KR20200040536A

KR20200040536A - 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 제조한 조정배지를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20200040536A
Application number: KR1020180120579A
Authority: KR
Inventors: 김동익; 김애경; 한규현
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단; 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2018-10-10
Filing date: 2018-10-10
Publication date: 2020-04-20
Also published as: WO2020076015A1

Abstract

본 발명은 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정배지(conditioned medium)를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물, 암세포 사멸 유도용 또는 암세포 증식 억제 유도용 배지 조성물, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 암 세포 사멸 유도용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정배지를 이용하면 암세포의 증식을 억제하면서 사멸을 유도할 수 있어, 항암제로 활용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 제조한 조정배지를 이용하면 주변 정상 세포의 사멸을 유도하지 않으면서 암세포만을 특이적으로 사멸시킬 수 있어 임상으로 바로 적용 가능한 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 제조한 조정배지를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물 및 이의 제조 방법{A composition for inducing cancer cell apoptosis comprising a conditioned medium prepared by culturing fibroblasts under hypoxic conditions and a method for producing the same}

본 발명은 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정배지(conditioned medium)를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물, 암세포 사멸 유도용 또는 암세포 증식 억제 유도용 배지 조성물, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 암 세포 사멸 유도용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

유전자의 정상적인 제어가 이루어지지 않아 발생하는 질병, 대표적으로 암으로 통칭되는 질환에 대한 효과적이고 전통적인 치료 방법은 외과적으로 종양을 절제하여 제거하는 방법이 활용되고 있었으나, 원발성 암이 타 기관으로 전이가 되는 경우는 외과적 수술이 불가하여 항암 약물 치료 요법이 사용되었다. 약물 치료로 사용되는 항암제는 주로 단분자 물질을 유기적 또는 무기적 방법으로 합성하여 사용하고 있다. 이러한 방식의 전통적 약물 치료법은 많은 부작용을 수반하는데, 그 중 한 가지는 약물로 사용되는 물질이 인위적으로 합성된 생체 외부 유래 물질이라는 것과 항암 물질의 작용점이 이미 과다 발현된 단백질을 목적으로 한다는 점이다.

섬유아세포(fibroblast)는 선유아세포(線維芽細胞)라고도 불리는 세포로, 결합조직의 고유세포로서 조면소포체와 골지체의 양호한 발육을 특징으로 하는 타원성인 핵과 방추상인 원형질을 갖춘 세포를 말한다. 많은 장기(臟器; internal organsviscera)에 존재하는 간질계세포(間質系細胞; mesenchymal cell)에서 실질세포(實質細胞; parenchymal cell;)를 메꾸는 역할을 하는 세포도 포함하며, 교질(collagen)과 프로테오글리칸(proteoglycan) 등 세포간질물질합성 분비능이 있고, 근아세포(myoplast)와는 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다.

또한 섬유아세포는 혈청 또는 섬유아세포 증식인자(fibroblast growth factor: FGF) 등에 의해 증식하며, 접촉저지(contact inhibition)하면 돌담모양처럼 모양이 변형되며, 정성섬유아세포에서는 계대배양을 반복하는 경우 50대가 되면 거의 사멸하는 것으로 알려져 있다. 상기와 같은 섬유아세포의 접촉저지기능상실(接觸沮止機能喪失; loss of function for contact inhibition)을 이용하여 발암의 선별(screening)에 사용하고 있으며, 세포의 증식연구, 특히 증식인자(growth factor)의 신호전달을 연구하는 데 많이 사용하고 있다.

현재까지 많은 천연물 및 단백질 또는 펩티드성 항암제와 화학합성 항암제가 개발되어 사용되고 있으나, 대부분 생체 내 정상세포에도 영향을 나타내는 심각한 부작용을 나타낼 뿐만 아니라, 암종에 따라 또는 동일한 암종이라도 환자에 따라서 동일한 치료효과가 나타나지 않는 경우가 일반적이다. 이에 따라 전 세계적으로 이러한 문제점들을 해결한 신개념 항암제로서, 생체 내 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서도, 암세포만을 선택적으로 제거할 수 있으면서, 더 나아가 모든 종류의 암세포를 제거할 수 있는 항암제를 개발하기 위하여 많은 연구의 필요성이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 암세포에만 특이적인 사멸을 유도하는 효과를 나타내 항암제로 사용할 수 있는 가능성을 가진 자연적으로 존재하는 세포 및 단백질에 관해 연구하던 중 저산소 배양환경에서 섬유아세포를 배양하여 제조한 섬유아세포 조정배지가 암세포의 증식을 억제하면서 동시에 세포사멸(apoptosis)을 유도할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정배지(conditioned medium)를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물, 암세포 사멸 유도용 또는 암세포 증식 억제 유도용 배지 조성물, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 암 세포 사멸 유도용 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정배지(conditioned medium)를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 저산소 환경에서 배양한 섬유아세포(fibroblast) 배양액을 포함하는 암세포 사멸 유도용 또는 암세포 증식 억제 유도용 배지 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 섬유아세포(fibroblast)를 저산소 환경에서 배양하여 조정배지를 제조하는 단계;를 포함하는 암 세포 사멸 유도용 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정배지를 이용하면 암세포의 증식을 억제하면서 사멸을 유도할 수 있어, 항암제로 활용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 제조한 조정배지를 이용하면 주변 정상 세포의 사멸을 유도하지 않으면서 암세포만을 특이적으로 사멸시킬 수 있어 임상으로 바로 적용 가능한 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 저산소 조건에서 배양한 섬유아세포 조정 배지를 48 시간(2일) 및 72 시간(3일) 동안 배양한 경우에 발생하는 Hela 세포 증식 억제능을 확인한 실험 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 2는 Medium(기본 배양 배지), C-CM(무혈청 배지조건), N-CM(21% 정상산소 조건), H-CM(1% 저산소 조건) 배지 별 아넥신 V 분석을 통한 Hela 세포의 세포사멸(apoptosis)의 정도를 나타낸 결과(도 2A) 및 이를 그래프화하여 나타낸 도(도 2B)이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 3은 Medium(기본 배양 배지), C-CM(무혈청 배지조건), N-CM(21% 정상산소 조건), H-CM(1% 저산소 조건) 배지별 암세포의 Caspase3/7 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 4는 Medium(기본 배양 배지), C-CM(무혈청 배지조건), N-CM(21% 정상산소 조건), H-CM(1% 저산소 조건) 배지별 암세포의 미토콘드리아 막 포텐셜 변화를 측정한 실험 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 5는 Medium(기본 배양 배지), C-CM(무혈청 배지조건), N-CM(21% 정상산소 조건), H-CM(1% 저산소 조건) 배지 별 암세포 세포 주기를 계수한 결과(도 5A)에, 암세포의 각각의 세포 주기에 해당하는 암세포를 배지별로 표시한 결과(도 5B)를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 6은 저산소 농도 조건을 1%(H 1%) 및 5%(H 5%)로 하고 섬유아세포를 배양하여 제조한 조정배지에서 확인한 암세포 사멸 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01).

본 발명은 저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정배지(conditioned medium)를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "섬유아세포"란 섬유아세포(fibroblast)는 선유아세포(線維芽細胞)라고도 불리는 세포로, 결합조직의 고유세포로서 조면소포체와 골지체의 양호한 발육을 특징으로 하는 타원성인 핵과 방추상인 원형질을 갖춘 세포를 말한다.

본 발명에서의 용어, '배지(culture media)'는 체외배양 조건에서 세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배양액을 의미하고, 섬유아세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 또한, 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용하는 용어 "조정 배지(conditioned medium, CM)"란, 섬유아세포를 배양하여 수득된 배양액 자체, 또는 그로부터 섬유아세포가 제거된 배양 상층액을 의미하며, "섬유아세포 배양 상층액", "섬유아세포 배양액" 또는 "섬유아세포 배양 배지"와 호환적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 배지는 영양혼합물(Nutrient Mixture)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 영양 혼합물은 세포배양에 일반적으로 사용되는 각종 아미노산, 비타민, 무기염 등을 포함하는 혼합물로서, 상기 아미노산, 비타민, 무기염 등을 혼합하여 제조하거나 상업적으로 제조된 영양 혼합물을 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 영양혼합물은 M199, MCDBllO, MCDB202, MCDB302 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서는 저산소 환경에서 섬유아세포를 배양하여 조정배지를 제조하였으며, 상기 제조된 조정배지가 항암활성을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 일 구체예에서 확인한 상기 항암 활성은 암세포 증식 억제, 암세포 사멸(apoptosis) 유도, 암세포 세포 주기 억류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 활성인 것을 확인하였다. 특히 본 발명에서는 세포 사멸 유도 활성이 caspase 3/7 활성 증가 또는 미토콘드리아 막 포텐셜 감소에 의한 것임을 확인하였다.

본 발명에 있어서 “저산소” 환경 조건은 정상 대기 산소 농도인 21%보다 낮은 산소 농도를 의미하는 것으로, 0.5% 내지 7% 산소 농도일 수 있으나, 바람직하게는 0.7% 내지 5% 산소 농도일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1%의 산소 농도를 포함하는 배양 조건일 수 있다.

또한 본 발명은 저산소 환경에서 배양한 섬유아세포(fibroblast) 배양액을 포함하는, 암세포 사멸 유도용 또는 암세포 증식 억제 유도용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 저산소 환경에서 배양한 섬유아세포 배양액을 포함하는 배지 조성물은 상기 조성물이 처리된 암세포의 caspase 3/7 활성을 증가시키거나 또는 미토콘드리아 막 포텐셜을 감소시킴으로써 암세포의 사멸을 유도할 수 있는바, 효과적으로 암세포 사멸 유도 용도로 활용할 수 있다. 또한 본 발명의 저산소 환경에서 배양한 섬유아세포 배양액을 포함하는 배지 조성물은 처리된 암세포의 세포 주기를 억류시킬 수 있어 효과적으로 암세포 증식 억제 용도로 활용할 수 있다.

본 발명에서의 '암'이란 정상적인 세포사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하고, 주변 조직으로 침윤할 수 있는 특징을 갖는 질병군을 말한다. 본 발명의 암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 요도암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암, 피부암, 골수종, 백혈병 및 악성림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 저산소 환경에서 섬유아세포를 배양하여 제조한 조정배지를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및/또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제 또는 흡입제로 제제화하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로서 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로는 0.0001 ~ 1000 ㎎/일, 바람직하게는 1 ~ 500 ㎎/일이며, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있다.

본 발명에서 '개체'란 암의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명의 섬유아세포를 저산소 환경에서 배양하여 조정배지를 제조하는 단계는 섬유아세포를 정상 대기 산소 농도인 21%보다 낮은 산소 농도에서 배양하는 단계를 포함하며, 상기 저산소 환경은 0.5% 내지 7% 산소 농도 환경일 수 있으나, 바람직하게는 0.7% 내지 5% 산소 농도 환경일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1%의 산소 농도 환경을 말한다.

본 발명의 조정배지 제조하는 단계에서 사용하는 배지는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등을 사용할 수 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제조 방법을 통한 암 세포 사멸 유도용 조성물을 이용하면 암세포의 증식을 억제하고 암세포의 세포 주기 억류시켜 상기 조성물을 처리한 암세포의 사멸을 효율적으로 유도할 수 있다.

본 발명을 이하 실시예를 통하여 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 섬유아세포(fibroblast) 배양을 통한 조정 배지의 제조

실험에 사용한 섬유아세포를 정상 대기 산소 농도 조건(21% O₂) 및 저산소 농도 조건(1% 및 5% O₂)에서 2주 이상 배양한 후, 각각의 산소 조건 환경에서 배양한 섬유아세포 2x10⁵ 개의 세포를 DMEM 배지(Dulbeco's Modified Eagle's Media)(Gibco, Grand NY, 미국)에 10% FBS (Fetal Bovine Serum)(Gibco, Grand NY, 미국) 및 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)(Gibco, Grand NY, 미국)를 첨가한 배양배지 용액 10ml을 첨가한 100mm 배양 플레이트에 seeding 하고 5일 동안 배양하였다. 이후, 섬유아세포의 세포 confluency가 90%가 될 때 1 X PBS로 세척하였다. 이후, 무혈청 조건의 DMEM 6ml를 섬유아세포에 첨가하였다. 24시간 이후, 배지를 수득하였으며, 수득한 배지를 300g로 5분 동안 원심분리를 수행하였다. 상층액을 수득하여 이를 -80℃에서 냉동보관하였다. 이후, 이하의 실시예에서는 본 실시예에서 수득한 조정배지를 사용하였다.

실시예 2. 저산소 환경에서 배양한 섬유아세포 조정 배지의 암세포 증식 억제능의 확인

저산소 농도 조건에서 배양한 섬유아세포 조정 배지가 암세포의 증식을 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 96 웰 white 플레이트의 각 웰에 1x10⁴ 개의 자궁경부암 세포인 Hela 세포를 넣고 1일 동안 배양하였다. 이 후, 정상 대기 산소 농도 조건(21% O₂)과 저산소 농도 조건(1% O₂)에서 배양된 실시예 1에서 수득한 섬유아세포 조정 배지 100 ㎕를 배지에 첨가하였다. 이 후, 48 시간(2일) 및 72 시간(3일) 동안 배양 후 CellTiter-Glo assay 2.0 reagent (Promega, USA)를 100 ㎕ 첨가하고 10분 동안 반응시켰다. 반응 이후에 GLOMAX Multi Detection System (Promega BioSystems Sunnyvale, Inc. USA)으로 발광을 분석하였고, 분석을 수행한 결과를 도 1에 나타내었다. Medium은 1% 항생제, DMEM 및 10% FBS가 첨가된 기본 배양 배지를 의미하고, C-CM은 1% 항생제와 DMEM만이 첨가된 무혈청 조건의 배양배지를 의미하며, N-CM은 실시예 1에서 수득한 정상산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정배지를 의미하고, H-CM은 실시예 1에서 수득한 1% 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정배지를 의미한다.

도 1에서 확인한 바와 같이, 각 배지 조건에서 2일 동안 hela 세포를 배양한 경우, 배양배지의 대조군인 C-CM 대비 N-CM 및 H-CM에서 hela 세포의 증식이 감소하는 것을 확인하였다. 특히, H-CM은 대조군인 C-CM 보다 암세포의 증식이 1/3정도 수준으로까지 감소한 것이 확인되었으며, N-CM과 비교한 경우에 암세포 증식 수준은 약 1/2 이하로 감소된 것을 확인하였다. 상기와 같은 조정 배지의 암세포 증식 억제능은 3일 동안 배양한 경우에 두드러지게 나타났는데, N-CM 및 H-CM에서 배양한 경우 hela 세포의 증식 억제가 2일 동안 배양한 경우보다 더욱 나타났으며, 특히 H-CM에서는 암세포의 증식억제능이 현저하게 나타났다. 종합적으로 저산소 환경에서 섬유아세포를 배양한 경우에 있어서 그 배양 배지는 암세포 증식 억제능력이 더욱 우수하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 저산소 농도에서 배양한 섬유아세포 조정 배지의 아넥신 Ⅴ를 통한 암세포 사멸 효과의 확인

저산소 농도 조건에서 배양하여 제조한 섬유아세포 조정 배지가 암세포를 사멸시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 아넥신 Ⅴ 발현 분석을 수행하였다. 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에 1.5x10⁵ Hela 세포를 넣고 하루 동안 배양 후, 정상 대기 산소 농도 조건(21% O₂)과 저산소 농도 조건(1% O₂)에서 배양된 실시예 1에서 수득한 섬유아세포 조정 배지 2 ml를 플레이트에 첨가하였다. 이 후, 48 시간 동안 Hela 세포를 배양하고 이를 FITC 아넥신(Annexin) V apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, SanDiego, CA, USA) 으로 염색한 후, 세포자동해석분리장치(FACS) Caliber flow cytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 결과를 분석하였고, 그 결과를 각각 2A 및 도 2B에 나타내었다. Medium은 1% 항생제, DMEM 및 10% FBS가 첨가된 기본 배양 배지를 의미하고, C-CM은 1% 항생제와 DMEM만이 첨가된 무혈청 조건의 배양배지를 의미하며, N-CM은 실시예 1에서 수득한 정상산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정배지를 의미하고, H-CM은 실시예 1에서 수득한 1% 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정배지를 의미한다.

도 2A 및 2B에 나타난 바와 같이, 아넥신 V 분석을 통하면 세포의 세포사멸을 확인할 수 있는데, Medium 및 C-CM에서 배양한 경우 암세포가 사멸이 거의 없어 생존한 세포의 수가 대부분인 것을 확인하였다. 다만, 초기 세포 사멸(early apoptosis)은 C-CM 대비 N-CM 및 H-CM에서 배양한 Hela 세포에서 유의하게 나타나는 것을 확인하였다. 후기 세포 사멸 즉 사멸한 암세포(late apoptosis/dead)는 특히 저산소 환경에서 배양한 H-CM배지의 경우에 N-CM 대비 사멸한 암세포의 수가 현저하게 상승한 것을 확인할 수 있었는데, 약 3배 이상 증가한 것이 확인되었다. 이를 통하여 저산소 환경에서 배양한 조정배지는 암세포의 세포 사멸을 유도하고, 최종적으로는 암세포의 사멸까지 유도할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. 저산소 농도에서 배양한 섬유아세포 조정 배지의 caspase 3/7 활성 분석을 통한 암세포 사멸 효과의 확인

저산소 농도 조건에서 배양하여 제조한 섬유아세포 조정 배지에서 배양한 암세포의 caspase 3/7 활성을 확인함으로써 상기 조정 배지가 암세포의 사멸을 유도하는지 확인하는 실험을 수행하였다. 96 웰 white 플레이트의 각 웰에 1x10⁴ 개의 Hela 세포를 넣고 1일 동안 배양하였다. 이 후, 정상 대기 산소 농도 조건(21% O₂)과 저산소 농도 조건(1% O₂)에서 배양된 실시예 1에서 수득한 섬유아세포 조정 배지 100 ㎕를 배지에 첨가하였다. 12, 24, 48시간 동안 상기 배지에서 배양한 후 Caspase-Glo 3/7 Assay(Promega, USA)를 100 ㎕ 첨가한 후에 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 GLOMAX Multi Detection System (Promega BioSystems Sunnyvale, Inc. USA)으로 발광을 분석하였으며, 상기 분석을 수행한 결과를 도 3에 나타내었다. Medium은 1% 항생제, DMEM 및 10% FBS가 첨가된 기본 배양 배지를 의미하고, C-CM은 1% 항생제와 DMEM만이 첨가된 무혈청 조건의 배양배지를 의미하며, N-CM은 실시예 1에서 수득한 정상산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정배지를 의미하고, H-CM은 실시예 1에서 수득한 1% 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정배지를 의미한다.

도 3에서 확인한 바와 같이, 조정 배지에서 배양을 시작하여 12시간이 경과한 후에는 세포사멸 마커인 caspase 3/7 활성이 대조군인 C-CM 대비 H-CM에서 증가하였으며, 24시간이 경과한 후에 보다 현저하게 그 활성이 증가된 것을 확인하였다. 특히 48시간이 경과된 경우에는 대조군인 C-CM 대비 H-CM에서 caspase 3/7 활성이 2배 이상 증가된 것을 확인하였다. 이에, 섬유아세포를 저산소 환경에서 배양하여 제조된 조정배지에서 암세포를 배양시키면 세포 사멸인자인 caspase 3/7의 활성이 현저하게 증가한 것을 확인하여, 상기 조정배지를 통하면 암세포를 현저하게 세포 사멸시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 저산소 농도에서 배양한 섬유아세포 조정 배지의 미토콘드리아 막 포텐셜 (Mitochondria membrane potential) 분석을 통한 암세포 사멸 효과의 확인

세포 사멸이 발생하면 미토콘드리아의 막 포텐셜의 변화가 발생한다. 이에, 저산소 농도 조건에서 배양하여 제조한 섬유아세포 조정 배지가 암세포를 사멸시킬 수 있는지 여부를 미토콘드리아 막 포텐셜 분석을 통하여 확인하는 실험을 수행하였다. 96 웰 black 플레이트의 각 웰에 1x10⁴ 개의 Hela 세포를 넣고 1일 동안 배양하였다. 이 후, 정상 대기 산소 농도 조건(21% O₂)과 저산소 농도 조건(1% O₂)에서 배양된 실시예 1에서 수득한 섬유아세포 조정 배지 100 ㎕를 배지에 첨가하였다. 12, 24 및 48시간 동안 상기 배지에서 배양한 후 Orange Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (Abcam, Cambridge, UK)을 처리하였고, 이 후 Mithras 2LB 943 Multimode Reader (Berthold Biotechnologies, Bad Wildad. Germany)로 형광(Ex/Em = 540/590 nm)의 조건에서 그 결과를 분석하였고, 이를 도 4에 나타내었다. Medium은 1% 항생제, DMEM 및 10% FBS가 첨가된 기본 배양 배지를 의미하고, C-CM은 1% 항생제와 DMEM만이 첨가된 무혈청 조건의 배양배지를 의미하며, N-CM은 실시예 1에서 수득한 정상산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정배지를 의미하고, H-CM은 실시예 1에서 수득한 1% 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정배지를 의미한다.

도 4에서 확인한 바와 같이, 조정 배지에서 배양을 시작하여 24시간이 경과한 후에 대조군인 C-CM 대비 N-CM 및 H-CM에서 배양한 경우에 암세포의 미토콘드리아 막 포텐셜이 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 특히 48시간이 경과된 후에는 N-CM보다 H-CM에서 배양한 경우에 암세포의 막 포텐셜이 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 저산소 환경에서 배양한 조정배지는 암세포의 사멸을 유도하여 미토콘드리아 막 포텐셜의 현저한 감소를 확인할 수 있었다.

실시예 6. 저산소 농도에서 배양한 섬유아세포 조정 배지의 암세포의 세포 주기 억류 효과의 확인

저산소 농도 조건에서 배양하여 제조한 섬유아세포 조정 배지가 암세포의 세포주기를 억류시켜 세포의 증식을 억제시킬 수 있는지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다. 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에 1.5x10⁵ 개의 Hela 세포를 넣고 하루 동안 배양한 후, 정상 대기 산소 농도 조건(21% O₂)과 저산소 농도 조건(1% O₂)에서 배양된 실시예 1에서 수득한 섬유아세포 조정 배지 2 ml를 플레이트에 첨가하였다. 이후 24시간 동안 배양한 후 Hela 세포를 프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide)(Abcam, Cambridge, UK)로 염색한 후, FACSVerse™ flow cytometer (BD, USA)로 분석을 수행하였으며, 배지 별 암세포 세포 주기를 계수한 결과를 도 5A에, 암세포의 각각의 세포 주기에 해당하는 암세포를 배지별로 표시한 결과를 도 5B에 나타내었다. Medium은 1% 항생제, DMEM 및 10% FBS가 첨가된 기본 배양 배지를 의미하고, C-CM은 1% 항생제와 DMEM만이 첨가된 무혈청 조건의 배양배지를 의미하며, N-CM은 실시예 1에서 수득한 정상산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정배지를 의미하고, H-CM은 실시예 1에서 수득한 1% 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정배지를 의미한다.

도 5A 및 5B에서 확인한 바와 같이, N-CM보다 H-CM을 처리하여 배양한 경우에 Hela cell에서 G0/G1기는 다소 증가하였으나, S기 및 G2/M기에 해당하는 세포의 수는 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 암세포는 정상세포 대비 현저한 세포 증식이 특징으로 나타나는데, 저산소 환경에서 배양한 조정배지에서 암세포를 배양하면 배양한 암세포의 세포 주기 중 세포가 분열하는 M기가 감소함과 동시에 세포 분열이 없는 G0/G1기 및 S기가 증가하는바, 세포 주기 억류 효과가 나타나 암세포의 전체적인 증식이 억제되는 효과가 종합적으로 나타날 수 있음을 확인하였다.

실시예 7. 섬유아세포 조정배지의 최적화된 암세포 증식억제 효과가 나타나는 저산소 농도 조건의 확인

상기 실시예 2 내지 6의 저산소농도 조건에서 배양한 섬유아세포 조정배지에 있어서, 저산소 농도 조건이 어느 정도인 경우에 암세포 사멸효과가 가장 우수한지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 96 웰 white 플레이트의 각 웰에 1x10⁴ 개의 자궁경부암 세포인 Hela 세포를 넣고 1일 동안 배양하였다. 이 후, 정상 대기 산소 농도 조건(21% O₂)과 저산소 농도 조건(1% O₂)에서 배양된 실시예 1에서 수득한 섬유아세포 조정 배지 100 ㎕를 배지에 첨가하였다. 48시간 동안의 배양 이후, hela 세포를 CellTiter-Glo assay 2.0 reagent (Promega, USA)를 100 ㎕ 첨가하여 10분간 반응시켰다. 이 후 GLOMAX Multi Detection System (Promega BioSystems Sunnyvale, Inc. USA)으로 발광을 분석하였고, 이를 분석한 실험 결과를 도 6에 나타내었다. M은 1% 항생제, DMEM 및 10% FBS가 첨가된 기본 배양 배지를 의미하고, C는 1% 항생제와 DMEM만이 첨가된 무혈청 조건의 배양배지를 의미하며, N(fibro)은 실시예 1에서 수득한 정상산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정배지를 의미하고, H-CM은 실시예 1에서 수득한 1% 저산소 조건에서 섬유아세포를 배양하여 수득한 조정배지를 의미한다.

도 6에서 확인한 바와 같이, 저산소 농도 조건 중 1% 산소 농도 조건이 5% 산소 농도 조건보다 유의할 정도로 암세포의 증식을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이에, 항암효과가 최적으로 나타나는 저산소 농도의 조건은 1%인 것을 확인할 수 있었다.

Claims

저산소 환경에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 제조한 조정배지(conditioned medium)를 포함하는 암세포 사멸 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 저산소 환경은 0.5% 내지 7%의 산소를 포함하는 배양 조건인, 암세포 사멸 유도용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조정배지는 항암 활성을 나타내는 것인, 암세포 사멸 유도용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 항암 활성은 암세포 증식 억제, 암세포 사멸(apoptosis) 유도 및 암세포 세포 주기 억류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 활성인, 암세포 사멸 유도용 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 암세포 사멸 유도 활성은 caspase 3/7 활성 증가 또는 미토콘드리아 막 포텐셜 감소에 의한 것인, 암세포 사멸 유도용 조성물.
저산소 환경에서 배양한 섬유아세포(fibroblast) 배양액을 포함하는, 암세포 사멸 유도용 또는 암세포 증식 억제 유도용 배지 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 요도암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암, 피부암, 골수종, 백혈병 및 악성림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
섬유아세포(fibroblast)를 저산소 환경에서 배양하여 조정배지를 제조하는 단계;를 포함하는 암 세포 사멸 유도용 조성물의 제조 방법.