SK288818B6 - Biocementový systém na regeneráciu defektov chrupky - Google Patents

Abstract

Biocementový systém určený na regeneráciu a rekonštrukciu chrupkových alebo osteochondrálnych defektov je zložený z mikrokryštalickej tetrakalcium fosfátovej a nanokryštalickej monetitovej fázy, pričom biocement môže obsahovať jednu alebo viaceré aminokyseliny a pripravuje sa in situ reakciou počas prípravy. Aplikáciou biocementového systému na miesto defektu v kĺbovej chrupke sa vytvára tkanivo blízke hyalínovej chrupke a zároveň dochádza k vyhojeniu defektu subchondrálnej kosti.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka zloženia a použitia biocementových systémov určených na regeneráciu a rekonštrukciu chondrálnych a osteochondrálnych defektov v lekárstve.

Doterajší stav techniky

Degenerácia a porušenie celistvosti chrupky', resp. v ťažších prípadoch až subehondrálnej kosti v dôsledku primárnych najmä genetických faktorov, ako aj sekundárnych faktorov (napr. metabolické, zápalové, poúrazové) predstavuje v súčasnosti pomerne významný celospoločenský jav. Osteoartróza ako nezápalové ochorenie kĺbov a chrbtice postihuje oblasť kĺbových chrupiek a sekundárne ovplyvňuje tkanivá v okolí kĺbov. Ochorenie postihuje 10 - 15 % populácie, pričom progresivita stúpa vo vyššom veku až do 50 - 80 % (EHIS 2009 - Európske zisťovanie o zdraví 2009, Štatistický úrad Slovenskej republiky, 2011; Správa o stave zdravotníctva na Slovensku, MZ SR, 2.011) a prejavuje sa zväčša chronickou bolestivosťou a obmedzením hybností končatín a častí tela. Vzájomné biomechanické a biochemické vzťahy medzi kĺbovou chrupkou a subehondrálnou kosťou zohrávajú významnú úlohu pri rozvoji osteoartritídy, pričom práve poruchy subehondrálnej kosti a vzájomného prepojenia tkanív významnou mierou prispievajú k bolestivým patologickým stavom pacientov. Subchondrálna kosť ukotvuje kolagénové vlákna zasahujúce do vonkajších vrstiev chrupky, je vysoko vaskularizovaná a obsahuje výživu pre samotnú kosť a okolité chrupkové tkanivo. Zároveň v nej končia nervové zakončenia, čo vedie k predpokladu, že práve táto časť je spojená s bolestivosťou kĺbov (S. P. Nukavarapu akol., Osteochondral tissue engmeering: Current strategies and challenges, Biotechnology Advances 31 (2013) 706 - 721). Subchondroplastika predstavuje jednu z využívaných metód pri liečení subchondrálnych defektov kostí indikovaných v špecifických prípadoch najmä pri neporušenej celistvej kĺbovej chrupke, pričom sa používa artroskopická metóda s aplikáciou kalcium fosfátových kostných cementov (BJ Cóle a JD Harris, Biológie Knee Reconstruction: A Surgeon’s Guide, 2.015). V lekárskej praxi sa aplikuje niekoľko chirurgických postupov v závislosti od štádia poškodenia kĺbovej chrupky - artroskopické odstránenie úlomkov chrupky, kosti a iných častí väzivového tkaniva; chondroplastika (aplikovaná na defekty’ vo forme trhlín prechádzajúcich až do celej hrúbky chrupky s cieľom vytvoriť stabilný povrch bez ďalších poškodení), mikrofraktúra (malé defekty’ 2-3 cm², defekty' cez celú šírku chrupky a čiastočne veľké defekty', pričom sa vy tvoria kanáliky v subehondrálnej kosti na uvoľnenie mezenchymálnych kmeňových buniek z kostnej drene a vytvorí sa tkanivo blízke k väzivovej chrupke neidentické s pôvodným tkanivom hyalinovej chrupky'), mozaikoplastika (autológna alebo allogénna osteocbondrálna transplantácia - určená na poškodenia väčšej plochy chrupky' po odobratí osteochondrálneho tkaniva z málo exponovanej časti kĺbov alebo prenosom z iného jedinca), autológna implantácia chondrocytov (odobratie chondrocytov zo zdravej chrupky a následná kultivácia na bioresorbovateľnej matrici pred implantáciou na postihnuté miesto) (D, Puppi a kol., Progress in Polymér Science 35 (2010) 403 - 440, C. L. Camp akol., SPORTS HEALTH 6 (3) (2013) 265). Všetky uvedené metódy majú svoje nedostatky, ku ktorým patri napr. tvorba tkaniva odlišných vlastností od pôvodného tkaniva, nutnosť otvorenia ďalšieho operačného poľa so zákrokom spojeným s odobratím tkaniva a problémami s odumretím tkaniva v donomom mieste, nutnosť kultivácie špecifických buniek (napr. chondrocytov), možnosť prenosu rôznych ochorení medzi darcom a pacientom, imunogenická reakcia organizmu atď. Kĺbová chrupka je zložená z troch štruktúrne a kompozične rozdielnych zón. V kontaktnej zóne sú kolagénové vlákna usporiadané rovnobežne s povrchom a obsahujú nižšie množstvo proteoglykánov; chondrocyty majú špecifický tvar. V strednej zóne sú kolagénové vlákna náhodne orientované s vysokým podielom proteoglykánov a sférickými chondrocytmi usporiadanými do menších zhlukov. Hlboká zóna je charakteristická zhlukmi kolagénových vlákien kolmých na subehondrálnu kosť a reťazcovitým usporiadaním chondrocytov. Hlboká zóna je ukončená tenkou kalcifíkovanou zónou, oddeľujúcou chrupkovú časť od subehondrálnej kosti. Vysoký' podiel vody obsahuje stredná zóna s najvyšším podielom sulfátovaných gíykózaaminoglykánov. Hierarchická štruktúra značne komplikuje výber vhodných biomateriálov a najmä ich prípravu. Vzhľadom na nízky počet aktívnych chondrocytov v chrupke sa biomateriálové systémy vyvíjajú vo forme pórovitých skeletov vhodných na rast a diferenciáciu mezenchymálnych kmeňových buniek do chondrogénej línie, ako aj priamo chondrocytov odobraných autológne a kultivovaných in vitro.

Významnou skupinou biopolymérov na spracovanie defektov chrupky' sú polysacharidy na báze glukózaamiopolysacharidov (chitosan, chitín, ky s. hyalurónová), ktoré sú vo veľkej miere aplikované v príprave vysokopórovitých substrátov a hydrogélov pre chondrogénne substráty. Gíykózaaminoglykány (GAG), ktoré sú prítomné v chrupke vo veľkom množstve (chondroitín sulfát, keratín sulfát) a podieľajú sa významnou mierou prostredníctvom vysokomolekulárneho proteoglykánu (agrekán) naviazaného na kys. hyalurónovú na vhodných viskoelastických vlastnostiach chrupkového tkaniva v kĺboch (P. L. Chandran a kol., Acta Biomaterialia 8 (2012) 3 - 12). Lyofilizáciou pripravené chitosanové špongie obsahovali po hydralácii až 90 % vody, pričom proliferácia chondrocytov, produkcia GAG a kolagénu rástla s veľkosťou pórov a ich vzájom nou prepojenosťou (D. J. GriVon a kol., Acta Biomaterialia 2 (2006) 313 - 320). Naopak v prípade chitosan/polyesterových kompozitov bol nájdený pokles tvorby GAG pri veľkopórovitých substrátoch, ale súčasne bola stimulovaná produkcia kolagénu Π (M. L. Alves da Silva, a kol., Acta Biomaterialia 6 (2010) 1149 1157). Zvýšená produkcia extracelulárnej matrice chondrocytmi kultivovanými in vitro bola pozorovaná na chitosanových vláknitých substrátoch oproti substrátom s polygiykolovej kyseliny (G. R. Ragetly a kol., J Biomed Mater Res 93A: 46 - 55, 2010), čo poukazuje na významný efekt chemického zloženia substrátov na stimuláciu buniek. Extraceluláme mikroprostredie v okolí chondrocytov odobratých z rôznych častí chrupky výrazne ovplyvnilo tvorbu a zloženie extracelulárnej matrice v hydrogéloch (S. Nathaniel a kol., FEBS Letters 581 (2007) 4172 —4178). V hybridných veľkopórovitých chitosan polyetylénoxidových, ako aj čistých chitosanových substrátoch povrchové naviazanie špecifického peptidového reťazca, resp. RGD motívu, rastových faktorov viedlo k efektívnejšej adherencii a proliferácií chondrocytov a zvýšenej tvorbe kolagénu a GAG počas kultivácie (Yung-Chih Kuo a Cheng-Chin Wang, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 84 (2011) 63 - 70; R. Seda Tigli a Menemse Gumusderelioglu, International Journal of Biological Macromolecuíes 43 (2008) 121 - 128). In vitro testovanie multivrstvového hydrogéíového systému sieťovaného cez metaktyláí a obsahujúcom polyetylén glykol a v hornej chrupkovej vrstve naviazaný chondroitín sulfát s RGD peptidom potvrdilo, že len dynamická mechanická stimulácia viedla k vysokej expepresii kolagénu II v tejto vrstve a mineralizáciu spodnej kostnej vrstve (NJ Steinmetz a kol., Mechanical loading reguiates human MSC differeniiation in a multi-Iayer hydrogel for osteochondral rissue eogineering. Acta Biomaterialia 2.1 (2015) 142 - 153), Dvojfázové lyofilizované biopolymerne implatitáty s chitosan/k. hyalurúnovou vrstvou na chondrálnej strane a poly-kys. mliečnou na subchondrálnej strane preukázali dobré previazanie s okolitým chrupkovým tkanivom a tvorbou hyalínovej chrupky po implantácii oproti implantátom s kolagénovou vrstvou na chrupkovej strane (S. R. Frenkel a kol., OsteoArthritis and Cartilage (2005) 13, 798 - 807). Horšie mechanické vlastnosti lyofilizovaných chitosanových substrátov boli pozitívne ovplyvnené prídavkom aniónového biopolyméru kys. hyaiurónovej (T. Funakoshi a koľ, J Biomed Mater Res 74A: 338 - 346, 2005) a biodegradovateľnosť kolagén/chitosanových kompozitov bola riadená zosieťovaním biopolymérov genípínom (Le-Ping Yau a kol., J Biomed Mater Res Part A: 95A: 465 - 475, 2010) pri zachovaní netoxickosti substrátov. Významné zvýšenie mechanických vlastností bolo dosiahnuté v chitosan/poly(3-kaprolaktonovýcb) (PCL) zmesiach vo forme vláknitých substrátov, pričom bola pozorovaná uniformná distribúcia chondrocytov a extracelulárnej matrice na povrchu vlákien v porovnaní s chitosanom (S. C. Neves a kol., Biomaterials 32 (2011) 1068 - 1079). Polyesterové pórovité substráty⁷ (lúhované NaCl z matrice) na báze poly(hydroxybutyrát-hydroxyvalerátu) preukázali pozitívny vplyv na proliferáciu chondrocytov a tvorbu kolagénu II, resp. GAG (J. Sun a kol., European Polymér Journal 41 (2005) 2443 - 2449). Aktuálne komerčne dostupné biomateriály na regeneráciu a rekonštrukciu defektov chrupky sú zložené najmä so zmesí prírodných biopolymérov, ktoré slúžia ako matrica na nasadenie a predkultivácíu chondrocytov alebo mezenchýmových kmeňových buniek, čo významne predlžuje, predražuje a komplikuje operačné procedúry a proces hojenia defektov. Vyvinuté sú biopolyméme pórovité matrice na báze kyseliny poly-mliečnej-ko-glykolovej (BioSeed®, Chondrotissue®), špongie a gély na báze kolagénu (CaReS®, Maioregen®, Cartícel®, ChondroGide®, NeoCART®), chitosanu (BST-CarGel®), želatíny, fibrinových tmelov (GelrinC™, Chondron™), alginátových hydrogélov (Cartipatch®), pomerne drahé preparáty na báze hyalmonanu a chondroitín sulfátu používané aj ako íubrikanty a podporné systémy kĺbov (Hyalgan®, Hyalubrix®, Biomect®, Hyaff®, Hyalograft®) /R. A. A. Muzzarelli a kol., Carbohydrate Polymers 89 (2012) 723 - 739). Problémom širšieho využitia biopolymérov na riešenie špecificky osteochondrálnych defektov je nedostatočné pokrytie mechanických vlastností a charakteristickej pásovej štruktúry hyalínových chrupiek definovanej rôznym chemickým zložením, usporiadaním kolagénových vlákien a hustotou chondrocytov; okrem toho tieto biomateriály musia byť schopné po implantácii zaisťovať mechanickú citlivosť a odozvu pre deliace sa chondrocyty, umožniť agregáciu a množenie buniek potrebných na tvorbu novej chrupky, zabezpečiť dostatočnú adherenciu a neskoršiu úplnú integráciu k okolitému pôvodnému tkanivu (Z. Ge a kol., J Biomed Mater Res Part A 2012: 100A: 2526 - 2536; RM Jeuken a kol., Polymers in Cartilage Defect Repair of the Knee: Current Status and Future Prospects, Polymers 2016, 8, 219).

Progresívne riešenie uvedených nedostatkov, ktoré súvisia s nižším osteomdukčným potenciálom biopolymérov v subchondrálnej oblasti defektu, predstavuje súčasná stimulácia tvorby hyalínovej a osteochondrogénnej časti chrupky prostredníctvom dvojvrstvového alebo multíštrukturálneho usporiadania biomateriáíov (JE Jeon a kol., Perspectives in Muldphasic Osteochondral Tissue Engineering. Anatóm Record 297: 26 - 35 (2014)), napr. dvojvrstvové usporiadanie chitosan/želatínového (obsahujúceho BMP2) a hydroxyapatit/chitosan/želatínového (obsahujúceho TGFB faktor) pórovitého lyofiíizovaného substrátu po zlepení vrstiev fibrínovým lepidlom a nasadení mezenchymálnych kmeňových buniek (J. Chen a kol., Biomaterials 32 (2011) 4793 - 4805), nanohydroxyapatit/chitosanové skelety po in vitro kultivácii v zodpovedajúcich médiách potvrdili diferenciáciu do zodpovedajúcich bunkových línií - chondrocytov v chitosanovej a osteoblastov v hydroxyapatitovej časti (JM Oliveira a koľ. Nove! hydroxyapatite/chitosan bilayered scaffold for osteochondral tissue-engineering applications: Scaffold design and its performance when seeded with goat bone mairow stromal cells. Biomaterials 27 (2006) 6123 - 6137). Skelety pripravené kombináciou injektovateľných kalcium fosfátových cementov s kyselinou hyalurónovou s nasadenými mezenchýmovýnu bunkami vykazovali po 12 týždňoch zonálne črty so zvýšenou osteoblastickou aktivitou v kalcium fosfátovej kostnej časti a chondrogenickou aktivitou v hyalurónovej chrupkovej časti (J Gao a kol., Repair of Osteochondral Defect with Tissue-Ľngineered Two-Phase Composite Matéria! of Injectable Calcium Phosphate and Hyaluronan Sponge. Tissue Eng 8 (2002) 827). Po aplikácii injektovateľného brushitového kostného cementu a pokrytí vrstvou peletizovaných chondrocytov v osteochondrálnom defekte králikov bolo pozorovaná rýchlejšia tvorba subchondrálnej kosti (MW Wong a kol., Bone micro-architectural changes after repair of osteochondral defects with injectable bone substimte and chondrocyte pelíet. Bone 47 (2010) S72-S241). Osteochondrálna implantácia acelulámeho hybridného systému amorfný kalcium fosfáú'poly-kyselina mliečna obsahujúcom fibroblastový rastový faktor potvrdila tvorbu neplnohodnotnej chrupkovej kĺbovej chrupky s vysokým podielom kolagénu I a II a agrekánu a nekompletným vyplnením defektu (X Huang a kol., Osteochondral repair using the combination of fibroblast growth factor and amorphous calcium phosphate/poly(L-lactic acid) hybrid materials. Biomaterials 28 (2007) 3091 -- 3100).

Trojvrstvový kompozitný chemicky previazaný systém zložený z kolagénu I/kyseliny hyalurónovej/nanohydroxyapatim biomimeticky spolavy zrážaného v zásaditom prostredí mal gradované chemické zloženie, kde v spodnej a strednej vrstve obsahoval 70 a 30 hmotu. % hydroxyapatitu a vrchná vrstva mimikujúca hyalínovú chrupku obsahovala len biopolymému zmes. In vitro a invivo testy (myšací model) po nasadení chondrocytov alebo mezenchýmových kmeňových buniek a ich kultivácii (predkultivácii) v skeletoch preukázali vznik nového kostného tkaniva v subchondráínej oblasti a chrupkového tkaniva na povrchu skeletu (A Tampieri a kol., Design of graded biomimetic osteochondral composite scaffolds. Biomaterials 29 (2.008) 3539 - 3546). Podobne trojvrstvový systém obsahujúci kolagén I, P-trikalcium fosfát a biopolymému zmes poly-mliečnej-polykaprolaktámu po implantácii do oviec preukázal tvotbu chrupkového tkaniva po 6 mesiacoch bez adverznej reakcie organizmu (A Yucekul a kol., Tri-layered composite plug for the repair of osteochondral defects: in vivo study in sheep. Journal of Tissue Eugineering 8 (2017) 1). Po implantácii do osteochondrálneho defektu oviec monofázového β-trikalcium fosfátového pórovitého skeletu došlo k takmer úplnej remodelácu skeletu na špongióznu kosť a neúplnej tvorbe chrupkového tkaniva s vysokým podielom kolagénu II po 52 týždňoch (A. Bemstein a kol., Microporous calcium phosphate ceramics as tissue engineering scaffolds for the repair of osteochondral defects: Histological results. Acta Biomaterialia 9 (2013) 7490 - 7505).

Aktuálny význam riešenia osteochondrálnycb defektov potvrdzuje aj obsah publikovaných patentových prihlášok, ktoré sú vo vysokej miere orientované na prípravu najmä celulámych typov biopolymérnych 3D-substrátov s nasadenými autológnymi kmeňovými bunkami, resp. chondrocytmi vo forme napr. devitalizovanýcb allo- alebo xeno-graftov chrupky’ obsahujúcich rastové faktory (WO2009011849, WO2010083051A2), tvorbou syntetického matrixu na substrátoch chondrocytmi in vitro (WO2009106642 Al), injektovateľných mikrogranuliek biopolymérov (WO210017265), celulózových hydrogélov (WO2009155583A1), fotokompozitov na báze chitosan/kolagénových zmesiach (WO2010120757A2), multištruktúrnych pórovitých systémov na báze hodvábu s fibrínovým lepidlom spojenými vrstvami (WO2011156586A2), kompozitných kalcium fosfátových/biopolymérnych filmov (JP2004049626) a vláknitých dvojvrstvových skeletov'· (US8475531), kompozitných implantátov z decelularizovanej chrupky a demineralizovaných kosti (MD1177), kalcium fosfát/kola génové špongie (CN106139255) alebo multifázové skelety (WO2017118863), gradientových pórovitý'ch skeletov'· obsahujúcich PLGA mikročastice a hydrogély (US2017239395), devitalizovanej mikronizovanej extracelulámej matrice (US2017232144), multivrstvových zmesi kolagén/kyselina hyalurónová (US2017157288), dvoj sieťové štruktúry s hydroxyapatitom a fibroinom (WO2016100721) chemicky previazaných s chitosanom (CN106178126), keramický štruktúrne dvojvrstvový systém s rozdielnou pórovitosťou vrstiev (US2007113951), kolagén/hydroxyapatitových multivrstvových štruktúr (US2009232875), špecifických kompozitných poly(laktid-koglykolidových) (PLGA) substrátov zabezpečujúcich podľa zloženia a fyzikálne-chemických stimulov diferenciáciu kmeňových buniek do požadovaných línií (WO20111633282A2). Opísaná a otestovaná je metóda riešenia osteochondráínych defektov prípravou celulámych 3D-substrátov vo forme pohárikov zapĺňajúcich defekt hydrogélmi ohraničenými PLGA nanosieťkami so zložením stimulujúcim zonálny rast chrupavky (WO2012021885A1); trojzonáíne usporiadaný systém nanovlákien PLA, PCL s pozdĺžne orientovanou prvou a náhodne orientovanými následnými vrstvami pomocou elektrospiningovej metódy (WO2012080706A2); kompozitný systém zložený z biopolyméru (napr. chitosan), alginátového hydrogélu a anorganickej zložky reprezentovanej rúrkovitými typmi prírodných skeletov na báze aragonitu, kalcitu (WO2013150537A1). Tetrakalcium fosfátový biocement s nanokryštalickým monetitom podľa patentu SK288348 bol vyvinutý’ len na nesenie defektov tvrdých tkanív (kostí). Z uvedených faktov je zrejmé, že riešenie v podobe kalcium fosfátových biocementových systémov s jednou tuhofázou finálnou zložkou po tuhnutí neviedlo doteraz k požadovaným procesom hojenia a reálne dostupné biomateriálové riešenia osteochondrálnych defektov sú obmedzené na lubrikanty, gély a podporné pórovité biopolyméme matrice a muítištruktúme viacfázové skelety s komplikovanou prípravou.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je zloženie biocementového kalcium fosfátového systému určeného na rekonštrukciu a regeneráciu chrupkových a osteochondrálnych defektov. Biocementový systém je zložený zo zmesi tetrakalcium fosfátových rmkrokryštalických častíc a jemných nanokryštaiických častíc hydrogén fosforečnanu vápenatého (monetit), do ktorej môžu byť pridané aminokyseliny jednotlivo alebo v zmesi. Aminokyselinovú zložku cementu predstavujú jednotlivo alebo v zmesiach glycín (GLY), prolín (PRO), hydroxyproíín (HYP), arginín (ARG) a iyzín (LYS). Kalcium fosfátovú zložku biocementu charakterizuje mólovým pomerom Ca/P zodpovedajúci stechiometrickému alebo kalcium deficitnému hydroxyapatitu v rozmedzí 1,5 - 1,68. Bázická prášková tetrakalcium fosfátová zložka biocementovej zmesi sa syntetizuje vy sokotepíotnou reakciou pri teplotách nad 1 400 °C homogénnej práškovej zmesi rôznych fosforečnanov vápenatých, najlepšie hydrogén fosforečnanu vápenatého (CaHPO4), dihydrátu hydrogén fosforečnanu vápenatého (CaHPO4 . 2H2O), dlhy drogén fosforečnanu vápenatého (Ca(H2PO4)2), pyrofosforečnanu vápenatého (Ca(H2PO4)2), ako aj hydrogén fosforečnanu diamónneho ((NH4)2HPO4) s uhličitanom vápenatým (CaCO3), oxidom vápenatým (CaO), hydroxidom vápenatým (Ca(OH)2) alebo inými vápenatými soľami, ktoré sa rozkladajú pri teplotách do 1 000 °C. Získaný tetrakalcium fosfát sa ďalej zjemňuje mletím v guľovom mlyne obvykle 15 - 60 minút tak, aby výsledný prášok obsahoval častice s rozmermi < 10 pm. Finálna cementová zmes sa pripravuje in situ mletím syntetizovaného mletého tetrakalcium fosfátu so zriedeným roztokom kyseliny ortofosforečnej v čistom organickom rozpúšťadle alebo zmesi rozpúšťadiel miesiteľných s vodou a nereagujúcich s kyselinou ortofosforečnou najlepšie v etanole, metanole, acetóne alebo ich zmesiach. Koncentrovaná kyselina ortofosforečná je zriedená organickým rozpúšťadlom najlepšie v pomere až 1 : 10. Kyselina ortofosforečná sa pridáva v presne definovanom množstve tak, aby sa dosiahol celkový mólový pomer Ca/P v intervale 1,5 až 1,68. Organické rozpúšťadlo môže byť absolútne, teda úplne bezvodé alebo môže obsahovať presne definované množstvo vody v rozsahu do 30 obj. %. Aminokyseliny sa pridávajú do roztoku kyseliny ortofosforečnej pred pridaním do mlecej nádoby s tetrakalcium fosfátovým práškom. Z uvedeného vyplýva, že cementové zmesi s prídavkom alebo bez prídavku aminokyselín sa získavajú počas jedného kroku prípravy. Celkové množstvo aminokyselín v cementovej zmesi je do 6 hmotu. % a je limitované rozpustnosťou aminokyselín v roztoku kyseliny ortofosforečnej. Aminokyseliny sú do biocementu pridávané jednotlivo alebo vo vzájomných zmesiach v rôznych pomeroch, najlepšie GLY : PRO : HYP : ARG : LYS = 6 : 3 : 3 : 2 : 2, Prídavok vody ovplyvňuje morfológiu vznikajúcich apatitových častíc počas tuhnutia, mikroštruktúra finálnych cementov, čas tuhnutia a mechanické vlastnosti cementov.

Suspenzia tetrakalcium fosfátu a organického roztoku kyseliny ortofosforečnej sa intenzívne melie v guľovom mlyne najlepšie v čase do 60 minút. Čas mletia ovplyvňuje kinetiku tuhnutia cementovej pasty a mechanické vlastnosti výsledného cementu. Počas mletia dochádza k interakcii medzi bázickým tetrakalcium fosfátom a kyslým organickým roztokom kyseliny ortofosforečnej, pričom konečným produktom je kyslý hydrogén fosforečnan vápenatý (monetit). Aminokyseliny sú naadsorbované na povrchu kalcium fosfátových častíc a postupne sa uvoľňujú do okolitého prostredia telových tekutín. Po mletí sa kalcium fosfátová suspenzia môže vysušiť pri teplote do 105 °C vo vákuu alebo sa prefiltruje a následne vysuší pri teplote do 105 °C. Cementové suspenzie obsahujúce aminokyseliny sa sušia pri teplotách do 80 °C alebo vo vákuu. Vysušený prekurzorový prášok nie je potrebné ďalej upravovať akýmkoľvek spôsobom a cementová pasta sa získa zmiešaním pripravenej prekurzorovej zmesi s 2 - 20 % vodným roztokom kvapaliny na tuhnutie obsahujúcej fosforečnany najlepšie 2-4 % roztokom dihydrogén fosforečnanu sodného, hydrogén fosforečnanu sodného, dihydrogén fosforečnanu draselného alebo ich zmesi. Pomer prekurzorového prášku k roztoku kvapaliny na tuhnutie môže byť v intervale 1,2 - 2,5 najlepšie 1,5 g/ml. Výhodou cementovej pasty pripravenej z práškového prekurzora uvedeným postupom je jednoduchá príprava, vynikajúca viskozita a konzistencia na plnenie defektov alebo foriem akýchkoľvek tvarov, ako aj odolnosť proti rozpadu vo vodných roztokoch už po 2 minútach od pridania kvapaliny na tuhnutie do práškového prekurzora. Časy tuhnutia cementov pripravených z práškového prekurzora podľa opísaného spôsobu sú v intervale 3-15 minút v závislosti od zloženia cementovej zmesi, času mletia, koncentrácie a množstva kvapaliny na tuhnutie. Výhodou biocementu je výrazné zníženie hodnoty pH v počiatočných fázach tuhnutia na hodnotu 8 - 8,4 pri cemente bez prídavku aminokyselín a 7,4 - 7,8 v cementových zmesiach obsahujúcich aminokyseliny, čo znižuje intenzitu dráždenia okolitých tkanív po aplikácii. Tento fakt je dôsledkom homogénnej distribúcie častíc kyslého monetitu v blízkosti zásaditých tetrakalcium fosfátových častíc a postupného rozpadu povrchových vápnikových komplexov aminokyselín v cementových zmesiach, ako aj podstatne vyššej rozpustnosti spôsobenej nanokryštalického monetitu. Biocement je jednoducho aplikovateľný v mieste defektu ihneď po príprave cementovej pasty a chirurgickej úprave miesta defektu. Optimálne je použitie mikrofraktúry s hlbším umelým defektom v subchondrálnej kosti tak, aby sa vyplavilo dostatočné množstvo mezenchýmových kmeňových buniek z kostnej drene. Nie je potrebná žiadna dodatočná separácia a kultivácia kmeňových buniek, ako aj následné nasadzovanie buniek do miesta defektu. Výsledky m vivo experimentov potvrdili tvorbu súvislej hyalínovej chrupky so zonáínou štruktúrou v mieste defektu v priebehu 12 týždňov.

V ďalšom je predmet vynálezu objasnený na príkladoch uskutočnenia bez toho, aby sa na ne obmedzoval.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je ukázaná histochemická analýza chrupkového tkaniva v 12 týždňoch spracovania osteochondrálneho defektu podľa nároku 4 dokumentujúca prítomnosť glykózaaminoglykánov (šedé až čierne oblasti), morfológiu tkaniva, distribúciu chondrocytov a kolagénu I a Π. H-E - štruktúra novovytvoreného chrupkového tkaniva ofarbená hematoxylín-eozínom; Alcian blue - dôkaz prítomnosti aktívnych chondrocytov produkujúcich glykozanúnoglykány; kolagén II - dôkaz prítomnosti kolagénu Π, ktorý’ predstavuje jednu z hlavných zložiek hyalínovej chrupky; kolagén I - imunohistochemickým farbením nebola dokázaná prítomnosť kolagénu I.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokryštalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 pm a nanokry štalický monetit Obsah jednotlivých zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomení Ca/P rovnajúcemu sa 1,68.

Príklad 2.

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokryštalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 pm a nanokry štalický monetit. Obsah jednotlivých zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomení Ca/P rovnajúcemu sa 1,50.

Príklad 3

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokryštalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 pm, nanokryštalický monetit, GLY a PRO. Obsah jednotlivých kalcium fosfátových zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomeru Ca/P rovnajúcemu sa 1,68 a 2 hmotu. % GLY, a 1 hmom. % PRO.

Príklad 4

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokry štalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 pm, nanokryštalický monetit, GLY a HYP. Obsah jednotlivých kalcium fosfátových zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomeru Ca/P rovnajúcemu sa 1,68 a 2 hmotu. % GLY, a 1 hmom. % HYP.

Príklad 5

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokryštalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 pm, nanokryštalický monetit, GLY, PRO a HYP. Obsah jednotlivých kalcium fosfátových zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomeru Ca/P rovnajúcemu sa '1,68 a 2 hmotu. % GLY, 1 hmotu. % PRO a 1 hmotn. % HYP.

Príklad 6

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokryštalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 um, nanokryštalický monetit, GLY, PRO, HYP a ARG. Obsah jednotlivých kalcium fosfátových zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomení Ca/P rovnajúcemu sa 1,68 a 2 hmotn.% GLY, 1 hmotn. % PRO, 1 hmotn. % HYP a 0,6 ARG.

Príklad 7

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokryštalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 gm, nanokryštalický monetit, GLY, PRO, HYP, ARG a LYS. Obsah jednotlivých kalcium fosfátových zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomeru Ca/P rovnajúcemu sa 1,68 a 2 hmotn. % GLY, 1 hmotn. % PRO, 1 hmotn. % HYP, 0,6 hmotn. % ARG a 0,6 hmotu. % LYS.

Príklad 9

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokryštalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 um, nanokry štalický monetit, GLY, PRO a LYS. Obsah jednotlivých kalcium fosfátových zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomeru Ca/P rovnajúcemu sa 1,68 a 2 hmota. % GLY, 1 hmotu. % PRO a 0,6 hmotn. % LYS.

Príklad 10

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokryštalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 um, nanokryštalický monetit, GLY, PRO a ARG. Obsah jednotlivých kalcium fosfátových zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomeru Ca/P rovnajúcemu sa 1,68 a 2 hmota. % GLY, 1 hmotn. % HYP a 0,6 hmotn. % ARG.

Príklad 11

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokryštalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 um, nanokryštalický monetit, GLY, PRO, HYP a ARG. Obsah jednotlivých kalcium fosfátových zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomeru Ca/P rovnajúcemu sa 1,60 a 2 hmotu. % GLY, 1 hmotn. % PRO, 1 hmotn. % HYP a 0,6 ARG.

Príklad 12.

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesí obsahujúcej práškový mikrokn šíalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 pm, nanokryštalický monetit, GLY, PR.O, HYP a LYS. Obsah jednotlivých kalcium fosfátových zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomeru Ca/P rovnajúcemu sa 1,60 a 2 hmotu. % GLY, 1 hmotn. % PRO, i hmotu. % HYP a 0,6 hmotn. % LYS.

Príklad 13

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokryštalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 pm, nanokryštalický monetit, GLY, PRO, HYP, ARG a LYS. Obsah jednotlivých kalcium fosfátových zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomeru Ca/P rovnajúcemu sa 1,50 a 2 hmotn. % GLY, 1 hmotn. % PRO, 1 hmotn. % HYP, 0,6 hmotu. % ARG a 0,6 hmotn. % LYS.

Príklad 14

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokryštalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 pm, nanokiyštalický monetit, GLY. Obsah jednotlivých kalcium fosfátových zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomeru Ca/P rovnajúcemu sa 1,68 a 3 hmotn. % GLY.

Príklad 15

Biocementový systém zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokryštalický tetrakalcium fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 pm, nanokryštalický monetit, GLY, PRO, HYP, ARG a LYS. Obsah jednotlivých kalcium fosfátových zložiek v biocemente zodpovedá mólovému pomeru Ca/P rovnajúcemu sa 1,50, hmotnosti^ pomer GLY : PRO : HYP : ARG : LYS je 6:3:3:2:2a celkový obsah aminokyselín je 4,5 hmotn. %.

Príklad 3,15 - spôsob prípravy

Vstupná prášková tetrakalcium fosfátová fáza bola pripravená žíhaním zmesi CaHPO4.2H2O a CaCO3 tak, aby sa mólový pomer Ca/P bol rovnal 2,0 pri teplote 1 450 °C/4 hod. na vzduchu. Tetrakalcium fosfátová fáza bola rozdrvená a mletá v guľovom mlyne 30 minút a výsledný prášok mal priemernú veľkosť častíc rovnajúcu sa 8 pm. Kalcium fosfátový cementový systém bol pripravený in situ 30 minútovým mletím práškového tetrakalcium fosfátu v planetárnom guľovom mlyne v takom množstve roztoku kyseliny ortofosforečnej (zriedená v objemovom pomere 1 : 5 v absolútnom etanole), ktoiý zodpovedá výslednému mólovému pomeru Ca/P podľa príkladu 6. K roztoku kyseliny ortofosforečnej boli pred mletím pridané aminokyseliny v množstve podľa príkladu 6. Získaná suspenzia bola sušená pri 80 °C/2 hod. Výsledkom bola homogénna prášková prekurzorová zmes, obsahujúca mikrokryštalický tetrakalcium fosfát, nanokryštalický monetit a naadsorbovane aminoky šelmy.

Príklad 16

Ovciam samičieho pohlavia sa vo veku 1,5 - 2 rokov v celkovej anestézii navodil subchondrálny defekt kĺbovej chrupky v ľavom kolennom kĺbe. Rez bol vedený z ľavej laterálnej strany, od mediálneho patelámeho väzu distálne k tibiálnej drsnatme. Kolenný kĺb bol sprístupnený nad záťažovou plochou mediálneho kondylu stehnovej kosti. Porušilo sa subkulámte väzivo a povrchová fascia. Pri flexii kolenného kĺbu a čiastočnej luxácii kolennej kosti sa použitím kitu Osteochondral autograft transfer systém (Arthrex) navodil defekt kĺbovej chrupky na vopred definovanom mieste distálnej epifýzy stehnovej kosti (distálna epifýza femuru - Ix ľavý mediálny kondyl), v priemere 8 mm a hĺbke 10 mm. Miesto vytvoreného defektu sa následne vyplnilo kalcium fosfátovým biocementom podľa príkladu 1.

Príklad 17

Ovciam samičieho pohlavia sa vo veku 1,5 - 2 rokov v celkovej anestézii navodil subchondrálny defekt kĺbovej chrupky v ľavom kolennom kĺbe. Rez bol vedený z ľavej laterálnej strany, od mediálneho patelámelio väzu distálne k tibiálnej drsnatine. Kolenný kĺb bol sprístupnený nad záťažovou plochou mediálneho kondylu stehnovej kosti. Porušilo sa subkutánne väzivo a povrchová fascia. Pri flexii kolenného kĺbu a čiastočnej iuxácii kolennej kosti sa použitím kitu Osteochondral autograft transfer systém (Arthrex) navodil defekt kí10 bovej chrupky na vopred definovanom mieste distálnej epilýzy stehnovej kosti (distálna epifýza femuru - Ix ľavý mediálny kondyl), v priemere 8 mm a hĺbke 10 mm. Miesto vytvoreného defektu sa následne vyplnilo kalcium fosfátovým biocementom podľa príkladu 6. Odber vzoriek bol uskutočnený po 3 mesiacoch po implantácii testovaného biomateriálu. Histologické analýzy' nepreukázali žiadny zápalový proces v mieste implantácie, morfologické hodnotenie dokázalo vznik hyalínového chrupkového tkaniva so zonálnou štruktúrou 15 a histochemická analýza potvrdila prítomnosť glykozaminoglykánov v aktívnych chondrocytoch (obr. 1).

RTG snímky potvrdili takmer úplné vyhojenie defektu subchondrálnej kosti.

Claims (5)

1. K Y

   1. Biocementový systém na použitie na regeneráciu defektov chrupky, vyznačujúci sa tým, že je zložený z kalcium fosfátovej zmesi obsahujúcej práškový mikrokryštalický tetrakaícmm fosfát s priemernou veľkosťou častíc < 10 um a nanokryštalický monetit, a celkový mólový pomer Ca/P je v intervale od 1,5 do 1,68.
2. 2. Biocemeníový systém podľa nároku 1 na použitie podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa tým, že obsahuje jednu alebo viaceré aminokyseliny zo skupiny glycin, prolín, hydroxyprolín, arginín a lyzínv celkovom množstve do 6 hmota %.
3. 3. Biocemeníový systém podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že vzájomný hmotnostný pomer glycínu : prolínu : hydroxyprolínu : arginínu : lyzínu sa rovná 6:3:3:2:2a celkové množstvo aminokyselín je do 6 hmotn. %.
4. 4. Spôsob prípravy biocementového systému podľa nároku 2, v y z n a č u j ú c í sa tým, že prášková tetrakalcium fosfátová fáza sa melie do 60 minút v roztoku kyseliny orlofosforečnej zriedenej v objemovom pomere 1 : 5 až. 1 : 10 v jednom alebo zmesiach organických rozpúšťadiel, ako sú etanol, metanol, acetón s obsahom vody do 30 obj. %, a obsahujúcom jednu alebo viaceré aminokyseliny zo skupiny glycin, prolín, hydroxyprolín, arginín a lyzín a získaná zmes sa vysuší pri teplote do 80 °C alebo vo vákuu.
5. 5. Biocemeníový systém podľa nárokov i až 3 na použitie na miesto chrupkového alebo osteochondrálneho defektu počas chirurgickej opravy, rekonštrukcie alebo náhrady chrupkového tkaniva.

   1 výkres