DE602004010307T2

DE602004010307T2 - Verwendung von polysulfatiertem alginat in zellmatrix

Info

Publication number: DE602004010307T2
Application number: DE602004010307T
Authority: DE
Inventors: August Verbruggen; Eric Veys
Original assignee: Universiteit Gent
Current assignee: Universiteit Gent
Priority date: 2003-12-02
Filing date: 2004-12-02
Publication date: 2008-09-25
Anticipated expiration: 2024-12-03
Also published as: DE602004010307D1; WO2005054446A3; US7988962B2; EP1711595B1; ES2297516T3; WO2005054446A2; US20070128173A1; EP1711595A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Matrizen, insbesondere Matrizen zur Verwendung bei der Reparatur osteochondraler Defekte sowie pharmazeutische Produkte, die diese Matrizen umfassen.
Hintergrund
Die therapeutische Verwendung von polysulfatierten Polysacchariden wurde in den letzten fünfzehn Jahren ausführlich untersucht. Durch Sulfatierung ihrer Hydroxylgruppen werden Polysacchariden besonders interessante biologische Aktivitäten verliehen.
Es wurde gezeigt, dass polysulfatierte Cyclodextrine die Wirkungen teratogener Substanzen auf die fötale Entwicklung vermindern oder blockieren ( WO 91/16905 ), die Bildung von Narbengewebe verbessern ( WO 93/09790 ), die Replikation von Retroviren (HIV) beeinträchtigen ( EP 447171 ) und die Angiogenese hemmen ( WO 89/06536 ).
Es wurde gezeigt, dass polysulfatiertes Inulin ein wirksamer Inhibitor des Komplementsystems ist ( US Patent Nr. 4,021,545 ; Immunol. 1965, 8: 29; Pharmacology 1973, 9: 74) und antilipämische Eigenschaften besitzt (Arch. Int. Pharmacodyn. 1954, XCIX: 334).
Es wurde gezeigt, dass Alginsäuresulfat gerinnungshemmende Eigenschaften besitzt ( US Patent Nr. 3,766,167 und Nr. 4,331,697 ) und es wurde als eine antithrombische Harzzusammensetzung in Kombination mit synthetischen Harzen vorgeschlagen ( US Patent Nr. 4,822,615 ). Es wurde gezeigt, dass Alginsäuresulfat Retroviren hemmt und es wurde als eine Substanz zur topischen Reinigung des menschlichen Körpers ( US Patent Nr. 5,100,879 ) und als ein Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen (T-Zellinfektionen), die von Retroviren verursacht werden ( US Patent Nr. 4,840,941 ), vorgeschlagen.
Sulfatierte Pektinsäure wurde als nicht-resorbierbares, synthetisches, sulfatiertes Polysaccharid zur Senkung der Absorption von Cholesterin und Fettsäuren verwendet ( US Patent Nr. 5,616,570 und 5,063,210 ) und es wurde gefunden, dass sie die pankreatische Cholesterinesterase hemmt ( US Patent Nr. 5,484,777 ).
Es wurde gefunden, dass polysulfatierte Glycosaminoglykane, wie beispielsweise Chondroitinpolysulfat, die Produktion von Makromolekülen aus der extrazellulären Matrix (Hyaluronan, Chondroitinsulfatproteoglykan) mit Hilfe von Bindegewebszellen (synoviale Zellen, Fibroblasten, Gelenkknorpelzellen) stimuliert (Acta Rheumatol. 1977, 1: 75; J. Rheumatol. 1979, 6: 554; J. Rheumatol. 1999, 26: 1663).
Chondrozyten sind nicht in der Lage, endochondrale Läsionen des Gelenkknorpels zu reparieren und diese Läsionen führen unweigerlich zu der Entwicklung von Osteoarthritis. Mit begrenztem Erfolg wurden Versuche zur Reparatur enchondraler Läsionen des Gelenkknorpels durch Implantation von humanen autologen Chondrozyten vorgeschlagen (N. Engl. J. Med. 1994, 331: 889). Es wurde gezeigt, dass die Implantation von humanen Chondrozyten in biokompatiblen und biologisch abbaubaren Hydrogel-Transplantaten die Möglichkeiten, diese Gelenkknorpelläsionen zu heilen, verbessert (PNAS 2002, 99: 9996–10001; Ann. NY Acad. Sci., 2002, 961: 118–122).
Kürzlich wurde die Technik einer Chondrozytenkultur in Alginatkügelchen, die durch Fibringel miteinander verklebt wurden, beschrieben (Ann. Rheum. Dis. 2001, 60 781–790). Unter dieser Kultivierungsbedingung besiedeln die Chondrozyten das gesamte Alginat/Fibrinhydrogel und bilden ein hyalinartiges Knorpelgewebe aus.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung basiert auf der Beobachtung, dass polysulfatiertes Alginat, wenn es in einer Matrix vorhanden ist, mit Hilfe der Bindegewebszellen eine günstige Wirkung auf die Proliferation und die Produktion der Bestandteile einer extrazellullären Matrix hat. Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung von polysulfatiertem Alginat als ein Matrix-Bestandteil zur Behandlung oder Prophylaxe osteochondraler Defekte.
Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft eine Matrix, die polysulfatierte Alginate zur Verwendung bei der Reparatur osteochondraler Defekte umfasst. Die Matrix kann zudem ein oder mehrere andere Bestandteile, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, Gelierungsmittel, Nährstoffe und Antibiotika umfassen. Insbesondere kann die Matrix ferner eine chemotaktische Substanz umfassen, die Bindegewebszellen zu der Matrix hin anzieht.
Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Matrix, die polysulfatierte Alginate umfasst und ferner ein nicht-sulfatiertes Polysaccharidgel umfasst. In einer spezielleren Ausführungsform ist das nicht-sulfatierte Polysaccharid Alginat. Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung betreffen eine Matrix, die ein Alginatgel umfasst und ferner zwischen ungefähr 0,5 mg und 100 mg polysulfatiertes Alginat/Gramm nicht-sulfatiertes Alginat umfasst.
Zudem wurde beobachtet, dass künstliche Matrizen, die polysulfatiertes Alginat umfassen, für die Kultur von Zellen, insbesondere von menschlichen Gelenkknorpelzellen, geeignet sind. Des Weiteren induziert die Gegenwart von polysulfatiertem Alginat in der künstlichen Matrix größtenteils die Produktion der EZM-Bestandteile mit Hilfe der Chondrozyten.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher die Verwendung von polysulfatiertem Alginat als ein Matrixbestandteil für die Kultivierung oder als ein Träger für menschliche oder tierische Zellen, im Besonderen Bindegewebszellen oder deren Vorläufern, insbesondere osteochondrale Zellen. Polysulfatiertes Alginat ist besonders als Matrixbestandteil für chondrogene Zellen, insbesondere Gelenkknorpelzellen (Chondrozyten) nützlich.
Eine bestimmte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von polysulfatiertem Alginat als Matrixbestandteil für menschliche oder tierische Zellen, die in den menschlichen oder tierischen Körper implantiert werden sollen. Polysulfatiertes Alginat ist im Besonderen in Matrizen für Zellen, die im Zusammenhang mit der Reparatur oder dem Remodelling des tierischen oder menschlichen Körpers implantiert werden sollen, von Nutzen.
Ein bestimmter Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von polysulfatiertem Alginat als Matrixbestandteil und/oder Träger für menschliche oder tierische Zellen, die in Zusammenhang mit der Reparatur eines osteochondralen Defekts in den menschlichen oder tierischen Körper implantiert werden sollen. Osteochondrale Zellen, die in diese künstliche Matrizen, die polysulfatierte Alginate umfassen, eingebettet sind, sind bei der Reparatur von Hautläsionen des osteoarthritischen Knorpels nützlich.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein in vitro-Verfahren für die Kultivierung von Bindegewebszellen oder deren Vorläufern (mesenchymale Stammzellen), das den Schritt des In-Kontakt-Bringens dieser Zellen mit einer Matrix, die polysulfatiertes Alginat umfasst, umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein in vitro-Verfahren zum Stimulieren der Aggrecansynthese mit Hilfe von osteochondralen Zellen oder Progenitorzellen, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen dieser Zellen mit polysulfatiertem Alginat umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Matrix enthält, die polysulfatiertes Alginat zur Verwendung bei der Reparatur osteochondraler Defekte umfasst. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ferner andere Bestandteile, wie beispielsweise Bindegewebszellen oder deren Vorläufer, wie zum Beispiel mesenchymale Stammzellen, aber im Besonderen osteochondrale Zellen, ganz besonders chondrogene Zellen, umfassen.
Polysulfatiertes Alginat kann als steriles und endotoxinfreies, benutzfertiges, injizierbares Gel für die Transplantation tierischer oder menschlicher Gelenk-Chondrozyten oder anderer tierischer oder menschlicher Bindegewebszellen geliefert werden.
Gemäß einer bestimmten Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung eine Matrix, die eine Konzentration an polysulfatiertem Alginat in dem Bereich von zwischen ungefähr 100 ng/ml bis ungefähr 500 μg/ml umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung von polysulfatiertem Alginat zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von osteochondralen Defekten. Im Besonderen liegt das Arzneimittel in Form einer Matrix vor, die andere Bestandteile, wie beispielsweise Bindegewebszellen oder deren Vorläufer, umfassen kann.
Ausführliche Beschreibung
Alginsäure ist ein lineares Heteropolysaccharid, das in der Natur in Seetang und einigen Bakterien vorkommt. Es ist ein Blockcopolymer aus sich wiederholenden Einheiten von β(1-4)D-Mannuronsäure (M) und α(1-4)L-Guluronsäure (G). ,Alginat(e)' wie es (sie) hierin verwendet wird (werden), bezieht (beziehen) sich auf ein oder mehrere Salze (und/oder Ester) dieses Polysaccharids. Der Anteil sowie die Verteilung der beiden Monomere bestimmt in hohem Maße die physiochemischen Eigenschaften des Alginats. Die M- und G-Reste sind in blockartiger Weise miteinander verbunden. Dies impliziert, dass drei Arten von Blöcken zu finden sind, homopolymere M-Blöcke (M-M-M), homopolymere G-Blöcke (G-G-G) und heteropolymere, sich nacheinander abwechselnde MG-Blöcke (G-M-G-M). Mit den meisten di- und multivalenten Kationen bildet Alginat Gele aus. Monovalente Kationen und Mg²⁺- Ionen induzieren keine Gelbildung, wohingegen Ionen wie Ba²⁺ und Sr²⁺ stärkere Alginatgele als Ca² ⁺erzeugen werden. Die Stärke des Gels wird von dem Gehalt an Guluronsäure und ebenso von der durchschnittlichen Anzahl an G-Einheiten in den G-Blöcken abhängen. Je nachdem ob eine steifere oder biegsame Struktur gewünscht wird, kann daher die Zusammensetzung der Alginsäure oder der Alginate angepasst werden. Modifikationen der Polysaccharide, die durch Derivatisierung der funktionellen OH-Gruppen erhalten werden, wurden in der Wissenschaft beschrieben. Deshalb schließt der Begriff ,Alginat' Alginatderivate, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, dialdehydisches Alginat, Carboxamidalginsäurederivate (wie beispielsweise 6-O-[(N-2-Desoxy-D-glucose)]carboxamidalginat), Methylaminalginsäurederivate (wie beispielsweise 6-Methylaminalginsäure; 2,3-Di(methylamin)alginsäurederivate), Diaminalginsäurederivate (wie beispielsweise 2,3-Di(amin)alginsäure, Dodecandiaminalginsäurederivate, 6-Hexandiaminalginsäurederivate, 2,3-Di(hexandiamin)alginsäurederivate), e-N-Maleimidopropionatalginat; N-Morpholinoalginamid, Poly(ethylenglycol)alginat, Succinimidylalginat, Alginatthioethylamin und Alginatthiocarbohydrazid, ein.
Polysulfatiertes Alginat kann unter Verwenden von Chlorsulfonsäure als Sulfatierungsmittel für Alginsäure und unter Befolgen des von T. Astrup et al. (Acta Phys. Scand., 1944, 8: 215–226) beschriebenen Verfahrens, so wie es hierin beschrieben ist, aus Alginsäure erhalten werden. Es soll jedoch verstanden werden, dass die Verwendung von polysulfatiertem Alginat, das mit einem beliebigen Herstellungsverfahren erhalten wurde, im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ins Auge gefasst wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von polysulfatiertem Alginat in einer Matrix für menschliche oder tierische Zellen. Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird polysulfatiertes Alginat daher als Matrixbestandteil verwendet.
Die Matrix für eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung ist für menschliche und/oder tierische Zellen geeignet. Das bedeutet, dass die Matrix diejenigen physikochemischen Eigenschaften haben sollte, die zulassen, dass tierische und/oder menschliche Zellen überleben und, wenn es geeignet ist, sich in der Matrix vermehren. Wie sie hierin verwendet wird, wird sich eine ,Kultivierung' entweder auf das Aufrecherhalten der Zellen in einem lebensfähigen Zustand (z. B. wie in einer Trägerfunktion) und/oder die aktive Stimulation einer Vermehrung (z. B. durch wiederholtes Passagieren) der Zellen beziehen.
Die erfindungsgemäße Matrix ist daher insbesondere eine pharmakologisch und biologisch verträgliche, nicht-toxische und biokompatible Matrix. Gegebenenfalls ist sie zudem eine biologisch abbaubare oder biologisch resorbierbare Biomatrix. Die erfindungsgemäße Matrix kann eine unbestimmte Form aufweisen und aus einem nicht-festen Material, wie beispielsweise einem Gel, bestehen oder sie kann die Form eines Blattes oder eines Kegels aufweisen.
Die Matrix kann deshalb jedes geeignete Material, einschließlich ein synthetisches polymeres Material und gemahlene Substanzen, umfassen. Beispiele für Matrizen sind das biologisch abbaubare und chemisch definierte Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, mit dem RTM-(Resin Transfer Moulding) Verfahren hergestellte Glasfaser, Verbandgips, beta-Whitlockit, biologisch abbaubare Polymere, einschließlich Homopolymeren (z. B. Polyparadioxanon, Polylysin oder Polyglykolsäure) und Copolymeren (z. B. Polyessigsäure und Polyglykolsäure) und deren Kombinationen. Andere mögliche Materialien sind biologisch abbaubar und biologisch allgemein definiert, wie beispielsweise Knochenkollagen oder Hautkollagen, Alginat, Pektin, Agarose und Fibrinogen. Andere mögliche Matrizen sind nicht biologisch abbaubar und chemisch definiert, wie beispielsweise gesintertes Hydroxyapatit, Bioglas, Aluminate oder andere Keramiken. Die Matrizen können aus Kombinationen von beliebigen der oben angegebenen Arten von Material bestehen. Ein Überblick über Biomaterialien und ihre entsprechenden Eigenschaften kann in Biomaterials, Alpha Science International Ltd., Pangbourne England, gefunden werden.
Je nach Anwendung kann die Matrix entweder vernetzt sein oder nicht. Beispiele für Matrizen sind in der US 6,514,514 beschrieben. Gemäß einer bestimmten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Matrix die Verabreichung von einem oder mehreren Arzneimitteln gegen einen osteochondralen Defekt in einem Gradienten. Der Gradient kann dem in dem Defekt und/oder dem Übergang vom Knorpel (geringe Konzentration) zum Knochen (hohe Konzentration) unterschiedlichen Ausmaß der erforderlichen Reparatur entsprechen.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Matrix ist, dass polysulfatiertes Alginat im Vergleich zu polysulfatiertem Chondroitinsulfat oder polysulfatiertem Xylosan oder natürlich vorkommendem Chondroitinsulfat viel stärkere Stimulation des Stoffwechsels von Bindegewebszellen zeigt. Es werden verschiedene Konzentrationen des polysulfatierten Alginats in der Matrix ins Auge gefasst und sie können von der speziellen Anwendung abhängen. Gemäß einer bestimmten Ausführungsform liegt das polysulfatierte Alginat in der Matrix in einem Bereich von zwischen 100 ng und 500 μg/ml, im Besonderen in einem Bereich zwischen 1 μg und 100 μg/ml Matrix, vor.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Matrix ist, dass Alginate (einschließlich polysulfatierten Alginaten) ein im Vergleich zu anderen Polysacchariden und polysulfatierten Polysacchariden erhöhtes Vermögen zur Gelbildung besitzt. Gemäß einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Matrix, die polysulfatiertes Alginat umfasst, ferner einen oder mehrere Bestandteile mit einer mit polysulfatiertem Alginat vergleichbaren Struktur, was eine homogene Verteilung derselben innerhalb der Matrix zulässt. Die Matrix umfasst daher ferner besonders ein hochmolekulares Polysaccharid, im Besonderen ein nicht-sulfatiertes (z. B. Natrium-)Alginat, das homogen mit dem polysulfatierten Alginat vermischt werden kann. Wenn es mit divalenten Kationen vernetzt wird, bildet Natriumalginat ein biologisch abbaubares Gel und dessen Eignung als Substrat für die Proliferation von Zellen bei Tissue Engineering, die durch die Zusammensetzung desselben beeinflusst werden kann, wurde beschrieben (siehe Wang et al., 2003, Biomaterials 24: 3475–3481). Das Gewichtsverhältnis von polysulfatiertem Alginat zu Alginat kann zwischen ungefähr 1:1 und ungefähr 1:100 oder höher variieren, wobei das Verhältnis von polysulfatiertem Alginat zu Alginat in einer bestimmten Ausführungsform 1:2n0 beträgt. In einer besonderen Ausführungsform beträgt der Prozentsatz des Gewichts des polysulfatierten Alginats im Vergleich zu Alginat zwischen 0,005 und 10% oder das Verhältnis zwischen polysulfatiertem Alginat und Alginat liegt zwischen 1/200 und 1/150, zwischen 1/150 und 1/100, zwischen 1/100 und 1/50, zwischen 1/50 und 1/25 oder zwischen 1/25 und 1/10. In einer bestimmten Ausführungsform beträgt die Konzentration an polysulfatierten Alginaten in der erfindungsgemäßen Matrix weniger als 500 Mikrogramm/ml.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Matrix gegebenenfalls in einer bestimmten Weise aufgebaut, um das Wachstum der Zellen nach einem bestimmten Muster zu steuern. Das hochmolekulare Polysaccharidgel, das das polysulfatierte Alginat gemäß der Erfindung umfasst, kann im Besonderen so gestaltet sein, dass es Kanäle enthält, so dass die Zellen dazu gebracht werden, in Säulen innerhalb der Matrix zu wachsen (wie es zum Beispiel bei Aydelotte et al., 1998, In vitro Cell Devel. Biol. – Animal 34: 123–130 beschrieben ist). Dies kann in Situationen von Interesse sein, in denen ein Wachstum der Zellen in einem geordneten Muster von Vorteil ist.
Optional dazu umfasst die erfindungsgemäße Matrix ferner andere polysulfatierte Polysaccharide, wie beispielsweise polysulfatiertes Cyclodextrin und/oder polysulfatiertes Inulin, oder andere Bestandteile, die in der Lage sind, die Produktion der extrazellulären Matrix von Bindegewebszellen zu stimulieren.
Ferner umfasst die erfindungsgemäße Matrix gegebenenfalls Nährmedien, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, MEM, Dulbeccos modifiziertes MEM, HAMs F12, Hanks balancierte Salzlösung oder deren Mischungen.
Gegebenenfalls kann die erfindungsgemäße Matrix ferner Wachstumsfaktoren umfassen, die das Wachstum bestimmter Zellen induzieren oder stimulieren. Die Art der Wachstumsfaktoren wird von der Zellart abhängen, für die die Matrix vorgesehen ist. Im Fall von osteochondralen Zellen kann die Matrix zum Beispiel gegebenenfalls einen oder mehrere Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise Platelet-derived growth factors (PDGF), transformierende Wachstumsfaktoren (transforming growth factors, TGF-beta), insulinähnliche Wachstumsfaktoren (insulin-like growth factors, IGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF), epidermale Wachstumsfaktoren (EGF), humane endotheliale Zellwachstumsfaktoren (endothelial cell growth factors, ECGF), Granolozyten-Makrophagen koloniestimulierenden Faktor (granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Cartilage-derived morphogenetic Protein (CDMP), morphogenetische Knochen-Proteine (bone morphogenetic Proteins, BMP), wie beispielsweise OP-1 OP-2, BMP2, BMP3, BMP4, BMP9, BMP11–14, DPP, Vg-1, 60A und Vgr-1, umfassen.
Die erfindungsgemäße Matrix kann ferner gegebenenfalls weitere Faktoren umfassen, die das Wachstum und/oder die Aktivität bestimmter Zellen beeinflussen. Im Fall von Chondrozyten kann zum Beispiel ein Faktor, wie beispielsweise Chondroitinase, die die Produktion von Knorpeln mit Hilfe von Chondrozyten stimuliert, zu der Matrix gegeben werden, um die Chondrozyten in einem hypertrophischen Zustand zu halten (wie beispielsweise in der US 20020122790 beschrieben ist).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Gegenwart von polysulfatierten Alginaten in einer Matrix die Aktivität und/oder das Wachstum des Zelltyps, der sich in der unmittelbaren Nachbarschaft der Matrix befindet oder in die Matrix eingebettet ist, verstärken. Die Matrix, die polysulfatiertes Alginat gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, ist als Träger oder für die Aufbewahrung und/oder Kultivierung von Zellen in vitro oder in vivo von Nutzen.
Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von polysulfatiertem Alginat in einer Matrix als Träger und/oder für die Kultivierung von Bindegewebszellen oder deren Progenitorzellen. ,Bindegewebe', wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Reihe von Strukturgeweben in dem Körper eines Säugetiers, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Knochen, Knorpel, Ligament, Sehnen, Meniskus, Haut, Oberhaut, Muskeln, Fettgewebe, Gelenkkapseln.
Genauer gesagt wurde entdeckt, dass polysulfatiertes Alginat die Aggrecansynthese und insbesondere die Synthese von Aggrecan-Aggregaten mit Hilfe von osteochondralen Zellen, wie beispielsweise humanen Gelenkkapselzellen, erhöht.,Osteochondrale Zellen', wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf Zellen, die entweder zur chondrogenen oder osteogenen Abstammungslinie gehören oder, in Abhängigkeit von den Signalen aus der Umgebung, eine Differenzierung zu entweder der chondrogenen oder der osteogenen Abstammungslinie hin durchlaufen können. Diese Möglichkeit kann in vitro oder in vivo geprüft werden (De Bari et al., 2001, Arthritis Rheum. 44(1): 85–95; Pittenger et al., 1999, Science 284(5411): 143–147; Dell'Acio et al., 2003, Exp. Cell Res. 287(1): 16–27). Ein bestimmter Aspekt der Erfindung betrifft daher die Verwendung von polysulfatiertem Alginat in einer Matrix für osteochondrale Zellen, im Besonderen chondrogene Zellen, d. h. Zellen, die in der Lage sind, Knorpel zu produzieren, oder Zellen, die selbst zu Zellen ausdifferenzieren, die Knorpel produzieren, einschließlich Chondrozyten, und Zellen, die selbst zu Chondrozyten ausdifferenzieren (d. h. Vorläuferzellen von Chondrozyten).
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine Matrix, die polysulfatierte Alginate umfasst, für die Erzeugung (und gegebenenfalls Implantation) von Prothesen, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, Knorpelprothesen, verwendet. Zum Beispiel können Chondrozyten auf biologisch abbaubaren, biokompatiblen, hochporösen Gerüsten, die aus Polymeren, wie beispielsweise Polyglykolsäure, Polyessigsäure, Agarosegel, oder anderen Polymeren, die sich mit der Zeit zersetzen, gebildet sind und die polysulfatierten Alginate der Erfindung umfassen, kultiviert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Natriumalginatgel, das polysulfatiertes Alginat umfasst, besonders geeignet. Die Matrizen sind so gestaltet, dass sie einen ausreichenden Nährstoff- und Gasaustausch für die Zellen zulassen, bis das Anwachsen (Engraftment) erfolgt. Optional dazu können die Zellen in vitro (oder ex vivo) kultiviert werden, bis sich bei den Zellen, die implantiert werden sollen, ein ausreichendes Zellvolumen und eine ausreichende Zelldichte entwickelt hat. Alternativ dazu kann die Matrix mit den Zellen direkt in den Körper implantiert werden. Die Matrizen können einzeln in eine gewünschte Form gegossen oder gepresst werden, so dass das Endprodukt genau dem (beispielsweise) Ohr oder der Nase des Patienten ähnelt, oder es können biegsame Matrizen verwendet werden, die eine Manipulation zum Zeitpunkt der Implantation, wie beispielsweise bei einem Gelenk, zulassen.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere zur Behandlung osteochondraler Defekte eines diarthrotischen Gelenks, wie beispielsweise einem Knie, einem Sprunggelenk, einem Ellbogen, einer Hüfte, einem Handgelenk, dem Knöchel von entweder einem Finger oder einem Zeh oder einem temperomandibulären Gelenk nützlich. Diese osteochondralen Defekte können durch eine traumatische Verletzung (z. B. eine Sportverletzung oder eine übermäßige Beanspruchung) oder eine Erkrankung, wie beispielsweise Osteoarthritis, verursacht werden. Eine bestimmte Ausführungsform betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Matrix zur Behandlung oder Prophylaxe von Hautläsionen des osteoarthritischen Knorpels. Daneben ist die vorliegende Erfindung zur Behandlung oder Prophylaxe osteochondraler Defekte, die durch Alterung verursacht werden, oder von Geburt an bestehen, von Nutzen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sollte auch verstanden werden, dass osteochondrale Defekte solche Zustände umfassen, bei denen die Reparatur von Knorpeln und/oder Knochen im Zusammenhang mit operativen Eingriffen, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, kosmetischen Eingriffen (z. B. Nase, Ohr) erforderlich ist. Solche Defekte können daher überall da im Körper auftreten, wo die Bildung von Knorpeln oder Knochen gestört wird oder wo Knorpel oder Knochen beschädigt sind oder infolge eines genetischen Defekts nicht vorhanden sind.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft deshalb eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Matrix enthält, die polysulfatiertes Alginat umfasst. Diese pharmazeutische Zusammensetzung ist besonders zur Behandlung oder zur Prophylaxe von Defekten des Bindegewebes, im Besonderen von osteochondralen Defekten, nützlich. Die Anwendung der Matrix bei dem osteochondralen Defekt übt eine stimulatorische Wirkung auf die Proliferation und Produktion der extrazellulären Matrix mit Hilfe der osteochondralen Zellen, die bei diesem Defekt vorhanden sind, aus. Die Matrix kann ferner gegebenenfalls Mittel umfassen, die osteochondrale Zellen anziehen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Matrix umfasst, die polysulfatiertes Alginat umfasst, gegebenenfalls Zellen, im Besonderen Bindegewebszellen oder deren Progenitorzellen. Zellen, die in der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung verwendet werden können, können autolog (selbst) oder allogen sein, die entweder aus einem Familienmitglied (verwandt) oder aus einem oder mehreren nicht miteinander verwandten Spender isoliert werden können.
Solche Zellen frisch isoliert, kultiviert oder passagiert werden. Optional dazu können solche Zellen basierend auf der Expression bestimmter Proteine von Interesse selektiert und/oder gereinigt werden (wie es beispielsweise in der WO 01/24833 , der WO 01/25402 , oder der WO 96/41620 für Bindegewebszellen beschrieben ist). Solche Zellen können aus verschiedenen Quellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, bereits vorhandenen Knorpeln und subchondralen Knochen, Perichondriumgewebe, der synovialen Membran und dem Knochenmark erhalten werden.
Wie oben angegeben ist, schließen Zellen, die zur Verwendung in der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung geeignet sind, Vorläuferzellen oder Progenitorzellen von Bindegewebszellen ein. Solche Zellen schließen Zellen ein, die direkt oder indirekt aus Bindegewebszellen des Knochenmarks oder mesenchymalen Stammzellen erhalten werden, aber auch aus anderen Geweben, wie beispielsweise einem Muskel, dem Herzen und Granulationsgewebe erhalten wurden, ein.
Die oben beschriebenen Zellen können in verschiedenen Konzentrationen in der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung vorhanden sein. Zum Beispiel können die Zellen in einer Konzentration von 1 bis 50 × 10⁶ Zellen pro ml in die gelartige Matrix, die polysulfatiertes Alginat umfasst, gemischt werden.
Kurze Beschreibung der Figur
Die folgenden Beispiele, die die Erfindung nicht auf die speziellen, beschriebenen Ausführungsformen beschränken sollen, können in Verbindung mit der begleitenden Figur verstanden worin:
1: Mit Hilfe der Chondrozyten in Kultur während einer Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen an polysulfatiertem Alginat neu synthetisierte ³⁵sulfatierte Aggrecane. (A) Menge an ³⁵sulfatiertem Aggrecan und DNA, die unabhängig voneinander gemessen wurden; (B) Menge an ³⁵sulfatiertem Aggrecan, bezogen auf die Menge an gemessener DNA abgebildet wurde.
Beispiele
Beispiel 1 – Zubereitung des polysulfatierten Alginats
Tropfenweise wird ein Vol. Chlorsulfonsäure zu 6,6 Vol. einskaltem Pyridin gegeben. Annähernd 300 mg des Alginats werden zu 5 ml der Chlorsulfonsäure/Pyridin-Mischung gegeben. Dann wird die Lösung für 5 Stunden auf 100°C gehalten. Nach dem Abkühlen werden 25 ml destilliertes Wasser dazugegeben. Anschließend werden 100 ml 10%-iges Na-Acetat in Methanol zu dieser Lösung gegeben, um die Polysaccharid-Polyschwefelsäuren auszufällen. Das Präzipitat wird 2-mal in Methanol gewaschen und in einer geeigneten Menge an pyrogen-freiem, destillierten Wasser gelöst, um die Reste der Chlorsulfonsäure, des Pyridins und der Puffersalze zu entfernen. Das Präzipitat, das das polysulfatierte Alginat enthält, wird lyophilisiert. Das polysulfatierte Alginat wird als trockenes, weißes Pulver rückgewonnen.
Der Grad der Sulfatierung und die Reinheit des Alginats sowie dessen Pyrogengehalt wurden mit herkömmlichen chemischen und biologischen Verfahren bestimmt. Unter den verwendeten Bedingungen wurde gefunden, dass die Sulfatierung des Alginats vollständig abgelaufen war.
Beispiel 2 – Bewertung der Wirkung von polysulfatiertem Alginat in vitro auf die Synthese durch humane Gelenkknorpelzellen von Aggrecanen der extrazellulären Matrix
Methodik
Isolierung von Chondrozyten
Humane Gelenk-Chondrozyten wurden so, wie es bei W. T. Green Jr (Clin. Orthop., 1971, 75: 248–260) und K. E. Kuettner et al. (J. Cell. Biol., 1982, 93: 743–750) beschrieben ist, mit ein paar Modifikationen (M. Cornelissen et al., J. Tiss. Cult. Meth., 1993, 15: 139–146) isoliert.
Inkubation mit polysulfatierten Alginaten
Die Gelenkknorpelzellen wurden so, wie es bei P. D. Benya et al. (Cell, 1982, 30: 215–224) beschrieben ist, in geliertem Alginat kultiviert. Das Alginat enthielt verschiedene Konzentrationen an Alginatpolysulfat, das so, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, zubereitet worden war.
Analyse der Aggrecansynthese
Die Synthese der Aggrecane wurde unter Verwenden von Na₂ ³⁵SO₄ als radioaktiver Precursor für ³⁵sulfatierte, mit Hilfe der Chondrozyten in Kultur neu synthetisierte Aggrecane.
Nach einer Kultivierungszeit von zwei Wochen wurden 10 μCi/ml der Markierung über einen Zeitraum von 48 Stunden in das Inkubationsmedium eingebracht. Die neu synthetisierten ³⁵S-Aggrecane sammelten sich zum Teil in der künstlichen, interzellulären Agarose-Matrix an. Ein anderer Teil dieser ³⁵S-Makromoleküle trat in das Inkubationsmedium aus. Dann wurde das Alginat unter Verwenden von 3,0 ml einer 55 mM Trinatriumcitratlösung in der Gegenwart von Proteinase-Inhibitoren bei 40°C über Nacht in der Kulturplatte aufgeschlossen. Die resultierende Suspension wurde zentrifugiert. Der Überstand, der die ³⁵S-Aggrecane der interterritorialen Matrix enthielt, und das Inkubationsmedium, das die ³⁵S-Aggrecan-Stoffwechselprodukte enthielt, die aus der extrazellulären Matrix ausgetreten waren, wurden zur weiteren Chromatographie getrennt voneinander in Pools gesammelt.
Das Pellet, das die Zellen und die mit den Zellen verbundenen ³⁵S-Aggrecane enthielt, wurde, 48 Stunden lang mit 1 ml 4,0 M Guanidiniumchlorid in 0,05 M Na-Acetat pH 5,8, das die Proteinesse-Inhibitoren enthielt behandelt, um die mit den Zellen verbundenen ³⁵S-Aggrecane zu extrahieren. Die resultierende Lösung wurde dann zentrifugiert, um die Zellen zu verwerfen und der Überstand wurde zur weiteren Chromatographie gelagert.
Nach der Zentrifugation wurden Aliquots der Nährmedien, Alginatverdaus und Extrakte aus der perizellulären Matrix durch Sephadex G25-Chromatographiegele in 0,067 M Phosphat pH 6,8, das 0,01 M Na₂SO₄ enthielt, entsalzen, um die mit ³⁵S markierten Aggrecane von dem freien ³⁵S-Sulfat abzutrennen. Die Radioaktivität der eluierten makromolekularen Fraktionen wurde ermittelt. Die Radioaktivität unter den Kurven (Porenvolumen) steht mit dem Gesamteinschluss an ³⁵Sulfat in den Aggrecanen bei den jeweiligen Kulturen in Zusammenhang. Unter Berücksichtigung der Menge an in Pools gesammeltem Kulturmedium, das schließlich nach der Chromatographie analysiert wurde, der spezifischen Aktivität des Inkubationsmediums, des Zerfalls des ³⁵Sulfats, der Dauer der Markierung in Stunden und der Anzahl an Zellen pro Kultur, wurde der Einschluss von Sulfat in pg eingeschlossenem SO₄ pro 1 × 10⁶ Chondrozyten pro Stunde ausgedrückt (G. Verbruggen et al., Osteoarthritis Cart., 2000, 8: 170–179).
Analyse von ³⁵S-Aggrecan-Subpopulationen
Die Pools aus miteinander vereinigten Medien und Agaroseverdaus wurden durch Chromatographie-Gele entsalzen, um die mit ³⁵S markierten Aggrecane von dem freien ³⁵Sulfat abzutrennen. Die aus dem Sephadex G25-Gel eluierten Fraktionen, die die mit ³⁵S markierten Makromoleküle enthielten, wurden in einem Pool gesammelt und für eine Gelpermeationschromatographie auf Sepharose CL-2B in dem gleichen Puffer verwendet. Es wurde gezeigt, dass die mit ³⁵S markierten Makromoleküle in drei Fraktionen eluierten: ³⁵S- Aggrecan-Aggregate und -Monomere, die in den ersten beiden Peaks voneinander abgetrennt wurden. Ein geringer Anteil an niedermolekularem Material (Abbauprodukte; Aggrecan-Subpopulationen mit geringer hydrodynamischer Größe) eluierte in der dritten Fraktion mit einem Tailing. Die Radioaktivität unter den ersten beiden Kurven ermöglichte eine Berechnung der Anteile an ³⁵S-Aggrecan-Aggregaten und -Monomeren.
Bestimmung des DNA-Gehalts
Nach der Proliferation in Alginat erfolge eine Messung des DNA-Gehalts in den Kulturen. Der Gehalt an DNA wurde unter Verwenden der Verstärkung der Fluoreszenz von Trisbenzimidazol (Hoechst 33258), wenn letzteres an doppelsträngige DNA bindet, untersucht (Lebarca C., Paigen K., 1980, Anal. Biochem., 102: 344–52). Die Alginatkulturen wurden daher durch Ultraschallbehandlung für 1 Minute (MSE-Ultraschallgerät, Typ 5.65; Stromaggregat mit 100 Watt) geschmolzen. Zu 2 ml der Färbelösung von Hoechst (0,1 μg/ml in 10 mM Trts-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA und 0,2 M NaCl) wurden 50 μl des geschmolzenen Alginats gegeben und die Fluoreszenz wurde in einem Dynaquant 2000-Fluorometer von Hoefer gemessen, wobei eine doppelsträngige DNA aus Kalbsthymus in geschmolzenem Alginat als Standard verwendet wurde.
Ergebnisse
Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, rief die Gegenwart von Alginatpolysulfat in Konzentrationen von 1 bis 10 μg/ml in den Kultivierungsmedien der Chondrozyten eine deutliche Zunahme der Synthese und Ansammlung von Aggrecanen in der mit den Zellen verbundenen, perizellulären Matrix und in der interterritorialen Matrix der Chondrozyten hervor.
1 zeigt zudem, dass sich die erhöhte Aggrecansynthese aus der erhöhten Expression von Aggrecan mit Hilfe der chondrogenen Zellen ergibt, da die Gesamtmenge an DNA, die gemessen wurde, nicht mit der höheren Konzentration an verwendetem polysulfatiertem Alginats zunahm. Tabelle 1: Menge an ³⁵S-Aggrecanen (pg SO₄ in den Aggrecanen /1 × 10⁶ Zellen/ Stunde)

Alg-SO₄ mit Zellen verbundene interterritoriale Matrix Kulturmedium

(μg/ml) Matrix

0 1,315 8,036 1,589

1 2,262 6,232 1,658

10 2,907 8,232 3,873

100 1,373 6,589 2,187

Alg-SO₄ = polysulfatiertes Alginat

Beispiel 3 – Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die polysulfatierte Alginate umfasst
Beispiel für eine Formulierung aus 100 ml Gel, das polysulfatiertes Alginat enthält, zur Verwendung als Matrix bei der Transplantation von humanen Chondrozyten

polysulfatiertes Alginat (Natriumsalz) 100 μg

Alginat 1 g

doppelt konzentriertes DMEM 100 ml

Antibiotika
Beispiel 4-Implantation von sulfatiertem Alginat, auf dem autologe Chondrozyten angesät worden waren, unter einem Periostläppchen bei Knorpeldefekten in einem Ziegenmodell
Das vorliegende Beispiel untersucht die Reparatur standardmäßiger Knorpeldefekte durch Implantation autologer Chondrozyten, die in einer Matrix eingebettet sind, die polysulfatiertes Alginat umfasst.
Für die Transplantation der autologen Chondrozyten wurden erwachsene, weibliche, nicht-säugende und nicht-trächtige Saanen-Ziegen verwendet. Alle Ziegen waren 3 Jahre alt oder älter und stammten von als CAE(Caprine Arthritis-Enzephalitis-Virus)-negativ geprüften Betrieben.

Die Knorpelchips der Ziegen wurden enzymatisch (Hyaluronidase (0,25% in DM) für 1 Stunde, Pronase (0,25% in DM) für 1 Stunde, über Nacht in DM ((DM) = DMEM LG + Antibiotika + L-Glutamin) + 10% autologes Serum, Collagenase (0,2% in DM + 10% autologes Serum) für 3–4 h) verdaut, um eine einzige Zellsuspension zu erhalten. Nach dem Waschen wurde die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen mit Hilfe des Trypanblau- Auschlusstests untersucht. Alle Zellpopulationen zeigten eine Lebensfähigkeit von mehr als 95%. Tabelle 2: Merkmale der autologen Ziegen-Chondrozyten

Behandlungsgruppe	Tier-Code	Dauer der Kultur in Tagen	Zell-Anzahl Millionen	geerntete Knorpel (mg)	Zellanzahl/mg Knorpel
ACT in polysulfatiertem Alginat	G142	7	1,7	nicht gemessen	N/A
	G138	7	3,1	nicht gemessen	N/A
	G132	7	0,75	45	16667
	G114	7	1,2	70,2	17094
ACT in Suspension	G136	8	5	nicht gemessen	N/A
	G126	8	0,44	20,6	21359
	G120	8	0,75	32	23438
	G113	8	3,7	nicht gemessen	N/A

Die Zellen wurden zu einer Endkonzentration von 5 × 10⁶ Zellen/ml polysulfatierte Alginatlösung gelöst. Zur Polymerisation wurde diese Zellsuspension durch eine G25-Gauge-Nadel in eine 102 mM CaCl₂-Lösung getropft (10 min). Nach Waschen mit 0,9%-iger NaCl wurde das Kügelchen umfassende polysulfatierte Alginat bis zur Implantation in DMEM + AK + L-Glut + 10%-igem autologem Serum kultiviert. Endkonzentration pro Kügelchen: annähernd 30000 Zellen/Kügelchen.
Am Tag der Implantation wurde das Kulturmedium verworfen und die Kügelchen wurden in 2 ml einer 55 mM Na-Citratlösung gelöst. Nach annähernd 2 Minuten wurden 10 ml PBS dazugegeben und die Lösung zum Waschen mit 1600 rpm, 10 min lang zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen und das Zellpellet wurde in DMEM + AK + L-Glut + 10%-igem autologem Serum auf eine Endkonzentration mit 5 Millionen/ml resuspendiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit einem Trypanblau-Auschlusstest überprüft und betrug > 95%.
Ein Standardvolumen eines Knorpeldefekts (6 mm Durchmesser) wurde gefüllt. Der Defekt wurde mit einem Periostläppchen mit einem Durchmesser von 8–10 mm abgedeckt und mit Fibrinklebstoff (Quixil^® – Omrix Biopharma) verschlossen.
Die linken und rechten Oberschenkelkondylen wurden nach ungefähr 13 Wochen untersucht. Das Synovium wurde mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung eingefärbt, die Kondylen wurden mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung, Toluidin-Blau-Färbung und Safranin O eingefärbt.

Die mikroskopische Beurteilung der Reparatur des Knorpels ist in Tabelle 3 zusammengefasst: Tabelle 3: Bildung des Knorpels nach dem ACT-Verfahren in Ziegen

Behandlungsgruppe	Tier-Code	Ergebnisse
ACT in polysulfatiertem Alginat	G142	schlechte Reparatur
	G138	Verfahren schlug fehl
	G132	teilweise Füllung des Defekts mit hyalinartigem
		Knorpel, der eine in gewissem Umfang gute
		Anordnung zeigte
	G114	neu gebildeter Knorpel im Reparaturbereich
ACT in Suspension	G136	Verfahren schlug fehl
	G126	Verfahren schlug fehl
	G120	führe Anzeichen von Osteoarthritis, jedoch eine in
		gewissem Umfang zu sehende Reparatur des
		Gewebes mit bestimmtem Aufbau. Eine
		Interpretation des Ergebnisses ist schwierig.
	G113	schlechte Reparatur

Claims

In vitro/ex vivo-Verfahren zur Kultivierung von Bindegewebszellen oder deren Progenitorzellen, das den Schritt des In-Kontakt-Bringens der Zellen mit einer Matrix, die polysulfatiertes Alginat umfasst, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Matrix zur Implantation in den menschlichen oder tierischen Körper geeignet ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Matrix ferner Nährmedien umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Matrix ferner nicht-sulfatiertes Alginat umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, worin das polysulfatierte Alginat und das nicht-sulfatierte Alginat in einem Gewichtsverhältnis von zwischen 1:10 und 1:100 vorliegen.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Zellen Bindegewebszellen sind.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Zellen chondrogen sind.
Verfahren nach Anspruch 7, worin die Zellen Vorläuferzellen von Chondrozyten sind.
Matrix, die polysulfatiertes Alginat und Bindegewebszellen oder deren Progenitorzellen von Säugern umfasst.
Matrix nach Anspruch 9, worin die Zellen osteochondrale Zellen sind.
Matrix nach Anspruch 10, worin die Zellen chondrogene Zellen sind.
Matrix nach Anspruch 9, worin die Zellen mesenchymale Stammzellen sind.
Matrix nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 12, die ferner Nährmedien umfasst.
Matrix nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 13, worin das polysulfatierte Alginat in einer Konzentration zwischen 100 ng und 500 μg/ml vorhanden ist.
Matrix nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 14, die ferner nicht-sulfatiertes Alginat umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die die Matrix gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 15 umfasst.
Verwendung einer Matrix, die polysulfatiertes Alginat umfasst, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von osteochondralen Defekten.
Verwendung nach Anspruch 17, worin die Matrix ferner chondrogene Zellen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 18, worin die chondrogenen Zellen Bindegewebszellen oder deren Progenitorzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 18, worin die chondrogenen Zellen mesenchymale Stammzellen sind.