WO2017113101A1 - 雌性生殖疾病靶点cmklr1及其拮抗剂与相关应用 - Google Patents

雌性生殖疾病靶点cmklr1及其拮抗剂与相关应用 Download PDF

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    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • assisted reproductive technology for patients with PCOS, especially for the application of standards for more than 6 months.
  • Patients with PCOS who have ovulation but are still not pregnant after ovulation induction therapy, or a variety of drugs that promote ovulation therapy and adjuvant therapy for patients who are anovulatory and urgently pregnant can choose the assisted reproductive technology of embryo transfer, including in vitro fertilization technology (In vitro) Fertilization (IVF) and in vitro maturation (IVM).
  • IVF in vitro fertilization technology
  • IVMF in vitro maturation
  • leptin can also promote the development of various cancers such as prostate cancer and thyroid cancer, and its expression level is positively correlated with tumorigenesis, but the level of leptin in pancreatic cancer is relatively low, and both. The relationship is not very clear. Studies have also found that adiponectin has an inhibitory effect on the development of tumors.
  • the present invention provides a method for preventing and/or treating a female reproductive disease, the method comprising: targeting CMKLR1, reducing the expression level of CMKLR1 and/or antagonizing the action of CMKLR1 to prevent and/or prevent Treatment of female reproductive diseases.
  • CMKLR1 knockout of the expression level of the CMKLR1 gene or the knockdown CMKLR1 gene
  • antagonize the action of CMKLR1 with an antagonist against CMKLR1.
  • Figure 11 Effect of CMKLR1 specific antagonist, ⁇ -NETA, on DHEA-induced mouse ovarian structure.
  • the cells were infected with the lentivirus containing the Tomato/Luciferase gene for 6 hours;
  • the cells to be transfected were gently rinsed once with PBS, 2 mL of complete medium was added to the wells, and cultured in a carbon dioxide incubator;
  • SKGM3-Luc-Tomato-shCMKLR1/LRH or SKOV3.ipl-Luc-Tomato-shCMKLR1/LRH, or pSM2c-Hu-scramble shRNA to digest the cells during the coagulation of the underlying gel, count, and adjust with serum-free medium.
  • concentration is 5 ⁇ 104/ml, and 100 ⁇ l of cells per well are used, and 3 parallel holes are set;
  • DHT+CMKLR1 antagonist group subcutaneously implanted DHT sustained release granules, pellets containing 7.5 mg of DHT for 90 consecutive days, daily release dose of 83.3 micrograms. 1 mg CMKLR1 antagonist ⁇ -NETA sustained release pump was implanted subcutaneously.
  • CMKLR1 antagonist group subcutaneous injection of sesame oil at 6 mg/100 g, intraperitoneal injection at 1 mg/kg CMKLR1 antagonist ⁇ -NETA.
  • CMKLR1 antagonist ⁇ -NETA was intraperitoneally injected at 1 mg/kg by subcutaneous injection of DHEA at 6 mg/100 g.

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Abstract

提供了雌性生殖疾病新型靶点CMKLR1，以及针对CMKLR1的拮抗剂在制备用于预防和/或治疗雌性生殖疾病的药物中的应用。还提供了一种预防和/或治疗雌性生殖疾病的药物组合物，其包含针对CMKLR1的拮抗剂。还提供了一种利用针对CMKLR1的拮抗剂预防和/或治疗雌性生殖疾病的方法。

Description

雌性生殖疾病靶点CMKLR1及其拮抗剂与相关应用 技术领域
本发明是关于与雌性生殖疾病相关的新型靶点，具体而言，本发明是关于雌性生殖疾病靶点CMKLR1及其拮抗剂与相关应用。
背景技术
国家统计局发布第六次全国人口普查主要数据公报数据显示，全国总人口为1,339,724,852人。与2000年第五次全国人口普查相比，十年增加7390万人，增长5.84％，年平均增长0.57％，比1990年到2000年的年平均增长率1.07％下降0.5个百分点。数据表明，我国人口增长处于低生育水平阶段。2015年10月，中国共产党第十八届中央委员会第五次全体会议公报指出：促进人口均衡发展，坚持计划生育的基本国策，完善人口发展战略，全面实施一对夫妇可生育两个孩子政策，积极开展应对人口老龄化行动。
然而近些年来，快节奏的工作和生活方式，高消费的压力，方方面面都挑战着婚育年龄的女性。因此，女性的健康，尤其是女性的生殖健康是不容忽视的社会问题。
(1)多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)
多囊卵巢综合征是育龄妇女常见的内分泌紊乱性疾病，发病率占育龄期妇女的6～10％，其主要表现为月经稀发或闭经、不孕、卵巢多囊性变、肥胖、多毛、高雄激素血症等。对于PCOS患者的治疗，包括手术治疗、药物治疗和辅助生育技术。
PCOS的手术治疗可以减少卵巢中部分颗粒细胞，卵巢间质产生雄激素减少，从而使循环中的雄激素水平降低，进而GnRH降低，引起血清雄激素浓度进一步降低，这也说明卵巢间质亦受垂体-卵巢轴调控。PCOS的手术治疗主要包括双侧卵巢楔形切除术(BOWR)，.腹腔镜下卵巢电灼或激光打孔治疗(Laparoscopic ovariandrilling,LOD)和经阴道水腹腔镜(Transvaginalhydrolaparoscopy，THL)。
PCOS的药物治疗目前已取代手术治疗作为一线治疗方法，治疗的目的主要与病人的生育要求相关，如采用降低高雄激素血症的药物治疗，促排卵药物治疗，或胰岛素增敏剂(insulin-sensitizing drugs,ISD)治疗等。
另外，也有对PCOS患者采用辅助生育技术，尤其是对于应用6个月以上标准的 促排卵周期治疗后有排卵但仍未妊娠的PCOS患者，或多种药物促排卵治疗及辅助治疗无排卵并急待妊娠的患者，可以选择胚胎移植的辅助生育技术，包括体外受精技术(In vitro fertilization,IVF)和卵母细胞体外成熟技术(In vitro maturation,IVM)。
然而以上治疗方法均有优缺点，关键是迄今为止，PCOS的发病机制仍不清楚，所以目前采用的治疗方法也只是治标。
大量研究表明40～60％的PCOS患者是肥胖者，出现胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)及继发性血胰岛素升高。众所周知，人体内脂肪组织是胰岛素作用的重要的靶器官之一，因此脂肪组织的某些病理、生理变化也将会影响PCOS IR的发生、发展。
(2)卵巢癌(Ovarian Cancer,OAC)
雌性生殖癌症中，有的与内分泌相关。如，乳腺癌(Breast Cancer)、子宫内膜癌(Endometrial Cancer)和卵巢癌(Ovarian Cancer,OAC)等。其中，卵巢癌是发生于卵巢的一种恶性肿瘤，90％～95％为卵巢原发性的癌，另外5％～10％为其它部位原发的癌转移到卵巢。虽然我国的卵巢癌发病率不如欧美国家高，但根除性的手术治疗，以及细胞毒性的化疗，均缺乏有效降低卵巢癌的死亡率的效用。由于卵巢癌早期缺少症状，即使有症状也不特异，筛查的作用又有限，因此早期诊断比较困难，就诊时60％～70％已为晚期，而晚期病例又疗效不佳。因此，虽然卵巢癌的发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，居妇科恶性肿瘤的第三位，但死亡率却超过宫颈癌及子宫内膜癌之和，高居妇科癌症首位，是严重威胁妇女健康的最大疾患。
在以往的临床研究中认为，卵巢癌在早期是没有明显的症状表现。但也一些研究表明，卵巢癌在早期是会表现出一些临床的症状，例如异常的腹胀、饱胀，腹部疼痛或背部疼痛，精神不振等，但这些症状往往被患者所忽视，当诊断时往往已发生转移，因而卵巢癌往往被形容为“无声的杀手”，进而也导致了卵巢癌的预后不良。
大量研究已表明，卵巢癌常通过直接蔓延及盆、腹腔播散种植到远处的器官。卵巢癌转移的主要途径是腹腔内种植性转移，据临床观察,转移的主要部位为大网膜，在患有卵巢癌的妇女中80％伴有网膜转移。此时，大网膜上的癌细胞以远快于原发病灶处的速度增长。大网膜是连接胃大弯至横结肠的腹膜，内含有吞噬细胞，有重要的防御功能，同时也是含有大量脂滴的脂肪组织，是体内一个重要的内分泌器官，并参与体内环境稳态。尽管卵巢癌向大网膜转移的事实很明显，但是其机理一直尚不明晰。 因大网膜部位以脂肪组织为主，脂肪组织是体内最大的内分泌器官，可以分泌脂肪因子，细胞因子等，脂肪组织内的脂肪细胞与卵巢癌细胞之间的关系及其机制，仍需要更多的证据阐明。
随着对肿瘤研究的不断深入，越来越多的证据表明，肥胖会增加癌症患者致死的风险。比如，白色脂肪组织分泌的瘦素(Leptin)能够促进乳腺癌的发展：一方面，瘦素能够通过激活JAK/STAT3、MAPK-ERK1/2或者PI3K通路，从而促进乳腺癌的生长；另外，瘦素还能通过诱导血管生成素的表达促进肿瘤相关血管的生成，并且瘦素还能诱导人表皮生长因子受体2(ErbB-2)的转录，并且参与三阴性乳腺癌细胞中胰岛素样生长受体1(IGF-1)的反应，激活表皮生长因子受体(EGFR)从而促进细胞的侵袭与转移。目前的研究还表明，瘦素还能在前列腺癌、甲状腺癌等多种癌症过程中有着促进作用，其表达水平和肿瘤发生呈正相关，但胰腺癌中的瘦素水平则比较低，并且两者间的关系并不是很清楚。也有研究发现脂联素对肿瘤的发生发展具有抑制作用。
有报道称，肥胖也能增加女性患上卵巢癌的风险。脂肪组织会影响肥胖妇女的卵巢癌的病情，研究人员对216名妇女进行研究，其中35名是肥胖妇女，108名是正常体重的妇女，发现在卵巢癌患者中，与正常体重的妇女相比，肥胖妇女的存活率较低，存活时间较短。科学家发现除了他们之间的癌症致死率和癌症复发率有区别外，他们的肿瘤细胞也表现不同，提示脂肪组织分泌的激素或者蛋白可能引起卵巢癌细胞增殖迅速。还有研究表明，腹腔中大网膜的脂肪细胞分泌的IL-6和IL-8能够促进卵巢癌细胞向其转移。
关于脂肪组织，尤其是大网膜脂肪，与卵巢癌的关系，2011年10月30日的《自然—医学》(Nature Medicine)杂志上Ernst Lengyel教授发表的一篇文章提供了详实的证据。chemerin是新近发现的一种脂肪细胞因子，又称趋化素，在免疫应答、炎症反应、脂肪细胞分化成熟、脂质代谢等方面发挥作用，与肥胖和代谢综合征相关。chemerin基因也称为他扎罗汀诱导基因2(Tazarotene Induced Gene2,TIG2)，1997年被首次克隆发现，随后，2003年，Wittamer等在卵巢癌继发的腹水中通过反相高压液相层析分离得到其活性蛋白。
2012年，Reverchon等的研究证实chemerin及其受体CMKLR1(类趋化因子受体-1)在主要的人卵巢颗粒细胞(hGCs)和人卵巢颗粒样肿瘤细胞(KGN)中有表达， 再次提到chemerin与卵巢肿瘤的关系。
2011年10月，Ernst Lengyel博士发表在nature medicine的研究发现卵巢癌在向大网膜转移过程中，FABP4起到了至关重要的作用，且大网膜的趋化因子参与了卵巢癌迁移至大网膜脂肪的过程，并检测到了大网膜脂肪细胞中的趋化因子脂联素和细胞因子IL-6、IL-8等。但文章中并没有记载检测到同样是趋化因子的chemerin。
现有文献和技术报道，还没有找到好的针对多囊卵巢综合征及卵巢癌这两种疾病的特异性靶点。
发明内容
本发明的主要目的在于寻找雌性生殖疾病的新靶点，以更好地预防和/或治疗雌性生殖疾病，缓解多囊卵巢综合征、抑制卵巢癌增殖。
本发明确定了chemerin/CMKLR1系统是调节多囊卵巢综合征和抑制卵巢癌的新型靶点。
CMKLR1(chemokine like receptor-1，类趋化因子受体-1)，是趋化因子/脂肪因子chemerin的受体之一，属于G蛋白偶联受体家族。
发明人在研究中发现，利用基因敲除技术或shRNA方式干扰CMKLR1的基因表达，或者，利用特异性拮抗剂干扰CMKLR1受体的作用，可以有效地缓解实验性小鼠多囊卵巢综合征的症状，也能有效抑制人卵巢癌细胞体外体内的增殖。
在本发明的一具体实验中，本发明利用特异性干扰CMKLR1基因表达的shRNA序列，建立了具有荧光素(Luciferase)和Tomoto荧光标记的、利用shRNA干扰敲弱CMKLR1基因的人上皮型卵巢癌SKOV3永久细胞系(Tomato-shCMKLR1 SKOV3)，体外细胞群落增殖实验显示，与对照组相比，敲弱CMKLR1基因的SKOV3细胞的增殖显著受到抑制。进一步，皮下注射Tomato-shCMKLR1SKOV3细胞，建立裸鼠荷瘤模型，每周检测体重和肿瘤生长情况，与对照组相比，Tomato-shCMKLR1 SKOV3细胞在动物体内生长显著缓慢。此外，利用CMKLR1特异性小分子拮抗剂拮抗CMKLR1的作用，在裸鼠荷瘤模型中，腹腔注射CMKLR1特异性小分子拮抗剂，与对照组相比，可以显著抑制肿瘤的生长。
在本发明的另一具体实验中，通过干扰CMKLR1的基因表达，或拮抗CMKLR1的作用，可以有效缓解由双氢睾酮(DHT)或脱氢表雄酮(DHEA)引起的实验性小 鼠多囊卵巢综合征的症状。
从而，一方面，本发明提供了针对CMKLR1的拮抗剂在制备用于预防和/或治疗雌性生殖疾病的药物中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗雌性生殖疾病的药物组合物，该药物组合物包含针对CMKLR1的拮抗剂。
另一方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗雌性生殖疾病的方法，该方法包括：以CMKLR1为靶点，降低CMKLR1的表达水平和/或拮抗CMKLR1的作用，以预防和/或治疗雌性生殖疾病。具体地，可以是利用针对CMKLR1的拮抗剂降低CMKLR1的表达水平(敲除CMKLR1基因或敲弱CMKLR1基因的表达水平)和/或拮抗CMKLR1的作用。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述针对CMKLR1的拮抗剂为任何可降低CMKLR1的表达水平和/或拮抗CMKLR1的作用的试剂。具有这样功能的试剂例如可包括siRNA、shRNA、反义RNA、抗体或其组合。这样的试剂对于本领域技术人员而言可根据现有技术获得，可以是现有技术中已知的任何可降低CMKLR1的表达水平和/或拮抗CMKLR1的作用的拮抗剂本身，也可是基于该分子式进行修饰、改构后仍具有降低CMKLR1的表达水平和/或拮抗CMKLR1作用的功能的试剂。在本发明的一优选具体实施方案，所述针对CMKLR1的拮抗剂为小分子拮抗剂，例如shRNA或是α-NETA等。更优选地，所述shRNA具有如SEQ ID No.1所示序列。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述预防和/或治疗雌性生殖疾病包括：缓解多囊卵巢综合征症状，和/或抑制卵巢癌细胞增殖。
根据本发明的具体实施方案，本发明的预防和/或治疗雌性生殖疾病的药物组合物中，除所述针对CMKLR1的拮抗剂外，还可根据需要包括医药上可接受的载体或赋形剂。
综合而言，本发明佐证了CMKLR1是预防和治疗多囊卵巢综合征和卵巢癌的新靶点，利用任何技术干扰CMKLR1基因表达或干预CMKLR1的作用，可以有效的缓解多囊卵巢综合征的症状，抑制卵巢癌的增殖。
附图说明
图1：敲弱CMKLR1基因，可抑制卵巢癌细胞系SKOV3中转移相关基因的表达。
图2：敲弱CMKLR1基因，可抑制卵巢癌细胞系SKOV3的迁移和增殖。
图3：敲弱CMKLR1基因，可抑制人卵巢癌细胞在裸鼠皮下的增殖。
图4：CMKLR1特异性拮抗剂，可抑制人卵巢癌细胞在裸鼠皮下的增殖。
图5A和图5B：CMKLR1基因的缺失对双氢睾酮引起的发情周期改变的影响。其中，WT,wild type：野生型小鼠。Cmklr1-/-：CMKLR1基因缺失小鼠。Control(Ctl):对照安慰剂组。DHT，双氢睾酮：埋植了双氢睾酮的实验组。P:proestrous：发情前期。D：diestrous：发情间期。E：estrous：发情期。M:metestrous：发情后期。days:天数。Estrous Cycles:发情周期。
图6：CMKLR1基因的缺失，对双氢睾酮引起的小鼠血清中激素水平的影响。
图7：CMKLR1基因的缺失，对双氢睾酮引起的小鼠卵巢结构的影响。
图8A和图8B：CMKLR1基因的缺失，对双氢睾酮引起的小鼠卵泡细胞凋亡的影响。
图9：CMKLR1基因的缺失，对双氢睾酮引起的卵巢组织中激素合成相关酶基因表达的影响。
图10：CMKLR1特异性拮抗剂，α-NETA，对双氢睾酮引起的小鼠卵巢结构、激素合成酶等基因表达的影响。
图11：CMKLR1特异性拮抗剂，α-NETA，对DHEA引起的小鼠卵巢结构的影响。
图12A和图12B：CMKLR1特异性拮抗剂，α-NETA，对DHEA引起的小鼠卵泡细胞凋亡的影响。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1：干扰CMKLR1的基因表达，或拮抗CMKLR1的作用，可有效抑制抑制人卵巢癌细胞的增殖。
本实施例验证了干扰CMKLR1的基因表达，或拮抗CMKLR1的作用，可有效抑制抑制人卵巢癌细胞的增殖。其中，设计特异性干扰CMKLR1基因表达的shRNA序 列，建立了具有荧光素(Luciferase)和Tomoto荧光标记的、利用shRNA干扰敲弱CMKLR1基因的人上皮型卵巢癌SKOV3永久细胞系(Tomato-shCMKLR1 SKOV3)。
体外细胞群落增殖实验显示，与对照组相比，敲弱CMKLR1基因的SKOV3细胞的增殖显著受到抑制。皮下注射Tomato-shCMKLR1 SKOV3细胞，建立裸鼠荷瘤模型，每周检测体重和肿瘤生长情况，与对照组相比，Tomato-shCMKLR1 SKOV3细胞在动物体内生长显著缓慢。利用CMKLR1特异性小分子拮抗剂拮抗CMKLR1的作用，在裸鼠荷瘤模型中，腹腔注射CMKLR1特异性小分子拮抗剂，与对照组相比，可以显著抑制肿瘤的生长。
具体如下：
1、建立具有荧光素(Luciferase，Fluc)和Tomato荧光标记的人卵巢癌细胞系：SKOV3-Luc-Tomato/LRH和SKOV3.ipl-Luc-Tomato/LRH。
本实验中，选用人卵巢癌细胞SKOV3、SKOV3.ipl(购于武汉博士德公司)制备含有Tomato/Luciferase基因的慢病毒载体(载体按照文献Ren P.-G.(任培根),Lee S-W,Biswal S,Goodman SB.Systemic trafficking of macrophages induced by bone cement particles in nude mice.Biomaterials,2008.29:4760-4765自行制备)。具体操作如下：
①选取生长旺盛的人卵巢癌细胞SK-OV3、SK-OV3.ipl，在转染前一天以5×105个/孔，接种于6孔板中，培养至第二日后，细胞融合度为60％；
②第二日用含有Tomato/Luciferase基因的慢病毒进行细胞感染6小时；
③6小时后，将待转染的细胞用PBS轻轻漂洗一次，向孔中加入2mL完全培养基，置于二氧化碳培养箱中培养；
④48小时后选用含有1μg/mL G418的培养基进行筛选；待细胞不再出现死亡后即得到稳定表达Tomato/Luciferase基因的卵巢癌细胞系：SKOV3-Luc-Tomato/LRH和SKOV3.ipl-Luc-Tomato/LRH，即可用于肿瘤细胞体外体内实验。
2、建立敲弱了CMKLR1基因的可发光的人卵巢癌细胞系：SKOV3-Luc-Tomato-shCMKLR1/LRH和SKOV3.ipl-Luc-Tomato-shCMKLR1/LRH。
本实验中所用人CMKLR1基因shRNA为pSM2c-Hu-shCMKLR1(购自Open Biosystems)，Hairpin序列：5’-TGCTGTTGACAGTGAGCGAGGTGATGAATACCCTG ATTATTAGTGAAGCCACAGATGTAATAATCAGGGTATTCATCACCGTGCCTACTGCCTCGGA-3’(SEQ ID No.1)。对照组为pSM2c-Hu-scramble shRNA。
①选取生长旺盛的可发光的人卵巢癌细胞：SKOV3-Luc-Tomato/LRH和SKOV3.ipl-Luc-Tomato/LRH，在转染前一天以5×105个/孔，接种于6孔板中，培养至第二日后，细胞融合度为60％；
②第二日进行转染，以6孔板的一个培养孔为单位，用200μL的opti-MEM培养基稀释3μg质粒，另以200μL的opti-MEM培养基稀释6μL脂质体Lipofectamine 2000，分别轻轻混匀后，室温放置5分钟；
③将两管稀释液轻轻混合，室温静置20分钟后，向混合后的稀释液中轻轻加入600μL的opti-MEM培养基；
④将待转染的细胞用PBS轻轻漂洗一次，然后将混合好的稀释液轻轻加入培养孔中，置于二氧化碳培养箱中培养；
⑤培养4～6小时后弃尽转染所用培养基，向孔中加入3mL完全培养基；
⑥48小时后选用含有1μg/mL嘌呤霉素(puromycin)的培养基进行筛选；待细胞不再出现死亡后即得到稳定表达CMKLR1 shRNA的可发光的卵巢癌细胞系。然后利用流式细胞仪进行筛选，分选出高表达红色荧光的细胞，
⑦用TRIzol提取总RNA，定量2μg RNA进行逆转录(逆转录试剂盒，购于Promega公司)，并用特异引物序列进行qPCR。
所用特异引物序列为Hu-CMKLR1引物序列：
Fw 5’-GAGGCGTGACATAGAATGGA-3’(SEQ ID No.2)
Rv 5’-TGATATGGATTGGGAGGAAGAC-3’(SEQ ID No.3)
⑧与转染了pSM2c-Hu-scramble shRNA的做比较，CMKLR1基因表达水平仅为其40％±2.87％，作为敲弱了CMKLR1基因的可发光的人卵巢癌细胞系，并命名为：SKOV3-Luc-Tomato-shCMKLR1/LRH；和SKOV3.ipl-Luc-Tomato-shCMKLR1/LRH；即可用于肿瘤细胞体外和体内实验。
3、敲弱了CMKLR1基因的可发光的人卵巢癌细胞系的体外增殖、迁移和侵袭实验。
(1)MTT增殖实验：
①将转入shRNA及空载质粒的卵巢癌细胞，分别以2000个/孔接种于96孔细 胞培养板中，每孔培养基体积为200μL，同时将不同的培养板放置于二氧化碳培养箱中，分别培养12小时、24小时、48小时、72小时；
②在不同的检测时间点将MTT溶液(5mg/mL)，加入培养板中，每孔20μL，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小时；
③弃培养板中的上清，加入150μL DMSO(二甲基亚砜)，震荡10分钟，在酶标仪上选择490nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。
(2)Soft Agar软琼脂克隆形成实验：
①配制1.2％和0.7％的琼脂糖，高压灭菌后置于55℃水浴中，使其保持融化状态；
②配含20％FBS、2×抗生素的2×RPMI 1640培养基，37℃预热；
③灌下层胶：1.2％的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合，加入到6孔板中，每孔3ml，室温放置待其凝固；
④等待下层胶凝固过程中消化SKOV3-Luc-Tomato-shCMKLR1/LRH，或SKOV3.ipl-Luc-Tomato-shCMKLR1/LRH，或pSM2c-Hu-scramble shRNA稳转细胞，计数，用无血清培养基调整浓度为5×104/ml，每孔用100μl细胞，设3个平行孔；
⑤下层胶凝固后灌上层胶：0.7％的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合(温度约40℃左右)，加入100μl细胞悬液，即5000个细胞，混匀，加入孔板中，每孔3ml；
⑥37℃5％CO2培养，约2～3周后荧光观察克隆大小，计数并比较两组克隆形成情况。
(3)Transwell侵袭实验：
采用Transwell小室以及预包被Metrigel的Transwell小室检测干扰CMKLR1基因表达对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响。具体操作如下：
①将转入shRNA及空载质粒的卵巢癌细胞饥饿培养24小时后，消化离心弃去上清，用无血清的培养基进行重悬并计数，将细胞密度调整为5×105个/mL；
②在Transwell小室(Pore size 8.0μm，购于Corning公司)和BD BioCoat小室(Metrigel Invasion Chember，Pore size 8.0μm，购于BD公司)的下室中加入600μL含有10％FBS的培养基，在上室中加入200μL制备好的细胞悬液后将小室放入二氧化碳培养箱中培养6小时；
③用PBS轻轻漂洗Transwell小室，并用棉签擦去上室中的细胞，用甲醇固定30分钟后充分晾干小室，用含有1μg/mL的DAPI溶液避光染色2分钟，并用蒸馏水轻轻漂洗后即可在荧光显微镜下进行观察，随机选取5个视野进行拍照，对细胞核进行计数并统计迁移细胞的数量。
图1显示敲弱CMKLR1基因，可抑制卵巢癌细胞系SKOV3中转移相关基因的表达。
在卵巢癌细胞系SKOV3中用慢病毒转染干扰CMKLR1基因的RNA(shCMKLRA)技术，敲弱细胞中内源性CMKLR1基因的表达(约敲弱50％CMKLR1基因的表达)，然后检测敲弱了CMKLR1基因后，对SKOV3中肿瘤转移基因粘蛋白家族-16(MUC16)和基质金属蛋白酶-2(MMP2)的表达水平的影响，结果显示MUC16和MMP2两个基因表达水平显著降低。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图2显示敲弱CMKLR1基因，可抑制卵巢癌细胞系SKOV3的迁移和增殖。
检测敲弱CMKLR1后对卵巢癌细胞系SKOV3迁移(migration)和侵袭(invasion)的影响。SKOV3.shCMKLR1为转染了shCMKLR1干扰RNA的细胞系；SKOV3.pSM2c为只转染了空白载体的SKOV3细胞系。
迁移实验中(图2中的图片A)，作为对照细胞系，SKOV3.pSM2c，当chemerin处理不同浓度(从0nM到0.5nM)后，随chemerin浓度升高迁移的细胞的数量也逐渐增多，chemerin处理浓度在0.02nM时，迁移细胞的数量达到最多，chemerin为0.5nM时，迁移的细胞数量开始降低。
当敲弱CMKLR1的表达后，给予不同浓度chemerin处理后，SKOV3细胞几乎没有迁移。
在侵袭实验中(图2中的图片B)，chemerin处理使对照组SKOV3细胞系(SKOV3.pSM2c)侵袭的数量增加，但是CMKLR1敲弱后，侵袭的细胞数量显著减少。
同时研究组建立了SKOV3-pSM2c和SKOV3-shCMKLR1细胞系的Tomato荧光标记的细胞系。软琼脂克隆实验可检测癌细胞的增殖(图2中的图片C)，结果显示，敲弱了CMKLR1基因的SKOV3-shCMKLR1细胞系，形成克隆的个数和大小，均明显低于未敲弱CMKLR1基因的对照组细胞系(SKOV3-pSM2c)。
4、敲弱了CMKLR1基因的可发光的人卵巢癌细胞系的体内增殖、迁移和侵袭 实验。
本实验中，进行裸鼠皮下荷瘤实验，以验证敲弱了CMKLR1基因的可发光的人卵巢癌细胞系的体内增殖、迁移和侵袭的影响。具体操作如下：
①随机选择6～8周龄的裸鼠，将可发光的敲弱了CMKLR1基因的人卵巢癌细胞制成细胞悬液，将1×10-7个/毫升浓度的细胞悬液0.2毫升(约含细胞数为2×10-6个)的量注射到细胞悬液接种裸鼠背部皮肤内，同时接种了同样细胞数量的pSM2c-Hu-scramble shRNA稳转细胞作为对照组；
②利用活体动物成像仪动态追踪观察两组肿瘤细胞模型的生长情况及体内肿瘤的转移情况。
图3显示敲弱CMKLR1基因，可抑制人卵巢癌细胞在裸鼠皮下的增殖。
将SKOV3细胞注射到裸鼠皮下，建立SKOV卵巢癌细胞体内荷瘤肿瘤模型，检测敲弱了CMKLR1基因的细胞系在小鼠体内形成肿瘤的情况。Tomato-SKOV3.shCMKLR1为转染了shCMKLR1干扰RNA的发光细胞系；Tomato-SKOV3.sramble为只转染了非特异性干扰RNA(sramble RNA)的SKOV3发光细胞系，作为对照。
将SKOV3 ipl-sramble RNA-Tomato细胞和SKOV3 ipl-shCMKLR1-Tomato细胞分别注射到小鼠的皮下，在第7天(D7)，第14天(D14)，第28天(D28)和第35天(D35)检测Fluc生物发光的强度，推断移植皮下肿瘤生长的程度。发光信号越强，发光信号面积越大，表示形成的肿瘤越大。随着时间延长，SKOV3 ipl-sramble RNA-Tomato细胞在小鼠体内增长明显，而shCMKLR1细胞几乎没有显著增长。
图4显示CMKLR1特异性拮抗剂，可抑制人卵巢癌细胞在裸鼠皮下的增殖。
将Tomato标记的SKOV3-Fluc-Tomato细胞系注射到小鼠的皮下，同时小鼠腹腔注射不同剂量药物a-NETA(a-NETA为CMKLR1特异性小分子拮抗剂，可按照以下文献自行制备：Graham KL,Zhang JV(张键),Lewén S,Burke TM,Dang T,Zoudilova M,Sobel RA,Butcher EC,Zabel BA.A Novel CMKLR1Small Molecule Antagonist Suppresses CNS Autoimmune Inflammatory Disease.PLOS ONE，2014 Dec 1；9(12):e112925.doi:10.1371/journal.pone.0112925.eCollection 2014)，每天每公斤体重注射0.1mg(a-NETA 0.1mg/kg/d)，每天每公斤体重注射1mg(a-NETA 1mg/kg/d)。在细胞注射后第7天(D7),第14天(D14),第28天(D28)和第35天(D35) 时检测Fluc生物发光的强度，推断移植皮下肿瘤生长的程度。发光信号越强，发光信号面积越大，表示形成的肿瘤越大。
在D7，三个处理组(对照，NETA-0.1mg/kg/d和1mg/kg/d)荧光强度无明显变化，在D14，D28和D35，对照组肿瘤组织明显增长，荧光强度逐渐增强。而在α-NETA处理组，相比对照组，α-NETA处理使得SKOV细胞肿瘤增长减慢，特别是在D28和D35，荧光强度明显减弱。
实施例2、干扰CMKLR1的基因表达，或拮抗CMKLR1的作用，可以有效缓解由DHT或DHEA引起的实验性小鼠多囊卵巢综合征的症状。
本实施例中，验证了干扰CMKLR1的基因表达，或拮抗CMKLR1的作用，可以有效缓解由DHT或DHEA引起的实验性小鼠多囊卵巢综合征的症状。其中，建立了高雄激素DHT或DHEA引起的实验性小鼠多囊卵巢综合征模型。但是，与野生型小鼠相比，CMKLR1基因敲除小鼠多囊卵巢综合征的症状明显得到缓解，包括：维持着一定的生理周期，血清中由一定水平的孕酮，卵巢上仍有黄体产生，减少DHT引起的卵巢基质和卵泡膜性细胞的调亡。DHT或DHEA引起的实验性小鼠多囊卵巢综合征模型，腹腔给予CMKLR1特异性小分子拮抗剂α-NETA，可以缓解多囊卵巢综合征的症状，包括：血清中维持有一定水平的孕酮，卵巢上仍有黄体产生。
具体如下：
(1)DHT实验性小鼠多囊卵巢综合征模型
C57BL/6J背景的CMKLR1基因敲除小鼠购自Deltagen有限公司，由斯坦福大学ZABLE博士实验室提供。C57BL/6J野生型雌性小鼠来自广东省医学实验动物中心。
将动物养在恒定温度和湿度下，12小时的光-暗循环饲养室内。饲料和水可用自由采食。所有动物的程序，按照动物福利伦理委批准的程序进行。
野生型小鼠：雌鼠在出生后的第19天(D19)，随机分为：安慰剂组，DHT组，CMKLR1拮抗剂组，DHT+CMKLR1拮抗剂组，每组至少10只小鼠)。
CMKLR1基因缺失小鼠：雌鼠在出生后的第19天(D19)，随机分为：安慰剂组，DHT组，每组至少10只小鼠。
DHT组：皮下植入DHT持续释放颗粒(美国，萨拉索塔，佛罗里达州的创新研究所)。这些粒料包含的DHT的7.5毫克，连续90天，每日释放剂量为83.3微克)。
安慰剂组：小鼠皮下植入安慰剂颗粒90天。
CMKLR1拮抗剂组：皮下植入1mg CMKLR1拮抗剂α-NETA缓释泵。
DHT+CMKLR1拮抗剂组：皮下植入DHT持续释放颗粒，粒料包含的DHT的7.5毫克，连续90天，每日释放剂量为83.3微克。皮下植入1mg CMKLR1拮抗剂α-NETA缓释泵。
在开始和治疗结束时称量体重，在治疗期90天结束时的处死小鼠。此外，在90-D治疗期结束时，收集血样和组织。将小鼠用异氟烷麻醉，眶后穿刺收集血样。分离卵巢和子宫，性腺脂肪，称重，并在4％多聚甲醛液流体过夜固定。此外，离体组织快速冷冻在液氮中，直至进一步处理。
图5A和图5B显示了CMKLR1基因的缺失对双氢睾酮引起的发情周期改变的影响。
如图5A所示，使用安慰剂的野生型小鼠(WT-control)，12天内一般会有2-3个发情周期(每个周期从发情前期(P)，发情期(E)，发情后期(M)，到发情间期(D))；而经过双氢睾酮(DHT)处理90天的野生型小鼠(WT-DHT)，其生理周期都处于发情间期(D)，没有完整的发情周期。双氢睾酮严重影响了小鼠的正常生理周期。
图5B中，a是野生型小鼠对照组和处理组两组之间量化的比较，统计学具有显著意义(aP<0.01)。
使用了安慰剂的CMKLR1基因缺失小鼠(cmklr1-/-control)，12天内也会有2-3个发情周期。当使用双氢睾酮诱发CMKLR1基因缺失小鼠后(cmklr1-/-DHT)，仍然有较完整的生理周期(P，E，M，D)，有1到2个完整的生理周期。图1B中，b是CMKLR1基因缺失两组之间量化的比较，统计学具有显著意义(bP<0.05)；d是双氢睾酮处理的野生型小鼠和CMKLR1基因缺失小鼠两组之间的比较，CMKLR1基因缺失明显改善了双氢睾酮对小鼠生理周期的影响，统计学具有显著意义(dP<0.001)。
WT,wild type：野生型小鼠。Cmklr1-/-：CMKLR1基因缺失小鼠。Control(Ctl):对照安慰剂组。DHT，双氢睾酮：埋植了双氢睾酮的实验组。P:proestrous：发情前期。D：diestrous：发情间期。E：estrous：发情期。M:metestrous：发情后期。days:天数。Estrous Cycles:发情周期。
图6显示了CMKLR1基因的缺失，对双氢睾酮引起的小鼠血清中激素水平的影 响。
对比四组小鼠处理组(WT-Control，WT-DHT，CMKLR1-/--Control,CMKLR1-/--DHT)血清中双清睾酮(DHT)的含量，其中WT-Control和CMKLR1-/--Control组中DHT含量都在100pg/mL左右，而在WT-DHT和CMKLR1-/--DHT处理组，血清中DHT的含量分别上升到200pg/mL左右，证明了双氢睾酮处理组造模成功。
然后分别对血清中雌激素(estradiol)和孕酮(progesterone)的水平进行了检测：雌激素在WT-Control和CMKLR1-/--Control组维持在5pg/mL左右，而DHT处理降低了WT小鼠中雌激素的水平；在CMKLR1-/-小鼠中，DHT的处理并未显著性的影响血清中雌激素的含量。同时，DHT的处理也降低了WT小鼠血清中孕酮的含量，而对于CMKLR1-/-小鼠，DHT并未影响血清中孕酮正常水平的表达。图6中，a是野生型小鼠对照组和DHT处理组两组之间量化的比较；b是CMKLR1基因缺失对照组和DHT处理组两组之间量化的比较；d是DHT双氢睾酮处理的野生型小鼠和CMKLR1基因缺失小鼠两组之间的比较。P<0.05代表统计学差异上有显著意义。
图7显示了CMKLR1基因的缺失，对双氢睾酮引起的小鼠卵巢结构的影响。
对比四组小鼠处理组(Wild type-placebo，wild type-DHT，CMKLR1-/--placebo,CMKLR1-/--DHT)的卵巢的形态，WT-Control和CMKLR1-/--Control小鼠的卵巢有各个发育时期的卵泡及黄体。DHT处理的WT小鼠(WT-DHT)的大部分卵泡已经萎缩，卵巢中没有黄体。而DHT处理的CMKLR1-/-(CMKLR1-/--DHT)小鼠中卵泡的发育比较正常，也能观察到完整的黄体。
图8A和图8B显示了CMKLR1基因的缺失，对双氢睾酮引起的小鼠卵泡细胞凋亡的影响。
对比四组小鼠处理组(WT-Control，WT-DHT，CMKLR1-/--Control,CMKLR1-/--DHT)卵巢中的凋亡信号(Tunnel染色—绿色)，蓝色信号为染核的DAPI信号。野生小鼠(WT)和CMKLR1基因缺失小鼠(CMKLR1-/-)对照组卵巢中的卵泡颗粒细胞(granulosa cell)，卵泡膜细胞(theca cell)，及卵泡间质细胞(interstitial cell)中都未发现明显凋亡着色(绿色)，而在野生小鼠(WT)和CMKLR1基因缺失小鼠(CMKLR1-/-)的双氢睾酮(DHT)处理组的卵巢中，卵泡颗粒细胞(granulosa cell)，卵泡膜细胞(theca cell)，及卵泡间质细胞(interstitial cell)中有明显的着色(如图 8A中所示)。其中，图8B中计算了四组小鼠处理组分别在卵泡颗粒细胞(granulosa cell)，卵泡膜细胞(theca cell)，及卵泡间质细胞(interstitial cell)中凋亡细胞的数量，统计分析显示，DHT处理增加了三种组织中凋亡细胞的数量，其中在颗粒细胞(granulosa)中，DHT处理显著增加在CMKLR1-/-小鼠中的凋亡细胞。DHT处理使得野生小鼠的膜细胞(theca)和间质细胞(interstitial cell)凋亡信号增加中，相应的，DHT处理导致CMKLR1基因缺失小鼠(CMKLR1-/-)膜细胞和间质细胞凋亡信号明显比野生型小鼠的弱。图中，a是野生型小鼠对照组和DHT处理组两组之间量化的比较；b是CMKLR1基因缺失对照组和DHT处理组两组之间量化的比较；d是DHT双氢睾酮处理的野生型小鼠和CMKLR1基因缺失小鼠两组之间的比较。P<0.05代表统计学差异上有显著意义。
图9显示了CMKLR1基因的缺失，对双氢睾酮引起的卵巢组织中激素合成相关酶基因表达的影响。
在四组小鼠处理组(WT-Control，WT-DHT，CMKLR1-/--Control,CMKLR1-/--DHT)中，检测了卵巢中的类固醇激素合成快速调节蛋白(steroidogenic acute regulatoryprotein,StAR),胆固醇侧链裂解酶(cholesterol-side-chain cleavage enzyme,P450scc),3β-羟类固醇脱氢酶(3bHSD),骨形态发生蛋白2(BMP2)和骨形态发生蛋白4(BMP4)mRNA水平的的表达。
StAR,P450scc,3bHSD的表达在野生小鼠(WT)和CMKLR1基因缺失小鼠(CMKLR1-/-)对照处理组卵巢中未有明显的差别。当双氢睾酮(DHT)处理后，三个基因的表达在WT小鼠中显著性降低，而在CMKLR1-/-组中，三个基因相比WT组表达量显著性增高。
BMP2和BMP4是BMP信号通路中的信号分子。BMP2在CMKLR1-/-小鼠卵巢中的表达较野生小鼠卵巢中的表达显著升高。而DHT处理多BMP2的表达没有明显的影响。
而BMP4在WT和CMKLR1-/-对照组小鼠卵巢中表达无差别，DHT处理增高了BMP4在野生小鼠卵巢中的表达，但是在CMKLR1-/-组无显著性增加。
图9中，a是野生型小鼠对照组和DHT处理组两组之间量化的比较；b是CMKLR1基因缺失对照组和DHT处理组两组之间量化的比较；d是DHT双氢睾酮处理的野生型小鼠和CMKLR1基因缺失小鼠两组之间的比较。P<0.05代表统计学差异上有显著 意义。
图10显示了CMKLR1特异性拮抗剂，α-NETA，对双氢睾酮引起的小鼠卵巢结构、激素合成酶等基因表达的影响。
观察四组野生小鼠(control，NETA，DHT，DHT+NETA)卵巢的形态。Control(溶剂对照组)，α-NETA(α-NETA单独处理组)，DHT(双氢睾酮单独处理组)，DHT+NETA(α-NETA和双氢睾酮协同处理组)。
溶剂对照组和NETA处理组卵巢中黄体(corpus luteum,CL)的数量未有明显的差别；DHT处理以后，小鼠卵巢中未观察到黄体，而用NETA和DHT共同处理小鼠的卵巢中仍有黄体的出现。
分别检测这四组小鼠血清中DHT，雌激素(Estradiol)和孕酮(progesterone)的含量，其中DHT单独处理及DHT与NETA协同处理均增加小鼠血清中DHT的含量(证明DHT造模成功)，DHT单独处理降低了血清孕酮的含量，NETA与DHT协同处理，不影响血清中DHT的含量，但是升高了DHT处理引起的血清中孕酮水平。血清中雌激素的含量并没有收到影响。
检测卵巢中激素关键合成酶3β-羟类固醇脱氢酶(3bHSD)mRNA水平的表达，结果显示，DHT处理降低了3b-HSD mRNA水平，而NETA的单独处理不影响3b-HSD mRNA水平，但是NETA和DHT共同处理后，升高了3b-HSD mRNA水平。
胱天蛋白酶-3(Caspase-3)水平增加，可显示卵巢中凋亡信号增高。DHT单独处理可显著性增加卵巢凋亡相关性酶Caspase3的表达，而与NETA协同处理后，NETA能够降低DHT对Caspase3表达的刺激作用。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
(2)DHEA实验性小鼠多囊卵巢综合征模型
野生型小鼠：雌鼠在出生后的第19天(D19)，随机分为：对照组，DHEA组，CMKLR1拮抗剂组，DHEA+CMKLR1拮抗剂组，每组至少10只小鼠)。
CMKLR1基因缺失小鼠：雌鼠在出生后的第19天(D19)，随机分为：对照组，DHEA组，每组至少10只小鼠)。
对照组：按照6mg/100g皮下注射芝麻油，按照1mg/kg腹腔注射生理盐水。
DHEA组：按照6mg/100g皮下注射DHEA，按照1mg/kg腹腔注射注射生理盐水。
CMKLR1拮抗剂组：按照6mg/100g皮下注射芝麻油，按照1mg/kg腹腔注射 CMKLR1拮抗剂α-NETA。
DHEA+CMKLR1拮抗剂组：按照6mg/100g皮下注射DHEA，按照1mg/kg腹腔注射CMKLR1拮抗剂α-NETA。
在开始和治疗结束时称量体重，在治疗期21天结束时的处死小鼠。此外，在21天治疗期结束时，收集血样和组织。将小鼠用异氟烷麻醉，眶后穿刺收集血样。分离卵巢和子宫，性腺脂肪，称重，并在4％多聚甲醛液流体过夜固定。此外，离体组织快速冷冻在液氮中，直至进一步处理。
图11显示了CMKLR1特异性拮抗剂α-NETA，对DHEA引起的小鼠卵巢结构的影响。
四组小鼠处理组(cnotrol，α-NETA，DHEA，DHEA+α-NETA)中卵巢中卵泡形态对比。Control(溶剂对照组)，α-NETA(α-NETA单独处理组)，DHEA(脱氢表雄酮单独处理组)，DHEA+NETA(α-NETA和脱氢表雄酮协同处理组)。在control和NETA处理组，可以观察到形态完整的二级卵泡，说明溶剂对照组和NETA的处理多卵泡的发育没有明显的影响。DHEA的处理使得卵泡的发育发生了明显的改变，在卵巢中未发现发育成熟的二级卵泡和排卵前卵泡。而在DHEA+NETA处理组中，二级卵泡的发育明显改善，有发育成熟的卵泡，说明了NETA对卵泡的发育的保护作用。
图12A和图12B显示了CMKLR1特异性拮抗剂α-NETA，对DHEA引起的小鼠卵泡细胞凋亡的影响。
四组野生小鼠(WT)处理组(cnotrol，NETA，DHEA，DHEA+NETA)中卵巢中凋亡信号的比较。凋亡信号(Tunnel染色—绿色)，蓝色信号为染核的DAPI信号。Control(溶剂对照组)，α-NETA(α-NETA单独处理组)，DHEA(脱氢表雄酮单独处理组)，DHEA+NETA(α-NETA和脱氢表雄酮协同处理组)。
图12A，在野生小鼠脱氢表雄酮处理组(WT-DHEA)中，卵泡的颗粒细胞(granulosa cell,GC)，膜细胞(Theca cell，TC)及间质细胞(interstitial cell,IC)中有较多的凋亡细胞；而与NETA协同处理后(WT-NETA-DHEA)，膜细胞(TC)中凋亡细胞明显减少，间质细胞(IC)中的凋亡细胞也显著减少。图12B分别对比计算了WT小鼠在Ctrl、NETA、DHEA、DHEA+NETA处理组中在GC、TC和IC中凋亡细胞的数量。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

Claims (15)

  1. 针对CMKLR1的拮抗剂在制备用于预防和/或治疗雌性生殖疾病的药物中的应用。
  2. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述针对CMKLR1的拮抗剂为降低CMKLR1的表达水平和/或拮抗CMKLR1的作用的试剂，例如可包括siRNA、shRNA、反义RNA、抗体或其组合。
  3. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述针对CMKLR1的拮抗剂为shRNA、和/或α-NETA。
  4. 根据权利要求3所述的应用，其中，所述shRNA具有如SEQ ID No.1所示序列。
  5. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述雌性生殖疾病包括多囊卵巢综合征和/或卵巢癌。
  6. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述预防和/或治疗雌性生殖疾病包括：缓解多囊卵巢综合征症状，和/或抑制卵巢癌细胞增殖。
  7. 一种预防和/或治疗雌性生殖疾病的药物组合物，该药物组合物包含针对CMKLR1的拮抗剂。
  8. 根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述针对CMKLR1的拮抗剂为降低CMKLR1的表达水平和/或拮抗CMKLR1的作用的试剂，例如siRNA、shRNA、反义RNA、抗体或其组合。
  9. 根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述针对CMKLR1的拮抗剂为shRNA和/或α-NETA。
  10. 根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述shRNA具有如SEQ ID No.1所示序列。
  11. 一种预防和/或治疗雌性生殖疾病的方法，该方法包括：以CMKLR1为靶点，降低CMKLR1的表达水平和/或拮抗CMKLR1的作用，以预防和/或治疗雌性生殖疾病。
  12. 根据权利要求11所述的方法，其中，是利用针对CMKLR1的拮抗剂降低CMKLR1的表达水平和/或拮抗CMKLR1的作用，所述针对CMKLR1的拮抗剂包括 siRNA、shRNA、反义RNA、抗体或其组合。
  13. 根据权利要求11所述的方法，其中，所述针对CMKLR1的拮抗剂为shRNA和/或α-NETA，该方法是利用shRNA敲弱CMKLR1的表达水平，或是利用α-NETA拮抗CMKLR1的作用。
  14. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述shRNA具有如SEQ ID No.1所示序列。
  15. 根据权利要求11所述的方法，该方法是用于缓解多囊卵巢综合征症状，和/或抑制卵巢癌细胞增殖。
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