KR101834019B1 - 저산소 조건 하에 배양된 세포로부터의 조정 배지 및 세포외 기질 조성물 - Google Patents

Abstract

배아 단백질을 포함하는 조성물의 제조 방법을 개시한다. 이 방법은 저산소 조건 하에 시험관내에서 생체적합성 지지체 상에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 이 배양 방법에 의해 가용성 분획과 불용성 분획이 둘 다 생성되며, 이들은 다양한 용도에 유용한 생리학적으로 허용되는 조성물을 얻기 위해 개별적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다.

Description

저산소 조건 하에 배양된 세포로부터의 조정 배지 및 세포외 기질 조성물{CONDITIONED MEDIUM AND EXTRACELLULAR MATRIX COMPOSITIONS FROM CELLS CULTURED UNDER HYPOXIC CONDITIONS}

본 발명은 일반적으로 세포외 기질 조성물 또는 조정 배지(conditioned medium)의 제조 및 용도에 관한 것이고, 더 구체적으로는 적합한 증식 배지 중에서 저산소 조건 하에 세포를 배양함으로써 얻은 조성물 및/또는 단백질에 관한 것이다.

세포외 기질(ECM: extracellular matrix)은 생체내의 포유동물 조직에서 발견되는, 세포를 지지해 주는 세포 주변의 복잡한 구조체이다. ECM은 흔히 결합 조직이라 불린다. ECM은 주로 콜라겐 및 엘라스틴 등의 구조 단백질, 피브릴린, 피브로넥틴, 라미닌 및 프로테오글리칸 등의 분화 단백질을 비롯한 주요한 3가지 부류의 생체분자로 이루어진다.

시험관내에서의 ECM 조성물의 증식 및 다양한 치료 분야 및 의료 분야에 있어서의 그 용도는 당업계에 알려져 있다. 이러한 ECM 조성물의 치료 분야 중 하나로서 주름 및 흉터와 같은 연조직 및 피부 결손의 치료 및 수복을 들 수 있다.

여드름, 수술 반흔 또는 노화와 같은 결손에 의해 발생된 연조직 결손의 수복 또는 증강은 매우 어려운 것으로 판명되었다. 다양한 성공률로 다양한 재료가 연조직 결손을 교정하기 위해 사용되었지만, 완벽하게 안전하고 효과적인 재료는 없었다. 예를 들어, 실리콘은 결절, 재발성 연조직염 및 피부 궤양 등의 장기간의 부작용을 비롯한 다양한 생리학적 문제와 임상적 문제를 일으킨다.

콜라겐 조성물 역시 연조직 증강을 위한 주사 가능한 재료로서 사용되고 있다. 콜라겐은 결합 조직의 주요 단백질이고, 포유동물에 가장 풍부하게 존재하는 단백질로서, 총 단백질 함량의 약 25%를 차지한다. 현재는 28가지 유형의 콜라겐이 문헌에 개시되었다(예를 들어, 상세한 목록에 대해서는 하기 표 1 및 2를 참조). 그러나, 체내 콜라겐 중 90% 이상은 콜라겐 I, II, III 및 IV이다.

재구성된 주사용 소 콜라겐, 가교결합된 콜라겐, 또는 다른 이종성(xenogeneic) 콜라겐과 같은 다양한 콜라겐 재료가 연조직 결손의 치료에 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 콜라겐의 경우 몇 가지 문제점이 있다. 공통된 문제는, 피험체에서의 알레르기 반응을 방지하기 위해 면역원성을 나타낼 가능성이 있는 물질이 제거되도록 임플란트 재료를 제조하는 데 비용이 많이 들고 제조 공정이 복잡하다는 것이다. 게다가, 이러한 콜라겐을 사용한 치료가 장기 지속성이 있다는 것도 입증되지 않았다.

수성 겔 중의 생체적합성 세라믹 입자(미국 특허 제5,204,382호), 열가소성 및/또는 열경화성 물질(미국 특허 제5,278,202호) 및 락트산계 중합체 블렌드(미국 특허 제4,235,312호)와 같은 연조직 수복 또는 증강에 사용될 수 있는 다른 재료도 개시된 바 있다. 추가로, 천연 분비형 ECM 조성물을 사용하는 것도 개시된 바 있다(미국 특허 제6,284,284호). 그러나, 이러한 재료들은 모두 한계가 있는 것으로 드러났다.

따라서, 종래 재료의 부족함을 극복할 수 있는 연조직 수복 및 증강을 위한 새로운 재료가 요구되고 있다.

안전하고, 주사 가능하며, 장기간 지속성이 있고, 생체흡수성이 있는 연조직 수복 및 증강용 재료가 요구되고 있다.

시험관내에서 배양된 ECM 조성물은 또한 손상된 심근 및 관련 조직 등의 손상된 조직을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이 조성물은 임플란트로서, 또는 심장 및 관련 조직 등의 장기에서의 맥관형성(vasculogenesis)을 촉진하기 위한 혈관 보철 또는 스텐트와 같은 이식형 디바이스 상의 생물학적 코팅으로서, 또한, 패치 등과 같은 탈장 교정술, 골반저 재건, 상처 회복 및 회전근개 수복에 유용한 디바이스로서 유용하다.

관상동맥 질환(CAD: coronary artery disease)으로도 불리는 관상동맥 심장 질환(CHD: coronary heart disease), 허혈성 심장 질환 및 죽상경화성 심장 질환은 심장에 혈액과 산소를 공급하는 작은 혈관의 협착을 특징으로 한다. 관상동맥 심장 질환은 일반적으로 죽상경화증으로 불리는 병태에 의해 유발되는데, 죽상동맥경화증은 지방 물질 및 플라크가 동맥벽에 축적되어 동맥을 협착시킬 때 일어난다. 관상동맥이 협착됨에 따라, 심장으로 전달되는 혈류는 감속되거나 중단되고, 이로써 가슴 통증(안정 협심증), 호흡 곤란, 심장 마비 및 기타 다른 증상이 발생할 수 있다.

관상동맥 심장 질환(CHD)은 미국에서의 남성 및 여성의 주된 사망 원인이다. 미국 심장 학회(American heart Association)에 따르면, 1500만명 이상의 사람들이 몇 가지 유형의 이 병을 앓고 있다고 한다. 관상동맥 심장 질환의 증상과 징후는 이 질환이 진행된 상태에서는 분명하게 나타나지만, 대부분의 관상동맥 심장 질환 환자들은 병이 진행되는 수십년 동안 어떠한 증거도 보이지 않다가 갑작스러운 심장 마비를 겪게 된다. 이 병이 돌연사의 가장 일반적 원인이며, 또한 20세 이상의 남성과 여성의 가장 일반적인 사망 원인이다. 미국 내에서의 현 추세에 따르면, 장래에는 건강한 40대 남성의 1/2과 건강한 40대 여성의 1/3에게서 CHD가 발병하게 될 것이다.

이환된 심장 또는 기타 다른 손상된 심장에서 혈류를 개선시키기 위한 현행 방법은 관상동맥 우회술, 혈관성형술 및 동맥내막절제술 등의 칩습성 수술 기법을 포함한다. 이러한 수술은 본래 수술 중과 수술 후 고유 위험도가 매우 높고, 대개는 심장 허혈의 임시 치료책에 불과하다. 따라서, 현재 이용할 수 있는, CHD 관련 증상의 치료 기법에 대한 성공률을 높이기 위해서는 새로운 치료 옵션이 필요하다.

시험관내에서 배양된 ECM 조성물은 또한 연골 또는 골연골 세포 등의 손상된 세포 또는 조직의 수복 및/또는 재생에 이용될 수 있다. 골연골 조직은 골 또는 연골과 관련되어 있거나 이를 포함하는 임의의 조직이다. 본 발명의 조성물은, 골연골 결손, 예를 들어 퇴행성 결합 조직 질환, 예컨대 류마티스양 질환 및/또는 골관절염뿐만 아니라, 외상에 의한 연골 결손을 갖는 환자의 결손을 치료하는 데 유용하다.

골연골 결손을 수복하고자 하는 현행의 시도는 관절 연골 병변이 회복될 수 있는 가능성을 향상시키고자 하는 시도로 생체적합성 및 생체분해성 하이드로겔 이식편 중의 인간 연골 세포를 이식하는 것을 포함한다. 추가로, 알기네이트 비드, 또는 폴리설페이트화 알기네이트를 포함하는 매트릭스 중에서 연골 세포를 배양하는 기법이 하이알린 유사 연골성 조직을 생성한다고 개시되었다. 그러나, 인간 자가 연골 세포를 이식함으로써 관절 연골의 내연골성 병변을 수복하고자 하는 시도는 제한된 성공만을 거두었다. 따라서, 골연골 결손을 치료하기 위한 현재 이용 가능한 기법의 성공률을 증가시키기 위해서는 새로운 치료 옵션이 필요하다.

시험관내에서 배양된 ECM 조성물은 또한 조직 공학적으로 처리된 조직 임플란트의 생성을 위한 조직 배양 시스템에서 유용하다. 조직 공학 분야는 새로운 생물학적 조직을 생성하거나 손상된 조직을 수복하기 위해 세포 배양 기술을 이용하는 것을 포함한다. 부분적으로는 줄기 세포 기술의 발전에 의해 가속화된 조직 공학 기술은 외상 후 조직 재생 및 치환 또는 퇴행성 질환의 치료에 대한 전망을 밝게 한다. 이는 또한 미용 수술과 관련해서도 이용될 수 있다.

조직 공학 기술은 다양한 세포 유형과 배양 기법을 이용하여 자가 조직 또는 세포 및 이종성 조직 또는 세포 둘 다를 생성하는 데에도 이용될 수 있다. 자가 임플란트를 제작할 때에는, 도너 조직을 수거하여 개별 세포로 분리한 후, 기능성 조직의 원하는 부위에 이식하고자 하는 기재 상에 부착시킨 후 배양한다. 다수의 단리된 세포 유형을 세포 배양 기법을 이용하여 시험관내에서 증식시킬 수 있지만, 부착 의존성 세포(anchorage dependent cell)는 대개 증식을 위한 주형으로서 작용을 할 수 있는 3차원 스캐폴드의 존재를 비롯한 특정 환경을 필요로 한다.

현행 조직 공학 기술은 일반적으로 인공 임플란트를 제공한다. 세포 이식 요법의 성공 여부는 시험관내 조직 배양과 생체내 조직 배양 양자를 위한 적합한 기재의 개발 여부에 달려 있다. 따라서, 천연 재료만을 포함하고 이식에 적합한 ECM을 개발하는 것은 내인성 조직의 더 많은 특징들을 갖게 될 것이다. 따라서, 천연 ECM 재료의 개발이 조직 공학 분야에 있어서의 계속되는 현재의 도전 과제이다.

본 발명은, 부분적으로는, 조기 배아 환경을 모의하는 조건(예를 들어, 저산소 조건 및 감소된 중력) 하에 (예를 들어, 2차원 또는 3차원으로) 배양된 세포가 태아의 특성을 갖는 ECM 조성물을 생산한다는 독창적인 발견에 기초하여 이루어진 것이다. 저산소 조건 하에 세포를 배양함으로써 제조한 1종 이상의 배아 단백질을 함유하는 ECM 조성물은 다양한 유익한 용도를 갖는다.

일 실시형태에서, 본 발명은 1종 이상의 배아 단백질을 함유하는 ECM 조성물의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은, 저산소 조건 하에 적합한 증식 배지 중에서 세포를 배양하여(예를 들어, 2차원 또는 3차원 증식), 가용성 분획 및 불용성 분획을 제조하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 이 조성물은 가용성 또는 불용성 분획을 따로따로 포함할 뿐만 아니라, 가용성 분획과 불용성 분획의 조합을 포함한다. 다양한 양태에서, 제조된 조성물은 라미닌, 콜라겐 및 Wnt 인자의 유전자 발현 및 생산이 상향 조절된 것을 포함한다. 다른 양태에서, 제조된 조성물은 라미닌, 콜라겐 및 Wnt 인자의 유전자 발현 및 생산이 하향 조절된 것을 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 종 특이적이고, 단일 동물 종으로부터 유래된 세포 및/또는 생물학적 물질을 포함한다. 시험관내에서 배양된 ECM 조성물은 인간의 치료에 유용함과 동시에, 이 조성물은 기타 다른 종의 동물에도 적용될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 수의학적 용도에도 매우 적합하다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 Wnt 단백질 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor)의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은, 저산소 조건 하에 적합한 증식 배지 중에서 세포를 배양함으로써(예를 들어, 2차원 또는 3차원 증식), Wnt 단백질 및 VEGF를 제조하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 증식 배지는 무혈청 배지이고, 저산소 조건은 산소 농도 1∼5%의 조건이다. 관련된 양태에서, Wnt 종은 산소 농도 약 15∼20%의 산소 조건에서 제조된 배지와 비교하여 상향 조절되어 있다. 예시적인 양태에서, Wnt 종은 wnt 7a 및 wnt 11이다. 다른 실시형태에서, 조정 배지는 본원에 기재된 다양한 단백질들을 함유하는 조성물로서 단리된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 수복 또는 재생시키고자 하는 세포를 본원에 기재된 ECM 조성물과 접촉시킴으로써 세포를 수복 및/또는 재생시키는 방법을 포함한다. 일 양태에서, 세포는 골연골 세포이다. 따라서, 본 방법은 골연골 결함을 수복하는 것을 고려한다.

또 다른 실시형태에서, ECM 조성물은 임플란트, 또는 이식형 디바이스 상의 생물학적 코팅으로서 유용하다. 다양한 양태에서, 본 발명의 조성물은 임플란트 중에 포함되거나, 심장 및 관련 조직 등의 장기에서의 맥관형성을 촉진하기 위한 혈관 보철 및 스텐트와 같은 이식형 디바이스 상의 생물학적 코팅으로서 사용된다. 관련된 양태에서, 이 조성물은 탈장 교정술, 골반저 재건, 상처 회복, 회전근개 수복 등에 유용한 조직 재생용 패치 또는 임플란트에 포함된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 피험체의 주름 부위에 본원에 기재된 ECM 조성물 또는 조정 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체의 피부 표면을 개선하는 방법을 포함한다. 추가의 다른 실시형태에서, 본 발명은 피험체의 주름 부위에 본원에 기재된 ECM 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체의 연조직을 수복 또는 강화시키는 방법을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 조직 배양 시스템을 포함한다. 다양한 양태에서, 상기 배양 시스템은, 2차원 또는 3차원 지지체 재료에 포함되는 것과 같이, 본원에 기재된 ECM 조성물 또는 배양 배지로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 ECM 조성물은 다양한 세포 유형의 증식을 위한 지지체 또는 2차원 또는 3차원 지지체로서의 역할을 한다. 예를 들어, 상기 배양 시스템은 줄기 세포의 증식을 지지하는 데 사용될 수 있다. 일 양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 또는 뉴런 줄기 세포이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 내피세포 증식 및 맥관형성을 촉진하기 위해 피험체에 디바이스를 이식하는 것과 관련하여 사용되는 표면 코팅제를 제공하는 데 사용될 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 세포를 배양함으로써(예를 들어, 섬유아세포를 저산소 조건 하에 배양함으로써) 정상 산소 조건 하에 배양될 때보다 적어도 3배 더 높은 수준으로 줄기 세포의 특징적인 유전자를 발현하는 줄기 세포를 생성하는 것을 포함한다. 그러한 유전자로는 예를 들어 Oct4, Sox2, KLF4, NANOG 및 cMyc을 포함한다.

본 발명의 방법에 의해 생성된 줄기 세포는 바람직하게는 다능성이다. 임의의 스트로마 세포 또는 비줄기 세포가 출발 세포 유형으로서 사용될 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 손상된 조직을 치료하는 방법을 제공하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은, 손상된 조직이 치료될 수 있도록 하는 조건 하에서 손상된 조직을, 1종 이상의 배아 단백질을 함유하는 조성물로서, 저산소 조건 하에 2차원 또는 3차원 지지체 상에서 세포를 배양함으로써 생성된 것인 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 ECM 조성물을 포함하는, 세포의 전달 또는 전달 부위에서의 유지를 위한 생물학적 비이클(biological vehicle)을 포함한다. 비이클은 줄기 세포 등의 세포를 손상된 심장 근육으로 주사하거나 힘줄 및 인대 수복을 위해 주사하는 것과 같은 용도에 사용될 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 모발 성장을 자극하거나 촉진하는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포를 본원에 기재된 ECM 조성물 또는 조정 배지와 접촉시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 세포는 모낭 세포이다. 다양한 양태에서, 세포는 생체내 또는 생체외에서 접촉시킬 수 있다.

도 1은 hECM으로 코팅된 폴리프로필렌 메쉬 삽입 후 2주째의 FBGC 형성을 그래프로 나타낸 것이다. 도 1a는 비코팅 섬유(첫 번째 컬럼) 및 hECM으로 코팅된 섬유(두 번째 컬럼)에 대한, 삽입 후 2주째의 섬유 1개당 FBGC 수를 나타낸다. 도 1b는 비코팅 섬유(컬럼 1∼3) 및 ECM으로 코팅된 섬유(컬럼 4∼6)에 대한, 삽입 후 2주째의 섬유 1개당 FBGC 수를 나타낸다. * 표시는 p<0.05임을 나타낸다.
도 2는 hECM으로 코팅된 폴리프로필렌 메쉬 삽입 후 5주째의 FBGC 형성을 그래프로 나타낸 것이다. 도 2a는 비코팅 섬유(첫 번째 컬럼) 및 hECM으로 코팅된 섬유(두 번째 컬럼)에 대한, 삽입 후 5주째의 섬유 1개당 FBGC 수를 나타낸다. 도 2b는 비코팅 섬유(컬럼 1 및 3) 및 hECM으로 코팅된 섬유(컬럼 2 및 4)에 대한, 삽입 후 5주째의 섬유 1개당 FBGC 수를 나타낸다.
도 3은 인간 모낭 세포를 그림으로 표현한 것이다. 도 3a는 hECM의 존재 하에 4주 동안 세포 배양한 후, 이어서 마우스 내로 이식하고, 추가로 4주 동안 증식시킨 인간 모낭 세포의 이미지이고, 도 3b는 대조군 모낭 세포의 이미지이다.
도 4는, MTT 분석법에 의해 확인되는, 세포외 기질 조성물(마우스 ECM 및 인간 ECM 둘 다)에 대한 섬유아세포 대사 반응을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는, 피코 그린 분석법(Pico Green Assay)에 의해 측정되는, hECM에의 인간 섬유아세포 노출에 대한 반응으로 나타나는 세포수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 레이저 치료 후 3일, 7일 및 14일째에 실시된 41명의 인간 피험체에 대한 홍반 평가를 그래프로 나타낸 것이다. 홍반의 중증도를 크기 0(없음)부터 4(중증)까지로 평가하였다. 4개의 데이터 세트(좌측부터 우측 방향으로 0.1X hECM, 1X hECM, 10X hECM, 및 대조군)로 이루어진 각각의 군은 3일째(좌측), 7일째(중간) 및 14일째(우측) 실시된 평가를 나타낸다.
도 7은 레이저 치료 후 3일, 7일 및 14일째에 실시된 41명의 인간 피험체에 대한 부종 평가를 그래프로 나타낸 것이다. 부종의 중증도를 크기 0(없음)부터 2.5(중증)까지로 평가하였다. 4개의 데이터 세트(좌측부터 우측 방향으로 0.1X hECM, 1X hECM, 10X hECM, 및 대조군)로 이루어진 각각의 군은 3일째(좌측), 7일째(중간) 및 14일째(우측) 실시된 평가를 나타낸다.
도 8은 레이저 치료 후 3일, 7일 및 14일째에 실시된 41명의 인간 피험체에 대한 가피 형성(crusting) 평가를 그래프로 나타낸 것이다. 가피 형성의 중증도를 크기 0(없음)부터 3.5(중증)까지로 평가하였다. 4개의 데이터 세트(좌측부터 우측 방향으로 0.1X hECM, 1X hECM, 10X hECM, 및 대조군)로 이루어진 각각의 군은 3일째(좌측), 7일째(중간) 및 14일째(우측) 실시된 평가를 나타낸다.
도 9는 레이저 치료 후 3일, 7일 및 14일째에 실시된 41명의 인간 피험체에 대한 경피 수분 손실(TWEL: transepidermal water loss) 값을 그래프로 나타낸 것이다. TWEL의 중증도를 크기 0(없음)부터 4(중증)까지로 평가하였다. 4개의 데이터 세트(좌측부터 우측 방향으로 0.1X hECM, 1X hECM, 10X hECM, 및 대조군)로 이루어진 각각의 군은 3일째(좌측), 7일째(중간) 및 14일째(우측) 실시된 평가를 나타낸다.
도 10은 눈가부의 실리콘 레플리카를 사용하여 실시한 3차원 형상 측정법 이미지 분석을 그래프로 나타낸 것이다. 데이터 점은 레이저 치료 이전, 치료 후 4주째, 및 치료 후 10주째 22명의 피험체로부터 획득한 것이었다. 데이터 시리즈 A는 hECM 투여에 대한 값을 나타내고; 데이터 시리즈 B는 대조군에 대한 것을 나타낸다.
도 11은 레이저 수술 후 페트롤라툼 사용에 관해 실시한 분석을 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 레이저 수술 후 0일, 3일, 5일, 7일, 10일 및 14일째 획득한 데이터 점을 사용하여 피부 홍반에 관해 실시한 분석을 그래프로 나타낸 것이다.
도 13은 레이저 수술 후 0일, 3, 5일, 7일, 10일 및 14일째 획득한 데이터 점을 사용하여 멕사미터(Mexameter) 분석을 그래프로 나타낸 것이다.
도 14는 hECM으로 코팅된 폴리프로필렌 메쉬를 이식한 지 2주 후의 FBGC 형성을 그래프로 나타낸 것이다. 도 14a는 비코팅 섬유(첫 번째 컬럼) 및 hECM 코팅 섬유(두 번째 컬럼)에 대한 이식 2주 후의 섬유당 FBGC 수를 나타낸다. 도 14b는 비코팅 섬유 및 ECM 코팅 섬유에 대한 이식 2주 후의 섬유당 FBGC 수를 나타낸다.
도 15는 hECM으로 코팅된 폴리프로필렌 메쉬를 이식한 지 5주 후의 FBGC 형성을 그래프로 나타낸 것이다. 도 15a는 비코팅 섬유(첫 번째 컬럼) 및 hECM 코팅 섬유(두 번째 컬럼)에 대한 이식 5주 후의 섬유당 FBGC 수를 나타낸다. 도 15b는 비코팅 섬유 및 ECM 코팅 섬유에 대한 이식 5주 후의 섬유당 FBGC 수를 나타낸다.
도 16은 hECM으로 코팅된 폴리프로필렌 메쉬를 이식한 지 2주 후 측정된 평균 섬유 피막 두께를 그래프로 나타낸 것이다. 도 16a는 비코팅 섬유(첫 번째 컬럼) 및 hECM 코팅 섬유(두 번째 컬럼)에 대한 이식 2주 후의 평균 섬유 피막 두께를 나타낸다. 도 17b는 비코팅 섬유 및 ECM 코팅 섬유에 대한 이식 2주 후의 평균 섬유 피막 두께를 나타낸다.
도 17은 hECM으로 코팅된 폴리프로필렌 메쉬를 이식한 지 5주 후 측정된 평균 섬유 피막 두께를 그래프로 나타낸 것이다. 도 17a는 비코팅 섬유(첫 번째 컬럼) 및 hECM 코팅 섬유(두 번째 컬럼)에 대한 이식 5주 후의 평균 섬유 피막 두께를 나타낸다. 도 16b는 비코팅 섬유 및 ECM 코팅 섬유에 대한 이식 5주 후의 평균 섬유 피막 두께를 나타낸다.
도 18은 wnt 7a를 비롯한 hECM을 투여한 후의 모발 성장 특성을 보여주는 히스토그램을 그래프로 나타낸 것이다.
도 19는 wnt 7a를 비롯한 hECM의 투여 효능을 테스트하는 연구 시작 후 12주째 2명의 테스트 피험체에 대한 모발 성장 특성을 보여주는 표를 도시한다.
도 20은 wnt 7a를 비롯한 hECM의 투여 효능을 테스트하는 연구 시작 후 22주째 2명의 테스트 피험체에 대한 모발 성장 특성을 보여주는 표를 도시한다.
도 21은, 둘 다 퍼터베이션(perturbation)을 포함하지 않는 처리된 피험체와 대조군 피험체의 종합적 결과를 비교하여 그래프로 나타낸 것이다. 도 21a는 3개월째의 결과를 도시한다. 도 21b는 5개월째의 결과를 도시한다.
도 22는, 둘 다 퍼터베이션을 포함하지 않는 hECM 처리된 피험체와 대조군 피험체의 종합적 결과를 비교하여 그래프로 나타낸 것이다. 도 22a는 3개월째의 결과를 도시한다. 도 22b는 5개월째의 결과를 도시한다.
도 23은 3개월째의 hECM 처리에 대한 경모 밀도로 측정된 피험체 반응의 분포를 그래프로 나타낸 것이다.
도 24는 3개월째의 hECM 처리에 대한 연모 밀도로 측정된 피험체 반응의 분포를 그래프로 나타낸 것이다.
도 25는 3개월째의 hECM 처리에 대한 모발 두께 밀도로 측정된 피험체 반응의 분포를 그래프로 나타낸 것이다.
도 26은 3개월째의 hECM 처리에 대한 모발 두께 평균으로 측정된 피험체 반응의 분포를 그래프로 나타낸 것이다.
도 27은 모발 성장 측정을 그래프로 나타낸 것이다.
도 28은 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 1종 이상의 배아 단백질을 포함하는 ECM 조성물 또는 조정 배지의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 조성물은, 저산소 조건 하에 적합한 증식 배지 중에서 세포를 배양함으로써(예를 들어, 2차원 또는 3차원 증식) 제조된다. 이 배양 방법에 의하면, 다양한 용도를 갖는 생리학적으로 허용되는 조성물을 얻기 위해 개별적으로 또는 조합하여 이용될 수 있는 가용성 분획과 불용성 분획 둘 다를 제조할 수 있다.

줄기 세포 및 다능성 전구세포의 분열, 분화 및 기능은 산소 가용도를 비롯한 미소환경에서의 복잡한 신호에 의해 영향을 받는다. 심각한 산소 부족(저산소 상태) 부위는, 예를 들어 빠른 세포 분열과 비정상적 혈관 형성으로 인해 종양 내에서 발생한다. 저산소 유도 인자(HIF)는 정상 조직과 암에서의 국부적 저산소 상태에 대한 전사 반응을 매개하여, 세포 물질대사를 변경하고 신생혈관형성(angiogenesis)을 자극함으로써 종양 진행을 촉진할 수 있다. 최근, HIF가 줄기 세포 자기 재생 및 다능성을 컨트롤하는 Oct4와 같은 전사 인자의 발현과 Notch와 같은 특정한 신호전달 경로를 활성화하는 것으로 밝혀졌다. 많은 암들이 소수의 형질변환된 자기 재생성의 다능성 "암 줄기 세포"로부터 발달하는 것으로 생각되기 때문에, 이러한 결과는 종양 진행에 있어서의 HIF에 대한 새로운 역할을 시사한다. 본 발명의 실시예에 제시된 데이터는 저산소 조건 하에 배양된 세포가, 예를 들어 Oct4, NANOG, Sox2, KLF4 및 cMyc과 같은, 다능성 세포와 일반적으로 관련되어 있는 유전자를 발현한다는 것을 나타낸다.

본 발명의 조성물은, 손상된 세포 또는 조직의 수복 및/또는 재생의 촉진, 조직 재생(예를 들어, 탈장 교정술, 골반저 재건, 회전근개 수복 및 상처 회복)을 촉진하기 위한 패치 및 임플란트에서의 용도, 줄기 세포 등의 세포의 배양을 위한 조직 배양 시스템에서의 용도, 이식형 디바이스(예를 들어, 심박조율기, 스텐트, 스텐트 그래프트, 혈관 보철, 심장 밸브, 션트, 약물 전달 포트 또는 카테터, 탈장 및 골반저 재건용 패치)와 관련하여 사용되는 표면 코팅제에서의 용도, 연조직 수복의 촉진, 주름과 같은 피부 표면의 강화 및/또는 개선, 외상 후 피부에의 사용(예를 들어, 레이저 수술 후), 모발 성장 촉진, 세포 전달 또는 전달 부위에서의 유지를 위한 생물학적 비이클로서 또는 생물학적 유착 방지제로서의 용도를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다양한 용도를 갖는다.

본 발명은, 부분적으로, 신생혈관형성 전 초기 배아 환경(저산소 상태 및 감소된 중력)을 모의하는 조건 하에 비드(마이크로캐리어) 또는 3차원 스캐폴드 상에서 배양된 세포가 배아 단백질의 생성을 비롯한 태아 특성을 갖는 세포외 기질 조성물을 생산한다는 발견에 기초한 것이다. 저산소 상태 하에서의 세포의 배양은 태아 특성 및 성장 인자 발현을 갖는 독특한 ECM 및 조정 배지를 만든다. 종래의 배양 조건 하에서의 ECM의 배양과는 달리, 저산소 조건 하에서 배양된 ECM에서는 5,000종 이상의 유전자가 차등적으로 발현된다. 이로 인해 상이한 특성과 상이한 생물학적 조성을 갖는 배양된 ECM이 얻어진다. 예를 들어, 저산소 조건 하에 생성된 ECM은 III형, IV형 및 V형 콜라겐과 당단백질, 예컨대 피브로넥틴, SPARC, 트롬보스폰딘 및 하이알루론산이 비교적 풍부하다는 점에서 태아 간엽 조직과 유사하다.

저산소 조건은 또한 상처 치유 및 기관형성을 조절하는 인자, 예컨대 VEGF, FGF-7 및 TGF-β뿐만 아니라, wnts 2b, 4, 7a, 10a 및 11을 비롯한 복수의 Wnt 인자의 발현을 증대시킨다. 배양된 배아 인간 ECM은 또한 효소 활성 증가로 측정되는 바와 같이 시험관내에서의 인간 섬유아세포에서의 대사 활성의 증가를 촉진한다. 또한, 배양된 배아 ECM에 반응하여 세포수 증가가 나타난다.

본 조성물 및 방법을 기술하기에 앞서, 기술되는 특정 조성물, 방법 및 실험 조건은 달라질 수 있기 때문에, 본 발명이 그러한 조성물, 방법 및 조건에 한정되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정되기 때문에, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기술하기 위한 것이지 한정을 의도한 것이 아님을 이해하여야 한다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용될 때, 단수 형태의 표현은 문맥상 명백히 다른 것을 나타내지 않는 한 복수의 개념을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"이라고 언급한 것은 본원에 기재된 유형의 하나 이상의 방법들 및/또는 단계들을 포함하는 것이며, 이는 본 명세서 등을 읽을 때 당업자에게는 자명할 것이다.

다양한 실시형태에서, 본 발명은 1종 이상의 배아 단백질을 포함하는 세포외 기질 조성물의 제조 방법 및 그 용도를 포함한다. 특히, 이 조성물은, 적합한 증식 배지 중에서 세포를 배양함으로써 생성된다. 단층으로서의 증식 또는 비드/마이크로캐리어 상에서의 증식이 본 발명에서 고려된다. 또한, 상기 조성물은 3차원 프레임워크 상에서 세포를 배양하여 다층 세포 배양 시스템을 형성하는 것에 의해 얻을 수 있다. 본 발명에 따르면, 3차원 프레임워크 지지체 상에서 배양된 세포는 다층으로 성장하여 세포 기질을 형성하게 된다. 배양 세포를 저산소 조건 하에 성장시키면, 저산소 배양 조건으로 인해 ECM 및 조정 배지 중에서의 종래의 배양과 비교하여 차등적인 유전자 발현이 나타난다.

ECM은 세포 배양에 의해 생성되는 조직을 실질적으로 포함하는 생체고분자 및 단백질의 조성물이다. 섬유아세포 등의 스트로마 세포는 세포 배양에 적합한 재료 및 표면에 부착된 상태에서 성장되어야 하는 부착 의존성 세포 유형이다. 배양 세포에 의해 생성된 ECM 재료는 3차원 배열로 퇴적되어 조직 유사 구조의 형성을 위한 공간을 제공한다.

3차원 구조를 제공하는 배양 재료를 스캐폴드라 칭한다. ECM의 퇴적을 위한 공간은, 필요에 따라, 예를 들어, 직물 메쉬 또는 마이크로캐리어로 불리는 구형 비드의 콤팩트한 구조 내에 형성된 간극 공간 내의 개구 형태로 존재한다.

본원에서 사용될 때, "세포외 기질 조성물"은 가용성 분획과 불용성 분획 양자, 또는 이의 임의의 일부분 또는 조합을 포함한다. 불용성 분획은 지지체 또는 스캐폴드 상에 퇴적되는 분비형 세포외 기질 단백질 및 생물학적 성분을 포함한다. 가용성 분획이란, 세포가 배양되고 세포가 활성 물질(들)을 분비한 증식 배지 또는 조정 배지를 의미하며, 스캐폴드 상에 퇴적되지 않는 단백질 및 생물학적 성분을 포함한다. 상기 두 분획 모두 수집하여 경우에 따라 추가로 처리하여 개별적으로 또는 조합하여 본원에 기재된 다양한 용도에 사용할 수 있다.

스트로마 세포 배양에 사용되는 3차원 지지체 또는 스캐폴드는 세포가 이것에 부착될 수 있게 하고(또는 세포가 이것에 부착될 수 있도록 변형될 수 있고); 세포가 1층보다 많은 층으로 성장할 수 있게 하는(즉, 생체내 조직 성장과 유사한 3차원 조직을 형성할 수 있게 하는) 임의의 재료 및/또는 형상의 것일 수 있다. 다른 실시형태에서, 실질적으로 2차원인 시트 또는 막을 이용하여 형태적으로 충분히 3차원인 세포를 배양할 수 있다.

생체적합성 재료는 3차원 구조 또는 스캐폴드로 형성되며, 이때 상기 구조는 세포가 3차원 조직으로 증식하도록 세포의 부착 및 성장을 위한 간극 공간을 갖는다. 일부 실시형태에서, 프레임워크의 개구 및/또는 간극 공간은 세포가 개구 또는 간극 공간을 가로질러 신장할 수 있도록 하는 적절한 크기의 것이다. 세포가 활발하게 성장하여 프레임워크를 가로질러 신장할 수 있도록 유지시켜 주는 것이 본원에 기재된 활성을 담당하는 성장 인자의 레퍼토리 생산을 강화시키는 것으로 생각된다. 개구가 너무 작을 경우, 세포는 빠르게 포화 상태에 도달할 수 있지만, 메쉬를 쉽게 빠져 나오지 못할 수 있다. 이러한 포획된 세포는 증식을 보조하고 장기간의 배양을 유지시하는 데 필요한 적절한 인자의 생산을 접촉에 의해 억제시키고 중단시킬 수 있다. 개구가 너무 클 경우, 세포는 개구를 가로지르는 신장을 할 수 없고, 이로써 증식을 보조하고 장기간의 배양을 유지하는 데 필요한 적절한 인자의 스트로마 세포 내 생산은 감소할 수 있다. 일반적으로, 간극 공간은 약 100 ㎛ 이상, 140 ㎛ 이상, 약 150 ㎛ 이상, 약 180 ㎛ 이상, 약 200 ㎛ 이상, 또는 약 220 ㎛ 이상이다. 본 발명자들은, 본원에서 예시된 바와 같은 메쉬형의 매트릭스를 사용할 경우, 약 100 ㎛∼약 220 ㎛의 개구가 만족할 정도의 효과를 가져온다는 것을 발견하였다. 그러나, 프레임워크의 3차원 구조 및 복잡성에 따라서 다른 크기의 것도 허용될 수 있다. 세포가 신장할 수 있고 장기간 동안 계속하여 복제 및 성장할 수 있도록 하는 임의의 형상 또는 구조가 본 발명의 방법에 따른 세포 인자를 정교하게 하는 기능을 할 수 있다.

일부 양태에서, 3차원 프레임워크는 브레이드, 직조, 편성되거나, 또는 메쉬 또는 패브릭과 같이 프레임워크를 형성하도록 다르게 배열된 중합체 또는 쓰레드로부터 형성된다. 이 재료는 또한 재료의 캐스팅에 의해 또는 발포체, 매트릭스, 또는 스폰지 유사 스캐폴드로의 제작에 의해 형성될 수 있다. 다른 양태에서, 3차원 프레임워크는 중합체 또는 다른 섬유를 함께 압축시켜 간극 공간을 갖는 재료를 형성함으로써 제조된 매팅 섬유 형태이다. 3차원 프레임워크는 세포 배양을 위한 임의의 형태 또는 기하학적 구조를 가질 수 있다. 따라서, 이하에 추가로 기재하는 바와 같은 다른 형태의 프레임워크도 적절한 조정 배지를 생성하는 데 충분할 수 있다.

스캐폴드 또는 프레임워크를 형성하는 데 다종 다양한 재료가 사용될 수 있다. 이러한 재료로는 비중합체 재료와 중합체 재료를 포함한다. 중합체가 사용될 경우, 이 중합체는 임의의 유형의 중합체, 예컨대, 단독중합체, 랜덤 중합체, 공중합체, 블록 중합체, 블록 공중합체(예컨대, 이량체, 삼량체 등), 선형 또는 분지형 중합체 및 가교결합 또는 비가교결합 중합체일 수 있다. 스캐폴드 또는 프레임워크로서 사용하기 위한 재료의 비한정적인 예로는 특히 유리 섬유, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드(예를 들어, 나일론), 폴리에스테르(예를 들어, 데이크론), 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 화합물(예를 들어, 폴리비닐클로라이드; PVC), 폴리카보네이트, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE; 테플론(TEFLON)), 써마녹스(TPX), 니트로셀룰로스, 다당류(예를 들어, 셀룰로스, 키토산, 아가로스), 폴리펩티드(예를 들어, 실크, 젤라틴, 콜라겐), 폴리글리콜산(PGA) 및 덱스트란을 들 수 있다.

일부 양태에서, 상기 프레임워크 또는 마이크로캐리어/비드는 사용 조건 하에서 시간이 경과함에 따라 분해되는 재료로 제조될 수 있다. 생체분해성이란 또한 생체내에 투여될 때 또는 시험관내 조건 하에서의 화합물 또는 조성물의 흡수성 또는 분해를 의미한다. 생체분해는 직접적 또는 간접적인 생물학적 제제의 작용을 통해 일어날 수 있다. 생체분해성 재료의 비한정적인 예로는 특히 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(즉, PLGA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리카프로락톤, 장선 봉합 재료, 콜라겐(예를, 말 콜라겐 발포체), 폴리락트산 또는 하이알루론산을 들 수 있다. 예를 들어, 이들 재료는 콜라겐 스폰지 또는 콜라겐 겔과 같은 3차원 프레임워크로 직조될 수 있다.

다른 양태에서, 배양물을 장기간 동안 유지하고/하거나 저온 보존하고/하거나 추가적인 구조적 일체성이 필요한 경우, 3차원 프레임워크는 비생체분해성 재료로 이루어져도 좋다. 본원에서 사용될 때, 비생체분해성 재료란 배양 배지 중의 조건 하에 현저히 분해 또는 붕괴되지 않는 재료를 말한다. 예시적인 비분해성 재료로는 비한정적인 예로서 나일론, 데이크론, 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 발포 PTFE(ePTFE) 및 셀룰로스를 들 수 있다. 예시적인 비분해성 3차원 프레임워크는 평균 공극 크기가 140 ㎛이고 나일론 섬유의 평균 직경이 90 ㎛인 나일론 여과 메쉬인 상표명 니텍스(Nitex)^®(#3-210/36, 뉴욕 소재의 Tetko, Inc.)로서 시판되는 나일론 메쉬를 포함한다.

다른 양태에서, 비드, 스캐폴드 또는 프레임워크는 생체분해성 재료와 비생체분해성 재료의 조합이다. 비생체분해성 재료는 배양 과정에서 3차원 스캐폴드에 안정성을 제공하는 반면, 생체분해성 재료는 치료 용도에 충분한 세포 인자를 생산하는 세포 네트워크를 생성하기에 충분한 간극 공간이 형성될 수 있도록 한다. 생체분해성 재료는 비생체분해성 재료 상에 코팅될 수 있거나, 메쉬로 직조, 편조 또는 성형될 수 있다. 생체해성 재료와 비생체분해성 재료의 다양한 조합이 이용될 수 있다. 예시적인 조합으로는, 극성 구조체를 얻기 위해서 얇은 생체분해성 중합체 필름인 폴리[D-L-락트-코-글리콜산)으로 코팅된 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)(PET) 직물이 있다.

다양한 양태에서, 스캐폴드 또는 프레임워크 재료는 세포 부착을 향상시키기 위해 세포 접종 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포 접종 전에 나일론 스크린을 0.1 M 아세트산으로 처리하고, 폴리리신, 소 태아 혈청 및/또는 콜라겐 중에서 인큐베이션하여 나일론을 코팅한다. 폴리스티렌은 유사하게 황산을 이용하여 처리할 수 있다. 다른 실시형태에서, 3차원 지지체 프레임워크의 존재 하에서 세포를 성장시키는 것은 세포 부착을 개선하기 위해 단백질(예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴 섬유, 망상 섬유), 당단백질, 글리코스아미노글리칸(예를 들어, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트 등), 피브로넥틴, 및/또는 당중합체(폴리[N-p-비닐벤질-D-락토아미드], PVLA)을 프레임워크에 첨가하거나 이것으로 코팅함으로써 추가로 향상시킬 수 있다. 스캐폴드 또는 프레임워크의 처리는 재료가 세포 부착에 불량한 기재일 경우에 유용하다.

일 양태에서, ECM 제조에 메쉬가 사용된다. 메쉬는 약 100 ㎛의 개구와 약 125 ㎛의 두께를 갖는 평직 형태의 직조 나일론 6 재료이다. 배양 상태에서, 섬유아세포인 세포는 하전된 단백질과의 상호작용을 통해 나일론에 부착하게 되고, ECM 단백질을 생산하고 퇴적시키면서 메쉬의 공극 내로 성장하게 된다. 지나치게 크거나 작은 메쉬 개구는 효과적이지 않을 수 있지만, ECM을 생산하고 퇴적시킬 수 있는 능력을 실질적으로 변경하지 않고 시키지 않는다면 메쉬 개구는 상기와 다를 수 있다. 또 다른 양태에서, 세포 성장과 ECM 퇴적에 적합한 기하학적 형태를 제공하는 직물 구성의 다른 직조 재료, 예컨대 폴리올레핀이 ECM 제조에 사용된다.

예를 들어, 원하는 크기로 절단하고, 0.1∼0.5 M 아세트산으로 세척한 후, 고순도 물로 세정한 뒤 스팀 멸균 처리함으로써, 본 발명의 단계 중 임의의 단계에서의 배양을 위한 나일론 메쉬를 제조한다. ECM 제조를 위한 3차원 스캐폴드로서 사용하기 위해, 메쉬를 약 10 cm×10 cm 크기의 사각형으로 만든다. 그러나, 메쉬의 크기는 목적하는 용도에 적합한 임의의 크기일 수 있고, 접종, 세포 성장 및 ECM 생산을 위한 배양 방법 및 최종 형태로의 제조를 비롯한 본 발명의 임의의 방법에 사용될 수 있다.

다른 양태에서, 배양된 조직을 생성하기 위한 스캐폴드는 비드 또는 입자인 마이크로캐리어로 이루어진다. 비드는 미시적이거나 거시적인 것일 수 있고, 조직 내로 침투되거나 특정 기하학적 형태로 압축될 수 있도록 추가로 치수 조정이 될 수 있다. 입자와 세포로 이루어진 복합체 크기는 주사 또는 카테터에 의해 조직 또는 장기 내로 투여되기에 충분한 크기이다. 비드 또는 마이크로캐리어는 일반적으로 2차원 시스템 또는 스캐폴드로 간주되며, 일반적으로 3차원(예를 들어, 단층) 증식을 가능하게 한다.

본원에서 사용될 때의 "마이크로캐리어"란 크기가 나노미터 내지 마이크로미터 크기를 갖는 입자를 말하는 것으로서, 여기서 입자는 불규칙형, 비구형, 구형, 또는 타원체인 임의의 형상 또는 기하학적 형태를 가질 수 있다.

본원의 목적에 적합한 마이크로캐리어의 크기는 특정 용도에 적합한 임의의 크기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 적합한 마이크로캐리어의 크기는 주사에 의해 투여될 수 있는 크기일 수 있다. 일부 실시형태에서, 마이크로캐리어의 입자 크기는 약 1 ㎛ 이상, 약 10 ㎛ 이상, 약 25 ㎛ 이상, 약 50 ㎛ 이상, 약 100 ㎛ 이상, 약 200 ㎛ 이상, 약 300 ㎛ 이상, 약 400 ㎛ 이상, 약 500 ㎛ 이상, 약 600 ㎛ 이상, 약 700 ㎛ 이상, 약 800 ㎛ 이상, 약 900 ㎛ 이상, 약 1000 ㎛ 이상의 범위이다.

일부 양태에서, 마이크로캐리어는 생체분해성 재료로 제조된다. 일부 양태에서, 상이한 생체분해성 중합체 층을 2층 이상 포함하는 마이크로캐리어가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 바깥쪽 제1 층은 배양물 중에서 조직을 형성하는 생체분해성 특성을 갖는 반면, 제1 층과는 상이한 특성을 갖는 생체분해성의 적어도 안쪽의 제2 층은 조직 또는 장기 내로 투여될 때 침식된다.

일부 양태에서, 마이크로캐리어는 다공성 마이크로캐리어이다. 다공성 마이크로캐리어란 분자가 이를 통과하여 마이크로입자 안팎으로 확산될 수 있는 간극을 갖는 마이크로캐리어를 의미한다. 다른 실시형태에서, 마이크로캐리어는 비다공성 마이크로캐리어이다. 비다공성 마이크로입자란 특정 크기를 갖는 분자는 마이크로입자의 안팎으로 확산되지 못하는 마이크로입자를 의미한다.

조성물에 사용하기 적합한 마이크로캐리어는 생체적합성이며 세포에 대한 독성이 적거나 없는 것이다. 적합한 마이크로캐리어는 치료하고자 하는 조직, 치료하고자 하는 손상의 유형, 원하는 치료 기간, 생체내에서의 세포 배양물의 수명 및 3차원 조직을 형성하는 데 소요되는 시간에 따라 선택될 수 있다. 마이크로캐리어는 천연 또는 합성, 하전된(즉, 음이온성 또는 양이온성) 또는 비하전된 것, 생체분해성, 또는 비생체분해성의 다양한 중합체일 수 있다. 중합체는 단독중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 그래프트 공중합체 및 분지형 중합체일 수 있다.

일부 양태에서, 마이크로캐리어는 비생체분해성 마이크로캐리어를 포함한다. 비생체분해성 미세캡슐 및 마이크로캐리어는 폴리설폰, 폴리(아크릴로니트릴-코-비닐 클로라이드), 에틸렌-비닐 아세테이트, 하이드록시에틸메타크릴레이트-메틸-메타크릴레이트 공중합체로 제조된 것을 포함하지만, 이들에 한정되지 않다. 이들은 조직 벌크화 특성을 제공하거나, 마이크로캐리어를 체내에서 제거하는 실시형태에서 유용하다.

일부 양태에서, 마이크로캐리어는 분해성 스캐폴드를 포함한다. 이는 천연 중합체로 제조된 마이크로캐리어를 포함하며, 그 비한정적인 예로는 특히 피브린, 카세인, 혈청 알부민, 콜라겐, 젤라틴, 렉시틴, 키토산, 알기네이트 또는 폴리아미노산, 예컨대 폴리리신을 들 수 있다. 다른 양태에서, 분해성 마이크로캐리어는 합성 중합체로 제조된 것이며, 그 비한정적인 예로는 특히, 폴리락티드(PLA), 폴리글리콜리드(PGA), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA), 폴리(카프로락톤), 폴리디옥사논 트리메틸렌 카보네이트, 폴리하이드록시알코네이트(예를 들어, 폴리(하이드록시부티레이트), 폴리(에틸 글루타메이트), 폴리(DTH 이미노카보닐(비스페놀 A 이미노카보네이트), 폴리(오르토 에스테르) 및 폴리시아노아크릴레이트를 들 수 있다.

일부 양태에서, 마이크로캐리어는 하이드로겔을 포함하는데, 하이드로겔은 일반적으로 물이 충전된 친수성 중합체 네트워크이다. 하이드로겔은 중합체 팽윤의 선택적 트리거라는 장점을 갖는다. 중합체 네트워크의 조성에 따라, 마이크로입자의 팽윤은 pH, 이온 강도, 열, 전기, 초음파 및 효소 활성을 비롯한 다양한 자극에 의해 유발될 수 있다. 하이드로겔 조성물에 유용한 중합체의 비한정적인 예로는 특히 폴리(락티드-코-글리콜리드); 폴리(N-이소프로필아크릴아미드); 폴리(메타크릴산-g-폴리에틸렌 글리콜); 폴리아크릴산 및 폴리(옥시프로필렌-코-옥시에틸렌) 글리콜 중합체; 및 천연 화합물, 예컨대 콘드로이탄 설페이트, 키토산, 젤라틴, 피브리노겐, 또는 합성 및 천연 중합체의 혼합물, 예를 들어, 키토산-폴리(에틸렌 옥시드)로부터 형성된 것을 들 수 있다. 중합체는 가역적으로 또는 비가역적으로 가교결합됨으로써 3차원 조직 형성에 적합화될 수 있는 겔을 형성할 수 있게 된다.

예시적인 양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 마이크로캐리어 또는 비드는 오로지 덱스트란으로만 이루어지거나 부분적으로 덱스트란으로 이루어진다.

본 발명에 따르면, 배양 방법은 스트로마 세포, 예컨대 섬유아세포, 및 특히, 1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 비롯한 다양한 유형의 세포를 증식시키는 데 적용될 수 있다. 다양한 양태에서, 스캐폴드 또는 프레임워크 상에 접종되는 세포는 이하에 추가로 기재하는 바와 같이 다른 세포 존재 또는 부재하에 섬유아세포를 포함하는 스트로마 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는, 일반적으로 (1) 뼈; (2) 소성 결합 조직(콜라겐 및 엘라스틴 포함); (3) 인대 및 힘줄을 형성하는 섬유성 결합 조직, (4) 연골; (5) 혈액의 ECM; (6) 지방 세포를 포함하는 지방 조직; 및 (7) 섬유아세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는 결합 조직으로부터 유래된 스트로마 세포이다.

스트로마 세포는, (경우에 따라) 생검에 의해 또는 부검 시 얻을 수 있는, 다양한 조직 또는 장기, 예컨대 피부, 심장, 혈관, 골수, 골격근, 간, 췌장, 뇌, 포피로부터 유래된 것일 수 있다. 일 양태에서, 태아 섬유아세포는 신생아 포피와 같은 포피로부터 다량 얻을 수 있다.

일부 양태에서, 세포는 태아, 신생아, 성체 유래의 섬유아세포 또는 그 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 스트로마 세포는 다종 다양한 세포 및/또는 조직의 성장을 보조할 수 있는 태아 섬유아세포를 포함한다. 본원에서 사용될 때, 태아 섬유아세포는 태아 공급원으로부터 유래된 섬유아세포를 의미한다. 본원에서 사용될 때, 신생아 섬유아세포란 신생아 공급원으로부터 유래된 섬유아세포를 의미한다. 적절한 조건 하에서 섬유아세포는 다른 세포, 예컨대 골 세포, 지방 세포 및 평활근 세포 및 중배엽 기원의 기타 다른 세포를 발생시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 섬유아세포는, 피부로부터 유래된 섬유아세포인 진피 섬유아세포를 포함한다. 정상 인간 진피 섬유아세포는 신생아 포피로부터 단리될 수 있다. 이들 세포는 일반적으로 1차 배양 종료시에 냉동 보존된다.

다른 양태에서, 3차원 조직은 줄기 세포 또는 전구 세포를 단독으로 또는 본원에서 언급된 임의의 세포 유형과의 조합으로 사용함으로써 제조될 수 있다. 줄기 세포 및 전구 세포의 예로는 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 뉴런 줄기 세포, 표피 줄기 세포 및 간엽 줄기 세포를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

일부 실시형태에서, "특이적인" 3차원 조직은 특정 장기, 즉, 피부, 심장으로부터 유래된 세포, 및/또는 본원에 기재된 방법에 따라 배양 증식시킨 세포 및/또는 조직을 추후에 받게 되는 특정 개체로부터 유래된 세포를 3차원 스캐폴드에 접종하는 것에 의해 제조된다.

생체내에서의 특정 용도를 위해서는, 환자 자신의 조직으로부터 스트로마 세포를 얻는 것이 바람직할 수 있다. 3차원 스트로마 지지체 프레임워크의 존재 하에서의 세포 증식은 단백질, 예를 들어 콜라겐, 라미닌, 탄성 섬유, 망상 섬유, 당단백질; 글리코스아미노글리칸, 예를 들어 헤파린 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트 등; 세포 기질, 및/또는 기타 다른 재료를 프레임워크에 첨가하거나, 이것으로 프레임워크 지지체를 코팅함으로써 추가로 향상시킬 수 있다.

따라서, 본원에 기재된 2차원 또는 3차원 배양 시스템이 다양한 세포 유형 및 조직의 증식에 적합하기 때문에, 배양하고자 하는 조직 및 원하는 콜라겐 유형에 따라, 프레임워크에 접종하기 위한 적절한 스트로마 세포를 선택할 수 있다.

본 발명의 방법 및 용도는 본원에서 언급된 상이한 세포 유형, 예컨대 조직 특이적 세포, 또는 상이한 유형의 스트로마 세포와 함께 이용하기에 적합하지만, 본 발명에 사용하기 위한 세포의 유래는 또한 종 특이적일 수 있다. 따라서, 종 특이적인 ECM 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 세포는 인간 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 인간 섬유아세포일 수 있다. 또한, 세포는 또 다른 종의 동물로부터 유래된 세포, 예컨대, 말과(말), 개과(개), 또는 고양이과(고양이) 세포이다. 추가로, 다른 종 또는 관련 계통(예를 들어, 동종이계, 동계 및 이종 발생성)에 사용하기 위한 ECM 조성물을 제조하기 위해 하나의 종 또는 종 계통으로부터 유래된 세포가 사용될 수 있다. 다중 종 ECM 조성물을 제조하기 위해 다양한 종으로부터 유래된 세포가 병용될 수 있다는 것도 이해되어야 한다.

따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 인간이 아닌 동물을 포함하는 용도에도 적합하다. 본원에서 사용될 때, "수의학"이란 동물, 특히, 가축의 의학적 또는 외과적 치료에 관한 또는 그와 관련된 의학을 의미하는 것이다. 일반적인 수의학적 동물로는 포유동물, 양서류, 조류, 파충류 및 어류를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전형적인 동물로는 개, 고양이, 말, 토끼, 영장류, 설치류 및 가축, 예컨대 소, 말, 염소, 양 및 돼지를 포함할 수 있다.

상기에 언급한 바와 같이, 추가적인 세포가 스트로마 세포를 포함하는 배양물 중에 존재할 수 있다. 이러한 추가적인 세포는 많은 유익한 효과를 가질 수 있는데, 그 중에서도 특히, 배양 상태에서의 장기간의 증식을 지지한다는 점, 성장 인자의 합성을 증대시킨다는 점 및 세포가 스캐폴드에 부착되는 것을 촉진한다는 점을 비롯한 효과를 가질 수 있다. 추가적인 세포 유형으로는 평활근 세포, 심장근 세포, 내피 세포, 골격근 세포, 내피 세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단핵구 및 지방세포를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 세포는 섬유아세포와 함께, 또는 일부 양태에서는 섬유아세포 부재 하에, 프레임워크 상에 접종될 수 있다. 이들 스트로마 세포는 비한정적인 예로서 피부, 심장, 혈관, 골수, 골격근, 간, 췌장 및 뇌를 포함하는 적절한 조직 또는 장기로부터 유래될 수 있다. 다른 양태에서, 섬유아세포를 제외한, 1종 이상의 기타 다른 세포 유형을 스캐폴드 상에 접종한다. 추가의 다른 양태에서, 스캐폴드에 섬유아세포인 세포만을 접종한다.

섬유아세포는 섬유아세포의 공급원으로서의 역할을 할 수 있는 적절한 장기 또는 조직을 분해시킴으로써 쉽게 단리될 수 있다. 예를 들어, 조직 또는 장기를 기계적으로 분해시키고/시키거나, 이웃 세포 간의 결합을 약화시키는 분해 효소 및/또는 킬레이트제로 처리함으로써, 현저한 세포 파괴 없이 조직을 개별 세포의 현탁액으로 분산시킬 수 있다. 효소에 의한 분해는, 조직을 잘게 썰고, 이 잘게 썬 조직을 다수의 분해 효소 중 어느 하나 또는 그 조합으로 처리함으로써 실시할 수 있다. 이러한 효소로는 트립신, 키모트립신, 콜라게나제, 엘라스타제, 하이알루로니다제, DNA 분해효소, 프로나제 및/또는 디스파제 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 기계적 파괴는, 그라인더, 블렌더, 체, 균질기, 압력 셀, 또는 인소네이터(insonator) 등을 이용하는 방법(여기에 한정되지 않음)을 비롯하여 다수의 방법에 의해 수행할 수 있다. 일 양태에서, 절제된 포피 조직을 일반적으로 콜라게나제 및/또는 트립시나제 같은 분해 효소를 사용하여 처리함으로써 세포를 캡슐화 구조체로부터 해리시킬 수 있다.

섬유아세포의 단리는, 예를 들어 하기와 같이 수행할 수 있다: 새로운 조직 샘플을 철저히 세척하고 행크스 평형 염 용액(HBSS: Hanks' balanced salt solution) 중에서 잘께 썰어 혈청을 제거한다. 잘게 썬 조직을 새로 제조한 트립신 등의 분해 효소의 용액 중에서 1∼12시간 동안 인큐베이션한다. 이러한 인큐베이션 후, 해리된 세포를 현탁시키고 원심분리에 의해 펠릿을 만들어 배양 접시에 플레이팅한다. 모든 섬유아세포는 다른 세포보다 먼저 부착되기 때문에, 적절한 스트로마 세포를 선택적으로 단리하여 증식시킬 수 있다. 그 후, 단리된 섬유아세포를 포화 상태까지 증식시키고, 포화된 배양물로부터 채취하여 3차원 프레임워크 상에 접종할 수 있다(문헌[Naughton et al., 1987, J. Med. 18(3&4):219-250] 참조). 3차원 프레임워크에 고농도의 스트로마 세포, 예를 들어, 약 10⁶∼5×10⁷개의 세포/ml로 스트로마 세포를 접종하게 되면 단기간 내에 3차원 기질 지지체가 확립되게 된다.

조직을 개별 세포 현탁액으로 만들고 나면, 이 현탁액을 부분집단으로 분획화할 수 있으며, 이로부터 섬유아세포 및/또는 기타 다른 스트로마 세포 및/또는 구성요소가 얻을 수 있다. 이는 또한 특정 세포 유형의 클로닝 및 선별, 원치않는 세포의 선택적 파괴(음성 선별), 혼합 집단에서의 차등적인 세포 응집성에 기초한 분리, 냉동-해동법, 혼합 집단에서의 세포의 차등적인 부착 특성, 여과, 통상적인 원심분리 및 띠원심분리, 원심 세정 분리(역류 원심분리), 단위 중력 분리, 향류 분배, 전기영동 및 형광 활성화 세포 분류를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 표준 세포 분리 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 클론 선별 및 세포 분리 기법에 관한 리뷰를 위해서는 문헌[Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 11 and 12, pp. 137-168]을 참조할 수 있다.

일 양태에서, 단리된 섬유아세포를 증식시켜 세포 은행을 구축할 수 있다. 세포 은행은, 다양한 양으로 다양한 시점에 배양 뱃치를 개시할 수 있고, 오염원 및 특이적인 세포 특징에 대해 세포를 우선적으로 테스트할 수 있도록 구축할 수 있다. 그 후, 세포 은행으로부터 얻은 섬유아세포를, 스캐폴드 시딩에 적절한 수준으로 세포수가 증가되도록 증식시킨다. 세포 및 세포 접촉 재료의 환경에의 노출을 포함하는 작업은 외래 물질 또는 바람직하지 않은 미생물의 오염 가능성을 줄이기 위해 무균 절차로 수행한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 세포를 단리한 후, 마스터 세포 은행을 구축하는 데 적합한 양이 되도록 세포를 몇 차례 계대배양할 수 있다. 그 후, 세포 은행을 회수하여 적절한 용기에 채워 넣고, 극저온 조건 하에 보존할 수 있다. 냉동 바이알에 담긴 마스터 세포 은행의 세포를 해동시켜, 추가적인 계대배양(일반적으로 2회 이상)을 통해 증식시킬 수 있다. 그 후, 이 세포를 극저온에서 보존되는 제조용 세포 은행(working cell bank)을 제조하는 데 사용할 수 있다.

세포 증식 단계는, 메쉬 또는 마이크로캐리어와 같은 스캐폴드 또는 지지체에 접종하기 위해 세포수를 추가로 늘리기 위해, 제조용 세포 은행 단계의 세포 바이알을 사용한다. 매회의 계대는, 세포를 성장 지지체에 접종하고 인큐베이션하고 세포에 영양을 공급하고 회수하는 일련의 계대배양 단계이다.

세포 은행 및 세포 증식을 위한 배양은 배양 플라스크, 롤러 보틀 또는 마이크로캐리어와 같은 배용 용기에 접종함으로써 수행할 수 있다. 섬유아세포와 같은 스트로마 세포는 의도된 세포 표면에 부착하여 증식 배지 존재 하에 증식한다. 배양 플라스크, 롤러 보틀 또는 마이크로캐리어와 같은 배양 용기는 특별히 세포 배양에 알맞게 구성되며, 통상적으로 의도된 용도에 적격인 다양한 플라스틱 재료로 제조된다. 마이크로캐리어는 일반적으로 미시적 또는 거시적인 비드이며, 일반적으로 다양한 플라스틱 재료로 제조된다. 그러나, 이것은 기타 다른 물질, 예컨대 유리 또는 고체/반고체의 생물계 물질, 예컨대 상기에 언급된 것과 같은 콜라겐 또는 기타 다른 물질, 예컨대 덱스트란, 변형 당 복합체로부터 제조될 수 있다.

배양 과정에서, 영양분의 적절한 이용성을 유지하고, 배양물의 억제성 생성물을 제거하기 위해(조정 배지가 바람직하지 않은 경우), 세포 성장 과정 동안 사용이 끝난 배지를 새로운 배지로 주기적으로 교환한다. 배양 플라스크 및 롤러 보틀은 세포가 증식할 수 있는 표면을 제공하며, 통상적으로 부착 의존성 세포의 배양에 사용된다.

일 양태에서, 인큐베이션은 37℃로 가열된 챔버에서 수행된다. 배지와 챔버 환경 사이에 소통이 필요한 배양 토폴로지는, pH 조절을 보조하기 위해, 5% CO₂ v/v를 챔버 기체 공간 중의 공기와 함께 이용한다. 대안으로, 배양 온도 및 pH를 유지하도록 장비가 갖추어진 용기를 세포 증식과 ECM 제조 공정 둘 다에 사용할 수 있다. 온도가 35℃ 미만 또는 38℃ 초과이거나, CO₂ 농도가 3% 미만 또는 12% 초과인 것은 부적절할 수 있다.

세포를 부착 표면으로부터 수거하는 것은, 증식 배지를 제거하고, 세포를 완충된 염 용액으로 세정하여 효소 경쟁 단백질을 감소시키고, 해리 효소를 가한 다음, 세포 탈착 후에 효소를 중화시킴으로써 수행할 수 있다. 수거된 세포 현탁액을 수집하고, 수거한 액을 원심분리에 의해 분리한다. 계대배양한 수거물로부터 얻은 세포 현탁액을 샘플링하여 회수된 세포량과 다른 세포 속성을 평가할 수 있으며, 그 후, 이것을 새로운 배지와 합하여 접종물로서 사용한다. 허용 가능한 ECM 특징을 얻는 것과 관련하여, 세포 은행 및 스캐폴드 접종물을 제조하는 데 사용되는 계대수가 중요하다.

적절한 3차원 스캐폴드를 제조한 후, 조제된 스트로마 세포를 시딩함으로써 접종을 한다. 침강 등의 다양한 방법으로 스캐폴드 접종을 행할 수 있다. 호기성 조건 하에서의 ECM 배양을 위해 제조된 메쉬는 저산소 상태 배양을 위한 메쉬와 동일한 방식으로 제조되는데, 단, 저산소 조건을 형성하기 위해 혐기성 챔버가 사용되지 않는 것을 예외로 한다.

예를 들어, 호기성 조건 및 저산소 조건의 양쪽 조건 하에서의 ECM 배양을 위해 제조된 양쪽 메쉬의 경우, 제조 및 멸균된 메쉬를 150 mm(직경)×15 mm(깊이)의 멸균 페트리 접시에 놓고, 약 10조각의 두께로 적층시킨다. 그 후, 메쉬 적층체를 침강에 의해 접종한다. 접종물에 대해 적절한 세포 농도가 되도록 세포를 새로운 배지에 첨가한다. 접종물을 메쉬 적층체에 첨가하며, 이때 세포는 인큐베이션 조건 하에 나일론 섬유 위로 침강하여 부착된 채로 유지된다. 적절한 시간이 경과한 후, 개별적으로 시딩된 메쉬 시트를 무균 상태에서 적층체로부터 분리하여, 약 50 ml의 증식 배지를 함유하는 별개의 150 mm×15 mm 페트리 접시에 개별적으로 첨가할 수 있다.

접종된 배양물의 인큐베이션은 저산소 조건 하에 수행하는데, 이렇게 하면 일반 배양 조건 하에 제조된 ECM과 비교하여 독특한 특성을 갖는 ECM 및 주변 배지가 생산된다는 것이 밝혀졌다. 본원에서 사용될 때, 저산소 조건은 주변 공기의 산소 농도(약 15%∼25%의 산소)와 비교하여 산소 농도가 더 낮은 것을 특징으로 한다. 일 양태에서, 저산소 조건은 산소 농도가 약 10% 미만인 것을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 저산소 조건은 산소 농도가 약 0.1%∼10%, 1%∼10%, 1%∼9%, 1%∼8%, 1%∼7%, 1%∼6%, 1%∼5%, 1%∼4%, 1%∼3%, 또는 1%∼2%인 것을 특징으로 한다. 특정 양태에서, 시스템은 배양 용기 내의 산소를 약 1∼3%로 유지한다. 저산소 조건은 주변 기체 농도를 조절할 수 있게 하는 배양 장치, 예를 들어, 혐기성 챔버를 이용함으로써 형성하고 유지할 수 있다.

세포 배양물의 인큐베이션은 일반적으로 증식 및 시딩을 위해 15∼22% 산소 및 5% CO₂를 포함하는 정상 대기 중에서 수행되며, 그 후 저산소 배양물을, 배양 배지 내에 저산소 환경이 형성되도록 95% 질소/5% CO₂로 퍼지한 기밀 챔버로 분할해 넣는다.

예를 들어, 저산소 조건 하에서의 ECM 생산을 위해 배양되는 메쉬를 갖는 페트리 접시를 처음 2∼3주 동안에는 37℃ 및 95% 대기/5% CO₂ 중에서 인큐베이션하여 증식시킨다. 대기와 유사한 조건 하의 배양 기간 후, 혐기성 배양을 위해 디자인된, 약 95% 질소 및 5% CO₂의 기체 혼합물로 퍼지된 챔버 중에서 메쉬를 갖는 페트리 접시를 인큐베이션한다. 배양 기간 동안 사용된 증식 배지를 대기 산소 수준의 새로운 배지로 교체하고, 배지를 교체한 후 메쉬가 충전된 페트리 접시를 혐기성 챔버에 놓고, 이 챔버를 95% 질소/5% CO₂로 퍼지한 뒤 37℃에서 인큐베이션한다. 배양된 메쉬가 원하는 크기에 도달하거나 원하는 생물학적 성분을 함유하게 되면 배양된 메쉬를 수거한다.

인큐베이션 기간 동안, 스트로마 세포는 3차원 프레임워크를 따라 선형으로 성장하여 이를 둘러싼 후 프레임워크의 개구로 증식하기 시작한다. 증식하는 세포는 무수히 많은 성장 인자, 조절 인자 및 단백질을 생산하게 되는데, 그 중 일부는 주변 배지로 분비되고, 나머지는 지지체 상에 퇴적되어 ECM을 구성하게 되며, 이에 대해서는 이하에서 더욱 상세히 설명한다. 성장 인자 및 조절 인자를 배양물에 첨가할 수는 있지만, 이는 필수적인 것은 아니다. 스트로마 세포를 배양하면 불용성 분획과 가용성 분획이 둘 다 생성된다. 세포를 ECM 단백질이 적당히 퇴적될 수 있도록 적절한 정도까지 증식시킨다.

3차원 조직을 배양하는 동안, 증식 세포는 프레임워크로부터 박리되어 배양 용기 벽에 부착되어 여기에서 계속 증식하여 포화 상태의 단층을 형성할 수 있다. 세포 성장에 영향을 줄 수 있는 이러한 현상을 최소화하기 위해, 3차원 세포 배양물에 영양분을 공급하는 동안 또는 3차원 세포 배양물을 새로운 배양 용기로 이전함으로써 박리된 세포를 제거할 수 있다. 포화 상태의 단층을 제거하거나 배양된 조직을 새 용기의 새로운 배지로 이전하는 것은 3차원 배양물의 증식 활성을 유지시키거나 회복시킨다. 일부 양태에서, 배양 세포 단층의 포화도가 25%를 초과하는 배양 용기에서 제거 또는 이전을 수행할 수 있다. 대안으로, 일부 실시형태에서는, 박리된 세포가 고착되지 못하도록 교반하고, 다른 한편으로는, 새로운 배지를 계내로 연속하여 주입한다. 일부 양태에서, 2종류 이상의 세포를, 동시에, 또는 하나를 먼저 배양한 다음 두번째 것을 배양하는 방식으로 함께 배양할 수 있다(예를 들어, 섬유아세포 및 평활근 세포 또는 내피 세포).

3차원 스캐폴드에 접종한 후, 세포가 3차원 조직으로 증식하는 것을 지지하는 적절한 영양 배지 및 인큐베이션 조건 하에 세포 배양물을 인큐베이션한다. 둘베코 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagles Medium), RPMI 1640, 피셔(Fisher's), 이스코브(Iscove's) 및 맥코이(McCoy's) 등의 다수의 상업적으로 입수 가능한 배지가 세포 배양물의 성장을 지지하는 데 적합할 수 있다. 배지에 추가적인 염, 탄소 공급원, 아미노산, 혈청 및 혈청 성분, 비타민, 미네랄, 환원제, 완충제, 지질, 뉴클레오시드, 항생제, 부착 인자 및 성장 인자를 보충할 수 있다. 다양한 유형의 증식 배지의 조제는 당업자가 이용할 수 있는 각종 참고 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrates for Serum Free Animal Cell Cultures, Alan R. Liss, New York (1984)]; [Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester, England (1996)]; [Culture of Animal Cell, A Manual of Basic Techniques, 4 th Ed., Wiley-Liss (2000)] 참조).

호기성 조건이든 저산소 조건이든 간에 본 발명의 임의의 배양 단계에 이용되는 증식 또는 배양 배지는 혈청을 포함해도 좋고 무혈청이어도 좋다. 일 양태에서, 배지는 4.5 g/L 글루코스, 알라닐-L-글루타민, Eq 2 mM을 포함하고 명목상 10% 소 태아 혈청이 보충된 둘베코 변형 이글 배지이다. 또 다른 양태에서, 배지는 무혈청 배지이고, 0.5% 혈청 알부민, 2 ㎍/ml 헤파린, 1 ㎍/ml 재조합 염기성 FGF, 1 ㎍/ml 대두 트립신 억제제, 1× ITS 보충제(인슐린-트랜스페린-셀레늄, Sigma 카탈로그 번호 13146), 1:1000으로 희석된 지방산 보충제(Sigma 카탈로그 번호 7050) 및 1:1,000으로 희석된 콜레스테롤이 보충되고, 글루타맥스(Glutamax)^®와 함께 4.5 g/L 글루코스 베이스의 배지를 포함하는 둘베코 변형 이글 배지이다. 추가로, 저산소 배양과 호기성 배양 둘 다에 동일한 배지가 사용될 수 있다. 일 양태에서, 시딩 및 처음 1주간의 증식 후에, 증식 배지를 혈청 베이스의 배지로부터 무혈청 배지로 교체한다.

인큐베이션 조건은 저산소 성장 조건을 유지하는 데 적절한 pH, 온도 및 기체(예를 들어, O₂, CO₂ 등) 조건이다. 일부 실시형태에서, 증식 활성을 최대화하고 분획의 원하는 활성을 촉진하는 인자를 생성하기 위해, 3차원 세포 배양물을 인큐베이션 기간 동안 배지 중에 현탁시킬 수 있다. 또한, 사용이 끝난 배지를 제거하고 박리된 세포를 줄이고 새로운 영양 공급원을 첨가하기 위해 배양물에 주기적으로 "영양 공급"을 할 수 있다. 인큐베이션 기간 동안, 배양된 세포는 3차원 스캐폴드의 필라멘트를 따라 선형으로 증식하여 이를 둘러싼 후 스캐폴드의 개구 내로 증식해 들어가기 시작한다.

약 15∼20%의 정상 대기 산소 농도 하에서의 인큐베이션과 비교하여 저산소 조건 하에 인큐베이션하는 동안, 수천 종의 유전자가 차등적으로 발현된다. 이러한 조성물 중에서 몇 종의 유전자, 그 중에서도 특히 특정 라미닌 종, 콜라겐 종 및 Wnt 인자가 상향 조절되거나 하향 조절되는 것으로 확인되었다. 다양한 양태에서, 3차원 ECM은, 일반 조건 하에서의 증식과 비교하여 저산소 조건 하에서의 증식으로 인해 세포에 의해 생산되는 일련의 세포 생성물 또는 특징적인 핑거프린트로 정의될 수 있다. 본원에 구체적으로 예시된 ECM 조성물에서, 3차원 조직 및 주변 배지는 다양한 인자의 발현 및/또는 분비를 특징으로 한다.

본원에 기재된 3차원 조직 및 조성물은 스캐폴드 또는 프레임워크 상에 존재하는 ECM을 갖는다. 일부 양태에서, ECM은 저산소 조건 하에서의 증식 및 지지체 상에서 증식한 세포 선별로 인하여 다양한 라미닌 및 콜라겐 유형을 포함한다. 적절한 콜라겐 유형을 가공하는 섬유아세포를 선별하고 특이적인 라민 및 콜라겐 종의 발현이 상향 조절 또는 하향 조절되는 저산소 조건 하에서 세포를 증식시킴으로써, 퇴적된 ECM 단백질의 비율을 조정하거나 향상시킬 수 있다.

일부 양태에서, 섬유아세포의 선별은, 특정 콜라겐 유형을 정의하는 적절한 이소타입 또는 서브클래스의 단일클론 항체를 사용함으로써 수행할 수 있다. 다른 양태에서, 자기 비드와 같은 고체 기재를 사용하여 항체가 결합되어 있는 세포를 선별하거나 제거할 수 있다. 이러한 항체의 조합물을 사용하여 원하는 콜라겐 유형을 발현하는 섬유아세포를 (양성적으로 또는 음성적으로) 선별해 낼 수 있다. 대안으로, 프레임워크에 접종하는 데 사용되는 스트로마는 원하는 콜라겐 유형을 합성하는 세포의 혼합물일 수 있다. 예시적인 콜라겐 유형의 분포 및 기원을 하기 표 1에 제시한다.

[표 1]

ECM 조성물 중에 존재할 수 있는 추가적 유형의 콜라겐을 하기 표 2에 제시한다.

[표 2a]

[표 2b]

상기에 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 ECM 조성물은 다양한 콜라겐을 포함한다. 실시예 1의 표 3에 나타낸 바와 같이, 여러 종의 콜라겐의 발현이 저산소 조건 하에 배양된 ECM 조성물 중에서 상향 조절되는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 일 양태에서, 1종 이상의 배아 단백질을 포함하는 ECM 조성물은 약 15∼20% 산소의 산소 조건에서 제조된 것과 비교하여 상향 조절된 콜라겐 종을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상향 조절된 콜라겐 종은 V형 알파 1; IX형 알파 1; IX형 알파 2; VI형 알파 2; VIII형 알파 1; IV형 알파 5; VII형 알파 1; XVIII형 알파 1; 및 XII형 알파 1이다.

본원에 기재된 ECM 조성물은, 각종 콜라겐 이외에도 각종 라미닌을 포함한다. 라미닌은 꼬인 코일 도메인을 통해 서로 연결되어 있는 알파쇄, 베타쇄 및 감마 쇄로 이루어진 당단백질 이종삼량체 패밀리이다. 현재까지, 5개의 알파 라미닌쇄, 4개의 베타 라미닌쇄 및 3개의 감마 라미닌 쇄가 서로 조합하여 15종의 상이한 동형체(isoform)를 형성하는 것으로 확인되었다. 이 구조 내에서, 다른 라미닌 및 기저판 분자, 및 막 결합형 수용체에 대해 결합 활성을 갖는 도메인을 확인할 수 있다. 도메인 VI, IVb 및 IVa는 구형 구조를 형성하고, 도메인 V, IIIb 및 IIIa(이는 시스테인이 풍부한 EGF 유사 요소를 포함한다)는 막대형 구조를 형성한다. 상기 3종의 쇄의 도메인 I 및 II가 삼중 가닥의 꼬인 코일 구조(긴 아암) 형성에 관여한다.

라미닌 쇄는 공통된 독특한 기능을 가지고 있으며, 특이적인 시간적(발생학적) 및 공간적(조직 부위 특이적) 패턴으로 발현된다. 라미닌 알파쇄는, 조직 특이적인 분포 패턴을 보이고 주요 세포 상호작용 부위를 포함하기 때문에, 이종삼량체에서 기능적으로 중요한 부분인 것으로 간주된다. 혈관 내피는, 발생 단계, 혈관 유형 및 내피의 활성화 상태에 따라 발현을 달리하는 2개의 라미닌 동형체를 발현하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 본 발명의 일 양태에서, 1종 이상의 배아 단백질을 포함하는 ECM 조성물은 산소 농도 약 15∼20%의 산소 조건에서 제조된 것과 비교하여 상향 조절 또는 하향 조절된 다양한 라미닌 종을 포함한다.

라미닌 8은 알파-4 라미닌쇄, 베타-1 라미닌쇄 및 감마-1 라미닌쇄로 이루어진다. 라미닌 알파-4 쇄는 성인에서도 발생 중에도 널리 분포되어 있다. 성인에서는 심근 섬유, 골격근 섬유 및 평활근 섬유를 둘러싸는 기저막과 폐의 폐포 중격에서 확인할 수 있다. 이는 또한 모세관 및 대혈관 양자의 내피 기저막, 및 말초 신경의 신경주위 기저막뿐만 아니라, 골수의 작은 세동맥, 대동맥 및 동모양 혈관 사이 공간에도 존재하는 것으로도 알려져 있다. 라미닌 8은 혈소판에 의해 발현되어 그에 부착되며, 3T3-L1 지방세포에서 합성되는 혈관 내피의 주요 라미닌 동형체로서, 이것의 합성 수준은 세포의 지방 전환 시에 증가하는 것으로 나타났다. 라미닌 8은 일반적으로 간엽 세포 계통에서 발현되어 결합 조직에서 미소혈관을 유도하는 라미닌 동형체인 것으로 생각된다. 라미닌 8은 또한 마우스 골수 1차 세포 배양물, 세동맥벽, 및 동모양 혈관 사이 공간(여기에서, 라미닌 8은 발생 중인 골수에서의 주요 라미닌 동형체임)에서 확인되었다. 라미닌 8은 성체 골수에서 조혈 세포에 인접해 위치하기 때문에, 알파-4 쇄를 포함하는 라미닌 동형체가 조혈 세포 발생과 생물학적으로 관련이 있는 상호작용을 가질 것으로 생각된다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, ECM은 상향 조절된 라미닌 종, 예컨대 라미닌 8을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 3차원 조직에 의해 생산된 라미닌은 적어도 라미닌 8을 포함하며, 이 라미닌 8이 조성물 중에 존재하는 라미닌 단백질의 특징 또는 표식을 정의한다.

본원에 기재된 ECM 조성물은 다양한 Wnt 인자를 포함한다. Wnt 패밀리 인자는 수많은 세포내 경로와 세포-세포 상호작용 과정에서 중요한 역할을 하는 신호전달 분자이다. Wnt 신호전달은 종양발생, 배아의 조기 중배엽 패턴 형성, 뇌 및 신장의 형태발생, 유선 증식의 조절 및 알츠하이머병에 연루되어 있다. 실시예 1의 표 4에 나타낸 바와 같이, 몇몇 Wnt 단백질 종의 발현이 저산소 상태에서 배양된 ECM 조성물 중에서 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 일 양태에서, 1종 이상의 배아 단백질을 포함하는 ECM 조성물은 산소 농도 약 15∼20%의 산소 조건에서 생산된 것과 비교하여 상향 조절된 Wnt 종을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상향 조절된 Wnt 종은 wnt 7a 및 wnt 11이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 3차원 조직에 의해 생산되는 Wnt 인자는 적어도 wnt 7a 및 wnt 11을 포함하며, 이들 Wnt 인자가 조성물 중에 존재하는 Wnt 단백질의 특징 또는 표식을 정의한다.

또한, 저산소 조건 하에서의 배양을 포함한 본원에 기재되어 있는 배양 방법은 다양한 성장 인자의 발현을 상향 조절하는 것으로 나타났다. 따라서, 본원에 기재된 ECM 조성물은 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 같은 다양한 성장 인자를 포함할 수 있다. 본원에서 사용될 때, VEGF는 공지된 모든 VEGF 패밀리 구성원을 포함하는 것으로 한다. VEGF는 성장 인자의 서브패밀리, 더욱 구체적으로는 시스틴 노트(cystine-knot) 성장 인자의 혈소판 유래 성장 패밀리의 서브패밀리이다. VEGF는 맥관형성(vasculogenesis) 및 신생혈관형성(angiogenesis) 둘 다에서 잘 알려진 중요한 역할을 한다. VEGF-A(이전에는, 기타 다른 VEGF 종이 발견되기 전에 VEGF로 알려져 있었다)를 비롯한 여러 종의 VEGF가 공지되어 있다. 기타 다른 VEGF 종으로는 태반 성장 인자(PlGF: placenta growth factor), VEGF-B, VEGF-C 및 VEGF-D를 포함한다. 추가로, 인간 VEGF의 여러 동형체도 잘 알려져 있다.

본원에 기재된 바와 같이 저산소 조건 하에서 배양함으로써 Wnt 단백질 뿐만 아니라 성장 인자의 생산도 증가함에 따라, 본 발명은 추가로 Wnt 단백질 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 본원에 기재된 바와 같은 저산소 조건 하에 적합한 증식 배지 중에서 3차원 지지체 상에서 세포를 배양함으로써 Wnt 단백질 및 VEGF를 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 예시적인 양태에서, Wnt 종은 wnt 7a 및 wnt 11이고, VEGF는 VEGF-A이다. 단백질은 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 또는 당업계에 공지된 방법에 의해, 추가로 가공되거나 수거될 수 있다.

본 명세서 전반에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 ECM 조성물은 가용성 분획과 불용성 분획을 둘 다 또는 이들의 임의의 일부분을 포함한다. 본 발명의 조성물은 상기 분획 중 어느 하나 또는 둘 다와 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 추가로, 개개의 성분들을 분획으로부터 단리하여 개별적으로 사용하거나 다른 단리물 또는 공지된 조성물과 함께 사용할 수 있다.

따라서, 다양한 양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여 제조된 ECM 조성물은 바로 사용하거나 다양한 방식으로 가공(프로세싱)할 수 있으며, 그 방법은 불용성 분획과 가용성 분획 둘 다에 적용될 수 있다. 인자를 보존 및/또는 농축하기 위해 무세포 상청액 및 배지를 포함하는 가용성 분획을 동결건조시킬 수 있다. 필요에 따라 활성 보존을 위해 다양한 생체적합성 방부제, 동결방지제 및 안정화제를 사용할 수 있다. 생체적합성 제제의 예로는 특히 글리세롤, 디메틸 설폭시드 및 트레할로스를 들 수 있다. 동결건조물은 또한 1종 이상의 부형제, 예컨대 완충제, 증량제 및 등장성 조절제를 포함할 수 있다. 이하에 추가로 기재하는 것과 같이, 냉동 건조된 배지는 적절한 용액 또는 약학적 희석제를 첨가함으로써 재구성할 수 있다.

다른 양태에서, 가용성 분획을 투석한다. 투석은 다공성 막을 통한 선택적 확산에 기초하여 샘플 성분을 분리해 내는 가장 보편적으로 이용되는 기법 중 하나이다. 용질의 90%가 막에 잔류하게 만드는 분자량을 특징으로 하는 막의 분자량 컷오프(MWCO: molecular-weight cutoff)를 공극 크기가 결정한다. 특정 양태에서, 원하는 컷오프에 따라 임의의 공극 크기를 갖는 막이 고려된다. 전형적인 컷오프는 5,000 달톤, 10,000 달톤, 30,000 달톤 및 100,000 달톤이지만, 모든 크기가 고려된다.

일부 양태에서, 활성 성분(예를 들어, 성장 인자)을 배지 중에 침전시킴으로써 가용성 분획을 프로세싱할 수 있다. 침전은 황산암모늄을 사용하는 염석, 또는 친수성 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)의 사용과 같은 다양한 방법을 이용할 수 있다.

다른 양태에서, 가용성 분획에 대해 다양한 선택적 필터를 사용하는 여과를 수행할 수 있다. 여과에 의해 가용성 분획을 프로세싱하는 것은 분획 중에 존재하는 인자를 농축시키는 데 유용하고, 또한, 가용성 분획 중에서 사용되는 소분자 및 용질을 제거하는 데에도 유용하다. 특정 분자량에 대해 선택성을 갖는 필터로는 <5,000 달톤, <10,000 달톤 및 <15,000 달톤인 것을 포함한다. 기타 다른 필터도 사용될 있고, 프로세싱된 배지로 본원에 기재된 바와 같이 치료 활성에 대해서 분석할 수 있다. 예시적인 필터 및 농축기 시스템으로는 특히 중공사막 필터, 필터 디스크 및 필터 프로브(예를 들어, Amicon Stirred Ultrafiltration Cell 참조)에 기초한 것을 포함한다.

추가의 다른 양태에서, 배지 중의 염, 불순물을 제거하거나 다양한 성분들을 분획화하기 위해 가용성 분획에 대해 크로마토그래피를 수행한다. 분자체, 이온 교환, 역상 및 친화성 크로마토그래피 기법과 같은 다양한 크로마토그래피 기법을 이용할 수 있다. 생물학적 활성을 크게 손실하지 않으면서 조정 배지를 프로세싱하기 위해서는, 마일드한 크로마토그래피 배지를 사용할 수 있다. 비한정적인 예로서 특히, 덱스트란, 아가로스, 폴리아크릴아미드에 기초한 분리용 배지(예를 들어, 세파덱스(Sephadex), 세파로스(Sepharose) 및 세파크릴(Sephacryl)과 같은 다양한 상표명으로 시판됨)를 들 수 있다.

또 다른 양태에서, 조정 배지는 리포좀으로서 조제된다. 활성 인자의 전달과 활성 인자의 수명 연장을 리포좀의 루멘 내로 성장 인자를 도입하거나 봉입할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 리포좀은 다양한 유형으로 분류될 수 있다: 다층막 소포체(MLV: multilamellar vesicle), 안정형 다층막 소포체(SPLV: stable plurilamellar vesicle), 소형 단층막 소포체(SUV: small unilamellar vesicle) 또는 대형 단층막 소포체(LUV: large unilamellar vesicle). 리포좀은, 포스파티딜 에테르 및 에스테르, 예컨대 포스포티딜세린, 포스포티딜콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 디미리스토일포스파티딜콜린; 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤; 세레브로시드; 스핑고미엘린; 글리세로지질; 및 기타 다른 지질을 비롯하여 합성 또는 천연의 다양한 지질 화합물로부터 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,833, 948호 참조).

가용성 분획은 추가적인 첨가제 없이 바로 사용될 수도 있고 약학적으로 허용되는 부형제, 비이클 또는 담체와 함께 약학 조성물로서 제조될 수도 있다. "약학 조성물"이란 가용성 분획 및/또는 불용성 분획과 1종 이상의 약학적으로 허용되는 비이클, 담체 또는 부형제로 이루어진 형태를 의미한다. 피내, 피하, 또는 근육내 투여를 위한 조성물은 수성 또는 유성 비이클 중 ECM 조성물의 멸균 현탁액, 용액 또는 에멀션으로 조제될 수 있다. 조성물은 또한 현탁화제, 안정화제 또는 분산제와 같은 제제화제를 함유할 수 있다. 주사용 제제는 방부제를 포함하거나 포함하지 않으면서, 다회 투여 용기 중의 앰플인 단위 제형으로 제공될 수 있다. 대안으로, 조성물은, 멸균 발열원 무함유 물, 식염수, 완충액, 또는 덱스트로스 용액을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 적절한 비이클을 사용하여 재구성할 수 있는 분말 형태로 제공될 수 있다.

다른 양태에서, 3차원 조직은 해동시켜 사용하는 동결보존된 제제이다. 약학적으로 허용되는 동결보존제로는 특히 글리세롤, 당류, 폴리올, 메틸셀룰로스, 및 디메틸 설폭시드를 들 수 있다. 당류 물질로는 단당류, 이당류 및 기타 다른 올리고당을 포함하며, 최대로 동결 농축된 용액의 유리 전이 온도(Tg)는 적어도 -60℃, -50℃, -40℃, -30℃, -20℃, -10℃, 또는 0℃이다. 동결보존에 사용하기 위한 당류의 예로 트레할로스가 있다.

일부 양태에서, 사용 전에 3차원 조직을 처리하여 세포를 사멸시킨다. 일부 양태에서, 투여를 위해 스캐플드 상에 퇴적된 ECM을 수집하여 프로세싱할 수 있다(본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제5,830,708호 및 제6,280,284호 참조).

다른 실시형태에서, 3차원 조직을 농축시키고 투여를 위해 약학적으로 허용되는 배지로 세척할 수 있다. 원심분리 또는 여과와 같은, 조성물을 농축시키기 위한 다양한 기법이 당업계에서 이용 가능하다. 그 예로 덱스트란 침강 및 분별 원심분리를 들 수 있다. 3차원 조직의 조제는 또한 현탁액의 이온 강도를 등장성 상태로(즉, 약 0.1∼0.2), 그리고 생리학적 pH(즉, pH 6.8∼7.5)로 조절하는 것을 포함할 수 있다. 제제는 또한 세포 현탁액의 투여 또는 안정성에 도움이 되도록 활택제 또는 기타 다른 부형제를 함유할 수 있다. 그 예로는 특히 당류(예를 들어, 말토스) 및 유기 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 및 하이알루론산을 들 수 있다.

상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 ECM 조성물은 ECM 조성물의 예상 용도 및 적절한 전달 또는 투여 방법에 따라 여러 방식으로 프로세싱될 수 있다. 예를 들어, 이 조성물은 3차원 스캐폴드 또는 임플란트로서 전달될 수도 있고, 상기에 기재된 바와 같이 주사용으로 제제화될 수도 있다. "투여" 또는 "투여하는"이라는 용어는 치료가 필요한 피험체에게 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물을 제공하는 행위를 포함하는 것으로 정의된다. 본원에서 사용될 때, "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"이라는 어구는 소화관내 투여 및 국소 투여 이외의 투여 방식으로서, 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 비한정적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피밑, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 본원에서 사용될 때, "전신 투여," "전신 투여되는," "말초 투여," 및 "말초 투여되는"이라는 어구는 화합물, 약물 또는 기타 다른 물질이 피험체의 전신에 유입됨으로써 대사 및 기타 다른 유사 과정을 거칠 수 있게 하는, 중추 신경계 내로 직접 투여하는 것 이외의 화합물, 약물 또는 기타 다른 물질 투여 방법을 의미하며, 예를 들어, 피하 투여가 있다.

본원에서 사용될 때, "피험체(또는 피험자)"라는 용어는 해당 방법의 실시 대상이 되는 임의의 개체 또는 환자를 지칭한다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이 피험체는 일반적으로 인간이지만 동물일 수도 있다. 따라서, 포유동물, 예컨대 설치류(마우스, 랫트, 햄스터 및 기니 피그), 고양이, 개, 토끼, 가축(소, 말, 염소, 양, 돼지 등 포함) 및 영장류(원숭이, 침팬지, 오랑우탄 및 고릴라 포함)을 비롯한 다른 동물도 피험체의 정의에 포함된다.

본 발명의 ECM 조성물은 손상된 세포 또는 조직의 수복 및/또는 재생 촉진, 조직 재생 촉진을 위한 패치에서의 용도, 줄기 세포 등의 세포 배양용 조직 배양 시스템에서의 용도, 이식형 디바이스(예를 들어, 심박조율기, 스텐트, 스텐트 그래프트, 혈관 보철, 심장 판막, 션트, 약물 전달 포트 또는 카테터)와 관련하여 사용되는 표면 코팅제에서의 용도, 주름과 같은 피부 표면의 연조직 수복, 강화 및/또는 개선 촉진, 생물학적 유착 방지제 또는 세포 전달 또는 전달 부위에서의 유지를 위한 생물학적 비이클로서의 용도를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다양한 용도를 갖는다.

추가로, 본원의 임의의 방법에 기재된 바와 같은 세포 배양으로부터 유래된 ECM 조성물은, 본 발명의 임의의 다른 용도 또는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조직 배양 시스템을 사용하는 세포 배양에 의해 생성된 ECM 조성물은, 예를 들어, 세포의 수복 및/또는 재생, 조직 재생 촉진을 위한 패치에서의 용도, 줄기 세포 등의 세포 배양용 조직 배양 시스템에서의 용도, 이식형 디바이스(예를 들어, 심박조율기, 스텐트, 스텐트 그래프트, 혈관 보철, 심장 판막, 션트, 약물 전달 포트 또는 카테터)와 관련하여 사용되는 표면 코팅제에서의 용도, 주름 등의 피부 표면의 연조직 수복, 강화 및/또는 개선 촉진, 생물학적 유착 방지제 또는 세포 전달 또는 전달 부위에서의 유지를 위한 생물학적 비이클로서의 용도에 사용될 수 있다.

다양한 실시형태에서, 본 발명은 세포 또는 조직을 수복 및/또는 재생시키는 방법 및 연조직 수복을 촉진하는 방법을 포함한다. 일 실시형태는 수복 또는 재생시키고자 하는 세포를 본 발명의 ECM 조성물과 접촉시켜 세포를 수복 및/또는 재생시키는 방법을 포함한다. 본 발명은 골연골 세포를 비롯한 각종 세포의 수복 및/또는 재생에 이용될 수 있다.

일 양태에서, 본 발명의 방법은 골연골 결손의 수복을 고려한다. 본원에서 사용될 때, "골연골 세포"는 연골발생 또는 골발생 계통에 속하거나 환경 신호에 따라서 연골발생 또는 골발생 계통으로 분화될 수 있는 세포를 말한다. 이러한 잠재력은 공지된 기법에 의해서 시험관내 또는 생체내에서 테스트할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명의 ECM 조성물은 연골발생 세포, 예를 들어, 연골을 생산할 수 있는 세포 또는 그 자체가 연골을 생산하는 세포로 분화되는 세포(연골 세포 및 그 자체가 연골 세포로 분화되는 세포(예를 들어, 연골 세포 전구 세포 포함)를 수복 및/또는 재생시키는 데 사용된다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 결합 조직을 수복 및/또는 재생시키는 데 유용하다. 본원에서 사용될 때, "결합 조직"이란 포유동물의 체내에 있는 많은 구조 조직 중 임의의 것을 지칭하며, 뼈, 연골, 인대, 힘줄, 반달 연골, 진피, 상피, 근육, 지방 조직, 관절낭을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 ECM 조성물은 가동 관절, 예컨대 무릎, 발목, 팔꿈치, 엉덩이, 손목, 손가락 또는 발가락 관절, 또는 턱관절의 골연골 결손을 치료하는 데 사용될 수 있다. 그러한 골연골 결손은 외상성 손상(예를 들어, 운동 상해 또는 과도한 마모) 또는 골관절염 등의 질환에 기인한 것일 수 있다. 특정 측면은 골관절염 연골의 표재성 병변의 치료 또는 예방에 있어서의 본 발명의 기질의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 노화 또는 출산으로 인한 골연골 결손의 치료 또는 예방에 있어서의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 있어서의 골연골 결손은 또한 미용 수술(예를 들어, 코, 귀)과 같은 수술(이에 한정되지 않음)과 관련하여 연골 및/또는 뼈의 수복이 필요한 상태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 이와 같은 결손은 연골 또는 골 형성이 중단되었거나 유전적 결함으로 인해 연골 또는 뼈가 손상되었거나 존재하지 않는 체내 어느 부위에서나 일어날 수 있다.

상기에서 언급한 바와 같이, 특정 세포의 성장을 유도하거나 자극하는 성장 인자 또는 기타 다른 생물학적 물질이 본 발명의 ECM 조성물에 포함될 수 있다. 성장 인자의 유형은 세포 유형 및 조성물의 의도된 용도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 골연골 세포의 경우, 추가적인 생물학적 물질, 예컨대 세포 성장 인자(예를 들어, TGF-β), 연골발생을 자극하는 물질(예를 들어, 연골 형성을 자극하는 BMP, 예컨대 BMP-2, BMP-12 및 BMP-13), 스트로마 세포가 스캐폴드로 이동하는 것을 자극하는 인자, 기질 퇴적을 자극하는 인자, 소염제(예를 들어, 비스테로이드성 소염제), 면역억제제(예를 들어, 사이클로스포린)가 포함될 수 있다. 기타 다른 성장 인자, 예컨대 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 내피 성장 인자(EGF: epidermal growth factor), 인간 내피 세포 성장 인자(ECGF: human endothelial cell growth factor), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 연골 유래 형태발생 단백질(CDMP: cartilage derived morphogenetic protein), 기타 다른 골 형성 단백질, 예컨대 OP-1, OP-2, BMP3, BMP4, BMP9, BMP11, BMP14, DPP, Vg-1, 6OA, 및 Vgr-1, 콜라겐, 탄성 섬유, 망상 섬유, 당단백질 또는 글리코스아미노글리칸, 예를 들어, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 케라틴 설페이트 등과 같은 기타 다른 단백질도 포함될 수 있다. 예를 들어, 아스코르베이트와 함께 TGF-β와 같은 성장 인자를 사용하는 것은 연골 세포 분화를 유발하고 연골 세포에 의한 연골 형성을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 하이알루론산은 연골 세포 및 다른 스트로마 세포가 부착하기 좋은 우수한 기재로서, 이것은 스캐폴드의 일부로서 도입되거나 스캐폴드 상에 코팅될 수 있다.

추가로, 특정 세포의 성장 및/또는 활성에 영향을 주는 다른 인자도 사용될 수 있다. 예를 들어, 연골 세포의 경우, 본원에서 참고로 포함하는 미국 특허 출원 제2002/0122790호에 기재된 바와 같이, 비대 상태로 연골 세포를 유지하기 위해 연골 세포에 의한 연골 생산을 자극하는 콘드로이티나제와 같은 인자를 기질에 첨가할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 방법은, 본원에서 참고로 포함하는 국제 특허 공개공보 WO 2005/054446에 기재된 바와 같이, 폴리설페이트화 알기네이트 또는 다른 폴리설페이트화 다당류, 예컨대 폴리설페이트화 사이클로덱스트린 및/또는 폴리설페이트화 인슐린, 또는 결합 조직 세포의 ECM의 생산을 자극할 수 있는 기타 다른 성분을 함유시키는 것을 포함한다.

본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생체내 또는 시험관내에서 수복 및/또는 재생시키고자 하는 세포 또는 조직을 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, ECM 조성물을 (예를 들어, 본 발명의 ECM 조직, 패치 또는 코팅된 디바이스를 통해) 피험체 내로 주사 또는 이식할 수 있다. 또 다른 양태에서, 수복 및/또는 재생시키고자 하는 조직 또는 세포를 피험체로부터 채취하여 시험관내에서 배양한 후, 공지된 수술 기법을 이용하여 피험체에 이식하거나 투여할 수 있다.

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 ECM 조성물을 다양한 방식으로 프로세싱할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 조직 배양 시스템을 포함한다. 다양한 양태에서, 상기 배양 시스템은 본원에 기재된 ECM 조성물로 이루어진다. 본 발명의 ECM 조성물은 다양한 방식으로 조직 배양 시스템 내로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 3차원 스캐폴드 재료를 함침함으로써 코팅으로서, 또는 세포 배양용 배지에 첨가되는 첨가제로서 혼입될 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 배양 시스템은 성장 인자 또는 배아 단백질 등의 본원에 기재된 ECM 조성물 중 어느 것이 함침된 3차원 지지체 재료를 포함할 수 있다.

본원에 기재된 ECM 조성물은 다양한 세포 유형의 증식을 위한 지지체 또는 3차원 지지체로서의 역할을 할 수 있다. 세포 배양이 가능한 임의의 세포 유형이 고려된다. 일 양태에서, 배양 시스템을 사용하여 줄기 세포의 증식을 지지할 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 또는 뉴런 줄기 세포이다.

조직 배양 시스템은 이식 가능한 조직과 같은 추가적인 ECM 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조직 배양 시스템을 사용한 세포의 배양은 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조직 배양 시스템을 사용하여 피험체에 주사하거나 이식하기 위한 ECM 조성물을 제조할 수 있다. 조직 배양 시스템에 의해 제조된 ECM 조성물은 본원에 기재된 임의의 방법으로 프로세싱하여 사용할 수 있다.

본 발명의 ECM 조성물은 세포 전달을 위한 생물학적 비이클로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, ECM 조성물은 가용성 분획 및/또는 불용성 분획 둘 다를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 ECM 조성물을 포함하는, 세포 전달 또는 전달 부위에서의 유지를 위한 생물학적 비이클을 기술한다. 세포 및 3차원 조직 조성물을 포함하는 본 발명의 ECM 조성물을 사용하여, 생체내에서 세포의 성장을 촉진하고/하거나 지지할 수 있다. 상기 비이클은, 상기에 기재된 바와 같이, 줄기 세포 등의 세포를 손상된 심장 근육으로 주사하는 것을 보조하거나, 힘줄 및 인대 수복을 위한 것과 같은 임의의 적절한 용도에 사용될 수 있다.

적절한 세포 조성물(예를 들어, 본 발명의 단리된 ECM 세포 및/또는 추가적인 생물학적 물질)은 ECM 조성물이 이식 또는 투여되기 전, 후 또는 중에 투여될 수 있다. 예를 들어, 배양 시스템 또는 생물학적 전달 비이클을 피험체 내로 이식하기 전에 세포를 투여, 결합 및/또는 삽입 부위에 시딩할 수 있다. 대안으로, 그 후에 적절한 세포 조성물을 (예를 들어, 그 부위 내로 주사하여) 투여할 수 있다. 세포는 그 안에서 조직 재생 및/또는 세포 수복을 유도하도록 작용한다. 세포를 결손 부위로 투여할 있는 임의의 수단에 의해, 예를 들어, 주사에 의해 세포를 시딩할 수 있다. 주사기 또는 관절경과 같이 세포의 생존성을 유지시켜 주는 임의의 수단을 이용하여 세포를 주사할 수 있다.

ECM 조성물은, 이 조성물을 투여하여 심장 및 관련 조직에서 내피 세포 증식 및 신생혈관형성을 촉진하는 것에 의해 기관 및 조직에서의 혈관 형성을 촉진하는 것으로 알려진 바 있다. 따라서, 추가의 또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 피험체에 디바이스를 이식하는 것과 관련하여 사용되는, 본원에 기재된 ECM 조성물을 포함하는 표면 코팅제를 포함한다. 상기 코팅은 심박조율기, 스텐트, 스텐트 그래프트, 혈관 보철, 심장 판막, 션트, 약물 전달 포트 또는 카테터와 같이, 피험체로의 이식 또는 침투에 사용되는 임의의 디바이스에 이용될 수 있다. 특정 양태에서, 코팅은 상처 치유를 조절하기 위해, 염증을 조절하기 위해, 섬유 피막 형성을 조절하기 위해, 조직 내증식을 조절하기 위해, 또는 세포 내증식을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 심장, 장, 경색 또는 허혈 조직 등의 손상된 조직을 치료하는 것을 포함한다. 이러한 용도에 고려되는 세포외 조성물의 제조에 관해 기술한 실시예가 이하에 제시된다. 정상 산소 조건 하에서 배양된 ECM 조성물의 제조 및 용도에 관해서는 본원에서 참고로 포함하는 미국 특허 출원 제2004/0219134호에 기재되어 있다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은, 조직 내증식과 같은 이익을 얻을 수 있게 하는 본원에 기재된 ECM 조성물을 포함하는 다양한 이식형 디바이스 및 조직 재생용 패치를 포함한다. 본원에서 언급된 바와 같이, ECM 조성물은 패치 또는 다른 이식형 디바이스 등의 의료용 디바이스 상의 코팅제로서 사용될 수 있다. 다양한 양태에서, 이러한 디바이스는 상처 회복, 탈장 교정술, 골반저 재건(예를 들어, 골반 기관 탈출증 수복), 회전근개 수복 등에 유용하다. 관련된 양태에서, 코팅제는 정형외과용 임플란트, 심혈관용 임플란트, 요도 슬링술 및 심박조율기 슬링술에 유용하다.

예를 들어, 탈장의 기본적인 징후는 복부 내용물이 근막의 결함부로 돌출되어 있는 것이다. 탈장 교정을 위한 수술 접근법은 복막강내 탈장 내용물을 감소시키고, 인공보장재, 동종이계 물질 또는 자가 물질을 사용함으로써 근막 결함부가 견고하게 봉합될 수 있도록 하는 것에 초점을 두고 있다. 다수의 많은 기법이 상기와 같은 봉합을 위해 사용되었지만, 현 생성물과 방법상의 결점으로는 상기 봉합이 다시 약해진 경우 탈장이 재발하게 됨으로써 복부 내용물이 다시 원래대로 결함부로 되돌아 나가게 된다는 점을 포함한다. 탈장 봉합술에서, 교정 조직 재생용 패치, 예를 들어, ECM 조성물로 코팅된 생체재흡수성 또는 합성 메쉬가 사용될 수 있다.

본 발명과 함께 사용될 수 있는 의료용 디바이스 표면에 생물학적 코팅제를 도포하는 다양한 기법들이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 자외선을 가함으로써 가교결합제가 활성화되면 디바이스 표면에 영구적으로 공유 결합할 수 있도록 하는 광활성 가교결합제를 사용하여 ECM 조성물을 코팅할 수 있다. 예시적인 가교결합제는 트리라이트(TriLite)™ 가교결합제인데, 이는 비세포독성이고, 생물학적 조직에 대해 비자극성이며, 비감작성을 나타내었다. ECM 재료는 다양한 이식형 디바이스를 코팅하거나, 그 내로 혼입되기 이전에, 예를 들어, 인간 콜라겐, 하이알루론산(HA), 피브로넥틴 등과 같은 개개의 성분들로 분리될 수 있거나, 분리되지 않을 수 있다. 또한, 세포 침윤 개선과 같은 유익한 이식 특성을 얻을 수 있도록 추가적인 성장 인자 등을 혼입할 수 있다.

다양한 관련 실시형태에서, 본 발명은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 노화방지제, 항주름제, 피부 필러, 모이스처라이저, 색소침착 강화, 피부 퍼밍 등과 같이 미용용/약용 화장품용으로 적용될 수 있는 방법 및 디바이스를 제공한다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 피험체의 주름 부위에 본원에 기재된 ECM 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 피부 표면을 개선하는 방법을 포함한다. 관련 실시형태에서, 본 발명은 피험체의 주름 부위에 본원에 기재된 ECM 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 연조직을 수복 또는 강화시키는 방법을 포함한다. 다양한 미용적 용도에서, 조성물을, 경우에 따라, 주사용 및 국소용 제제 등으로 제제화할 수 있다. 본원에 포함되어 있는 실시예에서 추가로 언급되는 바와 같이, 국소용 제제로서 제제화된 ECM 조성물은 주름 방지, 노화 방지 용도뿐만 아니라, 레이저 박피술에 대한 첨가물과 같은 다양한 피부 미용적 용도에서 효과적인 것으로 나타났다. ECM 함유 국소용 제제의 여러 유익한 특징들이 밝혀졌다. 그러한 유익한 이점으로는 1) 박피 후의 재상피화를 촉진한다는 점; 2) 비박피성 및 박피성 프랙셔널 레이저 박피 증상(예를 들어, 홍반, 부종, 가피 형성 및 감각기 통증)이 감소되었다는 점; 3) 피부결이 매끄러워지고, 고르게 되었다는 점; 4) 피부 보습을 제공한다는 점; 5) 잔주름/주름의 출현을 감소시킨다는 점; 6) 피부의 단단함과 유연성을 증가시킨다는 점; 7) 피부의 색소침착 장애를 감소시킨다는 점; 및 8) 붉은 부스럼 피부를 감소시킨다는 점을 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 바와 같이 제조될 수 있지만, 본원에 개시된 획기적인 배양 방법(예를 들어, 저산소 조건 하에서의 배양)을 이용한다. 세포의 수복 및/또는 재생, 피부 표면 개선 및 연조직 수복을 위한 정상 산소 배양 조건 하에서 생성된 세포외 기질 조성물의 사용 및 그 제조에 대해서는 미국 특허 제5,830,708호에 기재되어 있으며, 이 특허 문헌은 본원에서 참고로 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ECM 조성물을 포함하는 생물학적 유착 방지제를 포함한다. 이 제제는 그러한 용도에서 장 또는 혈관 문합 형성 후 사용되는 유착 방지용 패치로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 조성물 또는 활성 화합물은 일반적으로 치료되는 특정 질환을 치료 또는 예방하는 데 유효한 양으로 사용될 수 있다. 이 조성물은 치료적 이익을 얻기 위해 치료 목적으로 또는 예방적 이익을 얻기 위해 예방 목적으로 투여될 수 있다. 치료적 이익이란 치료 대상의 근본적 병태 또는 질병을 근절시키거나 호전시키는 것을 의미한다. 치료적 이익은 또한 실제로 개선이 일어나는지 여부에 관계없이, 질환의 진행을 중단시키거나 늦추는 것을 포함한다.

조성물의 투여량은, 예를 들어, 조성물의 유형, 치료 대상의 특정 적응증, 투여 방식, 원하는 이익이 예방적 이익인지 또는 치료적 이익인지, 치료 대상 적응증의 중증도 및 환자의 나이와 체중 및 투약 형태의 유효성을 비롯한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 유효 투여량을 결정하는 것은 충분히 당업자의 능력 내에 있다.

초기 투여량은 초기에 시험관내 분석으로부터 예측할 수 있다. 또한, 초기 투여량은 동물 모델과 같은 생체내 데이터로부터 예측할 수 있다. 모발 성장을 증진하는 조성물의 효능을 테스트하는 데 유용한 동물 모델로는 특히 설치류, 영장류 및 기타 다른 포유동물을 포함한다. 당업자는 시험관내 데이터 및 동물 데이터로부터 외삽법을 통한 추정에 의해 인간 투여에 적합한 투여량을 결정할 수 있다.

투여량은 특히 조정된 배지의 활성, 투여 방식, 치료 대상 병태 및 상기에 언급한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 투여량과 투여 간격은 치료적 또는 예방적 효과를 유지하는 데 충분한 수준을 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다.

상기에 언급된 용도에 고려되는 세포외 기질 조성물의 제조에 관한 실시예를 이하에 기재한다. 하기 실시예는 본 발명의 실시형태를 추가로 설명하기 위해 제공된 것이며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 이 실시예는 이용될 수 있는 전형적인 것에 해당하지만, 당업자에게 알려져 있는 다른 절차, 방법 또는 기법을 대안적으로 이용할 수 있다.

실시예 1

저산소 조건 하에서 배양된 ECM 조성물 중에서의 차등적 유전자 발현

1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 조직 배양 플라스크에서 표준 단층으로서 배양하고, 자연적으로 퇴적된 태아 유사 ECM 내에서의 3차원 섬유아세포 배양물과 비교하였다. 이 배양물을 본원에 개시된 바와 같이 증식시켰다. 유전자의 차등적인 발현을 평가하기 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 Agilent Whole human Genome Oligo Microarrays^®를 사용하여 전체 유전자 발현(40,000종 미만의 유전자를 포함함)에 대한 전체 RNA 샘플을 완성하였다.

비교 결과, 섬유아세포는 저산소 상태에서 배양된 자연적으로 분비된 ECM 내의 3차원 배양물 중에서 콜라겐 및 ECM 유전자 발현을 조절하는 것으로 확인되었다. 다양한 콜라겐 및 ECM 유전자 발현의 상향 조절 및 하향 조절이 표 3에 명백히 제시되어 있다.

[표 3]

비교 결과, 섬유아세포는 저산소 상태에서 배양된 자연적으로 분비된 ECM 내의 3차원 배양물 중에서 Wnt 경로 유전자의 유전자 발현을 조절하는 것으로 확인되었다. 다양한 Wnt 경로 유전자 발현의 상향 조절 및 하향 조절이 표 4에 명백히 제시되어 있다.

[표 4a]

[도 4b]

비교 결과, 섬유아세포는 저산소 상태에서 배양된 자연적으로 분비된 ECM 내의 3차원 배양물 중에서 골 형성 단백질(BMP: bone morphogenetic protein) 경로 유전자의 유전자 발현을 조절하는 것으로 확인되었다. 다양한 BMP 경로 유전자 발현의 상향 조절 및 하향 조절이 표 5에 명백히 제시되어 있다.

[표 5]

비교 결과, 섬유아세포는 저산소 상태에서 배양된 자연적으로 분비된 ECM 내의 3차원 배양물 중에서 추가적인 유전자의 발현을 조절하는 것으로 확인되었다. 추가적인 유전자 발현의 상향 조절 및 하향 조절이 표 6에 명백히 제시되어 있다. 결과는 저산소 배양 조건이 저산소 유도성 인자(HIF 1A)의 mRNA 발현을 14.78배 증가시키고 그 개개의 억제제를 4.9배 감소시킨다는 것을 나타낸다. 이는, HIF 1A 단백질의 번역을 코딩하는 HIF 1A에 대한 mRNA가 상향 조절되고 그 억제제가 하향 조절되기 때문에 저산소 조건에서 배양된 조정 배지가 낮은 산소 분압 환경(저산소 상태)을 경험한다는 것을 시사한다. 추가로, 저산소 배양 조건 하에 VEGFB(4.33배 증가), KGF(11.51배 증가) 및 IL-8(5.81배 증가) 수준도 상향 조절되었다.

[표 6a]

[표 6b]

[표 7]

실시예 2

1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 사용한 저산소 상태 하에서의 ECM 생산

1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 사용한 저산소 상태 하에서의 ECM 배양에 관한 2 가지 실시예를 제공한다.

1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 조직 배양 플라스크에서 10% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민이 보충된 90% DMEM(10% FBS/DMEM)의 존재 하에 증식시켰다. 세포를 0.05% 트립신/EDTA를 사용하여 3대까지 계대배양하고, 그 시점에 세포를 배지 1 ml당 0.04 mg의 건조 비드의 사이토덱스-1(Cytodex-1) 덱스트란 비드(100∼120 ml가 충전된 125 ml의 스피너 플라스크 중 5×10⁶ 세포/10 mg 비드), 또는 나일론 메쉬(25×10⁶ 세포/6×100 ㎠ 나일론)에 시딩하였다. 모든 배양물은 증식 및 시딩을 위해 표준 대기 및 5% CO₂ 중에서 유지하였고, 그 후저산소 배양물을 배양 배지 내에 저산소 환경이 형성될 수 있도록 95% 질소/5% CO₂로 퍼지된 밀폐 챔버로 분할해 넣었다. 이 시스템은 배양 용기 내 산소 농도를 약 1∼5%로 유지한다. 시딩을 위해 나일론 또는 비드를 덮는 데 필요한 최소 부피로 세포를 잘 혼합해 넣고, 그 후, 약 30분이 지나 1회 혼합한 후, 함습 37℃ 인큐베이터에서 밤새 방치하였다. 세포가 증식하여 ECM을 퇴적시키기 시작하는 동안 2∼3일마다 50∼70% 배지를 교환해 주면서 2∼4주 동안 10% FBS/DMEM을 배양물에 공급하였다. 추가로 4∼6주 동안, FBS 대신, 철 보충제, 및 20 ㎍/ml 아스코르브산을 함유하는 10% 송아지 혈청을 배양물에 공급하였다. 스피너 플라스크를 처음에는 15∼25 rpm으로 약 2∼4주 동안 혼합하였으며, 그 후 45 rpm으로 증가시켜 이후로는 이 속도를 유지하였다. 비드 배양물은 4주 후에 폭 및 직경이 약 0.5∼1.0 cm인 ECM 함유의 거대 무정형 구조체를 형성하였으며, 따라서 기체 확산과 높은 대사 요구량으로 상기 배양물은 저산소 상태가 되었다.

또 다른 실시예에서는, 1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 단층 플라스크에서 증식시킨 후, 시험관내 ECM 발생을 지지하도록 나일론 메쉬 스캐폴드 상에서 배양하였다. 고글루코스, 2 mM L-글루타민 및 10%(v/v) 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 중에서 섬유아세포를 증식시켰다. 또한, 배양물에 20 ㎍/ml 아스코르브산을 보충하였다. 주변 산소(대략 16∼20%의 산소) 중에서 3주 후, 한쌍의 ECM 함유 배양물을 95% 질소/5% 이산화탄소(카탈로그 번호 MC-101, 캘리포니아주 델 마 소재의 Billups-Rothenberg, Inc.)로 광범위하게 플러싱한 밀폐 챔버의 저산소 배양 조건(1∼5%의 산소)으로 전환하였다. 배양 배지로부터 대기 산소를 확실하게 고갈시키기 위해, 2∼3시간 후, 배지가 약 1∼3%의 산소를 포함하도록 공기를 바꾸었다. 두 세트의 ECM 함유 배양물 모두 추가의 4주 동안 매주 2회씩 영양분을 공급하면서 배양하고, 그 후 RNA 단리를 위해 배양물을 조제하였다. 제조사의 설명서에 따라 상업적으로 입수 가능한 키트(카탈로그 번호 Z3100, Promega, Inc.)를 사용하여 전체 세포 RNA를 단리하였다. 정제된 RNA 샘플을 -80℃에 보관해 두었다가, Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays^®를 이용하는 유전자 발현의 마이크로어레이 분석을 위해 프로세싱하였다.

Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays^®를 이용하여 결과를 분석한 바, 저산소 배양물로부터 제조된 프로브와 비교하여 주변 산소로부터 제조된 프로브로부터 차등적으로 발현된 전사체 약 5,500종이 검출되었다. 이 중 대략 절반(2,500종)은 저산소에 의해 2.0배 넘게 증가하였고, 대략 절반(2,500종)은 저산소에 의해 2.0배 넘게 감소하였다. 이는 저산소가 시험관내 유전자 발현에 현저한 변화를 유발한다는 것을 시사한다. 특히 중요한 것은, ECM 단백질, 특히 다수의 콜라겐 유전자에 대한 전사체는 상향 조절된 반면, 다수의 기질 분해 효소 유전자는 하향 조절되었다는 점이다.

실시예 3

치료 용도를 위한 조직 공학적으로 처리된 인간 배아 세포외 기질

배아 ECM은 흉터 형성 또는 유착을 유발하지 않고 신속한 세포 증식과 치유에 도움이 되는 환경을 형성한다. 신생혈관형성 전의 초기 배아 환경을 모의하는 조건(저산소 상태 및 감소된 중력) 하에 인간 신생아 섬유아세포가 3차원으로 증식시키면 태아의 특성을 갖는 ECM 조성물이 생성될 것이라고 가정하였다. 유전자 칩 어레이 분석에 의하면, 종래의 조직 배양 조건과 비교하여 저산소 상태 하에서 5,000종이 넘는 유전자가 차등적으로 발현되는 것으로 나타났다. 생성된 ECM은 콜라겐 III형, IV형 및 V형, 및 당단백질, 예컨대 피브로넥틴, SPARC, 트롬보스폰딘 및 하이알루론산이 비교적 풍부하다는 점에서 태아 중간엽 조직과 유사하였다. 또한 ECM은, 주요 성장 인자를 갖는 재생성 줄기 세포 집단을 지지하는 추정 영역에서 성장 인자에 결합하여 이를 제시하는 데 있어서 중요한 조절 기능을 하기 때문에, 본 발명자들은 배양 상태에서 태아 유사 ECM이 발생하는 동안 저산소 상태가 성장 인자 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 저산소 상태는 또한 상처 치유 및 기관형성을 조절하는 인자, 예컨대 VEGF, FGF-7 및 TGF-β와, wnt 2b, 4, 7a, 10a 및 11을 비롯한 다수의 wnt의 발현을 증진시킬 수 있다. MTT 분석법을 이용할 때 효소 활성의 증가로 측정되는 바와 같이, 배아 인간 ECM은 또한 시험관내 인간 섬유아세포의 대사 활성의 증가를 촉진하였다. 또한, 본 발명자들은 인간 ECM에 대한 반응으로 세포수가 증가한 것을 검출하였다. 이러한 인간 ECM은 흉터 형성 또는 유착의 발생없이 새 조직의 증식 및 치유가 필요한 다양한 치료 용도에 있어서 생물학적 표면 코팅제로서, 또 조직 필러 치료에 사용될 수 있다.

실시예 4

재생 의학 용도를 위한 천연적으로 가용성인 WNT 활성의 제공

피부 또는 혈액과 같은 성체 조직을 재생시킬 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포는 이러한 재생을 실현하기 위해 어느 정도까지는 배아 발생을 반복한다. 증가하고 있는 많은 연구를 통해, 배아발생 중에 활성을 띠는, 줄기 세포 다능성 및 계통 특이적 분화의 주요 조절인자가 특정 환경 하에서는 성체에서도 재발현된다는 것이 밝혀졌다. 분비된 형태발생 성장 인자 및 발생 인자의 WNT 패밀리는 잠재적으로 가치있는 연구 도구가 되고 결국 임상에서의 치료 수단이 될 수 있는 성장 인자 중 하나이다. 그러나, 현재까지 상업적 규모로는 Wnt가 표준 재조합 발현 및 정제 기법에 대하여 적합하지 않은 것으로 입증되었고, WNT 베이스의 제품을 임상적으로 개발할 수 있는 대규모 WNT 단백질 생산에 관한 보고도 없었다. 배양액 중의 다양한 스캐폴드 상의 신생아 인간 진피 섬유아세포를 사용하여 태아 유사 ECM을 배양 증식시킴으로써 3차원 조직 등가물을 생성할 수 있는 기법이 개발되었다. 이 과정에서, 상기 배양물이, ECM 생산에 사용되는 무혈청 조정 배지 중에 함유되어 있는 생물학적 활성 WNT의 상업적 규모의 공급원을 제공할 수 있다는 것이 발견되었다. 여기에서, 본 발명자들은 상기 WNT 생성물 후보물질에 대한 데이터를 제공한다.

세포의 유전자 발현 분석은, 적어도 3종의 WNT 유전자(wnt 5a, wnt 7a, 및 wnt 11)가 발현되었고, wnt 신호전달과 관련이 있는 소수의 유전자도 발현되었다는 것을 입증하였다; 그러나, 그 기능은 완전히 이해되고 있지 않다. 유전자 발현 데이터를 wnt 신호전달(1차 인간 표피 각질세포에서 β-카테닌의 핵 전좌)에 대한 시험관내 생물학적 분석으로 확장시켜, 혈액 줄기 세포에 대한 wnt 활성을 평가하였다. 두 분석 모두를 통해 정규(canonical) wnt 활성과 일치하는 활성이 입증되었다. 또한, 이들 배양물로부터 얻은 조정 배지는, 마우스의 피부 내로 주사되었을 때 모낭 줄기 세포가 성장기에 진입할 수 있도록 유도하여 모발 성장이 이루어질 수 있도록 하는 wnt 활성을 보였다. 이는 규정 배지 및 무혈청 조건 배지 중의 안정화된 WNT 활성은 정제를 필요로 하지 않는다는 것을 시사한다. 이러한 생성물을 모낭 재생용으로, 또 다양한 인간 줄기 세포의 배양을 위한 유용한 연구 수단으로서 사용할 수 있다.

실시예 5

저산소 상태 하의 섬유아세포는 독특한 ECM 생산과 성장 인자 발현을 나타낸다

인간 신생아 진피 섬유아세포는 시험관내에서 배양될 때 ECM을 생산하는데, 이는 진피와 매우 유사하고, 상처 치유와 같은 재생 의학 분야에서 손상된 진피를 대체할 수 있다. 상처 치유 과정은 또한 배아 환경을 모의함으로써 배아 발생을 반복하기 때문에, 본 발명자들은 생산된 ECM이 조직 재생 용도를 위한 증대된 ECM을 제공할 것이라고 가정하였다. 따라서, 신생혈관형성 전의 초기 배아에 존재하는 저산소 상태를 모의하기 위해, 인간 신생아 섬유아세포 유래의 ECM을 저산소 상태의 배양 조건으로 증식시켰다. 이 목적은 배양 상태에서의 조직 발생 중에 저산소 조건을 사용함으로써 태아 특성을 갖는 ECM을 생성하는 것이었다.

이러한 저산소 배양 상태에서 생산된 ECM은 콜라겐 III형 및 V형, 및 당단백질, 예컨대 피브로넥틴, SPARC, 트롬보스폰딘 및 하이알루론산이 비교적 풍부하다는 점에서 태아 중간엽 조직과 유사하였다. 또한, ECM은, 주요 성장 인자를 갖는 재생성 줄기 세포 집단을 지지하는 추정 영역에서 성장 인자에 결합하고 이를 제시하는 데 있어서 중요한 조절 기능을 하기 때문에, 본 발명자들은 배양 상태에서의 태아 유사 ECM의 발생 중에 저산소 상태가 성장 인자 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 저산소 상태는 또한 상처 치유 및 기관형성을 조절하는 인자, 예컨대 VEGF, FGF-7 및 TGF-β의 발현을 증대시킬 수 있는 것으로 확인되었다.

MTT 분석법을 이용할 때 효소 활성의 증가로 측정되는 바와 같이, 인간 ECM은 또한 시험관내 인간 섬유아세포의 대사 활성 증가를 촉진하였다. 또한, 인간 ECM에 대한 반응으로 세포수가 증가한 것도 검출되었다. 이러한 결과는 배아 세포 배양에서 코팅제/스캐폴드로서, 또 다양한 치료 용도 또는 의료용 디바이스에서 생물학적 표면 코팅제/필러로서의 상기 인간 ECM의 용도를 뒷받침한다.

실시예 6

인간 세포외 기질(hECM)이 코팅된 생물의학 재료

ECM은 빠른 세포 증식과 흉터 형성 또는 유착이 없는 치유에 도움이 되는 환경을 생성하는 것으로 보고되어 있다. 본원에 기재된 방법을 이용하여, 낮은 산소 및 비중 하에 신생아 섬유아세포를 배양함으로써 독특한 배아와 유사한 인간 ECM(hECM)을 생성하였다. 결과는 다음을 포함하였다: hECM을 융모요막에 배치할 경우 신생혈관형성이 관찰되고, hECM을 나일론 메쉬에 코팅하여 SCID 마우스의 옆구리 위치의 피하 영역에 이식할 경우 염증성 세포 이동의 감소가 관찰되었다. 이러한 결과에 기초할 때, 폴리프로필렌 메쉬 상의 본 발명의 hECM을 코팅하는 것은 SCID 마우스의 피하 영역의 재료와 생체의 계면에 섬유 피막을 형성하고 염증성 세포 이동을 감소시키는 것으로 추정되었다.

인간 유래의 재료(hECM)를 사용하여 제조된 ECM 조성물을 광활성 가교결합제를 사용하여 프로필렌 메쉬 상에 코팅하였다. hECM은 UV 공유 결합 메커니즘에 의해 6 mm의 생검 펀치 폴리프로필렌 상에 코팅하였다(Innovative Surface Technologies(ISurTec) TriLite^TM Crosslinker). 폴리프로필렌의 코팅 및 비코팅 hECM 6 mm 생검 펀치를 E-Beam^TM(BeamOne LLC E-BEAM^TM) 또는 에틸렌 옥시드(ETO)(ETO Flagstaff Medical Center에 의해 개시됨)를 사용하여 멸균하였다. 그 후, 각각의 6 mm 폴리프로필렌 디스크를 2개의 대칭 반원 삽입물로 분리하였다. 마지막으로, 폴리프로필렌 이식물을 옆구리 위치의 피하 영역에 무균 기법을 이용하여 좌우 양측에 배치하였다. 조직학적 분석을 위해 2주 및 5주 종료점에 샘플을 외식하였다.

hECM 코팅 폴리프로필렌 메쉬의 항피브로넥틴 면역형광 염색은 ECM 재료가 메쉬 섬유에 결합하여 비코팅 메쉬에 비해 그 위에 균일한 코팅을 형성하였음을 보여주었다. hECM 코팅 메쉬는 탈장 교정술 및 골반저 재건과 같은 의료 용도를 위한 이식형 패치에 적합하다. ECM 재료는 피브로넥틴 항체를 사용한 면역형광 염색을 통해 확인되는 바와 같이 메쉬의 개개의 섬유를 코팅하여 개선된 세포 성장을 가능하게 하는 것으로 확인되었다.

hECM을 병아리 융모요막(CAM)에 이식하여 새로운 미소혈관계 성장에 의해 입증되는 미소혈관 반응을 촉진하였다. 추가로, 4주 동안 마우스 피하에 이식한 hECM 코팅 나일론 메쉬는 비코팅 나일론 메쉬에 비해 개선된 생체적합성을 나타내었다. 특히, hECM 코팅 나일론 섬유에 대해 더 적은 염증 세포와 더 얇은 섬유 피막이 관찰되었다.

헤마톡실린 및 에오신 염색 샘플을 이용하여, hECM 코팅 폴리프로필렌 메쉬를 이식한 지 2주 및 5주째 생체적합성 평가를 수행하였다. FBGC 분석을 위해 샘플을 블라인드 코드하고, 형태 계측을 이용하여 평가하고, 그룹으로 분리하고, 통계적으로 평가한 후, 디코드하였다. 이물 거대 세포(FBGC)의 수를 조사하였다. 이식 후 2주째의 섬유당 FBGC의 수를 도 1a 및 1b에 도시하였으며, 추가 샘플은 도 14a 및 14b에 도시하였다. 이식 후 5주째의 섬유당 FBGC의 수는 도 2a 및 2b에 도시하였으며, 추가 샘플은 도 15a 및 15b에 도시하였다. 비코팅 메쉬와 비교할 때 hECM 코팅 폴리프로필렌 메쉬에 대한 FBGC의 감소가 명백하다. 2주 시점에, 샘플당 평균 FBGC 수가 비코팅 폴리프로필렌(9.20±2.03)의 경우 hECM 코팅 폴리프로필렌(4.53±0.89)에 비해 통계적으로 더 많은 것으로 측정되었다(ANOVA bonferroni 사후 검증 p<0.05). 5주 시점에는 샘플당 평균 FBGC 수가 폴리프로필렌(10.95±2.15)의 경우 hECM 코팅 폴리프로필렌(8.17±1.41)에 비해 더 많은 것으로 측정되었으나, 통계적 유의성은 없었다.

결과는, hECM 코팅 폴리프로필렌이 섬유 피막을 감소시킬 수 있음을 나타내었다. 섬유 피막은 2주 시점과 5주 시점에 트리크롬(Trichrome) 염색 샘플을 사용하여 평가하였다. 피막 분석을 위해, 샘플을 블라인드 코드하여, 형태 계측을 이용하여 평가하고, 그룹으로 나누고, 통계적으로 평가한 후, 디코드하였다. 2주 시점에, 평균 섬유 피막 두께는 hECM 코팅 폴리프로필렌(23.70±2.70 ㎛)의 경우 비코팅 폴리프로필렌(19.70±3.00 ㎛)의 경우에 비해 통계적으로 더 두꺼운 것으로 측정되었다(도 16a 및 16b)(ANOVA bonferroni 사후 검증 p<0.05). 5주 시점에, 평균 섬유 피막 두께는 hECM 코팅 폴리프로필렌(10.40±1.10 ㎛)의 경우 비코팅 폴리프로필렌(12.30±1.20 ㎛)의 경우에 비해 더 얇은 것으로 측정되었다(도 17a 및 17b). 2주 시점에서 5주 시점까지의 섬유 피막 형성의 평균 차이(%)를 평가할 때 중요한 관찰 결과가 확인되었지만, 역시, 비코팅 폴리프로필렌에 대한 hECM 코팅 프로필렌에 있어서의 차이는 통계적 유의성이 없는 것으로 확인되었다. 2주 시점에서 5주 시점까지의 섬유 피막 형성의 평균 감소율(%)은 hECM 비코팅 폴리프로필렌의 경우 37.6%, hECM 코팅 폴리프로필렌의 경우 56.1%였다.

FBGC 형성 메커니즘은, 폴리프로필렌과 같은 이식 가능한 생체재료에 대한 면역 반응에 있어서의 대식세포 융합의 결과이다. 이러한 거대 다핵 세포는 이식 가능한 생체재료에 대한 염증 반응을 정량적으로 평가할 수 있는 유효한 수단을 제공한다. 2주 시점에서는 비코팅 폴리프로필렌에 비해 인간 ECM 코팅 폴리프로필렌에 대해 샘플당 FBGC 수가 유의적으로 감소한 것이 관찰되었다. 이러한 데이터는 인간 ECM 표면 코팅이 다양한 이식형 디바이스에 사용될 수 있다는 것을 시사한다.

종래에, 이식형 디바이스의 유효성 및 수명은 FBGC 및 섬유 피막 형성을 비롯한 특이적인 면역 반응에 의해서 어려움이 있었다. 구체적으로, FBGC가 수퍼옥시드 및 자유 라디칼과 같은 분해성 물질을 분비할 뿐만 아니라, 다른 분해성 물질도 디바이스의 유효성 및 수명에 악영향을 미친다. FBGC가 임플란트가 존재하는 동안 임플란트 주변 바로 가까이에 위치하는 것으로 알려져 있기 때문에, 상기와 같은 역효과는 특히 중요한 의미를 갖는다. 숙주 또는 숙주 조직으로부터 외래 삽입물을 분리하기 위해 임플란트 주변에서 견고한 혈관 콜라겐 봉입체로서 형성되는 섬유 피막 형성이 설계된다. 이러한 반응은 특정 경우에 환자에게 불쾌감을 줄 수 있을 뿐만 아니라, 디바이스의 수명을 단축시킬 수 있고, 심지어는 디바이스의 유효성도 감소시킬 수 있다. 따라서, FBGC를 감소시키고 섬유 피막 형성을 감소시키는 코팅이 이식형 디바이스의 수명과 기능을 위한 매우 바람직한 결과이다.

폴리프로필렌 상의 hECM 코팅이 FBGC 존재를 감소시키고 재료-생체 계면에서의 섬유 피막 형성을 감소시킬 수 있다는 발견은 추가적인 실험에 대한 필요성을 뒷받침한다. 추가적인 평가는, hECM 코팅 및 비코팅 생체재료에 의한 섬유 피막 두께의 변화를 관찰하기 위해 더 오랜 기간의 시점을 포함할 수 있다. 또한, 다크론, 나일론, 스테인레스 스틸 및 티탄을 비롯한 다수의 생체재료를 사용한 다양한 생체내 환경에서의 평가가 추가적인 바람직한 hECM 코팅 생체재료 결과를 해명할 수 있다.

실시예 7

모발 성장 자극을 위한 세포외 기질 조성물의 용도

본 실시예는 ECM 조성물 투여에 의한 모발 성장의 자극을 예시한다.

모발 형성 능력을 촉진하고 유지할 수 있는 본원에 기재된 ECM 조성물의 능력을 확인하기 위하여 인간 모낭 세포 및 모낭으로부터 채취된 세포를 얻었다. 모낭 세포는 알데란스 리서치 인터내셔널(Alderans Research International)로부터 입수하였다. 세포를 ECM 존재 하에 배양하였다. 배양 4주째 및 8주째 실시한 세포 분석을 통해 도 3a 및 3b에 도시된 바와 같이 모낭과 유사한 구조체뿐만 아니라, 모간과 유사한 구조체가 관찰되었다. 2개월 동안 계속 배양해도, 세포는 여전히 살아서 증식하고 있었다.

ECM 조성물의 존재 하에 4주 동안 배양한 세포를 마우스에 이식하였다. 현미경 이미지 분석을 이용하여 관찰되는 바와 같이, 이식 후 4주째 배양 인간 모낭은 정상적인 수의 작은 휴지기 모낭만을 보이는 대조군 세포에 비해 다수의 거대 모낭을 형성하였다.

이러한 발견에 기초하여, 새로운 모낭 재생을 확인하기 위해 인간을 피험자를 대상으로 생체내 모발 성장 시험을 수행하였다. 이 연구에는 남성형 탈모(MPHL) 증상을 갖는 18∼45세의 남성 24명이 참여하였다. 연구 그룹의 모든 구성원은 Minoxidil^TM 또는 Finasteride^TM를 사용한 국소 치료 또는 사전 침습성 또는 최소 침습성 국소 두피 수술을 받지 않았다. Palomar Starluz 550p 레이저를 이용하였다(1540 비박피성 및 2940 박피성). 연구 기간은 (1회 sc 주사 후) 추적을 위해 12개월까지, 베이스라인 및 5개월로 정하였다. 주사 후 3일의 워시 아웃 기간을 지켰고 피험자는 연구 기간 내내 Cetaphil^TM 샴푸만을 이용하였다. 주사 전에 레이저와 미세박피술을 함께 실시하였다.

피험자에게, 대조군 비이클 및 염수와 함께, wnt 단백질 활성을 가지고 wnt 7a를 포함하는 것으로 확인된 hECM과 혼합된 비이클을 경피 투여하였다. 연구의 평가 변수(end point)는 7 포인트 임상 등급화 시스템(3명의 맹검 모발 이식 외과의), 임상 확대사진술(모낭 수), 2 mm 펀치 생검 및 피험자 자체 평가 설문을 포함하였다.

피험자에 대한 개개의 모낭 단위를 분석하였다. 모낭은 12주째 카운팅하여 연구 시작 시 동일 피험자에게서 관찰된 기저값과 비교하였다. 퍼터베이션 없이 hECM을 투여한 피험자에게서 모낭 단위 증가가 관찰되었다. 예를 들어, 한 피험자에게서는, 처리가 12주째 겉보기 모낭수를 기저값 217에서 265로 증가시켰다. 피험자의 총 모발수는 307에서 360으로 증가하여, 전체적으로 약 20%의 증가를 보였다. 다른 피험자에게서도 다음과 같이 모낭수 증가가 관찰되었다: 피험자 009(기저값 모발수 179, 12주째 모발수 193, 5개월째 모발수 201); 피험자 013(기저값 모발수 266.5, 12주째 모발수 267, 5개월째 모발수 294); 피험자 024(기저값 모발수 335.5, 12주째 모발수 415, 5개월째 모발수 433). 또한, 연구에서 hECM을 투여받은 13명의 환자 중 12명(92.3%)이 12주째 효능을 보였다. 도 18은 3개월째의 추가적인 모발 성장 측정을 도시한다.

2명의 피험자에 대해 각각 12주 및 22주째의 모발 성장 특성을 보여주는 추가적인 결과가 도 19 및 20에 도시된다.

연구 전반에 걸쳐 추가적인 모발 파라미터를 분석하였다. 기저값(0주)과 비교하여 12주 및 22주째 상대 모발수를 분석하였고, 기저값과 비교하여 경모를 분석하였으며, 기저값과 비교하여 모발 두께를 분석하였다. 예를 들어, 한 피험자에게서는, 처리가 12주째 모발수, 경모 및 모발 두께를 기저값과 비교하여 각각 22.4%, 27.8% 및 23.9% 증가시켰다. 또 다른 피험자에게서는, 처리가 12주째 모발수, 경모 및 모발 두께를 각각 23.7%, 24.2% 및 22.2% 증가시켰다. 피험자 009(상기한 바와 같이 기저값 모발수 179, 12주째 모발수 193, 5개월째 모발수 201)의 경우, 처리가 기저값과 비교하여 모발수, 경모 및 모발 두께를 12주째 각각 7.8%, 48.5% 및 19.2% 증가시켰고, 20주째 각각 12.9%, 33.0% 및 21.1% 증가시켰다. 피험자 013(상기한 바와 같이 기저값 모발수 266.5, 12주째 모발수 267, 5개월째 모발수 294)의 경우, 처리가 기저값과 비교하여 모발수, 경모 및 모발 두께를 12주째 각각 0.2%, 25.0% 및 8.3% 증가시켰고, 20주째 각각 10.3%, 41.4% 및 23.0% 증가시켰다. 피험자 024(상기한 바와 같이 기저값 모발수 335.5, 12주째 모발수 415, 5개월째 모발수 433)의 경우, 처리가 기저값과 비교하여 모발수, 경모 및 모발 두께를 12주째 각각 23.7%, 24.2% 및 22.2% 증가시켰고, 20주째 각각 29.1%, 5.9% 및 17.3% 증가시켰다.

13명의 연구 대상자에 대한 종합적 결과를 도 21 및 22에 도시하였다. 3개월째의 연구 대상자 반응의 분포는 도 23∼26에 도시하였다.

주목할 만한 점은, 치료된 연구 대상자가 3개월째 경모수의 유의적인 증가와 두께 밀도의 증가를 보였다는 것이다(pts의 84.6%). 또한, 부작용이 관찰되지 않았고, 정상적인 조직 상태가 관찰되었고, 과오종이 관찰되지 않았다.

이 결과는 이식 후 환자의 탈모 예방과 눈썹 및 속눈썹 성장과 같은 추가적인 용도에 hECM이 사용될 수 있음을 암시한다. 모발 이식 환자의 경우, 모발이 빠지고 일반적으로 4∼5개월 후 다시 나기 때문에, hECM을 사용한 치료가 그러한 이식 후 환자들에게서 탈모를 방지할 수 있을 것이다.

실시예 8

인간 세포외 기질 조성물(hECM)의 제조

신생아 인간 섬유아세포를 사용하여 인간 ECM 조성물을 제조하였다. 액체 배지로 조정된 비드형 구조체 상에 섬유아세포를 시딩하였다. 우태 혈청을 사용할 필요 없이 배양 조건을 최적화하였다. 수일 이내에 본원에 기재된 배아 배양 조건 하에 세포가 조밀한 배아 유사 ECM을 생성하였다. Wnt 패밀리 단백질뿐만 아니라 여러 종의 성장 인자의 분비가 관찰되었다.

배양물을 포화 상태까지 배양하였다. 그 후, 배양물을 멸균수에 노출시켜 세포의 균일한 용해를 유도하였다. 그 후, 비세포성 hECM을 세척해 내어, 모든 생존 세포와 세포 잔해물을 제거하고, 현미경 관찰로 세포 잔해가 제거되었는지를 확인하였다. 이어서, 인간 섬유아세포를 hECM으로 코팅된 배양 플라스크에 노출시키거나, 비처리 플라스크 상에 플레이팅한 후, 두꺼운 매트릭스 층으로 덮었다. hECM에서 확인되는 ECM 단백질은 표 8에 제시되어 있다.

[표 8]

도 4에 도시된 MTT 분석법을 이용할 때 효소 활성의 증가로 측정되는 바와 같이, hECM은 세포의 대사 활성 증가를 유도한다는 것이 관찰되었다. MTT 분석법에 의해 측정된 바와 같이, 마우스 ECM과는 달리 인간 ECM은 세포의 대사 활성에 있어서 용량 의존적 증가를 유도하였다. 세포는 hECM 중층 재료로 빠르고 균일하게 침윤한다는 것이 관찰되었다. 또한, 도 5에 도시된 피코 그린 분석법에 의해 측정되는 바와 같이, hECM에 대해 반응하여 세포수가 용량 의존적으로 증가하였다.

공지된 코팅제, 주사제 및 이식형 기질 제품은 일반적으로 소 콜라겐, 장 또는 방광으로부터 유래된 돼지 기질 단백질, 하이알루론산, 또는 사체의 피부로부터 유래된 인간 ECM이다. 이들 제품은 보다 생리학적으로 동등한 환경을 형성함으로써 이익을 제공할 수 있지만, 어느 것도 완전히 인간의 것과 같지는 않고, 어린, 발생 중인 조직에서 발견되는 전체 범위의 기질 단백질을 포함하고 있지 않다. 생성된 hECM은 어린 건강한 조직에서 발견되는 것과 동일한 ECM 재료를 함유한다. 이는 또한 인간 세포의 활발한 증식과 세포의 신속한 내증식도 돕는 것으로 관찰되었다. 인간 피험체를 대상으로 하는 용도에서 hECM을 사용했을 때 명백히 관찰되는 여러 장점이 있다. 예를 들어, hECM은 신속한 숙주 세포 통합 및 치유 개선을 촉진한다(숙주 세포에 대한 일반 스캐폴드로서의 역할을 한 후, 리모델링한다). 추가로, hECM은 비인간 동물 및 인간 조직으로부터의 바이러스 감염(특히, 소 조직으로부터의 BSE 및 인간 조직으로부터의 TSE)과 관련된 우려를 해소한다. 추가로, 생물학적 제품, 특히, 인간 진피 및 대퇴 근막과 비교했을 때, hECM의 경우에는 일관된 제품 조성 및 성능이 관찰된다. 추가로, hECM은 합성 임플란트에 비해 숙주 조직의 침식을 감소시킨다.

실시예 9

의료 미용 용도를 위한, 인간 섬유아세포 유래의 저산소 조정 세포외 기질

안면 레이저 박피술 후의 hECM 국소 투여에 대한 이중 맹검 무작위 연구를 수행하였다. 이 연구에는 40∼60세의 피험자 41명이 참여하였다. 연구 그룹의 모든 구성원은 이전에 침습성 또는 최소 침습성 국소 수술을 받은 적이 없거나, 사전 12개월 내에 국소 노화 방지 치료를 받지 않았다. 레이저 수술은 풀 프랙셔널 레이저 박피술, 눈가, 입가 및 전체 안면 수술을 포함하였다. Palomar Starluz 550p 레이저를 사용하였다(1540 비박피성 및 2940 박피성). 피험자에게 14일 동안 위약 또는 국소용 hECM 조성물을 1일 1회씩(상이한 농도로) 투여하였다. 연구 평가 변수는 임상적 촬영(3회의 맹검 평가-피부과 전문의가 실시), 경피 수분 손실(TEWL), 펀치 생검, 및 홍반, 부종, 및 가피 형성 평가를 포함하였다.

비이클 대조군과 비교하였을 때, 10X 농도의 hECM 조성물이 증상을 임상적으로 가장 크게 개선시켰다(임상 연구 수행과는 관계가 없는 2명의 미용 피부과 전문의가 본 평가를 수행하였다). 그 결과를 도 6(홍반), 7(부종), 및 8(가피 형성)에 제시하였다. 사진 평가를 통해서도 중증 환자에서 3일, 7일 및 14일째 홍반 중증도가 감소한 것이 나타났다.

레이저 치료 후 3일, 7일 및 14일째 41명의 피험자 모두에 대해서 경피 수분 손실(TEWL) 값도 평가하였다. 그 결과를 도 9에 제시하였다. 비이클 대조군과 비교하였을 때, 3일째, 및 7일째 관찰되는 바와 같이, 10X 농도의 hECM 조성물이 각질층 장벽 기능을 개선시켰다. 7일째, hECM 조성물은 비이클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의적이다(p<0.05). 이 관찰 결과는 프랙셔널 레이저 박피술 후 7일째에 재상피화를 나타낸 피험자가 있었다는 사실과도 일치한다.

또한, 노화 방지(예를 들어, 주름 감소)를 위한 hECM 국소 투여에 대하여 이중 맹검 무작위 연구를 수행하였다. 이 연구에는 40∼65세의 피험자 26명이 참여하였다. 이 연구 그룹의 모든 구성원은 이전에 침습 또는 최소 침습 수술을 받은 경험이 없거나, 사전 12개월 이내에 국소 노화 방지 치료를 받은 경험이 없었다. 10주 동안 위약 또는 국소용 hECM 조성물을 1일 2회씩 피험자에게 투여하였다. 연구 평가 변수는 임상적 촬영(2명의 맹검 미용 피부과 전문의가 실시), 피부 수분 측정기-피부 보습, 피부 탄력 측정기-탄력성, 펀치 생검, 분자적 평가(EGIR: Epidermal Genetic Information Retrieval)를 포함하였다.

hECM 투여 10주 후, 색소침착이 더 완화되었고, 피부결이 더 매끄러워졌고, 피부톤이 더 고르게 되었고, 미세 주름 및 잔주름의 출현이 감소된 것이 안면부 사진 평가를 통해 확인되었다.

눈가 부위의 실리콘 레플리카를 사용하여 26명의 피험자 중 22명에 대한 3차원 형태 계측(프로필로메트리) 이미지 분석도 수행하였다. 이 분석을 수행하기 위해, 콜리메이트 광원이 레플리카 평면으로부터 25°각도로 향하게 하였다. 레플리카가 회전하여 탭 방향이 입사광 방향에 수직이 되거나 평행이 되게 정렬될 수 있도록, 레플리카의 탭 위치 방향을 고정시켜 주는 홀더에 레플리카를 놓았다. 탭 방향이 귀를 향하도록 하여 각각의 눈 부근의 눈가 주름으로부터 레플리카를 취하였다. 수직 샘플링 배향을 통해서는, 표정에 의한 큰 주름(눈가 주름)에 민감한 피부결을 측정하였다. 평행 샘플링 배향을 통해서는, 작은 잔주름에 민감한 피부결을 측정하였다. 이 결과를 도 10에 제시하였다.

안면 레이저 박피술 후의 hECM 국소 투여에 대한 이중 맹검 무작위 연구를 수행하였다. 이 연구에는 40∼60세의 피험자 49명이 참여하였다. 이 연구 그룹의 모든 구성원은 이전에 침습 수술 또는 최소 침습 수술을 받은 경험이 없거나, 사전 12개월 이내에 국소적인 노화 방지 치료를 받은 경험이 없었다. 레이저 수술은 풀 프랙셔널 레이저 박피술, 눈가, 입가 및 전체 안면 수술을 포함하였다. Palomar Starluz 550p 레이저를 이용하였다(1540 비박피성 및 2940 박피성). 피험자에게 14일 동안 위약 또는 국소용 hECM 조성물을 1일 2회씩 투여하였다. 연구 평가 변수는 임상적 촬영(3회의 맹검 평가-피부과 전문의가 실시), 멕사미터 및 피험자 평가를 포함하였다.

수술 후 1일, 3일, 5일, 7일 및 14일째 위약과 비교할 때 매 시점마다 홍반이 뚜렷이 감소한 것이 안면부 사진 평가를 통해 확인되었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 수술 후 페트롤라툼 사용 일수를 평가하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 홍반 등급화를 수행하였다. 도 13에는 박피성(2940) 및 비박피성(1540) 레이저 셋팅에 대한 멕사미터 결과가 도시된다.

연구 결과를 통해 hECM 함유 국소용 제제의 여러 유익한 특징들이 밝혀졌다. 그러한 유익한 이점으로는 1) 박피 후의 재상피화를 촉진한다는 점; 2) 비박피성 및 박피성 프랙셔널 레이저 박피 증상(예를 들어, 홍반, 부종, 가피 형성 및 감각기 통증)이 감소되었다는 점; 3) 피부결이 매끄러워지고, 고르게 되었다는 점; 4) 피부 보습을 제공한다는 점; 5) 잔주름/주름의 출현을 감소시킨다는 점; 6) 피부의 단단함과 유연성을 증가시킨다는 점; 7) 피부의 색소침착 장애를 감소시킨다는 점; 및 8) 붉은 부스럼 피부를 감소시킨다는 점을 포함한다.

실시예 10

모발 성장 촉진을 위한 세포외 기질 조성물의 사용

이 실시예는 ECM 조성물을 투여하는 것에 의한 모발 성장의 촉진을 예시한다.

임상전 안전성 및 효능 연구를 통해, 최소 독성 특성이 확인되었고, hECM 주사에 의해 모발 성장의 쥐과 동물 모델의 휴지기 모낭에서 성장기 유도가 촉진될 수 있다는 것이 시사되었기 때문에, 그 후, 인체에서의 제제의 활성을 평가하기 위한 파일럿 연구에 착수하였다. 이 임상 연구는 이중 맹검, 위약 효과 통제, 무작위로 선택된 단일 부위 임상 시험으로 온드라스의 산 페드로 술라에서 수행되었으며, 주로 hECM 제품의 임상 사용에 있어서의 안전성을 평가하도록 계획되었다. 이 연구의 2차적 목표는 제품의 임상 활성 또는 개념 증명("proof of concept")을 평가하는 것이었다. 또, 연구의 일부로서, hECM 주사 전의 두피에의 퍼터베이션/자극이 모발 성장에 임의의 상가적 효과를 제공하는지를 평가하였다. 3종의 상이한 퍼터베이션 장치가 선택되었다: 1) 미세박피술(MegaPeel^TM, DermaMed Intl, Inc., Lenni, PA); 2) 비박피성 1540 및 박피성 2940 에르븀 레이저의 중복 통과(Palomar Medical Technologies, Inc., Burlington, MA); 및 3) Revage670^TM에 의한 저에너지 광 치료(Low Level Light Therapy)에 의한 자극(Apira Science Inc., Newport Beach, CA). 선택된 연구 참여자들을 이러한 3 가지의 퍼터베이션 방법 중 하나에 무작위로 할당하였다. 이 연구에서는 2종의 hECM 제제를 평가하였다: 10배 농축된 무혈청 제제 및 제2의 비농축 소 혈청 함유 제제. 이들 연구에서 사용된 hECM 중의 Wnt 단백질의 존재는 Wnt7a 단백질을 인식하는 1차 항체(Santa Cruz Biologicals, CA)를 사용하여 면역블롯 분석으로 평가하였다. 시험관내에서의 인간 표피 각질 세포의 β-카테닌의 핵내 전좌를 보여줌으로써 hECM의 정규형(canonical) Wnt 생체활성을 확인하였다. LiCl을 양성 대조군으로서 사용하였으며(데이터는 제시하지 않음), Wnt 수용체 길항제 DKK-1 존재 하에서의 비이클 또는 hECM을 사용한 처리는 β-카테닌 전좌를 유발하지 않았다. hECM 용액은 ELISA에 의해 확인된 바와 같이 또한 VEGF 및 KGF를 포함하였다.

사전 동의를 얻은 후, 18∼55세의 건강한 피험자 26명을 등록하였다. 포함 기준은 Fitzpatrick 점수 I∼IV, 남성형 탈모에 대한 노우드/해밀턴 분류(Norwood/Hamilton Classification) 4∼6 및 이전의 모발 치료 또는 면역 손상 병력의 부재를 포함하였다. 각 피험자 두피의 치료 부위를 전방부 2곳과 후방부 2곳의 4곳으로 하였다. 각각의 치료 부위는 그 주변부에 문신으로 표시하였다. 주사 전 퍼터베이션 없이 후방부 2곳을 무작위로 선택하여 2종의 hECM 제제 또는 위약(비조정 배지) 중 하나를 주사하였다. 전방부 처리 부위는 상기에 언급된 3종의 치료 중 하나를 이용하여 퍼터베이션한 직후, 역시 오른쪽/왼쪽을 무작위로 선택하여 hECM 또는 위약을 주사하였다. 모든 환자에 대해, 0일째, 각 부위의 4곳에 균등하게 0.1 cc를 피내 주사하였다.

시점 0, 12주째 및 22주째, 조사자의 포괄적 평가, 확대 사진술에 의한 모발수 측정 및 피험자의 자체 평가를 함께 수행하였다. 6명의 환자에 대해, 베이스라인 및 22주 내원 후 48시간째 펀치 생검(4 mm)을 행하여 조직병리학적 평가에 사용하였다. 또한, 염증, 발적, 부종, 소양감, 작열감, 팽윤 및 임의의 다른 부작용에 대해 매 시점에 임상의가 시각적으로 검사하여 안전성 결과를 측정하였다. 포괄적 평가와 확대 사진술 결과는 발적, 팽윤 및 내증식 모발을 비롯한 임의의 관찰 가능한 부작용에 대해 다른 피부과 전문의가 재검토하였다. 치료의 생물학적 효과와 임상적 효과는 성장기:휴지기 비, 모발 직경, 모발 밀도, 모발 두께, 및 연모 및 경모 모발수에 대해 TrichoScan 확대 사진술 이미지 수집 및 분석을 통해 평가하였다. 조사자는 국부적 모발 성장의 시각적 개선을 확인하기 위해 등급화 시스템을 이용하였다.

이 연구의 1차적 목적은 인간 피험자에 있어서의 hECM 투여의 임상적 안전성을 평가하는 것이었다. 모든 환자들이 수술을 잘 견뎠고, 어떠한 피험자에게서도 유의적인 불평, 임상적 증상 또는 부작용의 징후가 보고되지 않았다. 처리 후 22주째 채취한 처리 부위 생검의 조직병리학적 평가는 주사 부위에 최소 내지 약간의 염증이 있었음을 보여주었고, 비정상적인 형태, 과오종 또는 다른 병리학적 반응은 관찰되지 않았다. 이러한 관찰로부터, hECM의 1회의 피내 주사는 연구 진행 과정 동안 임의의 유의적인 독성, 병리학적 증상 또는 다른 부작용을 유발하지 않았다는 결론을 내린다.

모발 성장에 대한 hECM의 임상적 효과를 평가하기 위한 2차적 목적은 Trichoscan 이미지 분석에 의해 수행하였다. 달리 언급하지 않는다면 결과는 그룹 평균±SEM으로서 나타낸다. 0일째의 치료 부위의 등가성은 일원 ANOVA를 이용하여 측정하였다. 치료 후 0일째, 12주째 및 22주째의 처리 그룹 내의 그룹 평균 간 후속적 차이는 비대응(반복 측정) 양측 스튜던츠 t-검정을 이용하여 평가하였다. 그룹 평균 간의 다른 모든 차이는 비대응 양측 스튜던츠 t-검정을 이용하여 평가하였다. 통계적 유의성은 α= 0.05의 수준으로 설정하였다. 0일째의, 표시된 처리 및 비처리 부위 간의 모발 성장 인디케이터 측정치의 처리 전 그룹 평균의 비교는 통계적으로 유의한 차이가 없음을 나타내었다. 따라서, 투여 후 12주 또는 22주째의 후속 성장 차이는 실험적 치료의 결과인 것으로 추론할 수 있다.

12주 및 22주째의 위약 처리 부위(n=12)의 Trichoscan 이미지 분석은 측정된 모발 성장 인디케이터 어느 것에서도 유의적인 개선을 보이지 않았다. 또한, 혈청 함유 hECM 제제에 대해서도 유의적인 효과가 관찰되지 않았다. 그러나, 초기의 12주의 평가 기간 동안에는, 더 높은 농도의 무혈청 hECM 제제 처리 부위(n=13)가 연모 밀도를 제외한 모든 모발 성장 인디케이터의 증가를 보였으며, 연모 밀도는 연구 기간 동안 변화하지 않았다(도 1d 및 1e). hECM 투여 전의 퍼터베이션은 무혈청 hECM만 투여한 경우보다 성장 증대를 유발하지 않았다. 12주째, hECM 처리 부위에서, 모간 두께(p<0.05), 모발 두께 밀도(p<0.05) 및 경모수(p<0.005)에 있어서 0일째 값으로부터 통계적으로 유의적인 증가가 관찰되었다(도 27). hECM 처리에 의해 유발된 개선은 모간 두께(6.3%±2.5% vs. -0.63%±2.1%; p<0.05), 두께 밀도(12.8%±4.5% vs. -0.2%±2.9%; p<0.05) 및 경모 밀도(20.6±4.9% vs. 4.4±4.9%; p<0.05)에 있어서 위약 처리 부위보다 유의적으로 더 컸다. 한 피험자는 hECM을 1회 주사한 후 3개월째 총 모발수에 있어서 22.4% 증가를, 경모수에 있어서 27.8% 증가를 보였다. 22주째에도 유사한 경향이 관찰되었지만, 피험자의 추가적인 성장 개선이 없었기 때문에 유의성이 상실되었다. 이러한 결과들은 hECM의 1회 피내 투여가 남성형 탈모가 있는 피험자에게서 모발 성장을 유의적으로 개선시켰음을 입증한다.

이러한 인체를 대상으로 한 1차 임상 시험은 섬유아세포가 분비한 hECM 단백질 제제의 안전성을 입증하고 발모에 있어서 초기 효능이 있음을 나타낸다. 저산소 조건 하에서 배양한 섬유아세포에 의해 생성된 hECM 단백질은 모발 주기 조절에 있어서 중요한 인자들을 포함한다. 세포 계통의 측면에서, 섬유아세포는 모유두 세포의 친세포이다. 시험관내 연구에서 Wnt 단백질, VEGF, FGF, KGF 및 폴리스타틴의 존재가 또한 확인되었다. Wnt 단백질의 역할은 모발 성장 개시에서 중요한 역할을 하여 모낭에 있어서 중요한 것으로 확립되어 있다. 또한, Wnt 활성은, 휴지기의 후기 단계에, 모발 성장의 다음 성장기를 개시시키는 각질 세포로부터의 모아의 형성에 필요한 유전자 발현 및 세포의 활성화를 개시하여, 모발 주기에 있어서 중요하다. 따라서, hECM의 전달에 의해 유발된 모발 재성장의 촉진은 적어도 부분적으로 Wnt 활성에 기인하는 것으로 예상된다.

hECM의 1회 주사에 의해 관찰된 효능 결과는 발모 치료에 있어서 새로운 접근법을 제시한다. FDA가 승인한 치료제인 미녹시딜(minoxidil)(예를 들어, Rogaine^TM) 및 피나스테라이드(finasteride)(예를 들어, Propecia^TM)는 효능을 유발하여 지속시키려면 매일 사용해야 한다. 구체적으로, 이들 제품은 탈모 감소에 가장 큰 효능을 보이며, 4개월 이상 매일 사용한 후 새로운 모발 성장은 적은 비율로만 관찰된다. 이와는 대조적으로, hECM의 1회 주사는 새로운 경모의 통계적으로 유의적인 성장과 모발 밀도 및 두께의 증가를 유도하였다. 모발 성장에 관련된 메커니즘은, 연구자들이 진피 유두 관련 줄기 세포를 자극함에 있어서의 Wnt 단백질과 상처 성장 인자의 기본적인 중요성을 입증한 것과 같이 지난 십년 동안 연구되어 오고 있다. 이러한 임상적 파일럿 연구는 Wnt 단백질 및 상처 성장 인자를 함유하는 제제가 인체에서 새로운 모발의 생성에 생물학적 활성 자극 효과를 제공한다는 것을 첫 번째로 입증한 것이다.

실시예 11

배아 ECM으로 코팅된 정합성 폴리에틸렌 테레프탈레이트 보철의 제조

폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)와 같은 현재 임상적으로 이용이 가능한 합성 혈관 그래프트는 혈전증 및 내막증식으로 인해 소직경 혈관 치환술에 사용될 경우에는 종종 실패하는 문제가 있다. 이러한 실패는 포화 상태의 내피세포 단층의 부족과 혈관 그래프트와 주변 조직 사이의 부정합성에 기인한다. 천연 혈관 ECM의 특성을 모방하는 단백질을 포함하고 배아 조건 하에 생성된 인간 세포외 기질(hECM)을 포함하는, 생체역학적으로 정합성인 소직경(1.5 mm)의 부직포 PET 섬유 구조체를 제조하였다. hECM 단백질을 딥 코팅 및 공유 표면 아미노 그래프팅 폴리(비닐 아민)(PVA) 방법을 통해 부직포 PET 섬유 구조체에 코팅하여, 그래프트 실패의 주된 원인을 해소하였다. hECM 단백질은 PET에 가교결합되지 않아, 내피세포에 대한 세포 결합 도메인으로서의 RGD 및 CS5 표면 노출을 허용하였다. 이전의 연구를 통해, hECM 딥 코팅 폴리프로필렌 중합체가 랫트에 이식될 때 염증 반응을 감소시킨다는 것이 확인되었다. 또한, 이전의 연구를 통해, 본 발명자들은, 내피세포(EC) 및 평활근 세포(SMC) 성장, 표현형 및 전단 응력 조건 하에서의 유지력에 대해 부직포 PET 섬유 스캐폴드 직경 및 공극을 최적화함과 동시에, 소직경 대동맥을 모방하는 부직포 PET 섬유 구조체의 기계적 거동을 최적화하였다. 이 연구는, PET 스캐폴드에 대한 hECM 코팅의 결합력, 투여량 및 균일성을 조사한다.

하기 방법을 이용하였다. 순수(neat) PET(Dupont, Wilmington, DE)를 사용하여, 멜트 블로잉법을 이용하여 평균 섬유 직경 50 ㎛로 부직포 PET 섬유를 제조하였고, 개개의 PET 섬유 층의 병치(0°/90°)를 이용하여 3D 구조를 제작하였다. 교반형 생물반응기에서 덱스트란 미소구 상에서 신생아 진피 섬유아세포를 8주 동안 배양함으로써 배아 조건 하에 hECM을 제조하였다. 먼저 10% 송아지 혈청 함유 배지에서 4주 동안 배양한 후 무혈청 배지 배양으로 전환하였다. 부직포 PET 혈관 스캐폴드에의 hECM의 첨가는, 0.1 M NaOH, 0.1 M KCl, 750 mM PVA-HCl(Polysciences, USA), 400 ㎕의 1,4-디옥산에 의해 아미노 변성시키고, 그 후, 초음파 처리하고, 24시간 열 처리함으로써 수행하였다. 달리 언급하지 않는다면 시약은 캐나다의 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. 그 후, 부직포 PET 섬유 구조체(아미노화 및 비처리)를 4℃에서 hECM(PBS에 희석된 0.1 mg/ml∼0.6 mg/ml)에 밤새 침지하였다. 비공유 결합을 줄이기 위해, 10분 초음파 처리 주기로 샘플을 PBS로 3회 세척하였다. 부직포 PET 섬유 구조체의 hECM 커버율은 1) 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광분석법, 2) 주사 전자 현미경법(SEM) 및 집중적 화학 식별을 위한 에너지 분산(EDX) 스펙트럼, 3) 수적법에 의한 친수성 측정(Video Contact Angle 2000), 및 4) X선 광전자 분광분석법(XPS)에 의해 화학적으로 확인하였다. 또한, hECM 코팅을, 공초점 현미경(LSCM, Leica, Germany) 상에서, hECM에 로다민 B 이소시아네이트(RBITC)를 형광 결합함으로써 시각화하였다. hECM 코팅의 투여량은 hECM 코팅을 트립신 처리하여 마이크로 BCA 단백질 분석(Pierce Chemical Co, IL)으로 정량함으로써 정량하였다.

FTIR 연구는, 아미노화 부직포 PET 섬유 상의 hECM 코팅 농도를 증가시키는 것으로부터 발생하는 3개의 주요 피크의 출현을 보여 주었다: 1522 cm^-1(아미드 II sN-H 및 mC-N), 1656 cm^-1(아미드 I, sC=O) 및 3320 cm^-1(sNH) 밴드(도 28). FTIR 결과는, 0.6 mg/ml의 hECM 용액을 사용할 경우, 아미노화 PET 섬유의 최고 hECM 커버율이 얻어진다는 것을 제시한다. 비아미노화 PET 섬유의 경우 반대의 경향이 관찰되었는데, 이 경우에는 저 hECM 농도(0.1 mg/ml∼0.2 mg/ml)에서 작은 hECM 피크만이 출현하였다.

SEM 및 RBITC 형광 현미경 사진은, 아미노화 PET 섬유 상의 hECM 농도가 최고일 때(0.6 mg/ml) 균일한 hECM 커버율(hECM이 PET 표면 상에 명백히 관찰됨)이 얻어진다는 것을 보여주었으며, 이는 FTIR 경향을 뒷받침하는 것이다. 반면에, FTIR에서도 관찰되는 바와 같이, hECM 농도가 낮을 때(0.2 mg/ml 이하) 비처리 PET 섬유에 가장 잘 부착하였다. 마이크로 BSA 분석에 의하면, 비처리 PET 섬유에 비해 아미노화된 섬유 상에서 hECM 유지율을 2배 이상 더 높은 것으로 나타났다(각각 0.1 mg/cm² 및 0.04 mg/cm²). 마지막으로, PET의 접촉각(75°)은 PET 아미노화에 따라 감소하여(45°), 0.6 mg/ml의 hECM의 고정화에 의해 추가로 32°로 감소하였다.

PVA 아미노화 부직포 혈관 PET 섬유 구조체 상의 hECM 코팅은 PET 구조체에 세포 결합 hECM을 가교결합시키지 않는 고밀도 hECM 코팅법임을 입증하였다.

실시예 12

소직경 혈관 그래프트 상에 코팅된 배아 ECM

비코팅 및 hECM 코팅 PET 혈관 스캐폴드 상에서의 인간 대동맥 내피 세포(HAoEC)의 유지율을 동맥류 및 정맥류 파형 및 박동성을 재현하는 유로 내에서의 박동류 전단 응력에 노출한 후 평가하였다.

멜트 블로잉법으로 부직포 PET 섬유 스캐폴드를 제조하였다. hECM을 갖는 PET 섬유의 작용기화는 폴리(비닐 아민)을 사용하여 수행하였다. HAoEC를 비코팅 및 hECM 코팅 PET 혈관 스캐폴드 둘 다에 시딩하여(2.0×10⁵/cm²), 3일 동안 정적으로 함께 인큐베이션한 후, 동맥류(전단 속도 300 s-1) 및 정맥류(전단 속도 100 s-1) 조건 하에서의 생리학적 박동류 파형을 모의하는 혈관 유동계로 옮겼다. 인큐베이션 후, SEM 관찰, 알라마 블루(Alamar Blue) 생존력 분석, 및 Alexa Fluor 488(F-액틴) 표지화를 통한 형광 HAoEC 시각화에 의해 세포 유지율을 분석하였다.

동맥 전단 응력 조건과 정맥 전단 응력 조건 둘 다에 노출된 후 비코팅 PET 혈관 스캐폴드와 비교할 때 hECM 코팅 PET 혈관 스캐폴드에서 세포 손실의 상당한 감소가 관찰되었다. 동맥류 하에서 1시간 후 hECM 코팅 PET 혈관 스캐폴드 상에서 유지된 세포수는 비코팅 스캐폴드 상에서 유지된 것보다 3배 더 높았다(유지율 약 85%). 동맥류 1시간 후에 hECM 코팅 그래프트 상에서 HAoEC 유지율이 현저히 더 높다는 유사한 결과가 관찰되었다. 동맥 전단 조건과 정맥 전단 조건에 노출된 후 hECM 코팅 PET 혈관 스캐폴드 상에서 세포 유지율이 더 높다는 이러한 경향은 대사 활성(Alamar Blue 세포 생존력 분석으로 측정)과 세포수(SEM 현미경 사진으로 카운팅) 둘 다 3배 증가한 것에 의해서도 확인되었다.

RGD 결합 도메인을 가교결합시키지 않는, 고밀도 hECM 코팅법에 의한 PET 소직경(1.5 mm) 그래프트의 작용기화는 생리학적으로 모의된 시험관내 전단력에 대한 HAoEC의 저항력을 효율적으로 증대시켰다.

실시예 13

hECM에 의한 중합체 코팅은 생체적합성을 유의적으로 개선시킨다

배아 조건 하에서 생성된 인간 ECM을 사용하여 중합체 스캐폴드를 코팅하여 생체내 테스트 또는 생체적합성 테스트를 하였다. hECM은 교반형 생물반응기에서 덱스트란 미소구 상에서 배양한 신생아 진피 섬유아세포에 의해 생성되었다. 나일론, 폴리프로필렌(PPE) 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 부직포 스캐폴드에 ECM 코팅을 하였다. hECM을 글루타르알데하이드, "딥앤드라이(dip & dry)", UVA, 아세트산 에치, 폴리(비닐 아민)(PVA) 및 설포 산파(Sulfo Sanphah)를 이용하여 중합체 스캐폴드에 커플링하였다. 다양한 hECM 코팅을 푸리에 변환 적외선(FTIR) 및 에너지 분산(EDX) 스펙트럼을 이용하여 분석하고, 주사 전자 현미경(SEM) 및 면역형광법을 이용하여 시각화하였다. 그 후, 최상의 ECM 코팅 및 비코팅 스캐폴드를 SCID 마우스의 피하 공간에 외과 수술로 이식하였다. 절제된 임플란트의 조직학적 샘플을 염증 반응, 세포 침윤, 이물 거대 세포 및 피막 형성에 대해 평가하였다.

FTIR 결과는, 0.6 mg/ml의 ECM 용액으로부터 PVA 및 UVA 기법에 의해 최고의 ECM 커버율을 얻을 수 있음을 시사한다. 높은 ECM 용액 밀도는 중합체 표면 활성화 아민 기를 통한 ECM에 의한 완전한 중합체 커버율을 시사한다. 완전한 ECM 커버율은 생리학적 환경으로부터 중합체를 "감춘다"는 점에서 요망되었다. 이러한 경향은 균질하고 조밀한 ECM이 관찰된 SEM 및 형광 현미경 사진에 의해 확인되었다.

ECM 코팅 및 비코팅 스캐폴드에 시딩된 인간 대동맥 내피 세포(HAoEC)를 알라마 블루 분석으로 세포 증식에 대해 분석하였다. 일반적으로, 가장 높은 ECM 커버율을 보인 재료(FTIR 및 SEM 하에)가 역시 세포에 더 효율적으로 결합하여 세포 증식의 2배 증가를 지지하였다.

마지막으로, 피하 이식된 ECM 코팅 스캐폴드(PET, PPE 및 나일론 중합체 스캐폴드)는 비코팅 스캐폴드에 비해 면역 세포 침윤 및 이물 거대 세포 형성의 현저한 감소를 입증하였다. 추가로, 비코팅 대조군과 비교할 때 ECM 코팅된 다양한 중합체에 대해서도 개선된 콜라겐 피막 형성 및 조직 통합의 개선이 관찰되었다.

본 발명을 전술한 실시예를 참조하여 설명하였으나, 본 발명의 정신 및 범위 내에 변경 및 수정이 포함된다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 이하의 특허청구범위에 의해서만 한정된다.

Claims (63)

1∼5% 산소인 저산소 조건 하에 적합한 증식 배지에서, 메쉬를 포함하는 3차원 또는 비드를 포함하는 2차원인 표면상에 섬유아세포를 배양하여 다능성 줄기 세포를 생산하는 것을 포함하는 1종 이상의 배아 단백질을 포함하는 조성물의 제조 방법으로서, 상기 다능성 줄기 세포는 1종 이상의 배아 단백질을 포함하는 가용성 및 불용성 조성물을 생산하고, 상기 조성물은 모발 성장의 자극, 세포의 수복 또는 재생, 피부 표면의 개선 또는 연조직 수복 또는 증강을 촉진하는 것인 방법.

제1항에 있어서, 상기 증식 배지가 혈청을 포함하는 것인 제조 방법.

제1항에 있어서, 상기 증식 배지가 무혈청인 제조 방법.

삭제

제1항에 있어서, 15∼20% 산소의 산소 조건에서 제조된 배지와 비교하여 콜라겐 종이 상향 조절되는 것인 제조 방법.

제5항에 있어서, 상기 콜라겐이 V형 알파 1; IX형 알파 1; IX형 알파 2; VI형 알파 2; VIII형 알파 1; IV형 알파 5; VII형 알파 1; XVIII형 알파 1; 또는 XII형 알파 1로부터 선택되는 것인 제조 방법.

제1항에 있어서, 15∼20% 산소의 산소 조건에서 제조된 배지와 비교하여 Wnt 종이 상향 조절되는 것인 제조 방법.

제7항에 있어서, 상기 Wnt 종이 wnt 7a 및 wnt 11인 제조 방법.

제1항에 있어서, 15∼20% 산소의 산소 조건에서 제조된 배지와 비교하여 라미닌 종이 상향 조절되는 것인 제조 방법.

제9항에 있어서, 상기 라미닌 종이 라미닌 8인 제조 방법.

제1항에 있어서, 무세포 상청액을 투석하고, 동결건조시키고, 완충액 중에서 재구성하는 것인 제조 방법.

제1항에 있어서, 무세포 상청액을 투석하고, 건조시키고(desiccate), 완충액 중에서 재구성하는 것인 제조 방법.

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제1항에 있어서, 상기 섬유아세포가 신생아 섬유아세포인 제조 방법.

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제1항에 있어서, 상기 세포가 종 특이적인 것인 제조 방법.

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제1항의 방법에 의해 제조된 조성물을 포함하는, 피험체로의 디바이스의 이식과 관련하여 사용되는 표면 코팅제.

제32항에 있어서, 상기 디바이스가 심박조율기, 스텐트, 스텐트 그래프트, 혈관 보철, 심장 판막, 션트, 약물 전달 포트, 카테터 또는 패치인 코팅제.

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제1항의 방법에 의해 제조된 조성물을 포함하는 세포 전달 또는 전달 부위에서의 유지를 위한 생물학적 비이클.

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