或被织造成、编织成或形成筛网。可以使用生物可降解和非生物可降解材料的各种组合。示例性的组合是涂覆有生物可降解聚合物薄膜——聚D-L-乳酸-乙醇酸共聚物——的聚对苯二甲酸乙二酯(PET)织物，以获得极性结构。

在各个方面，支架或构架材料可以在用细胞接种之前被预处理，以增强细胞附着。例如，在用细胞接种之前，用0.1M乙酸处理一些实施方式中的尼龙筛子(screen)，并在聚赖氨酸、胎牛血清和/或胶原蛋白中温育，以涂覆尼龙。可以利用硫酸同样地处理聚苯乙烯。在其它实施方式中，在三维支撑物构架存在的情况下细胞的生长可通过以下被进一步增强：向构架加入蛋白质(例如，胶原蛋白、弹性蛋白纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸乙酰肝素、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、硫酸皮肤素、硫酸角质素等)、纤连蛋白和/或糖聚物(聚[N-对-乙烯基苄基-D-乳酰胺(lactoamide)]，PVLA)或用其涂覆，以改善细胞附着。支架或构架处理在材料为不易于细胞附着的底物的情况下是有用的。

在一个方面，筛网被用于产生ECM。筛网为平织纹形式的织造尼龙6材料，具有约100μm的孔和约125μm的厚度。在培养中，成纤维细胞通过带电荷的蛋白质相互作用附着到尼龙，并发展成筛网空隙，同时产生并沉积ECM蛋白质。过大或过小的筛网孔可能没有效，但可以不同于以上那些而基本上不改变产生或沉积ECM的能力。在另一个方面，织纹构型的其它织造材料，如聚烯烃的织造材料被用于ECM产生，产生适当的几何形状，用于细胞生长和ECM沉积。

例如，通过切割成期望的尺寸，用0.1-0.5M乙酸洗涤，接下来用高纯水漂洗，然后蒸汽清洁消毒，用本发明的任何步骤制备尼龙筛网，用于培养。为了用作ECM生产的三维支架，将筛网尺寸制作为约10cm×10cm的正方形。然而，筛网可以是适于预定应用的任意尺寸，并且可用于本发明的任意方法，包括用于接种的培养方法、细胞生长和ECM生产以及最终形式的制备。

在其它方面，用于产生培养的组织的支架由微载体组成，所述微载体是微球或颗粒。微球可以是微观的或肉眼可见的，并可进一步被按尺寸切割，以允许穿透到组织中，或被压紧，以形成特定的几何形状。颗粒和细胞的复合体的尺寸足以被施用到组织或器官中，如通过注射或导管。微球或微载体通常被认为是二维体系或支架，而且通常允许二维(例如，单细胞层)生长。

如本文所使用的，“微载体”指具有纳米到微米大小的颗粒，其中，该颗粒可以是任何形状或几何形状，不规则的、非球形的、球形的或椭圆形。

适于本文目的的微载体的尺寸可以是适于具体应用的任意尺寸。在一些实施方式中，适于本发明的微载体的尺寸可以是通过注射施用的那些尺寸。在一些实施方式中，微载体的具体尺寸范围为至少约1μm、至少约10μm、至少约25μm、至少约50μm、至少约100μm、至少约200μm、至少约300μm、至少约400μm、至少约500μm、至少约600μm、至少约700μm、至少约800μm、至少约900μm、至少约1000μm。

在一些方面，其中，微载体由生物可降解材料制成。在一些方面，可以使用包含一个或多个不同生物可降解聚合物层的微载体。在一些实施方式中，至少外部第一层具有形成培养中的组织的生物可降解特性，而具有不同于第一层特性的至少生物可降解的内第二层被制备，以在施用到组织或器官中时腐蚀。

在一些方面，微载体为多孔微载体。多孔微载体指这样的微载体：其具有空隙，通过该空隙分子可以扩散进入或者从微粒中出来。在其它实施方式中，微载体为非多孔微载体。非多孔微粒指其中具有选定尺寸的分子并不在该微粒中扩散或从该微粒中出来的微粒。

用于组合物的微载体是生物相容性的并对细胞具有低毒性或没有毒性。合适的微载体可以根据以下被选择：待治疗的组织、待治疗的损伤类型、期望的治疗长度、细胞培养物在体内的寿命和形成三维组织所需的时间。微载体可以包含各种聚合物，这些聚合物是天然的或合成的、带电的(即，阴离子的或阳离子的)或不带电的、生物可降解的或非生物可降解的。聚合物可以是均聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、枝接物共聚物和支化聚合物。

在一些方面，微载体包含非生物可降解微载体。非生物可降解微囊和微载体包括但不限于由聚砜、聚丙烯腈-氯乙烯共聚物、乙烯-乙烯基乙酸酯、羟乙基甲基丙烯酸酯-甲基-甲基丙烯酸酯共聚物制成的那些。这些对于提供组织膨胀特性或在微载体被身体消除的实施方式中是有用的。

在一些方面，微载体包含可降解支架。这些包括由天然产生的聚合物制成的微载体，所述天然产生的聚合物的非限制性实例包括血纤蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、胶原蛋白、明胶、卵磷脂、脱乙酰壳多糖、藻酸盐或聚氨基酸，如聚赖氨酸等等。在其它方面，可降解微载体由合成的聚合物制成，所述合成的聚合物的非限制性实例包括聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、聚(己酸内酯)、聚二氧六环酮碳酸亚丙基酯、聚羟链烷基酯(polyhybroxyalkonates)(例如，聚(羟丁酸)、聚(乙基谷氨酸盐)、聚(DTH亚氨基羰基(iminocarbony)(双酚A亚氨基碳酸酯)、聚(原酸酯)和聚氰基丙烯酸酯等等。

在一些方面，微载体包含水凝胶，其通常是填充水的亲水聚合物网络。水凝胶具有聚合物溶胀选择性引发的优势。根据聚合物网络的组合物，可以通过多种刺激——包括pH、离子强度、热、电、超声和酶活性——引发微粒溶胀。在水凝胶组合物中有用的聚合物的非限制性实例包括那些由以下形成的聚合物：聚交酯-乙交酯共聚物；聚(N-异丙基丙烯酰胺)；聚(甲基丙烯酸-g-聚乙烯乙二醇)；聚丙烯酸和聚(氧丙烯-氧乙烯共聚物)乙二醇；和天然化合物，如硫酸软骨素(chrondroitan sulfate)、脱乙酰壳多糖、明胶、凝血因子I、或者合成聚合物和天然聚合物的混合物，例如脱乙酰壳多糖-聚(环氧乙烷)。聚合物可以可逆地或不可逆地交联，形成适于形成三维组织的凝胶。

在示例性的方面，用于本发明的微载体或微球全部或部分由葡聚糖组成。

根据本发明，培养方法可应用于不同类型细胞——包括基质细胞，如成纤维细胞，尤其是初级人新生儿包皮成纤维细胞的增殖。在各个方面，如以下进一步描述地，在其它细胞存在或不存在的情况下，被接种到支架或构架上的细胞可以是基质细胞——包括成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞为通常源自结缔组织的基质细胞，所述结缔组织包括但不限于：(1)骨；(2)疏松结缔组织，包括胶原蛋白和弹性蛋白；(3)形成韧带和腱的纤维结缔组织；(4)软骨；(5)血液的ECM；(6)脂肪组织，包括脂肪细胞；和(7)成纤维细胞。

基质细胞可以源自各种组织和器官，如皮肤、心、血管、骨髓、骨骼肌、肝、胰腺、脑、包皮，其可以通过活体解剖(在合适的情况下)或尸体解剖获得。在一个方面，胎儿成纤维细胞可以大量地从包皮，如新生儿包皮获得。

在一些方面，细胞包括成纤维细胞，其可来自胎儿、新生儿、成体来源或其组合。在一些方面，基质细胞包括胎儿成纤维细胞，其可支持多种不同细胞和/或组织的生长。如本文所使用的，胎儿成纤维细胞指源自胎儿来源的成纤维细胞。如本文所使用的，新生儿成纤维细胞指源自新生儿来源(newbornsource)的成纤维细胞。在适当的条件下，成纤维细胞可产生其它细胞，如骨细胞、脂肪细胞和平滑肌细胞以及中胚层来源的其它细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞包括真皮成纤维细胞，其是源自皮肤的成纤维细胞。正常的人真皮成纤维细胞可以从新生儿包皮中分离。这些细胞通常在原代培养结束时被深低温保藏。

在其它方面，可以利用干细胞或祖细胞——单独地或与本文所述的任何细胞类型组合地——制备三维组织。干细胞和祖细胞包括——举例来说而不限于——胚胎干细胞、造血干细胞、神经元干细胞、表皮干细胞和间充质干细胞。

在一些实施方式中，“特异的”三维组织可以通过用细胞接种三维支架而制备，所述细胞源自特定器官即，皮肤、心和/或来自稍后即将根据本文所描述的方法接收培养基中生长的细胞和/或组织的特定个体。

对于某些体内的应用，优选获得来自患者自身组织的基质细胞。在三维基质支撑构架存在的情况下，细胞的生长可通过将蛋白质，例如胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性纤维、网状纤维、糖蛋白；糖胺聚糖，例如，硫酸肝素、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、硫酸皮肤素、硫酸角质素等；细胞基质和/或其它材料加入到构架或用其涂覆构架支撑物而进一步增强。

因此，由于本文所述的二维或三维培养体系适于不同细胞类型和组织的生长，并且，根据待培养的组织和所述胶原蛋白类型，可以选择合适的基质细胞来接种构架。

尽管本发明的方法和应用适合与不同的细胞类型，如组织特异性细胞或本文所述的不同类型的基质细胞一起使用，但本发明使用的细胞衍生化也可以是物种特异的。因此，也可以产生物种特异的ECM组合物。例如，用于本发明的细胞可以包括人细胞。例如，细胞可以是人成纤维细胞。同样地，细胞也来自其它动物种类，如马(马)、犬(狗)或猫(猫)的细胞。另外，来自一个物种或物种菌株的细胞可用于产生ECM组合物，用于其它物种或相关菌株(例如，同种异型的、同源的和异源的)。也应该理解，源自多个物种的细胞可以被组合，以产生多物种ECM组合物。

因此，本发明的方法和组合物适于涉及非人动物的应用。如本文所使用的，“兽医的”指关于医疗或外科手术治疗动物，尤其是家养动物或与其有关的医学科学。普通的兽医动物可以包括哺乳动物、两栖动物、禽类、爬行类和鱼。例如，典型的哺乳动物可以包括狗、猫、马、兔、灵长类、啮齿动物和农场动物，如母牛、马、山羊、绵羊和猪。

当如上所述时，另外的细胞可以与基质细胞一起存在于培养基中。这些另外的细胞可以具有许多有益效果，包括支持在培养基中长期生长、增强生长因子的合成以及促进细胞附着到支架等等。另外的细胞类型包括——作为非限制性实例——平滑肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、周细胞、巨噬细胞、单核细胞和脂肪细胞。这样的细胞可以与成纤维细胞一起被接种到构架，或者在一些方面，在成纤维细胞不存在的情况下被接种到构架。这些基质细胞可以源自合适的组织或器官，包括——举例来说而不限于——皮肤、心、血管、骨髓、骨骼肌、肝、胰腺和脑。在其它方面，一种或多种其他细胞类型——除成纤维细胞以外——被接种到支架。在其它方面，仅用成纤维细胞接种支架。

成纤维细胞可以通过解聚充当成纤维细胞源的合适的器官或组织而容易地分离。例如，组织或器官可以被机械解聚和/或用消化酶和/或螯合剂处理，所述螯合剂削弱邻近细胞之间的连接，使得将组织分散到不含可观察到的细胞断裂的个体细胞的悬浮液成为可能。可以通过切碎组织和用任何数量的消化酶单独地或组合地处理被切碎的组织来完成酶分离。这些酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、链霉蛋白酶和/或分散酶等。机械分裂也可以通过一些方法完成，所述方法包括但不限于应用研磨机、搅拌器、滤网、均浆器、挤压细胞或insonator等等。在一个方面，利用消化酶，通常用胶原蛋白酶和/或胰蛋白酶处理切除的包皮组织，以使细胞从包封的结构中分离。

成纤维细胞的分离，例如，可以通过如下完成：彻底洗涤新鲜组织样品，并在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中切碎，以去除血清。在新制备的解离酶，如胰蛋白酶溶液中，使切碎的组织温育1-12小时。在这样的温育之后，使解离的细胞悬浮，通过离心沉淀，并铺设在培养皿上。所有成纤维细胞将在其它细胞之前附着，因此，合适的基质细胞可以被选择性地分离和生长。然后，分离的成纤维细胞可以生长至汇合，将其从汇合的培养中提起(lift)并接种到三维构架上，参见Naughton等，1987，J.Med.18(3&4)：219-250。用高浓度基质细胞，例如，约10⁶到5×10⁷细胞/ml接种三维构架将导致较短时间内三维基质支撑物的建立。

一旦组织被简化成单个细胞的悬浮液，可将该悬浮液分馏成亚群，从该亚群中可以获得成纤维细胞和/或其它基质细胞和/或元件。这也可以利用用于细胞分离的标准技术来完成，所述标准技术包括但不限于克隆和选择特定细胞类型、选择性破坏不需要的细胞(负选择)、基于混合群体中差别细胞凝集力、冻融程序、混合群体中细胞的差别粘附特性的分离、过滤、常规和区带离心、离心淘汰同步(逆流离心(counter-streaming centrifugation))、单位重力分离(unit gravity separation)、逆流分布、电泳和荧光激活细胞分选术。对于克隆选择和细胞分离技术的评论，参见Freshney，Culture of AnimalCells.A Manual of Basic Techniques，第二版，A.R.Liss，Inc.，New York，1987，11和12章，pp.137-168。

在一个方面，分离的成纤维细胞可以生长以产生细胞库。产生细胞库，以允许开始培养批次(cultivation batch)的各种定量和计时，以及允许先行测试细胞污染物和特定细胞特性。来自细胞库的成纤维细胞随后生长，以将细胞数目增加到适当的水平，用于接种支架。涉及细胞和细胞接触材料环境暴露的操作通过无菌实践来进行，以降低外源物质或不期望的微生物污染的可能。

在本发明的另一个方面，分离后，通过几代，细胞生长的量可以适于构建主细胞库。然后，可以收获细胞库并装入合适的器皿中，在低温条件下保存。来自主细胞库的冰冻小瓶中的细胞可以融化，并通过另外的代次生长(通常为两代或更多代)。然后，可将细胞用于制备低温保存的工作细胞库。

细胞增殖步骤利用处于工作细胞库阶段的成瓶细胞，以进一步增加细胞数目，用于接种支架或支撑物，如筛网或微载体。每一代是一系列的继代培养步骤，包括接种细胞生长支撑物、温育、供养细胞和收获。

细胞库的培养和细胞增殖可以通过接种培养瓶，如培养烧瓶、滚瓶或微载体来进行。基质细胞，如成纤维细胞附着于预定的生长表面，并在培养基存在的情况下进行生长。培养瓶，如培养烧瓶、滚瓶和微载体被特别配置，用于细胞培养，一般由准予用于预定应用的各种可塑性材料制成。微载体通常是微观的或宏观的微球，通常由各种塑性材料制成。然而，它们可以由其它材料制成，所述其它材料，如玻璃或固体/半固体生物基材料，如胶原蛋白或其它材料，如葡聚糖、改性的糖复合体——如上所述。

在培养期间，在细胞生长过程中定期用新鲜培养基替换消耗的培养基，以保持营养供应充足，并去除抑制性培养产物(在条件培养基不是优选的情况下)。培养烧瓶和滚瓶为细胞在其上生长提供表面，并且，通常用于培养依赖贴壁细胞。

在一个方面，在加热到37℃的室中进行温育。要求培养基与室环境交流的培养拓扑学(topology)使用5％CO₂v/v，同时空气在室气体空间中以助于调节pH。可选地，被装备来维持培养温度和pH的器皿可用于细胞增殖和ECM生产作业。温度低于35℃或高于38℃以及CO₂浓度低于3％或高于12％可能是不合适的。

从附着表面收获细胞可以通过以下来进行：去除生长培养基并用缓冲盐溶液漂洗细胞以减少酶竞争蛋白质，施用解离酶，然后在细胞脱离之后中和所述酶。收集收获的细胞悬浮液，并通过离心分离收获液体。从继代培养收获的细胞悬浮液可以被取样以评估回收的细胞量和其它细胞特性，并且，随后与新鲜培养基组合以及作为接种物被应用。用于制备细胞库和支架接种物的传代数目对于实现可接受的ECM特征是关键的。

在制备合适的支架之后，通过用制备的基质细胞种植对其进行接种。可以以各种方式进行支架接种，如沉降。以与缺氧生长筛网相同的方式制备用于在厌氧条件下进行ECM培养而制备的筛网，例外是厌氧培养室不被用于产生低氧含量条件。

例如，对于用于在厌氧和低氧含量条件下进行ECM培养而制备的两种筛网，将被制备并消毒的筛网放置于无菌的150mm直径×15mm深的培养皿中，并堆叠成约10片的厚度。然后，通过沉降接种筛网堆。将细胞加入到新鲜的培养基中，以获得适当浓度的接种物细胞。将接种物加入到筛网堆，在该筛网堆中，细胞固定在尼龙纤维上并在温育条件中附着。在充足的时间之后，可以将单独种植的筛网片无菌地与堆分离，并逐个放入到独立的150mm×15mm培养皿，该培养皿中约含50ml的生长培养基。

在低氧含量条件下温育接种的培养物，发现与在正常培养条件下产生的ECM相比低氧含量条件下产生具有独特特性的ECM和周围介质。如本文所使用的，低氧含量条件特征在于：与环境空气的氧浓度(约15％-25％的氧)相比较低的氧浓度。在一个方面，低氧含量条件特征在于：氧浓度小于约10％。在另一个方面，低氧含量条件特征在于：氧浓度约为0.1％到10％、1％到10％、1％到9％、1％到8％、1％到7％、1％到6％、1％到5％、1％到4％、1％到3％或1％到2％。在某个方面，系统维持约1-3％的氧在培养瓶内。可以通过使用允许控制环境气体浓度的培养装置，例如厌氧培养室来产生和维持低氧含量条件。

细胞培养物的温育通常在具有15-22％氧和5％CO₂的正常大气压下进行，用于增殖和种植，在该点，低氧培养物分裂成充满95％氮/5％CO₂的气密室，以便在培养基中产生缺氧环境。

例如，具有筛网的培养皿被培养以在低氧含量条件下产生ECM，该培养皿最初在温育中在37℃和95％空气/5％CO₂中生长2-3周。在近似大气培养(atmospheric cultivation)时期之后，使具有筛网的培养皿在被设计用于厌氧培养的室中温育，所述室用约95％氮和5％CO₂的气体混合物净化。在培养期间，在大气氧水平用新鲜培养基替换消耗的生长培养基，并且，在交换培养基之后，将装满筛网的培养皿放入厌氧培养室中，该室用95％氮和5％CO₂净化，然后在37℃温育。当它们达到期望的尺寸或含有期望的生物学成分时，收获培养的筛网。

在温育期间期间，在开始发展成构架的孔之前，基质细胞将沿着并包围三维构架线性地生长。生长的细胞产生无数的生长因子、调节因子和蛋白质，它们中的一些分泌在周围介质中，而沉积在支撑物上以更充分地补充ECM的其它一些在以下论述。可将生长和调节因子加入到培养物中，但并不是必需地。基质细胞的培养同时产生不可溶部分和可溶部分。细胞生长到合适的程度，以允许ECM蛋白质的充分沉积。

在三维组织培养期间，增殖的细胞可以从构架释放并粘贴到它们可以继续增殖并形成汇合的单层的培养瓶的壁上。为了最小化可能影响细胞生长的这种情况的发生，可以在送料期间或者通过将三维细胞培养物转移到新的培养瓶中来去除释放的细胞。去除汇合的单层或将培养的组织转移到新器皿中的新鲜培养基中维持或恢复三维培养物的增殖活性。在一些方面，除去或转移可以在培养瓶中进行，该培养瓶具有超过25％汇合的培养细胞的单层。可选地，在一些实施方式中，培养物被搅拌以防止释放的细胞粘住；在其它实施方式中，新鲜培养基通过系统被连续地注入。在一些方面，两种或更多种细胞类型可以同时地或者先后地在一起培养(例如，成纤维细胞和平滑肌细胞或内皮细胞)。

在接种三维支架后，使细胞培养物在支持细胞生长成三维组织的合适营养培养基和温育条件下温育。许多商业可得的培养基，如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagles Medium)(DMEM)、RPMI 1640、Fisher培养基、Iscove培养基和McCoy培养基可适于支持细胞培养物的生长。培养基可以补充有另外的盐、碳源、氨基酸、血清和血清成分、维生素、矿物质、还原剂、缓冲剂、脂质、核苷、抗生素、附着因子和生长因子。不同类型培养基的制剂在本领域技术人员可得的多种参考著作中有描述(例如，Methods for Preparation of Media，Supplement s and Substrates for Serum FreeAnimal Cell Cultures，Alan R.Liss，New York(1984)；Tissue Culture：LaboratoryProcedures，John Wiley&Sons，Chichester，England(1996)；Culture of AnimalCells，A Manual of Basic Techniques，第四版，Wiley-Liss(2000))。

本发明任何培养步骤中应用的生长培养基或培养基——无论是在厌氧条件下或是在低氧含量条件下——可以包括血清或不含血清。在一个方面，培养基是达尔伯克氏改良伊格尔培养基，具有4.5g/L葡萄糖、丙氨酰-L-谷氨酰胺、Eq 2mM，并象征性地补充有10％胎牛血清。在另一个方面，培养基是不含血清的培养基，并且是达尔伯克氏改良伊格尔培养基，具有含

的4.5g/L葡萄糖基培养基，补充有0.5％血清白蛋白、2μg/ml肝素、1μg/ml重组碱性FGF、1μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、1×ITS补充剂(胰岛素-运铁蛋白-硒，Sigma批号I3146)、1∶1000稀释的脂肪酸补充剂(Sigma批号7050)和1∶1000稀释的胆甾醇。另外，相同的培养基可同时用于缺氧培养和厌氧培养。在一个方面，在种植和第一周生长之后，生长培养基由血清基培养基转变成不含血清的培养基。

温育条件将在适当的pH、温度和气体(例如，O₂、CO₂等)条件下，以维持低氧含量的生长条件。在一些实施方式中，三维细胞培养物可以在温育期间悬浮在培养基中，以使增殖活性最大化并产生促进各部分期望生物学活性的因子。另外，可以定期给培养物“送料”，以除去消耗的培养基、减少释放的细胞并增加新的营养源。在温育期间，在开始生长到支架的孔中之前，培养的细胞沿着并包围三维支架的丝体线性地生长。

与在大约15-20％的正常大气氧浓度下温育相比，在低氧含量条件下温育期间，数千细胞被差异表达。已经发现在这样的组合物中，最显著地，在某些层粘连蛋白物质、胶原蛋白物质和Wnt因子中若干基因被上调或下调。在各个方面，三维ECM可以通过与在正常条件下生长相比由于在低氧含量条件下生长而由细胞产生的特有指纹或一组细胞产物来限定。在本文特别示例的ECM组合物中，三维组织和周围介质的特征在于：各种因子的表达和/或分泌。

本文描述的三维组织和组合物具有存在于支架或构架上的ECM。在一些方面，由于在低氧含量条件下生长和选择在支撑物上生长的细胞，ECM包括多种层粘连蛋白和胶原蛋白类型。通过选择加工合适的胶原蛋白类型的成纤维细胞以及使细胞在上调或下调特定层粘连蛋白和胶原蛋白类型的表达的低氧含量条件下生长，可以操纵或提高沉积的ECM蛋白质的比例。

在一些方面，可以利用限定特定胶原蛋白类型的合适的同种型或亚类的单克隆抗体来完成成纤维细胞的选择。在其它方面，固体底物，如磁珠可用于选择或消除已经结合到抗体的细胞。这些抗体的结合可用于选择(正向地或负向地)表达期望的胶原蛋白类型的成纤维细胞。可选地，用于接种构架的基质可以是合成期望的胶原蛋白类型的细胞混合物。示例性的胶原蛋白类型的分布和来源显示在表I中。

表1：各种类型胶原蛋白的分布和来源

可能存在于ECM组合物中的另外类型的胶原蛋白显示在表2中。

表2：胶原蛋白类型及相应的基因(一种或多种)

胶原蛋白类型	基因(一种或多种)
		I	COL1A1、COL1A2
II	COL2A1
		III	COL3A1
IV	COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6
		V	COL5A1、COL5A2、COL5A3
VI	COL6A1、COL6A2、COL6A3
		VII	COL7A1
VIII	COL8A1、COL8A2
		IX	COL9A1、COL9A2、COL9A3
X	COL10A1
		XI	COL11A1、COL11A2
XII	COL12A1
		XIII	COL13A1
XIV	COL14A1
		XV	COL15A1
XVI	COL16A1
		XVII	COL17A1
XVIII	COL18A1
		XIX	COL19A1
XX	COL20A1
		XXI	COL21A1
XXII	COL22A1
		XXIII	COL23A1

XXIV	COL24A1
		XXV	COL25A1
XXVI	EMID2
		XXVII	COL27A1
XXVIII	COL28A1

如上所述，本文所述的ECM组合物包括各种胶原蛋白。如实施例1的表3所示，发现在低氧含量培养的ECM组合物中，几种胶原蛋白的表达被上调。因此，在本发明的一个方面，与在约15-20％氧的氧条件中产生的相比，包含一种或多种胚蛋白质的ECM组合物包括胶原蛋白物质的上调。在另一个方面，被上调的胶原蛋白物质是V型α1；IX型α1；IX型α2；VI型α2；VIII型α1；IV型α5；VII型α1；XVIII型α1；和XII型α1。

除了各种胶原蛋白之外，本文所述的ECM组合物还包括各种层粘连蛋白。层粘连蛋白是糖蛋白异源三聚体家族，由通过卷曲螺旋结构域连接在一起的α、β和γ链亚基组成。迄今，5α、4β和3γ层粘连蛋白链已经被识别，其能组合形成15种不同的同种型。在该结构中有可识别的结构域，其对其它层粘连蛋白和基板分子以及膜结合受体有结合活性。结构域VI、IVb和IVa形成球状结构，而结构域V、IIIb和IIIa(其含富含半胱氨酸的EGF样元件)形成杆状结构。三条链的结构域I和II参与三链卷曲螺旋结构(长臂)的形成。

层粘连蛋白的链具有共有的和独特的功能，并以特定的时间(发育的)和空间(组织-位点特异性)模式被表达。层粘连蛋白α-链被认为是异源三聚体的功能上重要的部分，因为它们显示组织特异性分布模式并含有主要的细胞互作位点。已知血管内皮表达两种层粘连蛋白同种型，不同的表达取决于发育阶段、血管类型和内皮的激活状态。

因此，在本发明的一个方面，与在约15-20％氧的氧条件中产生的相比，包含一种或多种胚蛋白质的ECM组合物包括各种层粘连蛋白物质的上调和下调。

层粘连蛋白8由α-4、β-1和γ-1层粘连蛋白链组成。层粘连蛋白α-4链广泛地分布于成体中和发育期间。在成体中，其可在围绕心纤维、骨骼纤维和平滑肌纤维的基膜中和肺泡隔中被鉴定到。已知其也存在于毛细血管和较大导管中的内皮基膜中和外周神经的围神经基膜中，以及存在于窦状隙间空间(intersinusoidal spaces)、大动脉和较小的骨髓微动脉中。层粘连蛋白8是血管内皮中主要的层粘连蛋白同种型，其通过血小板被表达和粘附并合成于3T3-L1脂肪细胞中，在细胞脂肪转换之后，其合成水平显示提高。层粘连蛋白8被认为是这样的层粘连蛋白同种型：其通常在间充质细胞谱系中表达，以在结缔组织中诱发微导管。层粘连蛋白8已经在小鼠骨髓原代细胞培养物、微动脉壁和窦状隙间空间中被鉴定到，其中，其在发育中的骨髓中是主要的层粘连蛋白同种型。由于其在成体骨髓中的定位邻近造血细胞，含有α-4链的层粘连蛋白同种型有可能与发育中的造血细胞有生物学上相关的相互作用。

因此，在本发明另一个方面，ECM包括层粘连蛋白物质，如层粘连蛋白8的上调。在另一个方面，由本发明三维组织产生的层粘连蛋白至少包括层粘连蛋白8，其限定存在于组合物中的层粘连蛋白质的性质或特征。

本文所述的ECM组合物可以包括各种Wnt因子。Wnt家族因子是信号传导分子，在无数细胞途径和细胞-细胞相互作用过程中具有作用。Wnt信号传导已经牵涉肿瘤发生、胚胎中胚层的早期发育、脑和肾的形态发生、乳腺增生的调节和阿耳茨海默病。如实施例1的表4所示，发现在低氧含量培养的ECM组合物中，若干种类Wnt蛋白质的表达被上调。因此，在本发明的一个方面，与在约15-20％氧的氧条件中产生的相比，包含一种或多种胚蛋白质的ECM组合物包括Wnt物质的上调。在另一个方面，被上调的Wnt物质为wnt7a和wnt 11。在另一个方面，由本发明三维组织产生的Wnt因子至少包括wnt7a和wnt11，其限定存在于组合物中的Wnt蛋白质的性质或特征。

本文所描述的培养方法——包括在低氧含量条件下培养——也已被显示上调各种生长因子的表达。因此，本文所述的ECM组合物可以包括各种生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)。如本文所使用的，VEGF意图包括所有已知的VEGF家族成员。VEGF是生长因子亚家族，更具体地，是胱氨酸结生长因子的血小板衍生的生长因子家族的生长因子亚家族。VEGF在血管发生和血管生成中都具有悉知的作用。已知若干VEGF，包括VEGF-A，其在发现其它VEGF物质之前被称为VEGF。其它VEGF物质包括胎盘生长因子(PlGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。另外，人VEGF的若干同种型是悉知的。

根据通过——如本文所述地——在低氧含量条件下培养而使Wnt蛋白质以及生长因子的产量增加，本发明还提供用于产生Wnt蛋白质和血管内皮生长因子(VEGF)的方法。该方法可以包括——如本文所述地——在低氧含量条件下在合适的生长培养基中在三维支撑物上培养细胞，以产生Wnt蛋白质和VEGF。在一个示例性方面，Wnt物质为wnt 7a和wnt 11，并且VEGF为VEGF-A。如本文所进一步描述地或通过本领域中已知的方法，蛋白质可以进一步被加工或收获。

如在全文中所论述的，本发明的ECM组合物同时包括可溶和不可溶部分(馏分，fraction)或其任何部分(portion)。应该理解，本发明的组合物可以包括两个部分或者之一以及其任意组合。另外，单种成分可以从部分中分离，以单独使用或与其它分离物或已知的组合物组合使用。

因此，在各个方面，利用本发明方法产生的ECM组合物可以直接使用或者以各种方式被加工，所述加工的方法可以适用于不可溶部分和可溶部分。可溶部分——包括不含细胞的上清液和培养基——可经历冻干，以保存和/或浓缩因子。各种生物相容性防腐剂、低温防护剂和稳定剂在需要的时候可用于保存活性。生物相容性剂的实例包括丙三醇、二甲亚砜和海藻糖等等。冻干产物(lyophilizate)也可以具有一种或多种赋形剂，如缓冲液、膨胀剂和张力改性剂。如以下进一步描述地，冻干的培养基可以通过加入合适的溶液或药学稀释剂而重构。

在其它方面，可溶部分被透析。透析是基于选择性跨过多孔膜扩散的分离样品成分的最常用的技术之一。孔尺寸确定以分子量为表征的膜的截留分子量(MWCO)，在所述膜处，90％的溶质被膜保留。在某些方面，具有任何孔尺寸的膜根据期望的截留(cutoff)被考虑。典型的截留为5,000道尔顿、10,000道尔顿、30,000道尔顿和100,000道尔顿，然而，所有的尺寸均被考虑。

在一些方面，可溶部分可以通过沉淀培养基中的活性成分(例如，生长因子)被加工。可以使用各种程序来进行沉淀，如用硫酸铵盐析出或使用亲水聚合物，例如，聚乙烯乙二醇。

在其它方面，使用各种选择性滤器使可溶部分经历过滤。通过过滤处理可溶部分在浓缩存在于该部分中的因子以及除去可溶部分中使用的小分子和溶质中是有用的。滤器对于特定分子量具有选择性，包括＜5000道尔顿、＜10,000道尔顿和＜15,000道尔顿。其它滤器可以被使用，而被加工的培养基可以针对本文所述的治疗活性被分析。示例性的滤器和浓缩系统(concentratorsystem)包括基于以下的那些：中空纤维滤器、盘式滤器(filter disk)和探头滤器(filter probes)等等(参见，例如Amicon Stirred Ultrafiltration Cells)。

在其它方面，使可溶部分经历层析，以去除盐、杂质或分离培养基的各个成分。可以应用各种层析技术，如分子筛层析技术、离子交换层析技术、反相层析技术和亲和层析技术。为了处理条件培养基而不明显损失生物活性，可以使用温和的层析培养基。非限制性的实例包括葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺基分离培养基等等(例如，可以以许多商品名，如Sephadex、Sepharose和Sephacryl得到)。

在其它方面，条件培养基被配制为脂质体。可将生长因子导入或包封到脂质体的腔中，用于运输和延长活性因子的寿命。如本领域中已知的，可将脂质体分成各种类型：多层脂质体(MLV)、稳定多层脂质体(stableplurilamellar)(SPLV)、单层小脂泡(SUV)或单层大脂泡(LUV)。可由各种脂质化合物制备脂质体，所述脂质化合物可以是合成的或者是天然产生的，包括磷脂酰醚和酯，如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；类固醇，如胆甾醇；脑苷脂；鞘磷脂；甘油脂类；和其它脂类(参见，例如美国专利号5,833,948)。

可溶部分可被直接使用而不需另外的添加剂，或者用各种药学上可接受的赋形剂、赋形物或载体制备为药物组合物。“药物组合物”指可溶和/或不可溶部分与至少一种药学上可接受的赋形物、载体或赋形剂的形式。对于皮内施用、皮下施用或肌肉施用，可以在水赋形物或油赋形物中的ECM组合物的无菌悬浮液、溶液或乳液中制备组合物。组合物也可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂或分散剂。用于注射的制剂可以以单位剂型——多剂量容器中的安瓿——存在，可以含有或不含防腐剂。可选地，组合物可以以粉末形式存在，用于用合适的赋形物——包括，举例来说而不限于无菌不含致热源的水、盐水、缓冲液或葡萄糖溶液——来重构。

在其它方面，三维组织是深低温保藏的制备物，其在使用之前被融化。药学上可接受的低温防护剂包括丙三醇、糖、多元醇、甲基纤维素和二甲亚砜等等。糖剂包括单糖、二糖和其它低聚糖，最大冷冻浓缩溶液的玻璃化转变温度(Tg)为至少-60、-50、-40、-30、-20、-10或0℃。用于深低温保藏的示例性糖是海藻糖。

在一些方面，三维组织被处理，以在使用之前杀死细胞。在一些方面，沉积在支架上的ECM可以被收集和被加工，用于施用(参见美国专利号5,830,708和6,280,284，其通过参考被并入本文)。

在其它实施方式中，三维组织可以被浓缩，并用药学上可接受的介质(medium)洗涤，用于施用。用于浓缩组合物的各种技术在本领域中是可得的，如离心或过滤。实例包括葡聚糖沉降和差速离心。三维组织的制剂也可以包括将悬浮液的离子强度调节至等渗(即，约0.1至02)和生理学pH(即，pH 6.8到7.5)。制剂也可含有润滑剂或其它赋形剂，以助于施用或在细胞悬浮液中的稳定性。这些包括糖(例如，麦芽糖)和有机聚合物，如聚乙烯乙二醇和透明质酸等等。

如上所述，本发明的ECM组合物可以以许多方式被加工，这取决于ECM组合物的预期应用和合适的运输或施用。例如，组合物可以作为三维支架或植入物被运输，或者组合物可以被配制用于注射——如上所述。术语“施用(administration)”或“施用(administering)”被限定为包括给需要治疗的对象提供本发明的化合物或药物组合物的行为。如本文中所用的，短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”意为除肠施用和局部施用以外的施用模式，通常通过注射施用，其包括但不限于：静脉内、肌肉、动脉内、鞘内、囊内、框内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内(intraarticulare)、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。如本文中所用的，短语“全身施用”、“经全身施用”、“外周施用”和“经外周施用”意为除直接进入中枢神经系统以外的化合物、药物或其它物质的施用，使得其进入对象的系统，因而经受代谢和其它类似的过程，例如，皮下施用。

如本文中所用的，术语“对象”指对其实施主题方法的任何个体或患者或动物。尽管本领域技术人员将理解对象可以是动物，但通常对象是人。因此，其它动物——包括哺乳动物，如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、农场动物，包括母牛、马、山羊、绵羊、猪等和灵长类(包括猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)——包括在对象的定义内。

本发明的ECM组合物具有多种应用，包括但不限于：促进修复和/或再生受损细胞或组织、应用于补片中以促进组织再生、应用于组织培养体系中用于培养细胞，如干细胞、应用于与可植入装置(例如，起搏器、支架、支架移植物、人工血管、心瓣膜、支路、药物递送端口或导管)联合使用的表面涂层中，促进软组织修复、增强和/或改善皮肤表面，如皱纹、用作生物抗粘连剂或用作生物学载体用于细胞运输或维持在运输位点。

此外，通过如本文任何方法所述的培养细胞衍生的ECM组合物可用于本发明的其它应用或方法。例如，利用本发明组织培养体系通过培养细胞产生的ECM组合物可以，例如，用于细胞修复和/或再生、用于补片中以促进组织再生、用于组织培养体中以培养细胞，如干细胞、用于与可植入装置(例如，起搏器、支架、支架移植物、人工血管、心瓣膜、支路、药物递送端口或导管)联合使用的表面涂层，促进软组织修复、增强和/或改善皮肤表面，如皱纹、用作生物抗粘连剂或用作生物学载体用于细胞运输或维持在运输位点。

在各个实施方式中，本发明包括细胞或组织修复和/或再生和促进软组织修复的方法。一个实施方式包括通过使待修复或再生的细胞与本发明的ECM组合物接触而使细胞修复和/或再生的方法。该方法可用于修复和/或再生本文所述的各种细胞，包括骨软骨细胞。

在一个方面，所述方法考虑骨软骨缺损的修复。如本文所使用的，“骨软骨细胞”指属于软骨形成细胞系或成骨细胞系的细胞，或可经过分化成为软骨形成细胞系或成骨细胞系的细胞，这取决于环境信号。这种潜能可通过已知的技术在体外或体内进行测试。因此，在一个方面，本发明的ECM组合物被用于修复和/或再生软骨形成细胞，例如，能产生软骨的细胞，或其本身分化成产生软骨的细胞——包括软骨细胞——的细胞，和其本身分化成软骨细胞的细胞(例如，软骨细胞前体细胞)。因此，在另一个方面，本发明的组合物在结缔组织的修复和/或再生中是有用的。如本文所使用的，“结缔组织”指哺乳动物体内许多结构组织中任何一种，包括但不限于：骨、软骨、韧带、腱、半月板、真皮、皮下组织(hyperdermis)、肌肉、脂肪组织、关节囊。

本发明的ECM组合物可用于治疗动关节，如膝、脚踝、肘、髋、腕、手指或趾的指节或颞下颌关节的骨软骨缺损。这样的骨软骨缺损可以是由于外伤损伤(例如，运动损伤或过度磨损)或疾病，如骨性关节炎。特别的方面与本发明基质在治疗或预防骨性关节炎软骨表面损伤中的应用有关。此外，本发明在治疗或预防由老化或生产导致的骨软骨缺损中是有用的。在本发明的背景中，骨软骨缺损也应该被理解为包括在外科手术，如但不限于整容手术(例如，鼻、耳)背景下需要软骨和/或骨修复的那些状况。因此，这样的缺损可以发生在软骨或骨形成被中断或软骨或骨被损伤或由于遗传缺陷而不存在的身体的任何部位。

如上所述，诱发或刺激特定细胞生长的生长因子或其它生物剂可以包含在本发明的ECM组合物中。生长因子的类型将取决于细胞类型和计划的组合物的应用。例如，在骨软骨细胞的情况下，可以存在另外的生物活性剂，如细胞生长因子(例如，TGF-β)、刺激软骨发生的物质(例如，刺激软骨形成的BMP，如BMP-2、BMP-12和BMP-13)、刺激基质细胞迁移到支架的因子、刺激基质沉积的因子、抗炎剂(例如，非甾体抗炎剂)、免疫抑制剂(例如，环孢菌素)。也可以包括其它蛋白质，如其它生长因子，如血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、人内皮细胞生长因子(ECGF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管内皮生长因子(VEGF)、软骨衍生的形态发生蛋白(CDMP)、其它骨形态发生蛋白，如OP-1、OP-2、BMP3、BMP4、BMP9、BMP11、BMP14、DPP、Vg-1、60A和Vgr-1、胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维、糖蛋白或糖胺聚糖，如硫酸肝素、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白等。例如，已经发现生长因子，如TGF-β和抗坏血酸盐触发软骨细胞分化和通过软骨细胞形成软骨。此外，透明质酸是用于软骨细胞和其它基质细胞附着的良好底物，并可作为支架的一部分被掺入或涂覆在支架上。

另外，也可以使用影响特定细胞生长和/或活性的其它因子。例如，在软骨细胞的情况下，因子，如通过软骨细胞刺激软骨产生的软骨素酶可以加入到基质中，以维持软骨细胞处于过度生长状态——如在美国专利申请号2002/0122790中所述，其通过引用被并入本文。在另一个方面，本发明方法包括下列物质的存在：多硫酸化藻酸盐或其它多硫酸化多糖，如多硫酸化环糊精和/或多硫酸化菊糖或能刺激结缔组织细胞ECM产生的其它成分——如在国际专利公布号WO 2005/054446中所述的，其通过引用被并入本文。

待修复和/或再生的细胞或组织可以通过本文所述的任何方法在体内或在体外接触。例如，可将ECM组合物注入或植入(例如，通过ECM组织、补片或本发明的涂覆装置)到对象中。在另一个方面，待修复和/或再生的组织或细胞可以从对象收获，在体外培养并随后利用已知的外科手术技术植入或施用到对象中。

如上所述，本发明的ECM组合物可以以各种方式被加工。因此，在一个实施方式中，本发明包括组织培养体系。在各个方面，培养体系由本文所述的ECM组合物组成。本发明的ECM组合物可以以各种方式被掺入组织培养体系中。例如，组合物可以通过浸渍本文所述的三维支架材料作为涂层被掺入，或者作为添加剂被掺入到培养细胞的培养基中。因此，在一个方面，培养体系可以包括浸渍有本文所述的任何ECM组合物，如生长因子或胚蛋白质的三维支撑物材料。

本文所述的ECM组合物可以用作各种细胞类型生长的支撑物或三维支撑物。能够进行细胞培养的任何细胞类型均被考虑。在一个方面，培养体系可用于支持干细胞的生长。在另一个方面，干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞。

组织培养体系可用于产生另外的ECM组合物，如可植入组织。因此，利用本发明的组织培养体系进行的细胞培养可以在体内或在体外进行。例如，本发明的组织培养体系可用于产生ECM组合物，用于注射或植入到对象中。由组织培养体系产生的ECM组合物可被加工和用于本文所述的任何方法。

本发明的ECM组合物可用作生物学载体，用作细胞运输。如本文中所述的，ECM组合物可同时包括可溶和/或不可溶部分。因此，在本发明的另一个实施方式中，描述了用于细胞运输或维持在运输位点的生物学载体，其包括本发明的ECM组合物。本发明的ECM组合物——包括细胞和三维组织组合物——可用于促进和/或支持细胞在体内生长。载体可用于任何合适的应用，例如，用于支持将细胞，如干细胞注射到受损的心肌中，或用于腱和韧带修复，如上所述。

合适的细胞组合物(例如，本发明分离的ECM细胞和/或另外的生物剂)可在植入或施用ECM组合物之前、之后或期间被施用。例如，可将细胞种植到施用、缺损和/或植入位点，然后将培养体系或生物运输载体植入到对象。可选地，合适的细胞组合物可在之后施用(例如，通过注射到位点)。细胞在其中发挥诱发组织再生和/或细胞修复的作用。可以通过允许将细胞施用到缺损位点的任何手段例如，通过注射来种植细胞。可以通过维持细胞生存力的任何手段，如通过注射器或关节内窥镜来注射细胞。

已经描述ECM组合物用于促进器官和组织中的血管生成——通过施用这样的组合物以促进心脏和相关组织中的内皮化和血管形成。因此，在再一个实施方式中，本发明包括联合在对象中植入装置应用的表面涂层，其包括本文所述的ECM组合物。涂层可应用于用于植入或穿透对象的任何装置，如起搏器、支架、支架移植物、人工血管、心瓣膜、支路、药物递送端口或导管。在某些方面，涂层可用于修饰伤口愈合、修饰炎症、修饰纤维囊形成、修饰组织向内生长或修饰细胞向内生长。在另一个实施方式中，本发明包括用于治疗损伤组织，如心、肠、内折的或缺血性组织。以下介绍实施例，其论述被考虑用于这样的应用的ECM组合物的产生。在标准氧条件下生长的ECM组合物的制备和应用描述在美国专利申请号2004/0219134中，其通过应用被并入本文。

在另一个实施方式中，本发明包括各种可植入装置和组织再生补片，包括本文所述的ECM组合物，其允许益处，如组织向内生长。如本文中所述的，ECM组合物可用作医疗装置，如补片或其它可植入装置上的涂层。在各个方面，这样的装置对于伤口修复、疝修复、骨盆底修复(例如，盆腔内脏器脱垂)、回旋套修复等等是有用的。在相关方面，涂层对于矫形植入物、心血管植入物、泌尿吊带(sling)和起搏器吊带是有用的。

例如，疝的基本表现是腹部内容物突出到筋膜中的缺损内。用于疝修复的外科方法集中于减少进入腹膜腔中的疝内容物并通过利用假肢、同种异型的或自体材料产生筋膜缺损的稳固封闭物。一些技术已用于产生这种封闭物，然而，当前产物和程序的缺点包括疝复发，其中，封闭物再次变弱，允许腹部内容物回到缺损中。在疝缝手术中，可以使用矫正组织再生补片，如涂有ECM组合物的生物再吸收筛网或合成筛网。

本领域中已知将生物涂层施用到医疗装置表面的多种方法，其可以被本发明利用。例如，可以利用光敏交联剂涂覆ECM组合物，所述光敏交联剂允许在通过施用紫外线辐射激活交联剂后永久地共价结合到装置表面。示例性的交联剂是TriLite^TM交联剂，其已被显示对生物组织是非细胞毒性的、无刺激性的而且无致敏性。ECM物质可以不被分离或分离成单独的成分，如人胶原蛋白、透明质酸(HA)、纤连蛋白等等，然后涂覆或掺入到各种可植入装置中。此外，另外的生长因子和这些可以被掺入，以允许有益的植入特征，如改善的细胞浸润。

在各个相关的实施方式中，本发明提供可应用于美容/药用美容(cosmeceutical)应用，如但不限于：抗老化、抗皱纹、皮肤填充剂、润湿剂、色素增强、皮肤紧致等等的方法和装置。因此，在一个实施方式中，本发明包括改善对象皮肤表面的方法，包括在皱纹部位给对象施用本文所述的ECM组合物。在相关的实施方式中，本发明包括修复或增强对象的软组织的方法，包括在皱纹部位给对象施用本文所述的ECM组合物。在各种美容应用中，可将组合物配制为合适的，如可注射的和局部制剂。如在本文所包括的实施例中所进一步论述地，被配制为局部剂(topical)的ECM组合物已经被证明在各种皮肤美学应用，如抗皱纹、抗老化应用中以及烧蚀激光手术的附属物是有效的。已经显示了含有局部剂的ECM的若干有益特征。这样的益处包括1)在表面重修(resurfacing)之后有助于上皮再形成；2)减少非烧蚀的和烧蚀的部分激光表面重修症状(例如，红斑、水肿、结痂和不舒适感)；3)产生光滑、甚至有肌理的皮肤；4)产生湿润皮肤；5)减少细纹/皱纹的外观；6)增加皮肤硬度和柔性；7)减少皮肤色素沉着异常；和8)减少红色、有斑点的皮肤。

如本领域中已知的，可以制备本发明的组合物，然而，应用本文所述的创新培养方法(例如，在低氧含量条件下培养)。用于细胞修复和/或再生、改善皮肤表面和软组织修复的在正常氧培养条件下产生的ECM组合物的制备和应用描述在美国专利号5,830,708中，其通过引用被并入本文。

在另一个实施方式中，本发明包括生物抗粘连剂，其包括本文所述的ECM组合物。该剂可用于这样的应用中，如在产生肠或血管吻合(anastomises)后使用的抗粘连补片。

本文所使用的组合物或活性成分通常将以有效治疗或预防被治疗的特定疾病的量而使用。该组合物可被治疗性地施用，以实现治疗益处，或被预防性地施用，以实现预防益处。治疗益处意为根除或改善潜在的状况或被治疗的病症。治疗益处也包括终止或减缓疾病的发展——不管是否实现改善。

施用的组合物的量将取决于各种因素，包括例如，组合物类型、被治疗的特定适应症、施用模式、所期望的益处是预防性的还是治疗性的、被治疗的适应症的严重性和患者的年龄和体重以及剂型的效力。测定有效剂量在本领域技术人员的能力范围之内。

最初可从体外分析估计初始剂量。也可以从体内数据，如动物模型估计初始剂量。对于测试用于增强毛发生长的组合物功效有用的动物模型包括啮齿动物、灵长类动物和其它哺乳动物等等。熟练的技术人员可以从体外和动物数据通过外推法测定适于人施用的剂量。

剂量将取决于条件培养基的活性、施用模式、被治疗的状况和上述各种因素等等因素。剂量和间隔可以被单独地调节，以提供足以维持治疗或预防效果的水平。

以下介绍实施例，其论述被考虑用于所述应用的ECM组合物的产生。以下实施例被提供，以进一步说明本发明的实施方式，但并不意图限制本发明的范围。虽然它们对于那些可能被使用的来说是典型的，但本领域技术人员所知的其它程序、方法或技术可以可选地被使用。

实施例1

在低氧含量条件下生长的ECM组合物中的差别基因表达

初级人新生儿包皮成纤维细胞在组织培养瓶被培养为标准单层，并与天然沉积的胎样ECM中的三维成纤维细胞培养物进行比较。如本文所公开地使培养物生长。为了评估基因的差异表达，利用用于全局基因表达的AgilentWhole Human Genome Oligo

按照制造商的方案完成总RNA样品(包括40,000以下个基因)。

在比较之后，发现成纤维细胞调节胶原蛋白和ECM基因在低氧含量培养的自然分泌的ECM中三维培养物中的表达。各种胶原蛋白和ECM基因表达的上调和下调显示在表3中。

表3.胶原蛋白和ECM在低氧含量的三维成纤维细胞培养物中的差别表达

基因	增加倍数	减少倍数
			COL4A1	17.2
COL20A1	6.88
			COL19A1	5.22
COL9A1	4.81
			COL10A1	4.45
COL6A3	3.48
			COL9A2	2.48
COL14A1	2
			SPARC	2.74
COL1A2		3.45
			COL13A1		4
COL18A1		4.76
			COL1A2		7.14

在比较之后，发现成纤维细胞调节Wnt通路基因在低氧含量培养的自然分泌的ECM内三维培养物中的基因表达。各种Wnt通路基因表达的上调和下调显示在表4中。

表4.Wnt在低氧含量的三维成纤维细胞培养物中的差别表达

基因	增加倍数	减少倍数
			WNT4	5.94
WNT7a	5.43
			WNT 7b	4.05
WNT 2b	3.95
			WNT 10a	3.86
WNT 8b	3.48
			WNT 6	3.36
WNT 3a	3.19
			WNT 9b	3.06
WNT 9a	3.02
			WNT 11	2.89
WNT 5a
			WNT 2
WNT 5b
			LRP6	3.43
LRP3	2.27
			LRP11		10
LRP12		7.69
			DKK1		50
DKK3		5.88
			FSZD5	4.48
FRZ9	3.85
			FRZB	3.36
FRZD1	2.94
			SFRP2	2.95
FRZD1	2.92
			FRZD3	2.84
AXIN2	4.4
			KREMEN2	4.24

KREMEN1	3.45
			b-联蛋白	4.76
GSK3b		11.1
			GSK3a	6.67
bFGF		50

在比较之后，发现成纤维细胞调节骨形态发生蛋白(BMP)通路基因在低氧含量培养的自然分泌的ECM内三维培养物中的基因表达。各种BMP通路基因表达的上调和下调显示在表5中。

表5.BMP在低氧含量的三维成纤维细胞培养物中的差别表达

基因	增加倍数	减少倍数
			BMP7/OP1	4.88
BMP2	4.19
			BMP5	3.49
BMP3	3.44
			BMPrecIb	3.37
BMP8b	3.36
			BMP 8a	3.15
BMP 10	2.86
			BMP1	2.12
BMPrecIa		2.5
			骨钙蛋白		2.5
骨桥蛋白		6.25
			BMPrecII		6.25

在比较之后，发现成纤维细胞调节另外的基因在低氧含量培养的自然分泌的ECM内三维培养物中的表达。另外基因的表达的上调和下调显示在表6中。结果表明，低氧含量培养条件导致低氧诱导因子(HIF 1A)在mRNA表达中增加14.78倍而其相应的抑制因子减少4.9倍。这表明，低氧含量培养的条件培养基正经历低氧张力(low oxygen tension)环境(低氧)，因为针对编码蛋白质翻译的HIF 1A的信使RNA被上调，而其抑制因子被下调。此外，VEGFB(4.33-倍增加)、KGF(11.51-倍增加)和IL-8(5.81-倍增加)水平在低氧含量培养条件下也被上调。

表6.由成纤维细胞ECM在体内低氧培养导致的另外基因的表达变化

表7.干细胞相关的基因表达

基因	增加倍数	减少倍数
			Oct4	5.1
Sox2	8.2
			NANOG	4.9
KLF4	21.0
			cMyc	7.1

实施例2

利用初级人新生儿包皮成纤维细胞产生低氧含量ECM

针对利用初级人新生儿包皮成纤维细胞的ECM低氧含量培养物提供了两个实施例。

在10％胎牛血清、具有2mM L-谷氨酰胺的90％High Glucose DMEM(10％FBS/DMEM)存在的情况下，使初级人新生儿包皮成纤维细胞在组织培养瓶中增殖。利用0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液继代培养细胞直到第三代，此时，它们被种到0.04mg干燥微球/ml培养基的Cytodex-1葡聚糖微球(5×10⁶细胞/10mg微球，在装载100-120ml的125ml旋转瓶中)，或种到尼龙筛网(25×10⁶细胞/6×100cm²尼龙)。所有培养物均被保持在正常大气压和5％CO₂，用于增殖和种植，在该点，低氧培养物分裂成充满95％氮/5％CO₂的气密室，使得可以在培养基中产生低氧含量环境。该系统在培养瓶中维持约1-5％的氧。细胞被充分混合成覆盖用于种植的尼龙或微球所需的最小体积，随后在30分钟之后被混合一次，然后允许在湿润的37℃恒温箱中静置过夜。给培养物供应10％FBS/DMEM 2-4周，每2-3天交换50-70％培养基，同时，增殖细胞并且然后开始沉积ECM。利用10％胎牛血清，以铁补充剂和20ug/ml抗坏血酸替代FBS另外供养培养物4-6周。最初以15-25rpm混合旋转瓶约2-4周，此时，它们被增加到45rpm并在以后维持该速率。微球培养物在四周后形成含有ECM的大的无定形结构，所述ECM的宽度和直径可达0.5到1.0cm，并且，由于气体扩散和高代谢需要，这些培养物因而是低氧含量的。

在另外的实施例中，使初级人新生儿包皮成纤维细胞在单层瓶中增殖，然后，在尼龙筛网支架上培养以支持ECM体外的发育。成纤维细胞在具有高葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺和10％(v/v)胎牛血清的DMEM中增殖。培养物也补充有20μg/ml抗坏血酸。在环境氧(约16％-20％的氧)中3周后，将含双倍ECM的培养物转到充满大量95％氮/5％二氧化碳的密封室(Cat.#MC-101，Billups-Rothenberg，Inc.，Del Mar，CA)中的低氧含量培养条件(1％-5％的氧)下。为了确保从培养基中排除大气氧，在2-3小时之后，替换大气以确保培养基含约1-3％的氧。使两组含ECM的培养物生长，每周送料两次达另外4周，然后，准备培养物用于RNA分离。利用商业可得的试剂盒，根据制造商的说明(Cat.#Z3100，Promega，Inc.)来分离总细胞RNA。将纯化的RNA样品储存在-80℃，然后利用Agilent Whole Human Genome Oligo

进行基因表达的微阵列分析。

在分析结果期间，与由低氧培养物制备的探针相比，利用Agilent WholeHuman Genome Oligo由环境氧制备的探针检测到约5,500个差异表达的转录物。在这些之中，约一半(2,500)在低氧中增加大于2.0倍，而约一半(2,500)在低氧中减少大于2.0倍。这表明，低氧导致体外基因表达的明显变化。特别感兴趣地是，ECM蛋白质，尤其是一些胶原蛋白基因的转录物被上调，而基质降解酶的一些基因被下调。

实施例3

用于治疗应用的组织-工程改造的人胚胞外基质

胚ECM产生有益于快速细胞增殖和痊愈而不形成疤痕或粘连的环境。假设人新生儿成纤维细胞在血管生成之前刺激早期胚胎环境的条件下(低氧和减小的重力)在三维中的生长会产生具有胎性质的ECM。基因芯片阵列分析显示，对比传统组织培养条件，在低氧含量下超过5000个基因的差异表达。产生的ECM与胎间充质组织相似，因为它在胶原蛋白III、IV和V型以及糖蛋白，如纤连蛋白、SPARC、血小板反应蛋白和透明质酸中相对丰富。因为ECM在支持具有关键生长因子的再生干细胞群体的假定小生境中在结合和表现生长因子中也发挥重要的调节作用，因此我们评价低氧对在培养中的胎样ECM发育期间的生长因子表达的影响。低氧也可以增强调节伤口愈合和器官发生的因子的表达，如VEGF、FGF-7和TGF-β以及多种wnt，包括wnt 2b、4、7a、10a和11。胚胎人ECM也刺激体外人成纤维细胞中代谢活性的增加，如利用MTT分析通过提高的酶活性所测量的。另外，我们检测到响应人ECM的细胞数目的增加。该人ECM可用作生物表面涂层以及在新组织生长和愈合而没有疤痕和粘连的各种治疗应用中的组织填充治疗。

实施例4

用于再生性医学应用的天然可溶的WNT活性的产生

能再生成体组织，如皮肤或血液的干细胞或祖细胞在一定程度上再现胚胎发育，以完成该再生。越来越多的研究已经证明，在胚胎发生期间多能的和有谱系特异性分化活性的干细胞的关键调节子在某些情况下在成体中被再表达。分泌的形态发生生长和发育因子的WNT家族属于这样的生长因子：其能潜在地提供有价值的研究工具以及在临床中的最终治疗处理。然而，已经证明Wnt对于商业规模上目前的标准重组表达和纯化技术来说难以控制，并且，没有关于大规模WNT蛋白质生产以使基于WNT产物的临床发展能够进行的报道。已经开发了这样的技术：其利用新生儿人真皮成纤维细胞使培养中的胎样ECM在培养中的各种支架上生长，以产生三维组织等同物。在该过程中，发现这些培养物可以提供包含在用于ECM生产的无血清条件培养基中的生物活性WNT的商业规模来源。在本文中我们示出关于该WNT产物候选者的数据。

细胞的基因表达分析表明，至少3个WNT基因被表达(wnt 5a、wnt 7a和wnt 11)，而且，与wnt信号传导相关的少量基因也被表达；然而，它们的功能并没有被完全理解。使基因表达数据延伸到wnt-信号传导的体外生物分析(初级人表皮角质形成细胞中β-联蛋白的核易位)，并且评价wnt对血干细胞的活性。两个分析均表明与标准wnt活性一致的活性。此外，在被注入到小鼠皮肤时，这些培养的条件培养基显示wnt活性，诱导毛囊干细胞进入生长期，从而引起毛发生长。这表明在定义的和不含血清的条件培养基中的稳定的WNT活性不需要纯化。该产物可用于毛囊再生和用作培养各种人干细胞的有价值的研究工具。

实施例5

低氧含量成纤维细胞显示独特的ECM生产和生长因子表达

当在体外培养时，人新生儿真皮成纤维细胞产生ECM，其逼真地模仿真皮并且在再生医学应用，如伤口愈合中可以取代受损的真皮。因为伤口愈合过程也再现胚胎发育，因此通过刺激胚胎环境，我们假定产生的ECM将提供提高的ECM，用于组织再生应用。因此，使人新生儿成纤维细胞衍生的ECM在低氧含量条件下在培养中生长，以模拟血管生成前存在于早期胚胎中的低氧。该目标是利用低氧含量条件在培养的组织发育期间产生具有胎性质的ECM。

在这些低氧含量培养中产生的ECM与胎间充质组织相似，因为它在胶原蛋白III和V型中以及在糖蛋白，如纤连蛋白、SPARC、血小板反应蛋白和透明质酸中相对丰富。因为ECM在支持具有关键生长因子的再生干细胞群体的假定小生境中对结合和呈递生长因子也发挥重要作用，因此我们评价低氧对在培养中的胎样ECM发育期间的生长因子表达的影响。显示低氧也可以增强调节伤口愈合和器官发生的因子的表达，如VEGF、FGF-7和TGF-β。

人ECM也刺激体外人成纤维细胞中代谢活性的增加——如利用MTT分析通过提高的酶活性所测量的。另外，检测到响应于人ECM的细胞数目的增加。这些结果支持将该热ECM用作胚胎细胞培养中的涂层/支架和用作各种治疗应用或医疗装置中的生物表面涂层/填料。

实施例6

涂有生物材料的人胞外基质(hECM)

已经报道ECM产生有益于快速细胞增殖和痊愈而不形成疤痕或粘连的环境。利用本文所述的方法，通过在低氧和低比重中培养新生儿成纤维细胞而产生独特的、胚胎样的、人ECM(hECM)。结果包括：在将hECM放置于尿囊绒膜上时，血管生成，和当将hECM涂覆到尼龙筛网上并植入到SCID小鼠皮下区域中的侧翼位置上时，炎性细胞迁移减少。基于这些结果，假设将我们的hECM涂覆到聚丙烯筛网上会禁止炎性细胞迁移的减少和在SCID小鼠皮下区域中的材料-生物学界面处纤维包裹(fibrous encapsulation)。

利用光敏交联剂将利用人衍生的材料产生的ECM组合物(hECM)涂覆到丙烯筛网上。通过紫外线共价结合机制(Innovative Surface Technologies(ISurTec)TriLite^TM Crosslinker)将hECM涂覆在6mm活体解剖打孔聚丙烯上。利用E-Beam^TM(BeamOne LLC E-BEAM^TM)或环氧乙烷(ETO)(由ETOFlagstaff Medical Center描述)，使涂覆的和未涂覆的hECM 6mm活体解剖聚丙烯穿孔消毒。接下来，每个6mm聚丙烯盘分裂成两个对称的半圆形插片。最后，利用无菌技术将聚丙烯植入物放在皮下区域中侧翼位置的两边。在组织学的两周和五周结束时移植样品。

hECM涂布的聚丙烯筛网的抗纤连蛋白免疫荧光染色显示，与为涂覆的筛网相比，ECM物质在筛网纤维上结合并形成均匀的涂层。HECM涂覆的筛网适于可植入补片，用于医疗应用，如疝修复和骨盆底修复。显示ECM物质涂覆筛网的单个纤维——如通过用允许改善细胞向内生长的纤连蛋白抗体进行免疫荧光染色所显示的。

hECM被植入到鸡尿囊绒膜(CAM)上，其刺激微血管应答——如由新微维管结构生长所证明的。另外，hECM涂布的尼龙筛网经皮下植入到小鼠中达四周，对比未涂覆的尼龙筛网，其显示提高的生物适应性。尤其地，用hECM涂覆的尼龙纤维观察到较少的炎性细胞和较薄的纤维囊。

在植入hECM涂布的聚丙烯筛网后两周和五周，利用苏木精和伊红染色的样品进行生物相容性评价。为进行FBGC分析，样品被盲编号、利用形态剂量法评价、分成组、从统计学上进行评价，然后去除编号(decod)。检验异物巨细胞(FBGC)的数目。植入后两周每条纤维的FBGC数目显示在图1A-B中以及图14A-B中另外的样品中。植入后五周每条纤维的异物巨细胞的数目显示在图2A-B中以及图15A-B中另外的样品中。相比于未涂覆的筛网，hECM涂覆的聚丙烯筛网的FBGC减少明显。在2周的时间点，未涂覆的聚丙烯(9.20+/-2.03)的每个样品平均FBGC计数测定为在统计学上高于(ANOVA bonferroni后验分析p＜0.05)hECM涂覆的聚丙烯(4.53+/-0.89)。在5周的时间点，未涂覆的聚丙烯(10.95+/-2.15)的每个样品平均FBGC计数测定为高于hECM涂覆的聚丙烯(8.17+/-1.41)，尽管统计学上不显著。

结果表明，hECM涂覆的聚丙烯可减少纤维囊。在2周和5周的时间点，利用三色染色样品评价纤维包裹。为进行囊分析，样品被盲编号、利用形态剂量法评价、分成组、从统计学上进行评价，然后去除编号。在2周的时间点，hECM涂覆的聚丙烯(23.70+/-2.70uM)的平均纤维囊厚度未被测定为在统计学上高于(ANOVA bonferroni后验分析p＜0.05)未涂覆的聚丙烯(19.70+/-3.00uM)(图16A-B)。在5周的时间点，hECM涂覆的聚丙烯的平均纤维囊厚度被测定为(10.40+/-1.10uM)，相对于未涂覆的聚丙烯(12.30+/-1.20uM)(图17A-B)。再次，hECM涂覆的与未涂覆的聚丙烯的差异未被测定为统计学上显著的。尽管在评价2周到5周的时间点的纤维包裹的平均百分比差异时发现重要的观察。2周到5周的时间点的纤维包裹的平均百分比差异针对hECM未涂覆的聚丙烯的为37.6％，相对于hECM涂覆的聚丙烯的56.1％。

FBGC形成的机制是响应于对可植入生物材料，如聚丙烯的免疫应答中的巨噬细胞融合结果。这些大的多核细胞提供从数量上评估对可植入生物材料的炎性反应的有效手段。在2周的时间点，观察到用人ECM涂覆的比未涂覆的聚丙烯在每个样品的FBGC计数上明显减少。该数据表明，人ECM表面涂层可应用于各种可植入装置。

从历史上来看，可植入装置的功效和寿命已经受到特异免疫应答，包括FBGC和纤维囊形成的挑战。尤其地，FBGC可分泌降解剂，如过氧化物和自由基，以及其它降解剂挑战装置的功效和寿命。因为已知FBGC在植入物存在期间保持紧邻定位在植入物周围，所以这些负效应是尤其明显的。作为围绕植入物的坚硬血管胶原蛋白包裹出现的纤维囊形成意在从宿主或宿主组织中分离外源植入物。这种响应不仅在某些情况下可以引起患者不适，而且可以缩短装置的寿命长度，甚至减小装置功效。因此，减少FBGC和纤维包裹的涂层对于可植入装置的寿命和功能是高度期望的结果。

将hECM涂覆在聚丙烯上将减少FBGC的存在和可能减少材料-生物界面处的纤维包裹的发现支持进一步试验的需要。进一步的评价可以包括较长持续时间的时间点，以观察以hECM涂覆的和未涂覆的生物材料的纤维包裹的厚度变化。另外，用在各种体内环境中的包括涤纶、尼龙、不锈钢和钛的生物材料的连续体进行评价可以阐明进一步理想的hECM涂覆的生物材料结果。

实施例7

胞外基质组合物刺激毛发生长的应用

该实施例说明通过施用ECM组合物来刺激毛发生长。

获得人毛囊细胞和取自毛囊的细胞，以测定本文所述的ECM组合物刺激和维持毛发形成能力的能力。毛囊细胞获自Alderans Research International。在ECM存在的情况下培养细胞。在培养4周和8周时对细胞进行分析，显示类似毛囊的结构以及类似毛干的结构，如图3A和B所示。连续培养2个月后，细胞保持存活和生长。

将在ECM组合物存在的情况下培养了4周的细胞移植到小鼠中。在移植4周后，培养的人毛囊形成许多大的滤泡，相比之下对照细胞仅显示正常数目的小休止期毛囊，如利用微观图像分析所观察的。

基于这些发现，利用人对象进行体内毛发生长试验，以从新测定毛囊(follicular)毛发再生。该研究招募患有男性型脱发(MPHL)的24个男人，年龄为18到45岁。所有研究组的成员之前没有进行侵入性或微创局部透皮手术或用Minoxidil^TM或Finasteride^TM进行局部治疗。使用Palomar Starluz 550p激光(1540-非烧蚀的和2940烧蚀的)。指定研究持续期间多达12个月以跟踪基线，和5个月(在单次sc注射之后)。在注射之后，观察三天的洗出期，并且在整个研究中，对象仅使用Cetaphil^TM洗发精。在注射之前进行激光发射和微皮肤摩擦术的组合。

与对照载体和盐水一起经皮给对象施用混合有hECM的载体，其被测定为具有wnt蛋白质活性和包括wnt 7。研究的终点包括7点临床分级系统(pointclinical grading system)(3个盲式毛发移植外科医生)、临床放大照相(滤泡计数)、2mm穿孔活体解剖和对象自身评估调查问卷。

分析对象的单个毛囊单位。在12周时对滤泡进行计数，并且与在研究开始时观察到的相同个体的基线进行比较。在施用hECM的对象中观察到毛囊单位的增加而没有微扰。例如，在一个对象中，在12周时治疗使明显的毛囊从基线217增加到265。对象的总毛发计数显示从307增加到360，总体增加约20％。在其它对象中观察到以下毛囊计数的增加，如下：对象009(基线毛发计数179，12周毛发计数193，5个月毛发计数201)；对象013(基线毛发计数266.5，12周毛发计数267，5个月毛发计数294)；对象024(基线毛发计数335.5，12周毛发计数415，5个月毛发计数433)。此外，在研究中施用hECM的13个患者中的12个(92.3％)在12周时显示功效。图18显示在3个月时另外的毛发生长测量。

另外的结果显示在图19和20中，其显示2个测试对象在12和22周时各自的毛发生长特性。

在整个研究中分析了另外的毛发参数。在12周和20周时，与基线相比(0周)分析相对毛发计数，与基线相比分析终毛以及与基线相比分析毛发厚度。例如，在一个对象中，与基线相比，在12周时治疗分别增加毛发计数、终毛和滤泡厚度22.4％、27.8％和23.9％。在另一个对象中，与基线相比，在12周时治疗分别增加毛发计数、终毛和滤泡厚度23.7％、24.2％和22.2％。在对象009(其基线毛发计数为179，12周毛发计数193，5个月毛发计数201，如上)中，与基线相比，在12周时治疗分别增加毛发计数、终毛和滤泡厚度7.8％、48.5％和19.2％；而在20周时，分别为12.9％、33.0％和21.1％。在对象013(其基线毛发计数为266.5，12周毛发计数267，5个月毛发计数294，如上)中，与基线相比，在12周时治疗分别增加毛发计数、终毛和滤泡厚度0.2％、25.0％和8.3％；而在20周时，分别为10.3％、41.4％和23.0％。在对象024(基线毛发计数335.5，12周毛发计数415，5个月毛发计数433，如上)中，与基线相比，在12周时治疗分别增加毛发计数、终毛和滤泡厚度23.7％、24.2％和22.2％；而在20周时，分别为29.1％、5.9％和17.3％。

13个研究成员的综合结果显示在图21和22中。在3个月时，研究成员反应的分布显示在图23-26中。

注意，治疗的研究成员在3个月时显示终毛数目明显增加和和厚度密度增加(总得分的84.6％)。另外，没有观察到不良反应，观察到正常的组织学机构，并且没有观察到错构瘤。

结果指出在另外的应用中使用hECM，如防止患者移植后脱发和用于眉毛和睫毛生长。在毛发移植患者中，已知毛发脱落通常需要4到5个月再长出，因此，用hECM治疗会防止在这样的移植后个体中的毛发脱落。

实施例8

人胞外基质组合物(hECM)的产生

利用新生儿人成纤维细胞产生人ECM组合物。将成纤维细胞种植到适应液体培养基的微球样结构上。培养条件被优化而不需要胎牛血清。在几天之内，在本文所述的胚胎培养条件下，细胞产生密集的胚胎样ECM。观察到Wnt家族蛋白质以及若干生长因子的分泌。

将培养物生长至汇合。随后使培养物暴露于无菌水，以诱发均匀的细胞裂解。然后，非细胞的hECM被洗涤，以确保除去所有的活细胞和细胞碎片，并经显微镜检查，以确定除去细胞碎片。接下来，使人成纤维细胞暴露于涂覆有hECM的培养烧瓶或铺到未处理的瓶上，然后，用厚层基质覆盖。在hECM中鉴定的ECM蛋白质显示在表8中。

表8.在hECM中观察到的胞外基质蛋白质

基质蛋白质	功能
		多能聚糖	结构的，结合透明质酸(HA)和胶原蛋白
饰胶蛋白聚糖	结合生长因子，影响胶原蛋白结构
		β聚糖	TGF-βIII型受体
黏结蛋白聚糖	结合生长因子，增强活性
		胶原蛋白I、II、III、V型	真皮的主要结构蛋白
纤连蛋白	细胞黏附、分布、迁移、运动(motogenesis)
		生腱蛋白	诱发伤口愈合，控制细胞黏附

如利用MTT分析通过增加的酶活性所测量的，观察到hECM诱发细胞代谢活性的提高，如图4所示。与小鼠ECM不一样，人ECM诱发细胞代谢活性的剂量依赖性提高——如通过MTT分析所测量的。观察到细胞快速并均匀地渗透hECM覆盖材料。此外，存在响应hECM的细胞数目的剂量依赖性增加——如通过Pico Green分析所测量的，如图5所示。

已知涂层、可注射的和可植入的基质产物通常是牛胶原蛋白、源自肠或膀胱的猪基质蛋白质、透明质酸，或者是源自尸体皮肤的人ECM。虽然这些产物可以通过产生更加生理学上相当的环境而提供益处，但没有一个是完全的人并包含在年轻的、发育中的组织中发现的整个范围的基质蛋白质。产生的hECM包含与在年轻的、健康组织中发现的ECM物质相同的ECM物质。它也被观察到支持人细胞的活性增殖以及细胞的快速向内生长。在涉及人对象的应用中使用hECM有若干明显的优势。例如，hECM促进快速的宿主细胞整合和提高愈合(充当宿主细胞和随后重构的标准支架)。另外，hECM消除关于病毒从非人动物和人组织传播的顾虑(尤其地，来自牛组织的BSE和来自人组织的TSE)。此外，与生物产物，尤其是人真皮和阔筋膜相比，观察到hECM的一致的产物组成和性能。另外，与合成的植入物相比，hECM减少宿主组织的腐蚀。

实施例9

用于医学美容应用的人成纤维细胞衍生的低氧含量条件下的胞外基质，

进行面部烧蚀激光手术后局部hECM施用的双盲随机性研究。该研究招募41个对象，年龄在40和60岁之间。所有研究组的成员在12个月之前没有预先进行侵入性或微创外科手术或局部抗老化治疗。激光程序包括完全部分烧蚀激光程序(full fractional ablative laser procedure)、眼周的、口周的和全脸。使用Palomar Starluz 550p激光(1540-非烧蚀的和2940烧蚀的)。给对象施用局部hECM组合物，一天一次(以不同的浓度)，或者施用安慰剂载体14天。研究的终点包括临床照相(3三个盲式评估-皮肤病学家)、经表

皮失水(TEWL)、穿孔活体解剖和红斑、水肿与结痂的评估。

与载体对照相比，10×浓度hECM组合物提供症状的大多数临床改善(由两个美容皮肤病学家“盲目地”进行评估，与临床研究的任何行为均无关)。结果显示在图6(红斑)、7(水肿)和8(结痂)中。照相评估也表明在第3、7和14天，红斑严重性在几个患者中降低。

在激光治疗后第3、7和14天，对所有41个对象评估经表皮失水(TEWL)值。结果显示在图9中。如在第3、7和14天所注意到的，与载体对照相比，10×浓度hECM组合物使层聚角质层屏障功能得以改善。在第7天，与载体对照相比，hECM组合物在统计学上显著(p＜0.05)。该观察与这样的事实一致，即在烧蚀部分激光治疗后第7天有对象显示上皮再形成。

也进行用于抗老化(例如，皱纹减少)的局部hECM施用的双盲式、随机性研究。该研究招募26个对象，年龄在40和65岁之间。研究组的所有成员在之前12个月内没有预先进行侵入性或微创外科手术或局部抗老化治疗。给对象施用局部hECM组合物，一天两次，或施用安慰剂载体10周。研究的终点包括临床照相(2盲式美容皮肤病学家)、corneometer-表面水合、皮肤弹性测试(cutometer-elasticity)、穿孔活体解剖、分子评估(Epidermal GeneticInformation Retrieval(EGIR))。

面部区域的照相评估表明，在施用hECM10周后，产生较轻的色素沉着、更光滑的皮肤肌理、更均匀的皮肤色调和减少细纹和皱纹的出现。

针对26个对象中的22个也进行眼周区域的硅复制物的三维轮廓图像分析。为进行该分析，从复制物平面以25°角定向准直光源。将复制物放入固定物中，所述固定物固定复制物的标签位置(tab position)方向，以便复制物可以被旋转以与垂直或平行于入射光方向的标签方向对准。复制物取自与每只眼睛邻近的鱼尾纹(crow’s feet)区域，以标签方向指向耳朵。垂直取样方向使肌理测量对主要的、表情引起的皱纹(鱼尾纹)敏感。平行取样方向使肌理测量对较小的、细纹敏感。结果显示在图10中。

进行面部烧蚀激光手术后局部hECM施用的双盲式、随机性研究。该研究招募49个对象，年龄在40和60岁之间。研究组的所有成员在之前12个月内没有预先进行侵入性或微创外科手术或局部抗老化治疗。激光程序包括完全部分烧蚀激光程序(full fractional ablative laser procedure)、眼周的、口周的和全脸。使用Palomar Starluz 550p激光(1540-非烧蚀的和2940烧蚀的)。给对象施用局部hECM组合物，一天两次，或施用安慰剂载体14天。研究的终点包括临床照相(三个盲式评估-皮肤病学家)、黑色素和血红素测量和对象评估。

在术后第1、3、5、7和14天，面部区域照相评估显示红斑在每个时间点与安慰剂相比明显减少。

术后进行矿脂应用的天数评估，如图11所示。进行红斑分级，如图12所示。烧蚀的(2940)和非烧蚀的(1540)激光设置的黑色素和血红素测量结果显示在图13中。

研究的结果表明含hECM的局部剂(topical)的若干有益特征。这样的益处包括：1)在表面重修之后有助于上皮再形成；2)减少非烧蚀的和烧蚀的部分激光表面重修症状(例如，红斑、水肿、结痂和不舒适感)；3)产生光滑、甚至有肌理的皮肤；4)产生皮肤湿润；5)减少细纹/皱纹的外观；6)增加皮肤的硬度和柔性；7)减少皮肤色素沉着；和8)减少红色、有斑点的皮肤。

实施例10

胞外基质组合物用于刺激毛发生长的应用

该实施说明通过施用ECM组合物刺激毛发生长。

在临床前安全和功效研究——指示最小毒性特性并表明在毛发生长的鼠科动物模型中在毛发生长终期滤泡诱发生长期可以通过注射hECM而被加快——之后，进行初步研究，以评估该制备物在人中的活性。临床研究为双盲式、安慰剂对照、随机化单位点临床试验，在San Pedro Sula，Honduras中进行，并最初被设计为评估hECM产物的临床应用的安全性。该研究的第二个目标是评估该产物的临床活性或“概念验证”。同时，作为该研究的一部分，在hECM注射之前微扰/刺激头皮是否对毛发生长有加成效应被评估。选择了三个不同的微扰装置：1)微皮肤摩擦(MegaPeel^TM，DermaMed Intl，Inc.，Lenni，PA)；2)非烧蚀的1540和烧蚀的2940铒激光的重叠经过(overlapping passes)(Palomar Medical Technologies，Inc.，Burlington，MA)；和3)通过Revage670^TM以弱光治疗进行刺激(Apira Science Inc.，Newport Beach，CA)。这些选择的研究参与者被随机分配到这三个微扰方法之一中。两种hECM制备物在研究中被评估；10×浓缩的、不含血清的制备物，和第二种非浓缩的、含牛血清的制备物。Wnt蛋白质在用于这些研究的hECM中的存在通过免疫印记分析利用识别Wnt7a蛋白质的一抗(Santa CruzBiologicals，CA)进行评估。hECM的标准Wnt生物活性通过体外证明β-联蛋白在人表皮角质形成细胞的核易位来确定。LiCl用作阳性对照(数据未显示)，而用载体或hECM在Wnt受体拮抗剂DKK-1存在的情况下进行治疗并不产生β-联蛋白易位。hECM溶液也含有VEGF和KGF，如通过ELISA所测定的。

获得知情同意后，招募了26个健康对象，年龄在18-55岁之间。纳入标准包括Fitzpatrick得分I-IV、男性型脱发的Norwood/Hamilton分级4-6和没有先前治疗毛发的历史或免疫学危害。在每个对象的头皮上识别四个区域作为治疗部位——两个前面的和两个后面的。每个治疗部位由其周围的纹身标记。前面的两个部位被随机化并注射两种hECM制备物之一或安慰剂(非条件培养基)，同时没有预注射微扰。利用以上提及的三种处理方法之一，紧接着用hECM或安慰剂注射来干扰后面的治疗部位，其也被随机化为右/左。在所有的患者中，每个部位在第零天接受四种均匀放置的皮内0.1cc注射剂。

在第零时间、12周和22周，进行研究者全局评价(investigator globalassessment)、通过放大照相的毛发计数和测试对象自身评价的组合。在16个患者中，在第22周访问之后，在基线和48小时时进行穿孔活体解剖(4mm)，并用于组织病理学评价。同时，由临床医生在炎症、充血、水肿、瘙痒、灼热、溶胀和任何其它不良事件的每个时间点通过目视检查来测量安全性结果。由独立的皮肤病学家针对任何可见的不良事件，包括充血、溶胀和向内毛发生长来对全局和放大照相进行评论。通过TrichoScan放大照相图像采集(macrophotographic image acquisition)和分析生长期：毛发生长终期比、毛发直径、毛发密度、毛发厚度和毫毛与非毫毛计数来评价治疗的生物学和临床效应。研究者利用评级系统来测定区域毛发生长的视觉改善。

本研究的最初目的是评估hECM在人对象中施用的临床安全性。对该程序耐受良好并没有明显病症、不良反应的临床症状或征兆的所有患者在任何主题中均被报道。在治疗后22周进行的治疗部位活体解剖的组织病理学评价表明，在注射部位有最小限度的到轻微的炎症并且没有异常的形态、错构瘤或其它病理反应被观察到。通过这些观察得出结论，在研究过程中，hECM的单一皮内注射并不导致任何明显的毒性、病理学或其它不良事件。

第二个目的是评估hECM对毛发生长的临床效应，这通过Trichoscan图像分析来完成。结果被表示为组平均值(group mean)±SEM，除非另有说明。利用单因素方差分析(ANOVA)，在处理前的第零天测定治疗部位的等同部位(equivalence)。利用成对(重复测量)、双尾学生t-检验，在治疗后第零天、12和22周评价治疗组内组平均值之间的随后差异。利用未成对的、双尾学生t-检验，评价组平局值之间的所有其它差异。统计学显著性水平设置为α＝0.05。在第零天进行比较，在未处理的和处理的指定部位之间的毛发生长指示物测量结果的预处理组平均值表明没有统计学上显著的差异。在施用后12或22周，任何随后的生长上的差异可因而被推断为试验处理的结果。

在第12和22周，对安慰剂处理部位的Trichoscan图像分析(n＝12)显示在测量的任何毛发生长指示物中没有明显改善。此外，用含血清的hECM制剂没有观察到明显的效应。然而，在最初的12周评价阶段期间内，较高浓度、不含血清的hECM制剂处理部位(n＝13)显示所有毛发生长指示物的提高——除了毫毛密度在研究过程中保持没有变化之外(图1D、E)。与单独使用不含血清的hECM相比，在施用hECM之前的微扰并没有导致生长增强。在第12周，在hECM处理的部位中观察到毛干厚度(p＜0.05)、毛发厚度密度(p＜0.05)和非毫毛、终毛数目(p＜0.005)与第零天的值相比在统计学上显著提高(图27)。由hECM治疗引起的改善明显大于在安慰剂处理的部位中观察到的毛干厚度(6.3％±2.5％对比-0.63％±2.1％；p＜0.05)、厚度密度(12.8％±4.5％对比-0.2％±2.9％；p＜0.05)和终毛密度(20.6±4.9％对比4.4±4.9％；p＜0.05)。一个对象显示在单一注射hECM后在三个月时总毛发计数增加22.4％和终毛增加27.8％。尽管在第22周观察到相似的趋势，但没有显著性，因为在对象中没有进一步的生长提高。这些研究明确表明，单一皮内施用hECM显著地改善患有雄激素性脱发的对象中的毛发生长。

该首次用于男人的临床研究表明成纤维细胞分泌的hECM蛋白质制备物的安全性并在毛发恢复中显示最初效应。由在低氧含量条件下生长的成纤维细胞产生的hECM蛋白质包括在毛发周期调节中重要的因子。就细胞谱系而言，成纤维细胞是毛乳头细胞的亲本细胞。在体外研究中，确定了Wnt蛋白质、VEGF、FGF、KGF以及促滤泡素抑制素的存在。Wnt蛋白质的作用被确定为在毛囊中是重要的，在毛发初始生长中发挥关键作用。此外，Wnt活性在毛发周期中是重要的，在毛发生长终期的稍后阶段发动从角质形成细胞形成毛芽所需的细胞的活化和基因表达，所述毛芽将会进入毛发生长的下一个生长期阶段。因此，预期由输送hECM诱发的毛发向内生长的刺激是由于——至少部分地——Wnt活性。

通过单一hECM注射观察到的功效结果代表了毛发生长治疗中的一个新颖途径。FDA批准的产品——敏乐定(例如，Rogaine^TM)和菲那雄胺(finasteride)(例如，Propecia^TM)要求每日使用治疗剂以引发并维持功效。尤其地，这些产品显示它们的最大功效在于减少脱发，同时，在每日使用至少4个月后才观察到小百分比的新毛发生长。相比之下，单一注射hECM导致新终毛在统计学上显著增加以及毛发密度和厚度增加。造成毛发生长的机制(一种或多种)已被研究了10多年，因为研究者已经证明Wnt蛋白质和伤口生长因子在刺激真皮乳头相关的干细胞中的潜在重要性。该临床初步研究是首次证明，含Wnt蛋白质和伤口生长因子的制备物对人中新毛发诱发有生物学活性的刺激效应。

实施例11

涂覆有胚胎ECM的顺应性聚对苯二甲酸乙二酯假体的构造

当前临床上可得的人工血管移植物，如聚对苯二甲酸乙二酯(PET)常常在用于小直径的血管取代时由于血栓形成和内膜超常增生而失败。该失败归于缺少汇合的内皮单层和在血管移植物和周围组织之间的适应错配。生物力学适应的小直径(1.5mm)非织造PET纤维结构被制备，其包含在胚胎条件下发育的人胞外基质(hECM)，还包含模拟天然血管ECM特性的蛋白质。通过浸涂和共价表面氨基接枝聚(乙烯胺)(PVA)方法，将hECM蛋白质涂覆到非织造PET纤维结构上，以解决移植失败的首要原因。hECM蛋白质未与PET交联，这允许RGD和CS5表面作为内皮细胞的细胞结合结构域而暴露。以前的工作已经表明，hECM浸涂的聚丙烯聚合物在植入大鼠中时降低炎性反应。同样，在以前的研究中，我们优化了用于内皮(EC)和平滑肌(SMC)细胞生长的非织造PET纤维支架的直径和小孔尺寸、表现型和在剪应力条件下的保持力以及模拟小直径主动脉的非织造PET纤维结构机械性能。该研究检验hECM涂层在PET支架上的结合、剂量和均匀性。

使用以下方法。利用熔体喷射方法使用Neat PET(Dupont，Wilmington，DE)产生非织造PET纤维，平均纤维直径50μm，并且，将单个PET纤维层的并置(0°/90°)用来制作3D结构。在胚胎条件hECM下，通过在搅动的生物反应器中在葡聚糖微球体上培养新生儿真皮成纤维细胞8周来制备hECM。前4周在含10％小牛血清的培养基中，然后转移到不含血清的培养基制剂中。用0.1MNaOH、0.1MKCl、750mMPVA-HCl(Polysciences，USA)、400μl 1，4-二轴突细胞通过氨基改性PET纤维在非织造PET血管支架上加入hECM；接下来进行声波法和24h热处理。试剂购自Sigma Aldrich，Canada，除非另有说明。然后，将非织造PET纤维结构(胺化的和未处理的)浸入hECM(0，1mg/ml到0.6mg/ml，稀释在PBS中)，在4℃过夜。为了降低非共价结合，在10min声波循环下在PBS中样品被洗涤3×。非织造PET纤维结构的hECM覆盖的化学特征为：1)傅里叶变换红外(FTIR)光谱学，2)扫描电镜术(SEM)和能量分散(EDX)谱，用于局部化的化学识别，3)通过水滴方法的亲水性(Video Contact Angle 2000)和4)X-线光电子能谱(XPS)。也通过荧光结合到hECM的异硫氰酸罗丹明B(RBITC)在共聚焦显微镜(LSCM，Leica，Germany)上观察hECM涂层。通过胰蛋白酶消化hECM涂层和通过微BCA蛋白质检验(Pierce Chemical Co，IL)对其定量来量化hECM涂层的剂量。

FTIR研究表明由在胺化的非织造PET纤维上的hECM涂层浓度不断增加引起的三个主要的峰：1522cm^-1(酰胺II sN-H和mC-N)、1656cm^-1(酰胺I，sC＝O)和3320cm^-1(sNH)带(图28)。FTIR结果表明，用0.6mg/ml hECM溶液获得胺化的PET纤维的最高hECM覆盖。用小的hECM峰仅在低hECM浓度(0.1mg/ml到0.2mg/ml)时出现的非胺化的PET纤维观察到相反的趋势。

SEM和RBITC荧光显微照相显示，在胺化的PET纤维上以最高hECM浓度(0.6mg/ml)的同质性hECM覆盖(在PET表面上清楚地观察到hECM)，支持FTIR趋势。另一方面，低hECM浓度(上至0.2mg/ml)最佳地粘附在未处理的PET纤维上，如通过FTIR所观察到的。微BSA检验揭示，与未处理的PET纤维相比，在胺化的PET纤维上的hECM保持力至少高2倍(分别为0.1mg/cm²和0.04mg/cm²)。最后，PET的接触角(75°)随PET胺化而减小(45°)，随着0.6mg/ml hECM的固定进一步减小到32°。

将hECM涂覆到PVA胺化的非织造血管PET纤维结构上证明了高密度hECM涂层方法，而不使结合细胞的hECM结构域与PET交联。

实施例12

涂覆在小直径血管移植物上的胚胎ECM

在暴露于流动回路(flow circuit)中的脉动流剪切应力后，评估人大动脉内皮细胞(HAoEC)在未涂覆的和hECM涂覆的PET血管支架上的保持力，所述流动回路再生股动脉和静脉血流波形和搏动。

非织造PET纤维支架通过熔体喷射方法产生。利用聚(乙烯胺)以hECM进行PET纤维的功能化(Functionalization)。将HAoEC种植(2.0×10⁵/cm²)在未涂覆的和hECM涂覆的PET血管支架上，并静止地共温育3天，然后转移到在动脉(剪切速率为300s-1)和静脉(剪切速率为100s-1)流条件下刺激生理学脉动流波形的血管流变仪。在温育之后，通过以下表征细胞保持力：SEM观察、Alamar Blue生存力检验和通过Alexa Fluor 488(F-肌动蛋白)标记的荧光HAoEC显象。

与未涂覆的PET血管支架相比时，在动脉和静脉剪应力条件之后，在hECM涂覆的PET血管支架中观察到细胞损失的实质性降低。保持在hECM涂覆的PET血管支架上的细胞数目在动脉速度下在流动1h之后，比未被涂覆的高3×(保持率～85％)。在动脉速度下在流动1h之后，观察到相似的结果，即在hECM涂覆的移植物上明显较高的HAoEC保持力。在动脉和静脉剪应力条件之后，在hECM涂覆的PET血管支架上较高的细胞保持力的这种趋势也被在这些支架中获得的代谢活性(通过Alamar Blue细胞生存力检验)和细胞数目(在SEM显微照相上计数)增加3倍所证实。

用高密度hECM涂层方法进行PET小直径(1.5mm)移植物的功能化而不使结合RGD的结构域交联，有效地增强HAoEC对在生理学上体外刺激的剪切力的抗性。

实施例13

用hECM涂覆聚合物显著地改善生物适应性

胚胎条件下产生的人ECM被用于涂覆到聚合物支架并被在体内检验或被检验生物相容性。hECM由在搅动的生物反应器中生长的葡聚糖微球体上生长的新生儿真皮成纤维细胞产生。尼龙、聚丙烯(PPE)和聚对苯二甲酸乙二酯(PET)非织造支架被涂覆ECM。将hECM连接到聚合物支架，所述连接利用：戊二醛，“浸渍的和干燥的(dip&dry)”、UVA、乙酸蚀刻、聚(乙烯胺)(PVA)和Sulfo Sanphah。各种hECM涂层利用以下表征：傅里叶变换红外光谱学(FTIR)和能量分散(EDX)谱和利用扫描电镜术(SEM)的显象以及免疫荧光。然后，通过外科手术将最佳的ECM涂覆的和未涂覆的支架植入到SCID小鼠的皮下空间。离体植入物的组织学样品针对炎性反应、细胞渗透、异物巨细胞和囊形成被评估。

FTIR结果表明，通过PVA和UVA技术的最高ECM覆盖来自ECM溶液，其为0.6mg/ml。高ECM溶液密度表明，用ECM通过聚合物表面活化的胺基团进行完全的聚合物覆盖。完全的ECM覆盖期望为“隐藏”来自生理学环境的聚合物。该趋势由在其中观察到同质性和浓厚ECM覆盖的SEM和荧光显微照相所证实。

种植到ECM涂覆的和未涂覆的支架的人大动脉内皮细胞(HAoEC)针对细胞增殖通过Alamar Blue检验被分析。通常，显示最高ECM覆盖(在FTIR和SEM下)的物质也更有效地与细胞结合并支持细胞增殖增加2倍。

最后，经皮下植入的ECM涂覆的(PET、PPE和尼龙聚合物支架)显示，与未涂覆的支架相比时，免疫细胞渗透和异物巨细胞形成明显降低。另外，当与其未涂覆的对照相比时，用ECM涂覆的各种聚合物观察到改善的胶原蛋白囊形成和组织同化(integration)。

尽管本发明已经通过参考以上实施例被描述，但应该理解，各种修饰和变化也包含在本发明的精神和范围之内。因此，本发明仅限于所附的权利要求书。

Claims

1.制备包含一种或多种胚蛋白质的组合物的方法，包括：

在低氧含量条件下在合适的生长培养基中在支撑物上培养细胞，从而产生包含一种或多种胚蛋白质的可溶和不可溶组合物。

2.权利要求1的方法，其中所述生长培养基包含血清。

3.权利要求1的方法，其中所述生长培养基不含血清。

4.权利要求1的方法，其中所述低氧含量条件包括1-5％的氧。

5.权利要求1的方法，其中与在约15-20％氧的氧条件中产生的介质相比，胶原蛋白物质被上调。

6.权利要求5的方法，其中所述胶原蛋白选自V型α1；IX型α1；IX型α2；VI型α2；VIII型α1；IV型α5；VII型α1；XVIII型α1；或XII型α1。

7.权利要求1的方法，其中与在约15-20％氧的氧条件中产生的介质相比，Wnt物质被上调。

8.权利要求7的方法，其中所述Wnt物质为wnt 7a和wnt 11。

9.权利要求1的方法，其中与在约15-20％氧的氧条件中产生的介质相比，层粘连蛋白物质被上调。

10.权利要求9的方法，其中所述层粘连蛋白物质为层粘连蛋白8。

11.权利要求1的方法，其中不含细胞的上清液在缓冲液中被透析、低压冻干和重构。

12.权利要求1的方法，其中不含细胞的上清液在缓冲液中被透析、干燥和重构。

13.权利要求1的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。

14.权利要求13的方法，其中所述成纤维细胞是新生儿成纤维细胞。

15.权利要求1的方法，其中所述细胞是干细胞。

16.权利要求1的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞。

17.权利要求1的方法，其中所述支撑物允许三维生长。

18.权利要求17的方法，其中所述支撑物包含筛网。

19.权利要求1的方法，其中所述支撑物允许二维生长。

20.权利要求19的方法，其中所述支撑物包含微球。

21.权利要求1的方法，其中所述细胞是种特异性的。

22.通过权利要求1的方法制备的组合物，其中所述组合物是所述可溶部分。

23.通过权利要求1的方法制备的组合物，其中所述组合物是所述不可溶部分。

24.通过权利要求1的方法制备的组合物，其中所述组合物是所述可溶和不可溶部分的组合。

25.修复和/或再生细胞的方法，包括使待修复或再生的细胞与由权利要求1所述的方法制备的组合物接触。

26.权利要求25的方法，其中所述细胞是骨软骨细胞。

27.权利要求25的方法，其中所述细胞是干细胞。

28.组织再生补片，包含由权利要求1所述的方法制备的组合物。

29.组织培养体系，包括由权利要求1所述的方法制备的组合物。

30.权利要求29所述的组织培养体系，其中所述体系用于支持干细胞生长。

31.权利要求30所述的组织培养体系，其中所述干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞。

32.联合在对象中植入装置应用的表面涂层，包含由权利要求1所述的方法制备的组合物。

33.权利要求32的方法，其中所述装置是起搏器、支架、支架移植物、人工血管、心瓣膜、支路、药物递送端口、导管或补片。

34.权利要求32的方法，其中所述涂层可用于改良伤口愈合、改良炎症、改良纤维囊形成、改良生长中的组织或改良生长中的细胞。

35.治疗损伤组织的方法，包括使所述损伤组织与由权利要求1所述的方法制备的组合物在允许治疗所述损伤组织的条件下接触。

36.权利要求35的方法，其中所述组织是心组织。

37.权利要求35的方法，其中所述组织是梗塞的组织或缺血性组织。

38.权利要求35的方法，其中所述组织是肠组织。

39.改善对象中的皮肤表面的方法，包括在皱纹部位给所述对象施用由权利要求1的方法制备的组合物，从而提供改善的皮肤表面。

40.生物抗粘连剂，包含由权利要求1所述的方法制备的组合物。

41.用于细胞输送或维持在输送位点的生物学载体，包含由权利要求1所述的方法制备的组合物。

42.用于修复或增强对象中的软组织的方法，包括在皱纹部位给所述对象施用由权利要求1的方法制备的组合物，从而使软组织修复或增强。

43.促进毛发生长的方法，包括使细胞与由权利要求1的方法制备的组合物接触，从而促进毛发生长。

44.权利要求43的方法，其中所述细胞是毛囊细胞。

45.权利要求43的方法，其中所述细胞在体内被接触。

46.权利要求43的方法，其中所述细胞在体外被接触。

47.权利要求46的方法，其中所述细胞被移植到对象中。

48.产生Wnt蛋白质和血管内皮生长因子(VEGF)的方法，包括

在低氧含量条件下在支撑物上在合适的生长培养基中培养细胞，从而产生所述Wnt蛋白质和所述VEGF。

49.权利要求48的方法，其中所述生长培养基不含血清。

50.权利要求48的方法，其中所述低氧含量条件为1-5％的氧。

51.权利要求49的方法，其中与在约15-20％氧的氧条件中产生的介质相比，Wnt物质被上调。

52.权利要求51的方法，其中所述Wnt物质为wnt 7a和wnt 11。

53.权利要求48的方法，其中与在约15-20％氧的氧条件中产生的介质相比，VEGF物质被上调。

54.权利要求53的方法，其中所述VEGF物质是VEGF-A或其同种型。

55.权利要求48的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。

56.权利要求48的方法，其中所述支撑物允许三维生长。

57.权利要求56的方法，其中所述支撑物包含筛网。

58.权利要求48的方法，其中所述支撑物允许二维生长。

59.权利要求58的方法，其中所述支撑物包含微球。

60.产生干细胞的方法，包括在低氧含量条件下在支撑物上在合适的生长培养基中培养细胞，从而产生以比含氧量正常的条件高至少3倍的水平表达干细胞基因特征的细胞。

61.权利要求60的方法，其中所述基因选自Oct4、Sox2、KLF4、NANOG和cMyc。

62.权利要求61的方法，其中所述基因是Oct4。

63.权利要求60的方法，其中低氧含量条件包含1-5％的氧。