ES2251289B1 - Nuevo uso terapeutico de un grupo de polisacaridos sulfatados. - Google Patents
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Abstract
Nuevo uso terapéutico de un grupo de polisacáridos sulfatados. La presente invención se refiere al uso de un polisacárido sulfatado en forma ácida o una sal fisiológicamente aceptable del mismo seleccionado entre el grupo formado por sulfato de inulina, sulfato de gelano, sulfato de pululano, sulfato de curdlano, sulfato de ácido algínico, sulfato de laminarina y sulfato de pectina para la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de la artrosis en un mamífero. Preferentemente el polisacárido sulfatado es sulfato de inulina, más preferentemente polisulfato sódico de inulina. La presente invención también se refiere al uso de un oligosacárido sulfatado derivado de un polisacárido seleccionado entre el grupo formado por inulina, gelano, pululano, curdlano, ácido algínico, laminarina y pectina para la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de la artrosis en un mamífero.
Description
Nuevo uso terapéutico de un grupo de
polisacáridos sulfatados.
La presente invención se refiere al uso de un
polisacárido sulfatado para la preparación de un medicamento para
el tratamiento o profilaxis de la artrosis. De igual modo la
presente invención se refiere al uso de un oligosacárido sulfatado
para la preparación de un medicamento para el tratamiento o
profilaxis de la artrosis.
La artrosis, también llamada osteoartritis es
una enfermedad degenerativa articular que afecta a la mayoría de
las personas a partir de los 65 años de edad, y que se caracteriza
por una paulatina degradación del tejido cartilaginoso, unido a la
presencia de inflamación y dolor. La inflamación se presenta
particularmente cuando la enfermedad está en estado avanzado, siendo
de diferente naturaleza que la inflamación que se observa en la
artritis reumatoide, y generalmente sólo es un componente
minoritario en la patología artrósica. La artrosis se puede definir
como la degeneración del cartílago hialino articular. Secundario a
este efecto se produce la afectación de la membrana sinovial y el
hueso subcondral, así como la formación de hueso nuevo en los
márgenes de las superficies de la articulación. La etiología de la
artrosis es desconocida y su evolución lenta.
El cartílago permite que los huesos se muevan
deslizándose unos sobre otros. También absorbe la tensión que
produce el movimiento físico. En la artrosis, la superficie del
cartílago se rompe y desgasta causando que los huesos se muevan
unos contra otros, produciendo fricción, dolor, hinchazón, y pérdida
de movimiento en la articulación. Con el paso del tiempo la
articulación puede deformarse.
Como ayuda para la diagnosis de la artrosis se
utilizan principalmente dos técnicas: la radiografía, que es el
método más sencillo para identificar los cambios óseos de la
articulación, y la resonancia magnética nuclear (RMN) que a
diferencia de la anterior permite visualizar simultáneamente todos
los componentes de la articulación.
En condiciones normales, la renovación del
cartílago es un proceso muy lento que consiste en una constante
síntesis (anabolismo) y degradación (catabolismo) de los
componentes de la matriz extracelular. El condrocito es la célula
responsable de este metabolismo que debe estar coordinado.
En condiciones patológicas, este proceso se
altera dado que la renovación del cartílago se acelera conduciendo
a una reparación precoz del tejido cartilaginoso causada por un
desequilibrio entre el programa anabólico y catabólico del
condrocito que conlleva una degradación del cartílago. La reacción
de reparación resulta de una hiperproliferación de los condrocitos,
conjuntamente con un incremento en la síntesis de los componentes de
la matriz extracelular del cartílago por parte de estas células (D.
Hamermam et al., N. Engl. J. Med., 320,
1322-1330 (1989)). Existe, por tanto, un balance
entre síntesis y degradación del cartílago que controla dicha
reacción homeostática y que depende de hormonas sistémicas y de
factores de crecimiento cuyas secreciones disminuyen con la edad.
La degradación del cartílago
está regulada por enzimas y radicales libres producidos por tejidos adyacentes, pero también por el mismo condrocito.
está regulada por enzimas y radicales libres producidos por tejidos adyacentes, pero también por el mismo condrocito.
Resaltaremos los siguientes tratamientos
farmacológicos actuales de la artrosis:
Sustancias de acción sintomática que actúan de
forma rápida como los analgésicos, antiinflamatorios no esteroideos
(AINEs), corticoides e inhibidores de la ciclooxigenasa 2
(COX-2).
Sustancias de acción sintomática que actúan de
forma algo más lenta conocidas como SYSADOA (Symptomatic Slow
Acting Drug for Osteoarthritis (Fármacos con acción sintomática
lenta para el tratamiento de la artrosis)) (M.G. Lequesne, Rev.
Rhum. (Eng./Ed.), 61, 69-73 (1994)),
entre las que se encuentran el ácido hialurónico, el sulfato de
condroitina y el sulfato de glucosamina. Este grupo se caracteriza
por presentar un efecto que se inicia después de 2-3
semanas de tratamiento y persiste de 2 a 6 meses después de cesar
su administración.
En la bibliografía se han encontrado documentos
acerca de otras aplicaciones de los polisacáridos sulfatados de la
presente invención:
R.V. Jones (US 2,686,779) describe un
procedimiento para preparar sales de sulfato de inulina con metales
alcalinos. En dicha patente se resalta que las sales alcalinas de
sulfato de inulina con diversos grados de sulfatación se han
aplicado en la industria química como espesantes para pastas,
adhesivos y como aditivos para fangos utilizados en la perforación
de pozos petrolíferos.
Se ha descrito que el sulfato de inulina
presenta una actividad anticoagulante (Arkiv for kemi,
mineralogi o. geologi., Bd 24B (5), 1-4 (1946))
y antilipémica (Arch. Int. Pharmacodyn, XCIX, 334
(1954)).
V.G. Nair et al. (US 4,021,545) dan a
conocer que sales de polisulfato de inulina (completamente
sulfatada) tienen una actividad inhibidora del complemento, por lo
que según los inventores podrían utilizarse en el tratamiento de
enfermedades como la artritis reumatoide, el lupus eritematoso
sistémico, ciertos tipos de vasculitis, etc.
G. Franz et al. (Bioactive
Carbohydrate Polymers, 47-58, Kluwer Academic
Publishers, Netherlands, 2000) describen la actividad anticoagulante
y antitrombótica del sulfato de pululano.
C.C. Lee (EP 499.164) reivindica, aunque no
describe en ningún ejemplo, una composición inyectable que puede
contener carragenano para suplementar los fluidos lubricantes
naturales. En el citado documento no mencionan el polisulfato de
carragenano.
T. Kanamaru et al. (US 5.135.920)
describen que el sulfato de curdlano es un agente angiostático. S.
Alban et al. (Thromb. Res. 78 (3),
201-10 (1995)) describen que el mismo compuesto
actúa como anticoagulante y antitrombótico.
T. Hata et al. (JP 04257509) dan a
conocer la aplicación de sulfato de ácido algínico como hidratante
en preparaciones cosméticas. L. Lange et al. (ES 2.064.736)
describen la utilización de alginato sulfato para inhibir el
colesterol pancreático.
E. Besterman (Brit. Med. J., 310 (1957,
I)) describe que el polisacárido sulfato de laminarina posee
actividad antilipémica. H. Q. Miao et al. (Int. J. Cancer,
83 (3), 424-31 (1999)) revelan la actividad
antimetastática del sulfato de laminarina. P. Bohlen et al.
(WO 03/006645) describen que el polisacárido sulfato de laminarina
inhibe la actividad heparanasa, la cual, según reivindican, se
encuentra asociada, entre otros, a procesos inflamatorios, diabetes
o artritis.
L. Lange et al. (ES 2.064.736) dan a
conocer que el polisacárido sulfato de pectina es útil para tratar
los niveles elevados de colesterol en sangre.
Hasta el momento no se ha encontrado descrito el
uso de sulfato de inulina, sulfato de gelano, sulfato de pululano,
sulfato de curdlano, sulfato de ácido algínico, sulfato de
laminarina o sulfato de pectina con cualquier grado de sulfatación
en el tratamiento o profilaxis de la artrosis.
Tampoco se ha encontrado descrito hasta el
momento el uso de los oligosacáridos sulfatados correspondientes a
los polisacáridos sulfatados citados en el tratamiento o profilaxis
de la artrosis.
Por todo lo dicho se desprende que el
proporcionar un fármaco útil en el tratamiento de la artrosis, es
todavía un problema de la terapéutica.
El problema a solucionar por la presente
invención es proporcionar polisacáridos sulfatados alternativos
para utilizar en el tratamiento o profilaxis de la artrosis. La
solución que corresponde con el primer aspecto de la invención se
refiere al uso de un polisacárido sulfatado en forma ácida o una sal
fisiológicamente aceptable del mismo seleccionado entre el grupo
formado por sulfato de inulina, sulfato de gelano, sulfato de
pululano, sulfato de curdlano, sulfato de ácido algínico, sulfato
de laminarina y sulfato de pectina para la preparación de un
medicamento para el tratamiento o profilaxis de la artrosis en un
mamífero.
En una realización preferida el polisacárido
sulfatado se selecciona entre el grupo formado por sulfato de
inulina, sulfato de gelano, sulfato de pululano y sulfato de
curdlano. Entre estos, los más preferidos son sulfato de inulina y
sulfato de gelano.
En una realización más preferida el polisacárido
sulfatado se encuentra total o parcialmente salificado con un metal
alcalino o alcalinotérreo. Preferentemente el metal alcalino es
sodio y el polisacárido preferido es sulfato sódico de inulina.
Igualmente preferido es el polisacárido sulfato sódico de
gelano.
Más preferida es el sulfato sódico de inulina
que presenta un grado de sulfatación comprendido entre el 25% y el
62%, sobre base anhidra.
Aún más preferida es el sulfato sódico de
inulina que presenta un grado de sulfatación comprendido entre el
55% y el 62%, sobre base anhidra.
En una realización igualmente preferida el
polisacárido sulfatado se encuentra parcialmente hidrolizado.
En una realización más preferida el polisacárido
parcialmente hidrolizado es un oligosacárido sulfatado.
Preferentemente derivado de la inulina o del gelano.
En otra realización igualmente preferida el
polisacárido sulfatado es un polisacárido polisulfatado,
seleccionado entre el grupo formado por polisulfato de inulina,
polisulfato de gelano, polisulfato de pululano, polisulfato de
curdlano, polisulfato de ácido algínico, polisulfato de laminarina y
polisulfato de pectina. Entre estos, el más preferido es
polisulfato de inulina, preferentemente polisulfato sódico de
inulina. Igualmente preferido es polisulfato de gelano,
preferentemente polisulfato sódico de gelano.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de un oligosacárido sulfatado en forma ácida o una sal
fisiológicamente aceptable del mismo, derivado de un polisacárido
seleccionado entre el grupo formado por inulina, gelano, pululano,
curdlano, ácido algínico, laminarina y pectina para la preparación
de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de la artrosis
en un mamífero.
En una realización preferida el oligosacárido
sulfatado es un oligosacárido polisulfatado.
En una realización especialmente preferida el
medicamento se adapta para administración oral.
Igualmente, en una realización especialmente
preferida el medicamento se adapta para administración
\hbox{intraarticular.}
Los polisacáridos sulfatados de la presente
invención son conocidos, y se pueden obtener mediante sulfonación
parcial o total de los grupos hidroxilos libres presentes en la
estructura de los polisacáridos: inulina, gelano, pululano,
curdlano, ácido algínico, laminarina y pectina.
La sulfonación de un grupo hidroxilo da lugar al
correspondiente grupo sulfato.
Cuando en la memoria de la presente invención se
habla de grado de sulfatación se refiere al % de grupos sulfatos
sobre base anhidra (respecto a la molécula).
Cuando en la memoria de la presente invención se
habla de polisacáridos sulfatados se refiere a un polisacárido
sulfatado con cualquier grado de sulfatación. A un polisacárido
sulfatado con un elevado grado de sulfatación, en la literatura se
tiende a denominarlo polisacárido polisulfatado, y por supuesto,
cuando el polisacárido está totalmente sulfatado también se le
denomina polisacárido polisulfatado. Así pues, en la presente
invención están incluidos los polisacáridos polisulfatados
(polisulfato de inulina, polisulfato de gelano, polisulfato de
pululano, polisulfato de curdlano, polisulfato de ácido algínico,
polisulfato de laminarina y polisulfato de pectina).
Los polisacáridos sulfatados se pueden obtener
por sulfonación parcial o total de los hidroxilos libres de los
polisacáridos comerciales citados anteriormente, utilizando
procedimientos descritos en la literatura, como por ejemplo mediante
ácido clorosulfónico/piridina (T. Astrup et al., Acta Physiol.
Scand., 8, 215-226 (1944)), o bien utilizando
ácido piperidina-N-sulfónico (N.
Kinzo et al., Carbohyd. Res., 21, 420-426
(1972)), o bien empleando el complejo trióxido de
azufre-piridina (C. Mähner et al., Carbohyd.
Res., 331, 203-208 (2001)).
Para obtener diferentes grados de sulfatación se
pueden modificar los procedimientos citados anteriormente (variar
la concentración de los reactivos, temperatura de reacción, tiempos
de reacción etc...). También, si se desea, se pueden sulfonar
selectivamente diferentes hidroxilos del polisacárido, mediante
protección/desprotección de los hidroxilos del polisacárido.
Si el polisacárido de partida tiene un peso
molecular medio demasiado elevado, si se desea, se puede hidrolizar
parcialmente antes o después de la sulfonación.
Los oligosacáridos sulfatados que se utilizan en
la invención se pueden obtener mediante hidrólisis enzimática o
química (procedimientos bien establecidos en la literatura) del
polisacárido comercial, seguido de sulfonación, o bien directamente
por hidrólisis enzimática o química del polisacárido sulfatado.
También se pueden obtener por síntesis química.
Cuando en la memoria de la presente invención se
habla de una sal fisiológicamente aceptable se refiere a una sal de
metal alcalino, como por ejemplo sodio o potasio, una sal de metal
alcalinotérreo, como por ejemplo calcio o magnesio, o bien una sal
orgánica, como por ejemplo sal con trimetilamina, con trietilamina,
o con un aminoácido, como por ejemplo lisina, arginina, prolina,
glicina o serina.
La salificación del polisacárido sulfatado se
puede llevar a cabo a través de procedimientos químicos sencillos
bien conocidos.
Para utilizar en el tratamiento o prevención de
la artrosis, los polisacáridos sulfatados de la invención, en forma
ácida o una sal fisiológicamente aceptable de la misma, se formulan
en composiciones farmacéuticas adecuadas, recurriendo a técnicas y
excipientes o vehículos convencionales, como los descritos en
Remington's Pharmaceutical Sciences Handboock, Mack Pub. Co.,
N.Y., USA.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
pueden administrarse al paciente en dosis requeridas. La
administración de las composiciones puede efectuarse por diferentes
vías, por ejemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal,
intraarticular, subcutánea, intramuscular, tópica, sublingual,
intradermal o intranasal. Las composiciones farmacéuticas de la
invención incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz del
polisacárido sulfatado de la presente invención, en forma ácida o
una sal fisiológicamente aceptable de la misma, dependiendo dicha
cantidad de muchos factores, como por ejemplo, el estado físico del
paciente, edad, sexo, compuesto particular, vía de administración y
de otros factores bien conocidos en la técnica. Además, se entenderá
que dicha dosificación de compuesto activo puede administrarse en
unidades de dosis única o múltiple para proporcionar los efectos
terapéuticos deseados. Si se desea, pueden emplearse otros agentes
terapéuticos junto con los proporcionados por la presente
invención.
invención.
Las preparaciones farmacéuticas de la invención
generalmente estarán en forma sólida, líquida o como gel. Entre las
preparaciones farmacéuticas en forma sólida que pueden prepararse
de acuerdo con la presente invención se incluyen polvos,
minigránulos (pellets), comprimidos, gránulos dispersables,
cápsulas, sellos, supositorios y otras formas galénicas sólidas.
Entre las preparaciones en forma líquida se incluyen soluciones,
suspensiones, emulsiones y microesferas. Se contemplan también las
preparaciones de formas sólidas que se desean convertir,
inmediatamente antes de ser utilizadas, en preparaciones en forma
líquida para la administración por vía oral, parenteral o
intraarticular. Dichas formas líquidas incluyen soluciones,
suspensiones y emulsiones.
La Figura 1 representa un Western Blott. La
flecha superior indica la zona de agrecano intacto y la flecha
inferior indica la zona de fragmentos de agrecano marcados con el
anticuerpo NITGE G1. En el primero de los pocillos se sembró una
muestra control (sin tratamiento), en el segundo una muestra tratada
con interleuquina-1 (IL-1), en el
tercero una muestra tratada con 100 \mug/mL de polisulfato de
inulina del Ejemplo Químico 1 y en el cuarto una muestra tratada
con IL-1 y 100 \mug/mL de polisulfato de inulina
del Ejemplo Químico 1.
Los siguientes ejemplos son meramente
ilustrativos y no representan una limitación del alcance de la
presente invención.
Ejemplo
Químico
Con agitación constante y a una temperatura <
de 6ºC, se añadieron gota a gota 88 mL (1,32 mol; 1,8 eq/OH) de
ácido clorosulfónico sobre 580 mL (7,20 mol) de piridina seca. La
mezcla resultante se calentó a 75ºC y posteriormente se adicionaron
40 g (0,25 mol) de inulina (Fibruline Standar, comercializada por
Trades S.A.). Se continuó la agitación y el calentamiento a 100ºC
por espacio de 5 h. Transcurrido este tiempo la mezcla de reacción
se dejó enfriar hasta aproximadamente 50ºC y se adicionaron 50 mL
de agua desionizada para destruir el exceso de ácido
clorosulfónico. Durante este paso la temperatura del medio se elevó
ligeramente y aparecieron dos fases.
El crudo de reacción se dejó en reposo hasta que
alcanzó la temperatura ambiente. La fase superior (piridina) se
separó por succión, mientras que la fase inferior oleosa se vertió
sobre una solución al 10% de acetato de sodio en metanol. El
precipitado que se formó se dejó sedimentar. El sobrenadante se
separó por decantación y se descartó.
El tratamiento con la solución metanólica de
acetato de sodio se repitió dos veces y en el último paso el sólido
se separó por filtración a vacío con un filtro de profundidad tipo
k-100 (Pall Corporation.
Seitz-k-100).
El filtro obtenido (sólido marrón) se disolvió
en agua destilada y la solución resultante se filtró a vacío por un
filtro de profundidad k-100 para eliminar restos de
materia insoluble procedentes de la reacción.
El filtrado procedente del paso anterior era una
solución de color ámbar oscuro que se trató con amonio cuaternario
(Cuartamin). Como consecuencia, se formó un sólido muy abundante
que se aisló por filtración a vacío utilizando una
pre-capa de tierras Hyflo (100 g). El filtro se
lavó abundantemente con agua destilada.
El complejo polisulfato de
inulina-Cuartamin se separó cuidadosamente de las
tierras de filtración y se trató con una solución acuosa de NaCl
20%, a 80ºC, durante dos horas.
Transcurridas las dos horas de reacción se
detuvo el calentamiento, y cuando la temperatura del medio alcanzó
60ºC se adicionó isopropanol. La agitación se mantuvo por espacio
de 30 min. y luego la mezcla se vertió en un embudo de decantación
para separar la fase acuosa de la orgánica.
La fase orgánica (isopropanol + amonio
cuaternario) se desechó. La fase acuosa se filtró a vacío para
eliminar los restos de tierras Hyflo.
Sobre la fase acuosa se vertió una mezcla de
metanol/acetona. El precipitado marrón que se formó se dejó
sedimentar. El sobrenadante se separó por decantación y se desechó.
El sedimento se lavó con metanol y posteriormente se disolvió en
agua desionizada.
El pH de la solución resultante se ajustó entre
10,5-11 con NaOH 10%. La solución se calientó a
50ºC y se trató durante 15 min. con H_{2}O_{2}. Finalmente se
detuvo el calentamiento y el pH del medio se ajustó a 5,5 con una
solución de ácido acético al 2%.
Cuando la solución decolorada alcanzó la
temperatura ambiente, se vertió sobre ella una solución de
metanol/aceta-
to de sodio 10%. Inmediatamente se formó un precipitado blanco o ligeramente amarillo que se dejó sedimentar.
to de sodio 10%. Inmediatamente se formó un precipitado blanco o ligeramente amarillo que se dejó sedimentar.
El sobrenadante se separó por decantación y el
sedimento se anhidrificó abundantemente con metanol.
El sulfato de inulina se separó por filtración a
vacío con placa porosa Nº 3 y se secó en estufa de vació a 30ºC
hasta que la concentración de metanol fue igual o inferior a
0,3%.
El producto se obtuvo como un polvo fino,
amorfo, de color blanco o ligeramente amarillo.
Se pesaron exactamente 150 mg de producto, se
disolvieron en agua y la solución resultante se llevó hasta 250 mL
con el mismo disolvente. Se pipetearon 5 mL de esta solución, se
transfirieron a un vaso de precipitados de 50 mL y se añadieron 25
mL de agua. Se valoró fotométricamente a 420 nm con una solución de
cloruro de N-cetilpiridinio (CPC) al 0,1% (0,00279 M).
Se calculó el contenido en sulfatos mediante la
siguiente ecuación:
%SO_{4} =
\frac{V \times 0,00279 \times 96 \times 100}{\frac{5
\times(100 - PPS) \times P}{250 \times 100}} = \frac{13,392
\times V \times 100}{\frac{100 - PPS}{100} \times
P}
Donde:
V: Volumen consumido de la solución de CPC 0,1%
en mL.
P: Peso de muestra en mg.
PPS: Pérdida de peso por desecación del producto
(105ºC, 4 h) en %.
Grado de sulfatación obtenido: 58,0% expresado
sobre base anhidra, lo cual corresponde a una molécula de inulina
completamente sulfatada (sulfonación de todos los hidroxilos)
Piridina residual libre y en forma de sal: 127
ppm (el límite permitido es 200 ppm)
Sulfatos libres: 0,08%
IR (KBr) cm^{-1}: 2900
(C-O-H), 1247 (S=O), 800
(C-S-O).
La resistencia del cartílago y su capacidad de
reparación está determinada por los proteoglicanos de la matriz
extracelular, y especialmente por los agrecanos. La síntesis de
éstos agrecanos por los condrocitos articulares y su calidad
disminuyen con la edad, lo que constituye uno de los factores
principales implicados en el desarrollo de la artrosis.
Este procedimiento se puede aplicar a la
evaluación de cualquier polisacárido sulfatado de la presente
invención.
Los condrocitos articulares humanos se aislaron
según los métodos descritos por W.T. Green Jr. (Clin. Orthop.,
75, 248-260 (1971)) y K.E. Kuettner et
al. (J. Cell. Biol., 93, 743-750
(1982).
Estos condrocitos se cultivaron en un gel de
agarosa según el método descrito por P.D. Benya et al.
(Cell, 30, 215-224, (1982)), y modificado por
G. Verbruggen et al. (Clin. Exp. Rheumatol., 8,
371-378 (1990)) y por M. Cornelissen et al.
(J. Tiss. Cult. Meth., 15, 139-146
(1993)).
La síntesis de agrecanos se determinó mediante
la incorporación de ^{35}S, utilizando como precursor radioactivo
sulfato de sodio marcado Na_{2}^{35}SO_{4}. Después de dos
semanas de cultivo, se introdujeron 10 \muCi/mL de precursor
radiomarcado en el medio de cultivo durante 48 h, así como también
el compuesto a ensayar (polisulfato de inulina del Ejemplo Químico
1) a diferentes concentraciones (0,0, 0,1, 0,5, 1,0, 5,0
\mug/mL).
Los ^{35}S agrecanos sintetizados de nuevo se
acumularon parcialmente en la matriz de agarosa intercelular o bien
se liberaron en el medio de incubación.
Finalizado el periodo de incubación, el gel de
agarosa se rompió mecánicamente y después se digirió mediante 3 mL
de una solución de agarosa de 50 U/mL en un tampón fosfato 0,067 M
de pH 6,0, en presencia de inhibidores de proteinasa.
La suspensión así obtenida se centrifugó, el
sobrenadante que contenía los ^{35}S agrecanos de la matriz
interterritorial, y el medio de incubación que contenía los
metabolitos de ^{35}S agrecanos liberados en la matriz
extracelular se reunieron posteriormente por cromatografía.
El residuo, que contenía los condrocitos y los
^{35}S agrecanos asociados, se trató durante 48 horas con 1 mL de
una solución de cloruro de guanidinio 4,0 M en un tampón acetato
0,05 M de pH 5,8 que contenía los inhibidores de proteinasa.
El objetivo de esta operación es la extracción
de los ^{35}S agrecanos asociados a las células. La solución
obtenida se centrifugó para separar las células del sobrenadante
que se separó posteriormente por cromatografía. Las operaciones de
cromatografía de las diferentes fracciones obtenidas se llevaron a
cabo sobre gel de Sephadex G25 en un tampón fosfato pH 6,8 que
contenía 0,01 M de Na_{2}SO_{4}, para separar los ^{35}S
agrecanos del Na_{2}^{35}SO_{4} libre.
La radioactividad de cada uno de los eluyentes
macromoleculares obtenidos se midió y se relacionó con el número de
condrocitos contenidos en el cultivo inicial y se expresó en pg de
^{35}SO_{4} incorporados en los agrecanos, por millón de
condrocitos y por hora.
Se presentan en las Tablas 1, 2 y 3.
Las tablas muestran la eficacia remarcable del
polisulfato de inulina 10 del Ejemplo Químico 1, en la producción
total de agrecanos sintetizados de nuevo (Tabla 3). El polisulfato
de inulina del Ejemplo Químico 1 también es capaz de aumentar la
producción de agrecanos tanto en la matriz interterritorial (Tabla
1) como los asociados a las células (Tabla 2).
La actividad óptima se encuentra a una
concentración alrededor de 0,5 \mug/mL.
\vskip1.000000\baselineskip
| pg ^{35}S/10^{6} cels/h | % cambio | % Total | PSI (\mug/mL) |
| 7.710 | 67,4 | 0,0 | |
| 7.818 | 1,4 | 66,2 | 0,1 |
| 12.383 | 60,6 | 70,7 | 0,5 |
| 10.887* | 41,2* | 70,7 | 1,0 |
| 8.340 | 8,2 | 67,9 | 5,0 |
| \begin{minipage}[t]{158mm} Cantidad de azufre marcado radioactivamente incorporado en los agrecanos de la matriz interterritorial, por millón de células y por hora. % Cambio = Porcentaje de cambio respecto al control no tratado (PSI = 0,0 \mu g/mL). % Total = Porcentaje respecto a la cantidad total de agrecanos. PSI: dosis de polisulfato de inulina del Ejemplo Químico 1 añadido. * p < 0,05 respecto al control no tratado.\end{minipage} | |||
| pg ^{35}S/10^{6} cels/h | % cambio | % Total | PSI (\mug/mL) |
| 2.378 | 20,9 | 0,0 | |
| 2.737 | 15,1 | 23,5 | 0,1 |
| 3.064* | 28,8* | 18,4 | 0,5 |
| 2.662 | 11,9 | 17,9 | 1,0 |
| 2.041 | 14,2 | 17,4 | 5,0 |
| \begin{minipage}[t]{158mm} Cantidad de azufre marcado radioactivamente incorporado en los agrecanos de la matriz extracelular asociada a las células, por millón de células y por hora. % Cambio = Porcentaje de cambio respecto al control no tratado (PSI = 0,0 \mu g/mL). % Total = Porcentaje respecto a la cantidad total de agrecanos. PSI: dosis de polisulfato de inulina del Ejemplo Químico 1 añadido. * p < 0,05 respecto al control no tratado.\end{minipage} | |||
| pg ^{35}S/10^{6} cels/h | % cambio | % Total | PSI (\mug/mL) |
| 11.429 | 100 | 0,0 | |
| 11.756 | 2,9 | 100 | 0,1 |
| 17.312* | 51,5* | 100 | 0,5 |
| 15.281* | 33,7* | 100 | 1,0 |
| 12.106 | 3,0 | 100 | 5,0 |
| \begin{minipage}[t]{158mm} Cantidad total de azufre marcado radioactivamente incorporado en los agrecanos sintetizados de nuevo, por millón de células y por hora. % Cambio = Porcentaje de cambio respecto al control no tratado (PSI = 0,0 \mu g/mL). % Total = Porcentaje respecto a la cantidad total de agrecanos. PSI: dosis de polisulfato de inulina del Ejemplo Químico 1 añadido. * p < 0,05 respecto al control no tratado.\end{minipage} |
Los condrocitos articulares humanos se aislaron
y se cultivaron según los métodos descritos anteriormente.
La acumulación de agrecanos asociados a los
condrocitos se midió, después de una semana de cultivo, mediante la
técnica de inmunocitoquímica descrita por L. Wang et al.
(Osteoarthritis Cart., 9, 248-260 (2001)).
Los condrocitos fueron tratados con interleuquina-1
(IL-1) para simular una situación de inflamación y
catabolismo. El polisulfato de inulina del Ejemplo Químico 1 se
adicionó conjuntamente con IL-1.
Finalizado el periodo de incubación, los
condrocitos se liberaron del gel de agarosa según el método
descrito. Los condrocitos y los agrecanos asociados se estudiaron
mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales
dirigidos específicamente contra la parte proteica de los
agrecanos.
Se presentan en la Tabla 4.
Esta Tabla confirma la eficacia del polisulfato
de inulina del Ejemplo Químico 1 sobre la producción de agrecanos
asociados a las células.
Además se puede observar que existe una relación
dosis-efecto, ya que a mayor dosis de compuesto se
produce un aumento mayor de la producción de agrecanos asociados a
las células.
Este procedimiento se puede aplicar a la
evaluación de cualquier polisacárido sulfatado de la presente
invención.
Se establecieron cultivos de condrocitos de
condrosarcoma de ratas en placas de 24 pocillos y se dejaron crecer
hasta llegar al 80% de confluencia en medio DMEM (Dulbecco's
Modification of Eagle's Medium) (+4,5 g/L de glucosa) + 10% de suero
bovino fetal (FCS).
Posteriormente, se retiró el medio de cultivo y
fue sustituido con 1 mL de DMEM (+4,5 g/L de glucosa) + 10% FCS +
20 \muCi/mL ^{35}S (Na_{2}^{35}SO_{4}) y 1, 10 y 100
\mu/mL de polisulfato de inulina del Ejemplo Químico 1. La
incorporación se facilitó durante 18 horas y después se finalizó
con la adición de guanidina HCl sólida.
Se separaron las macromoléculas solubilizadas
por la guanidina HCl de los isótopos no incorporados mediante
cromatografía y se determinó la radioactividad mediante un contador
de centelleo.
Se presentan en la Figura 1, donde se representa
un Western Blott resultado de los distintos tratamientos aplicados
a un cultivo de condrocitos de condrosarcoma de rata. En dicha
figura puede observarse como el tratamiento de los condrocitos con
IL-1 provoca un aumento de la degradación de
agrecano, por lo que la banda de fragmentos de agrecano marcados
con el anticuerpo NITGE G1 se hace más gruesa. Por el contrario,
cuando el cultivo es tratado con polisulfato de inulina del Ejemplo
Químico 1, en presencia o no de IL-1, se inhibe la
degradación de agrecano, por lo que la banda anteriormente
mencionada se estrecha hasta casi desaparecer. Así pues, el
polisulfato de inulina es capaz de disminuir la degradación de
agrecanos en un cultivo de condrocitos, por lo que también frenará
la degradación de la matriz extracelular en casos de pacientes con
artrosis.
Claims (22)
1. Uso de un polisacárido sulfatado en forma
ácida o una sal fisiológicamente aceptable del mismo seleccionado
entre el grupo formado por sulfato de inulina, sulfato de gelano,
sulfato de pululano, sulfato de curdlano, sulfato de ácido
algínico, sulfato de laminarina y sulfato de pectina para la
preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de
la artrosis en un mamífero.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que el
polisacárido sulfatado en forma ácida o una sal fisiológicamente
aceptable del mismo se selecciona entre el grupo formado por
sulfato de inulina, sulfato de gelano, sulfato de pululano y
sulfato de curdlano.
3. Uso según la reivindicación 2, en el que el
polisacárido sulfatado es sulfato de inulina.
4. Uso según la reivindicación 2, en el que el
polisacárido sulfatado es sulfato de gelano.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4, en el que el polisacárido sulfatado se encuentra total o
parcialmente salificado con un metal alcalino o alcalinotérreo.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que el
metal alcalino es sodio.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que el
polisacárido sulfatado en forma de sal de sodio es sulfato sódico
de inulina.
8. Uso según la reivindicación 6, en el que el
polisacárido sulfatado en forma de sal de sodio es sulfato sódico
de gelano.
9. Uso según la reivindicación 7, en el que el
sulfato sódico de inulina presenta un grado de sulfatación
comprendido entre el 25% y el 62%, sobre base anhidra.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que el
grado de sulfatación está comprendido entre el 55% y el 62%, sobre
base anhidra.
11. Uso según la reivindicación 1, en el que el
polisacárido sulfatado se encuentra parcialmente hidrolizado.
12. Uso según la reivindicación 11, en el que el
polisacárido sulfatado parcialmente hidrolizado es un oligosacárido
sulfatado.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que el
oligosacárido sulfatado deriva de la inulina.
14. Uso según la reivindicación 12, en el que el
oligosacárido sulfatado deriva del gelano.
15. Uso según la reivindicación 1 u 11, en el
que el polisacárido sulfatado es un polisacárido polisulfatado.
16. Uso según la reivindicación 15, en el que el
polisacárido polisulfatado se selecciona entre el grupo formado por
polisulfato de inulina, polisulfato de gelano, polisulfato de
pululan, polisulfato de curdlano, polisulfato de ácido algínico,
polisulfato de laminarina y polisulfato de pectina.
17. Uso según la reivindicación 16, en el que el
polisacárido polisulfatado es polisulfato de inulina.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que el
polisulfato de inulina es polisulfato sódico de inulina.
19. Uso según la reivindicación 16, en el que el
polisacárido polisulfatado es polisulfato de gelano.
20. Uso según la reivindicación 19, en el que el
polisulfato de gelano es polisulfato sódico de gelano.
21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 20, en el que el medicamento se adapta para administración
oral.
22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 20, en el que el medicamento se adapta para administración
intraarticular.
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