JP5537933B2 - 変形性骨関節炎を治療するための硫酸化ヒアルロン酸 - Google Patents

Description

発明の主題
本発明は、変形性骨関節炎の治療において有効である硫酸化ヒアルロン酸に基づく、経口製剤および関節内製剤に関する。

発明の分野
骨関節炎（ＯＡ）は、細胞成分および細胞外成分の喪失の後に薄化し、劣化し、完全に消失することさえあり得る、関節軟骨の進行性変性を特徴とする、非常に一般的な障害である。この疾患の原因は、部分的にしか明らかでない。原因には、基本的に、例えば、外傷または機械的ストレス後の、関節全体に影響する力学的不均衡によって誘発される、一連のプロセスが関与していると思われる。軟骨の内部では、消耗した細胞外基質の破壊とインタクトな基質の形成との間で、繊細な均衡が存在する。すべてこれは、関節基質の細胞成分である、軟骨細胞によって産生される酵素に大きく依存する。関節上に過剰または不均衡な負荷がかかる事象では、炎症性状況が生じる。これは、炎症性サイトカインの放出を誘発し、これは次に、軟骨細胞を刺激して軟骨の破壊に関与する酵素である、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を産生させ、こうして細胞外基質の合成と分解との間の均衡を変化させる。科学文献にも、軟骨細胞が、基質の崩壊によって産生される物質に接触するとき、軟骨細胞に影響する細胞死プロセスが詳細に記載されている（Ｃａｏら、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、１９９９、２４６：５２７−３７）。

上述した要因を考慮して、変形性骨関節炎は、炎症性骨関節炎として知られる、初期の急性段階の炎症後に通常起こる慢性疾患として定義することができる。関節中の炎症状態（他の物質とともにサイトカインおよびＭＭＰによって引き起こされる）の存在または不存在により、疾患の急性炎症段階（炎症性骨関節炎）と慢性非炎症段階（変形性骨関節炎）が区別される。変形性骨関節炎は、炎症性骨関節炎の慢性段階として起こるだけでなく、関節軟骨の生理的老化にも起因する。

したがって、細胞外基質の完全性は、軟骨細胞の生存に重大であり、その結果として健康な軟骨に必須である。

軟骨基質は、コラーゲン分子およびプロテオグリカンの凝集複合体からなる３次元構造であり、この複合体はさらには、
− ヒアルロン酸（ＨＡ）の骨格、
− グルコサミンまたはガラクトサミンの繰り返し二糖単位を含有し、さらには、負に帯電したカルボキシル基またはサルフェート基を保有し、その結果、長い負に帯電した鎖を形成する、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、
− ポリペプチド
によって形成される。

ＨＡは、かなりの粘弾性特性を有する多糖分子である。これは、滑液の基本成分として、関節腔中に存在し、そこでこれは、滑剤および衝撃吸収剤として作用し、軟骨細胞を炎症性サイトカインの作用から保護する（Ａｓａｒｉら、Ａｒｃｈ Ｈｉｓｔｏｌ Ｃｙｔｏｌ、１９９５、５８：６５−７６；Ｂｒｕｎら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒ Ｃａｒｔｉｌ、２００３、１１：２０８−１６；Ｓｔｏｖｅら、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ、２００２、２０：５５１−５）。ＨＡは、そのようなものとして、または誘導体化された形態で、「ビスコサプリメント（ｖｉｓｃｏｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）」または滑剤のいずれかとして、変形性骨関節炎を治療するのに古くから使用されてきている。

様々な製品として（例として）、Ｈｙａｌｇａｎ（登録商標）（ＥＰ１３８５７２Ｂ１に従って、雄鶏のとさかから精製されたＨＡ）、Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）（Ｈｙｌａｎ Ｇ−Ｆ２０、すなわち、特許ＵＳ４７１３４４８に記載されているような、ホルムアルデヒドおよびジビニルスルホンと架橋したＨＡ）、およびＡｒｔｚ（登録商標）（６２０と１２００ｋＤａの間の分子量を有するＨＡ）が挙げられ、これらは、関節内経路によってのみ投与することができる。

従来技術による経口治療は、関節腔でのＨＡ合成を促進し、炎症を低減し、骨関節炎関節中の軟骨細胞を保護するために、ＨＡおよび加水分解コラーゲンとともに、硫酸化ＧＡＧ、例えば、グルコサミンサルフェートおよびコンドロイチン硫酸などを投与することを伴う（ＵＳ６６４５９４８；ＵＳ６４７６００５）。

科学的な証拠により、炎症性骨関節炎を患っている患者の滑液中のＨＡ含量を増加させることにおける、硫酸化ＧＡＧの効力が明らかに実証されている（ＭｃＣａｒｔｙら、Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈ、２０００、５４：７９８−８０２；ＭｃＣａｒｔｙ ＭＦ、Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈ、１９９８、５０：５０７−５１０）。

コンドロイチン硫酸とともにＨＡを関節内投与することが関与する（ＵＳ６９０６０４４）、またはグルコサミン、コンドロイチン硫酸もしくはグルコサミンサルフェートを場合により伴った（ＵＳ６９２４２７３）、所与の用量のＨＡでの経口治療を特許請求している（特許ＵＳ６６０７７４５）、炎症性骨関節炎のための新規な治療を記載している、さらなる特許および特許出願も知られている。最後に、骨粗鬆症の予防および治療のための、高分子量を有するＨＡの使用が知られている（特許出願ＷＯ２００５／０３２２７６）。

グルコサミンサルフェートおよびコンドロイチン硫酸に加えて、コンドロプロテクション（ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）のために使用される別の硫酸化ＧＡＧは、従来技術に記載されているような、適切に硫酸化されたＨＡであり、抗炎症、抗凝血、および細胞接着阻害効果は、これに起因する。

特に、ＵＳ２００４００５３８８５には、炎症性関節炎、および特に関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）（自己免疫疾患）の関節内治療における、硫酸化ヒアルロン酸（以後ＨＡ−Ｓと呼ばれる）の使用が開示されており、一方、ＥＰ７５４４６０Ｂ１には、関節リウマチ（ｊｏｉｎｔ ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）を含めた、炎症状態の非経口注射治療におけるＨＡ−Ｓの使用が特許請求されている。

本発明は、従来技術に取って代わるが、これは、本発明が、経口投与または関節内注射用の、化学的に硫酸化されたＨＡに基づく製剤に関し、これが、関節の変性を有効に遅らせ、炎症段階ではない結果である、慢性変形性骨関節炎によって冒された関節中の細胞外基質の再構築を促進するためである（したがって、これらの組成物は、炎症性骨関節炎を治療するのに使用することはできない）。特に好ましい態様によれば、本発明は、ＥＰ７０２６９９Ｂｌに記載されているように、硫酸化によって化学的に修飾されたＨＡに基づく製剤に関する。本出願者は、骨関節炎性軟骨欠損症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）の治療における、硫酸化グリコサミノグリカンに基づく標準的治療と比較することによって、ＨＡ−Ｓの治療効力を実証し、その効力を非硫酸化ＨＡと比較することによって、ＧＡＧおよびＨＡの両方に対するＨＡ−Ｓの明らかな薬理学的優位性を実証した。

軟骨組織の病理組織学的分析による変性度の評価結果を示す図である。 軟骨組織の病理組織学的分析による構造完全性の評価結果を示す図である。 病変による磨耗の平均深度を示す図である。

発明の詳細な説明
本発明は、炎症後遺症を伴わない、慢性形態の変形性骨関節炎の（好ましくは経口）治療において有効である、硫酸化によって化学的に修飾されたＨＡに基づく製剤に関する。

既に述べたように、変形性骨関節炎のプロセスは、関節軟骨中の細胞外基質に対する進行性の損傷の原因となる。この損傷は、基質の薄化および軟骨細胞成分の喪失によって顕在化する。このプロセスは、関節軟骨の完全破壊に達する。この障害は、炎症性骨関節炎の慢性化（ｃｈｒｏｎｉｃｉｓａｔｉｏｎ）として顕在化し、または関節老化プロセスの生理的発達を表す場合がある。

形態学的観点から、軟骨は、関節表面から軟骨下骨まで、４つの異なるゾーン、すなわち、
− ゾーンＩ：部分的にしか細胞化（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｓｅｄ）していない、最も薄い、最も外側の部分、
− ゾーンＩＩ：最も高い割合の細胞を含有し、基質生成に基本的に関与する、移行ゾーン、
− ゾーンＩＩＩ：最も大きく、軟骨の全体の厚さがその構造に依存する、放射状ゾーン、
− ゾーンＩＶ：放射状ゾーンを軟骨下骨から分離する薄層である、石灰化ゾーン
に分割することができる。

冒されるゾーンが深いほど、変形性骨関節炎によって生じる損傷は、より重度である。これは、炎症性疾患によるものであっても、加齢または過負荷によって生じる、生理的な関節老化に起因しても、同じゾーンを伴って、同じプロセスで発症する。

その耐荷重性骨格を強化し、細胞喪失を防止するために、プロテオグリカンのその複雑な構造を再構成する必要のある細胞外基質に「ビルディングブロック」を提供することのできる薬理学的治療は、障害の慢性化の段階で最も有用であろう。本発明は、硫酸化ヒアルロン酸の投与が、これらの目的に対する妥当な治療手法を代表することを実証するが、これは、硫酸化ヒアルロン酸の投与によって、軟骨基質の「足場」を構成する物質の存在を、関節内で増加させ、かつ軟骨基質の構造的完全性を保証することにより、その脱細胞化（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）が防止されるためである。したがって、本発明の製剤は、軟骨損傷の予防のためにも使用することができる。

本出願者によって実施されたｉｎ ｖｉｖｏ試験は、ＨＡ−Ｓが、他のＧＡＧおよび非硫酸化ＨＡよりも驚くほど大きな程度で、分解を遅らせ、細胞外基質の基本構造の再生を刺激することを実証する。

本発明の目的に適した硫酸化ヒアルロン酸は、ＥＰ７０２６９９Ｂ１に記載された方法によって調製される。この方法では、ＳＯ₃−ピリジン複合体に硫酸化が実施され、多糖鎖中に存在するアルコール性ヒドロキシルが関与する。

硫酸化度は、抽出、発酵、または技術的手段によって生成されるＨＡを使用して、５００００から８０００００Ｄ、好ましくは、１０００００から２３００００Ｄの範囲の様々な分子量を有するＨＡから開始して、０．５と３．５の間の範囲とすることができ（ＥＰ０９４０４１０Ｂ１）、好ましくは０．５と１．５の間である（平均グレードは、１：１のサルフェート基対二糖基として定義される）。

得られる誘導体は、出発ポリマーのすべての物理的特性を維持する。特に、ＨＡの分子量は、硫酸化プロセスによって変化せず、その結果として、出発多糖と同じ粘性を維持することが可能になる。

以下に説明する実験は、未処置の対照に対して、１８０／２００ＫＤの平均分子量および１の平均硫酸化度を有する、発酵によって生成されたＨＡ−Ｓを、Ｃｏｎｄｒａｌ（登録商標）（ガラクトサミノグルクロノグリカンサルフェート、コンドロイチン硫酸の解重合形態）に基づく参照処置およびＨＡ（１８０／２００ＫＤの平均分子量を有する）に基づく処置と比較することによって行った。

試験デザイン：変形性骨関節炎の誘導および処置
実験は、現在の法律を厳密に遵守して、成体ウサギで行った。十分に確立した実験モデル（Ｙｏｓｈｉｍｉら、Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ、１９９４、２９８：２９６−３０４）による、前十字靭帯の外科的切除によって、右膝の変形性骨関節炎を一側性に誘導した。使用した実験モデルでは、対照を含めたすべての処置動物の関節腔において血漿浸潤物がまったくないことにより実証されるように、炎症プロセスが誘発されない（表）。靭帯の外科的アブレーションは、実験的変形性骨関節炎の良好な例を表し、これにより、試験した製剤の正確な薬理学的評価が可能になる。

動物を４つの同質のグループに分け（１グループ当たり６匹の動物）、手術から２４時間後、６１日間毎日、
− ０．９％のＮａＣｌの食塩液（対照）、
− ５．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＨＡ−Ｓ、
− ２０ｍｇ／ｋｇの用量でのＨＡ、
− ２０ｍｇ／ｋｇの用量でのＣｏｎｄｒａｌ（登録商標）
を用いて経口的に処置した。

処置の最後に、動物を殺し、肉眼で検査することによって、全身的毒性のないことを確認した。次に、脛骨板を有する大腿骨の外側顆および内側顆を、１０％に緩衝したホルマリン中に固定し、パラフィンワックス中に包埋した。次いで、当業者に知られている方法により、標本を処理することによって、ヘマトキシリン−エオシンで染色した後に光学顕微鏡下で分析可能な切片を得た。

次いで、内側および外側大腿顆から取り出した軟骨組織を、半定量的病理組織学的分析および組織形態計測的分析にかけた。特に、変性、軟骨の構造的完全性および軟骨の厚さの磨耗の程度に関するパラメーターを考慮に入れた。

結果の分析

既に述べたように、滑液および軟骨中に血漿浸潤物がまったく欠如していることにより、ＮａＣｌで処置した対照および研究したすべてのグループにおける関節腔に炎症が完全にないことが確認される。

動物およびその器官の肉眼分析でも、試験した薬理学的組成物の全身的毒性の欠如が実証された。

図１に、軟骨の検査から収集したデータを要約する。食塩液で処置した動物のグループ（対照）において、細胞成分の形態学的変化を特徴とする重度の変性が明白であった。Ｃｏｎｄｒａｌ（登録商標）で処置した動物の状況は、より良好であった。この場合、軟骨の変性は２．８と推定され、したがって中等度／過度であった。この結果は、ＨＡ処置で得られた結果と非常に類似していることに注目することが重要である。ＨＡ−Ｓで処置した動物の軟骨は、はるかに良好な状況であった。分解のレベルは軽度（１．７）であった。したがって、ＨＡ−Ｓの経口投与により、変形性骨関節炎に冒された関節の軟骨分解のプロセスを著しく遅らせることにおいて有効であることが証明された。

第２の重要な評価は、表面および軟骨構造の異常に関して、認められた標準によって測定される、軟骨組織の構造的完全性の分析に関する（図２）。前述のグラフのように、このグラフにより、ＨＡ−Ｓでの処置は、対照と比較して、およびまたＣｏｎｄｒａｌ（登録商標）での処置と比較して、かなりの程度に、良好な構造的完全性を維持するのに役立つことが確認される。ＨＡ−Ｓで処置された動物のグループは、移行軟骨ゾーンにおいて軽度の亀裂を示しただけであったが、Ｃｏｎｄｒａｌ（登録商標）で処置された動物のグループは、放射状ゾーンの過度の病変を示した。ＨＡでの処置に関する知見は、やはりＣｏｎｄｒａｌ（登録商標）と同じぐらいの有効性であることを証明したが、特に興味深い。

最後に、図３は、軟骨の全体の厚さに沿った病変の深度を例示し、最大の病変は、軟骨の全喪失後に骨組織の露出を生じさせるものである。

データは、外側顆および内側顆の病変の平均値を例示する。今度も、軟骨基質の完全性を保存することにおいて、ＨＡ−Ｓでの経口処置は、Ｃｏｎｄｒａｌ（登録商標）での処置またはＨＡ単独での処置よりも有効であることが確認された。

ここに示したデータの分析により、外傷／疾患に起因してもまたは通常の関節老化プロセスに起因しても、非炎症性骨関節炎の治療において、ＨＡ−Ｓが、硫酸化ＧＡＧおよびＨＡよりも有効であることが明らかに示される。

必要であれば、ＨＡ−Ｓは、細胞外基質を強化するのに有用な他の分子、例えば、コラーゲン（場合により加水分解された）もしくは他のＧＡＧなど、または他の薬理学的および／もしくは生物学的活性物質、例えば、成長因子および／もしくはホルモン、ビタミン（特に、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、およびＥ、および一般にＢ群）、抗生物質および無機塩類（特に、カルシウム、マグネシウム、およびセレンの塩、ならびに他の微量元素）などを場合により伴うことができるであろう。したがって、本発明で説明し、特許請求した手順は、問題となっている障害のための現在の経口治療に対する明確な改善を表す。

ＨＡ−Ｓの経口投与で得られた驚くべき結果ならびにヒアルロン酸誘導体の周知の物理化学的および薬理学的特性はまた、炎症症状が存在しない慢性変形性骨関節炎の形態に限定された、注射、特に関節内注射による、これらの製剤の投与の可能性を示唆する。この場合も、ＨＡ−Ｓは、他のＧＡＧなどの他の分子、または他の薬理学的および／もしくは生物学的活性物質、例えば、成長因子および／もしくはホルモン、ビタミン、抗生物質および抗ウイルス剤などを場合により伴うことができるであろう。

経口および関節内投与のための、本発明のＨＡ−Ｓを含有する製剤の調製のいくつかの実施例を、例としてであるが限定としてではなく以下に説明する。ＨＡ−Ｓは、顆粒、懸濁液、溶液、カプセルおよび錠剤の調製のために、安定剤、賦形剤、保存剤、および／または最良の可能な製剤を得るのに有用であると考えられる他の物質とともに、最新技術による、すべての知られている方法で製剤化することができる。

経口製剤
これらの製剤に使用されるＨＡは、１の平均硫酸化度および１８０／２００ＫＤの平均分子量を有する。活性成分の濃度は、１用量単位当たり５０と４００ｍｇの間の範囲である。

実施例１

最初に、ＨＡ−Ｓ、ラクトース、コーンスターチおよび無水コロイド状二酸化ケイ素を混合する。得られた予混合物にステアリン酸マグネシウムを加え、混合する。硬ゼラチンカプセルフォーマット００（ｆｏｒｍａｔ ００）の間で、最終混合物を分配する。

実施例２

最初に、ＨＡ−Ｓ、微結晶性セルロース、コーンスターチおよび無水コロイド状二酸化ケイ素を混合する。得られた予混合物にステアリン酸マグネシウムを加え、混合する。硬ゼラチンカプセルフォーマット００の間で、最終混合物を分配する。

実施例３

最初に、ＨＡ−Ｓ、微結晶性セルロース、コーンスターチおよび無水コロイド状二酸化ケイ素を混合する。得られた予混合物にステアリン酸マグネシウムを加え、混合する。硬ゼラチンカプセルフォーマット００の間で、最終混合物を分配する。

実施例４

最初に、ＨＡＳ１、微結晶性セルロースおよびコーンスターチを混合する。水およびポリビニルピロリドンからなる結合剤溶液と混合する。混合物が均一に湿ったら、２ｍｍの篩を通して顆粒化する。顆粒を乾燥させ、次いで乾燥した顆粒を、０．８ｍｍの篩に強制的に通して篩にかける。顆粒粉末を、ソルビトール、クエン酸、アスパルテームおよびオレンジ香料と混合する。サシェに顆粒を充填する。

注射製剤
１８０／２００ＫＤまたは５００／７５０ＫＤの平均分子量を有し、１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０ｍｇ／ｍｌ、およびさらにより好ましくは１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、滅菌無発熱物質食塩液中に調製された、ＨＡ−Ｓグレード１または２が、注射用関節内調製物用に使用されることが好ましい。最終溶液は、滅菌で無発熱物質でなければならない。これは、凍結乾燥し、使用時に再構成することもできる。

Claims (17)

1. 炎症症状を有しない慢性変形性骨関節炎および／または関節構造の老化による磨耗によって生じる軟骨損傷の予防および／または治療用の、硫酸化ヒアルロン酸を含有する医薬組成物。
2. 前記ヒアルロン酸の分子量が５００００と８０００００Ｄの間である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記ヒアルロン酸の分子量が１０００００と２３００００Ｄの間である、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 前記ヒアルロン酸の分子量が５０００００と７５００００Ｄの間である、請求項２に記載の医薬組成物。
5. 前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が０．５と３．５の間である、請求項１から４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が０．５と１．５の間である、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 前記ヒアルロン酸が、抽出、発酵、または技術的手段によって生成される、請求項１に記載の医薬組成物。
8. コラーゲンおよび／または加水分解コラーゲンおよび／またはグリコサミノグリカンを含有する、請求項１から７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
9. 薬理学的および／または生物学的活性物質を含有する、請求項１から７、および８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. 前記薬理学的および／または生物学的活性物質が、ビタミンおよび／または無機塩類および／またはホルモンおよび／または抗生物質および／または成長因子の群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 炎症症状を有しない慢性変形性骨関節炎および／または関節構造の老化による磨耗によって生じる軟骨損傷の経口投与による予防および／または経口治療用の、請求項１から１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
12. 硫酸化ヒアルロン酸の濃度が、１用量単位当たり７５と４００ｍｇの間である、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 炎症症状を有しない慢性変形性骨関節炎および／または関節構造の老化による磨耗によって生じる軟骨損傷の関節内治療用の、請求項１から１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. 硫酸化ヒアルロン酸の濃度が１と１００ｍｇ／ｍｌの間である、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. 硫酸化ヒアルロン酸の前記濃度が１０と２０ｍｇ／ｍｌの間である、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 炎症症状を有しない慢性変形性骨関節炎および／または関節構造の老化による磨耗によって生じる軟骨損傷の経口投与による予防および／または経口治療用の請求項１１または１２に記載の医薬組成物を含む製剤の調製のための、硫酸化ヒアルロン酸の使用。
17. 炎症症状を有しない慢性変形性骨関節炎および／または関節構造の老化による磨耗によって生じる軟骨損傷の関節内治療用の請求項１３から１５のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む注射製剤を調製するための、硫酸化ヒアルロン酸の使用。

Images