ES2710857T3 - Uso de polianiones para inhibir la actividad citotóxica de las histonas en el tratamiento de la sepsis - Google Patents

Abstract

Un polianión para su uso en un método para tratar sepsis inhibiendo la actividad citotóxica de histonas extracelulares en un sujeto, en el que el polianión no tiene una actividad anticoagulante sustancial, de modo que el polianión aumenta el tiempo de protrombina (PT), el tiempo de tromboplastina parcial (PTT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), el tiempo de coagulación de la trombina (TCT), o el tiempo de coagulación activada (ACT) en un 0% a un 10% del intervalo normal; y en el que el polianión es un oligosacárido polianiónico que tiene la estructura general (I): A-(B)n-D (I) en la que A y B son cada uno independientemente un monosacárido cíclico o un monosacárido desoxi cíclico; D es un monosacárido cíclico, un monosacárido desoxi cíclico, un monosacárido de anillo abierto. o un alcohol de azúcar; n es un número entero seleccionado de 0, 1 y 2; y en la que cada uno del monosacárido cíclico, el monosacárido desoxi cíclico, el monosacárido de anillo abierto, o el alcohol de azúcar está independientemente sustituido opcionalmente con OSO3-, COO-, OPO3-, un alquilo opcionalmente sustituido, un alquenilo opcionalmente sustituido, un alquinilo opcionalmente sustituido, un arilo opcionalmente sustituido, o un aralquilo opcionalmente sustituido; y en la que el oligosacárido polianiónico incluye al menos dos sustituyentes aniónicos seleccionados del grupo que consiste en OSO3-, COO- y OPO3-.

Description

DESCRIPCION

Uso de polianiones para inhibir la actividad citotoxica de las histonas en el tratamiento de la sepsis

Campo tecnico

La invencion se refiere a un polianion para su uso en un metodo para tratar la sepsis mediante la inhibicion de la actividad citotoxica de las histonas extracelulares.

Antecedentes

La sepsis es una respuesta inflamatoria sistemica a una infeccion o traumatismo asociada con y mediada por la activacion de varios mecanismos de defensa del huesped, incluida la red de citocinas, los leucocitos y los sistemas de complemento y coagulacion/fibrinolisis. La sepsis puede ser causada por infecciones bacterianas, fungicas, virales y otras, asf como por estfmulos no infecciosos, tales como traumatismos multiples, quemaduras graves y trasplante de organos. En cuestion de horas o dfas, la sepsis puede progresar a coagulacion espontanea en los vasos sangufneos, hipotension grave, insuficiencia organica multiple y muerte.

A pesar del uso clfnico de los antibioticos modernos, sigue existiendo un nivel significativo de mortalidad debido al tratamiento ineficaz de los pacientes con sepsis. Los pacientes que estan inmunocomprometidos debido, por ejemplo, a la profilaxis contra el rechazo del injerto tambien tienen un riesgo mayor. La mayorfa de los pacientes con leucemia mueren por sepsis antes que por leucemia. Se estima que hay 500 000 episodios de sepsis al ano en Estados Unidos, con una tasa de mortalidad bruta del 35%, y 200000 episodios de choque septico con una tasa de mortalidad del 40-70%. La sepsis es la principal causa de muerte en las unidades de cuidados intensivos no coronarias. El 40% de las muertes hospitalarias despues de una lesion se deben a un sfndrome de disfuncion organica multiple causado por sepsis.

Se han realizado varios intentos en tiempos recientes para encontrar una nueva terapia eficaz para pacientes con sepsis. Se ha realizado un esfuerzo considerable para producir anticuerpos monoclonales contra mediadores clave de la inflamacion, por ejemplo, anticuerpos monoclonales del factor de necrosis antitumoral, pero estos han demostrado ser clfnicamente ineficaces y tambien se ha encontrado que tienen efectos secundarios peligrosos en pacientes con sepsis. Otro enfoque ha sido utilizar factores de coagulacion humanos purificados, tal como protefna C activada (APC) que incluye APC humana recombinante (por ejemplo, Xigris®). Sin embargo, estas terapias de sepsis basadas en APC han tenido poco impacto clfnico. Hay varias razones para esto que incluyen la actividad anticoagulante de la APC, que conduce a un mayor riesgo de hemorragia, por lo que el farmaco se excluye para la sepsis que se desarrolla en pacientes despues de una cirugfa o despues de un traumatismo. Por la misma razon, la terapia para sepsis basada en APC queda excluida para los pacientes con leucemia, que tienen un alto riesgo de hemorragia. La sepsis puede avanzar rapidamente y el modo de accion relativamente lento de la terapia para la sepsis basada en APC es una desventaja en relacion con la rapida progresion de la sepsis aguda. Xigris se retiro del mercado el 25 de octubre de 2011.

Las histonas son pequenas protefnas basicas que funcionan en el nucleo celular para regular la expresion genica y forman complejo con el ADN para formar nucleosomas que se ensamblan en la estructura de la cromatina. Xu et al, (Nat Med. 2009. 15:1318-21) han notificado una actividad citotoxica para las histonas liberadas en respuesta a procesos inflamatorios con las histonas extracelulares que actuan como mediadores de la disfuncion de las celulas endoteliales, la insuficiencia organica y la muerte en la sepsis.

Wall et al., Thrombosis Research, 2001, vol. 301, paginas 325-335 describen el estudio de 17 oligosacaridos sulfatados para la actividad anticoagulante utilizando la prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada.

El documento de patente WO2009/061918 describe histonas extracelulares como biomarcadores para el pronostico y dianas moleculares para la terapia.

El documento de patente WO2006/015171 describe el uso de glucosaminoglucanos tales como heparina de bajo peso molecular, en la prevencion y el tratamiento de la sepsis.

El documento de patente WO2007/013123 describe el uso de ciclodextrinas para la preparacion de un medicamento para la prevencion del sfndrome septico y un metodo para eliminar endotoxinas bacterianas (lipopolisacaridos) de la sangre.

El documento de patente US2005/0282775 describe un metodo y un medicamento para tratar la inflamacion en un paciente con un polisacarido sulfatado sin inducir la activacion de plaquetas o trombosis en presencia de anticuerpos contra el complejo del factor 4 de heparina y plaquetas.

El documento de patente WO03/106503 describe polisacaridos bacterianos O-sulfatados y su uso como agentes antiinflamatorios en inflamaciones cronicas y agudas. La presente invencion se basa en el descubrimiento de que los polianiones pueden formar complejos con histonas extracelulares en la circulacion de un animal vivo e inhibir su actividad citotoxica. Ademas, los polianiones pueden formar complejos con histonas extracelulares y prevenir la acumulacion de histonas en los organos. Ademas, estos polianiones tienen propiedades anticoagulantes insignificantes.

Resumen

La invencion se define en las reivindicaciones y se basa en el hecho de que los presentes inventores han identificado que la actividad citotoxica de las histonas extracelulares y la acumulacion de histonas extracelulares en un organo puede inhibirse mediante la administracion de un polianion de oligosacarido. La administracion de un polianion de oligosacarido ofrece un medio para mejorar al menos algunas de las deficiencias de los tratamientos para la sepsis, actualmente disponibles. Ademas, como se describe en el presente documento unicamente a modo de ejemplo, el uso de una histona marcada con nanopartfculas proporciona un medio para cribar compuestos capaces de inhibir la acumulacion de histonas en los organos.

Por lo tanto, en un primer aspecto se proporciona un polianion para su uso en un metodo para tratar la sepsis mediante la inhibicion de la actividad citotoxica de las histonas extracelulares en un sujeto,

en el que el polianion no tiene una actividad anticoagulante sustancial, de modo que el polianion aumenta el tiempo de protrombina (PT), el tiempo de tromboplastina parcial (PTT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), el tiempo de coagulacion de la trombina (TCT), o el tiempo de coagulacion activada (ACT) en un 0% a un 10% del intervalo normal; y

en el que el polianion es un oligosacarido polianionico que tiene la estructura general (I):

A-(B)ⁿ-D (I)

en la que A y B son cada uno independientemente un monosacarido cfclico o un monosacarido desoxi cfclico;

D es un monosacarido cfclico, un monosacarido desoxi cfclico, un monosacarido de anillo abierto. o un alcohol de azucar;

n es un numero entero seleccionado de 0, 1 y 2; y

en la que cada uno del monosacarido cfclico, el monosacarido desoxi cfclico, el monosacarido de anillo abierto, o el alcohol de azucar esta independientemente sustituido opcionalmente con OSO^3", COO^- , OPO^3", un alquilo opcionalmente sustituido, un alquenilo opcionalmente sustituido, un alquinilo opcionalmente sustituido, un arilo opcionalmente sustituido, o un aralquilo opcionalmente sustituido; y

en la que el oligosacarido polianionico incluye al menos dos sustituyentes anionicos seleccionados del grupo que consiste en OSO^3", COO^- y OPO^3".

En una forma de realización, el monosacarido cfclico se selecciona del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, manosa, gulosa, idosa, talosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, sorbosa, tagatosa y sedoheptulosa.

En otra forma de realización, el monosacarido cfclico se selecciona del grupo que consiste en glucosa, galactosa y fructosa.

En otra forma de realización, el monosacarido desoxi cfclico se selecciona del grupo que consiste en fucosa, desoxirribosa y ramnosa.

En otra forma de realización, el alcohol de azucar se selecciona del grupo que consiste en glicol, glicerol, eritritol, treitol, ribitol, arabitol, xilitol, sorbitol (glucitol), manitol, dulcitol (galactitol), iditol y fucitol.

En otra forma de realización, el monosacarido de anillo abierto se selecciona del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa, eritrosa, treosa, eritrulosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, manosa, gulosa, idosa, talosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, sorbosa, tagatosa y sedoheptulosa.

En otra forma de realización, el polianion puede ser un oligosacarido polianionico que tiene la estructura general (I-a):

en la que cada R¹ se selecciona independientemente de OSO^3- , COO^- , OPO^3- , OH o H; y n es un numero entero entre 0, 1 y 2; y en la que al menos dos de R¹ se seleccionan del grupo que consiste en OSO^3- , COO^- , y OPO^3- .

En otra forma de realización, el polianion puede ser un oligosacarido polianionico que tiene la estructura general (I-b):

donde cada R¹ se selecciona independientemente de OSO^3- , COO^- , OPO^3- , OH o H; y n es un numero entero entre 0, 1 y 2; y en la que al menos dos de R¹ se seleccionan del grupo que consiste en OSO^3- , COO^- , y OPO^3- .

En otra forma de realización, el polianion puede ser un oligosacarido polianionico seleccionado del grupo que consiste en:

y

en los que cada R² se selecciona independientemente de OSO^{3 -}, COO^' , OPO^{3 -}, OH o H; y en los que al menos dos de R² se seleccionan del grupo que consiste en OSO^{3 '}, COO^' , y OPO^{3 '}.

En otra forma de realización, el polianion puede ser un oligosacarido polianionico seleccionado del grupo que consiste en sulfato de maltosa, sulfato de maltotriosa, sulfato de maltotetraosa, sulfato de panosa, sulfato de isomaltotriosa, sulfato de erlosa, sulfato de celobiosa y sulfato de rafinosa.

En una forma de realización adicional, el polianion puede ser el oligosacarido polianionico sulfato de celobiosa. En el presente documento tambien se describe una ciclodextrina polianionica que tiene la estructura general (II):

donde cada R³ se selecciona independientemente de un grupo O-alquilo, O-arilo, O-aralquilo, O-alquenilo, O-alquinilo opcionalmente sustituido, OSO^3- , COO^- , OPO^3- , OH o H y cada R⁴ se selecciona independientemente de o SO^3- , c Oo ^- , OPO^3- , OH o H; x es un numero entero entre 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, y 10, y en la que la ciclodextrina polianionica incluye al menos dos sustituyentes anionicos seleccionados del grupo que consiste en OSO^3- , COO^- y OPO^3- .

La ciclodextrina puede ser a-ciclodextrina, p-ciclodextrina o Y-ciclodextrina.

En el presente documento tambien se describe un metodo para cribar un inhibidor de histonas, comprendiendo dicho metodo:

(i) poner en contacto una histona con un compuesto candidato

(ii) determinar la union de dicho compuesto candidato a dicha histona

(iii) seleccionar dicho compuesto candidato que se une a dicha histona.

En el presente documento se describe adicionalmente un metodo para cribar un inhibidor de histonas, comprendiendo dicho metodo:

(i) proporcionar una histona marcada con nanopartfculas

(ii) administrar dicha histona marcada a un sujeto de ensayo

(iii) administrar un compuesto candidato a dicho sujeto de ensayo

(iv) controlar de la localizacion de histonas en un organo en relacion con un sujeto de control

(v) seleccionar dicho compuesto candidato que altera la localizacion de histonas en un organo en relacion con un sujeto de control.

En un aspecto, la histona marcada puede administrarse al sujeto de ensayo antes, despues o al mismo tiempo que el compuesto de ensayo.

En el presente documento tambien se describe un metodo adicional de cribado de un inhibidor de histonas, comprendiendo dicho metodo:

(i) proporcionar una histona marcada con nanopartfculas

(ii) poner en contacto dicha histona marcada con nanopartfculas con un compuesto candidato

(iii) administrar dicha histona marcada y dicho compuesto de ensayo a un sujeto de ensayo

(iv) controlar la localizacion de histonas en un organo de dicho sujeto de ensayo en relacion con un sujeto de control.

(v) seleccionar dicho compuesto candidato que altera la localizacion de histonas en un organo en relacion con un sujeto de control.

En un aspecto el compuesto candidato es un polianion.

De acuerdo con la invencion, o uno cualquiera de los aspectos anteriores, el polianion puede inhibir la union de una histona a una celula, tejido u organo.

Breve descripcion de los dibujos

Una forma de realización preferida de la presente invencion se describira ahora, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos en los que:

La Figura 1 representa un ejemplo de los datos generados utilizando el ensayo de citometrfa de flujo para la citotoxicidad de histonas, en este caso, las celulas endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se incubaron solas (panel izquierdo) o con 200 pg/ml de histonas de timo de ternero (panel derecho) durante 1 hora in vitro. Las cifras en cada panel representan el porcentaje de HUVEC en cada cuadrante, indicandose cuadrantes de celulas viables (Calcefna-AM-brillante, Pl-apagado) y muertas (Calcefna-AM-apagado, PI-brillante).

La Figura 2 representa la capacidad de diferentes concentraciones de histonas de timo de ternera (100-800 pg/ml) para causar la muerte de (A) HUVEC y (B) celulas endoteliales microvasculares humanas (HMEC) despues de 1 h de exposicion in vitro.

La Figura 3 representa la capacidad de diferentes concentraciones (6,25-100 pg/ml) de sulfato de maltosa, sulfato de maltotriosa, sulfato de maltopentosa, sulfato de isomaltotriosa y sulfato de p-ciclodextrina para inhibir la citotoxicidad in vitro de las histonas de timo de ternera (200 pg/ml) para HUVEC.

La Figura 4 representa la capacidad de un intervalo de concentracion mas amplio (1,6-100 pg/ml) de sulfato de maltosa, sulfato de maltotriosa y sulfato de maltopentosa para inhibir la citotoxicidad in vitro de las histonas de timo de ternera (200 pg/ml) para HUVEC.

La Figura 5 muestra los datos primarios de citometrfa de flujo que muestran que sulfato de maltotriosa a 25 pg/ml y 100 pg/ml puede inhibir drasticamente los efectos citotoxicos in vitro de las histonas de timo de ternera (200 pg/ml) para HUVEC. Las cifras en cada panel representan el porcentaje de HUVEC en cada cuadrante, indicandose cuadrantes de celulas viables (Calcefna-AM-brillante, Pl-apagado) y muertas (Calcefna-AM-apagado, Pl-brillante).

La Figura 6 muestra los datos primarios de citometrfa de flujo que muestran que sulfato de maltotriosa a 25 |jg/ml y 100 jg/ml puede inhibir total y parcialmente, respectivamente, los efectos citotoxicos in vitro de las histonas de timo de ternera (400 jg/ml) para HMEC. Las cifras en cada panel representan el porcentaje de HMEC en cada cuadrante, indicandose cuadrantes de celulas viables (Calcefna-AM-brillante, Pl-apagado) y muertas (Calcefna-AM-apagado, Pl-brillante).

La Figura 7 demuestra que la eliminacion de heparan sulfato de la superficie celular de HMEC con heparanasa plaquetaria humana o Flavobacterium heparitinasa no tiene ningun efecto sobre la citotoxicidad in vitro de las histonas de timo de ternera (400 jg/ml) para HMEC.

La Figura 8 demuestra que la lfnea celular CHO-K1 de tipo silvestre, que expresa heparan sulfato de superficie celular, y la lfnea celular CHO mutante (pgsA-745) que carece de heparan sulfato, son igualmente susceptibles a la citotoxicidad in vitro de las histonas de timo de ternera.

La Figura 9A es una serie de adquisiciones de 30 segundos de gammagraffa, comenzando desde el inicio de la inyeccion de histonas marcadas con nanopartfculas de Tc99m en la vena de la oreja de un conejo anestesiado.

La Figura 9B es una serie de adquisiciones de 30 segundos de gammagraffa, comenzando desde el inicio de la inyeccion de nanopartfculas de Tc99m en la vena de la oreja de un conejo anestesiado.

La Figura 10A es una serie de adquisiciones de 30 segundos de gammagraffa, comenzando desde el inicio de la inyeccion de histonas marcadas con nanopartfculas de Tc99m en la vena de la oreja de un conejo anestesiado.

La Figura 10B es una serie de adquisiciones de 30 segundos de gammagraffa, comenzando desde el inicio de la inyeccion de histonas marcadas con nanopartfculas de Tc99m en la vena de la oreja de un conejo anestesiado tratado previamente con 15 mg/kg de maltohexaosa sulfato sodico.

La Figura 11 es una serie de adquisiciones de 30 segundos (tramas 1-4) y adquisiciones de 60 segundos (tramas 5-8) de gammagraffa, comenzando desde el inicio de la inyeccion de histonas marcadas con nanopartfculas de Tc99m en la vena de la oreja de un conejo anestesiado tratado previamente con 15 mg/kg de maltotetraosa sulfato sodico.

La Figura 12 es una serie de adquisiciones de 30 segundos de gammagraffa, comenzando desde el inicio de la inyeccion de histonas marcadas con nanopartfculas de Tc99m en la vena de la oreja de un conejo anestesiado tratado previamente con 15 mg/kg de celobiosa sulfato sodico.

La Figura 13 es una grafica de supervivencia de Kaplan-Meier para un modelo de sepsis de raton inducido por lipopolisacarido (LPS) y evaluacion de la eficacia in vivo de los artfculos de ensayo 1 (sulfato de maltotriosa; TA1), 2 (sulfato de celobiosa; TA2) y 3 (heparina; TA3. Los artfculos de ensayo se administraron conjuntamente i.p. el dfa 1 con LPS (50 mg/kg), y luego se dosificaron a diario i.p. durante 2 dfas mas. Los artfculos de ensayo 1 y 2 se evaluaron a 2 concentraciones de dosis (dosis alta, 100 mg/kg, y dosis baja, 15 mg/kg), y el artfculo de ensayo 3 en una dosis (1,1 mg/kg). Los eventos marcados en el grafico registran los tiempos hasta que los ratones fueron encontrados muertos o tuvieron que ser sacrificados.

Definiciones

Se usan ciertos terminos en el presente documento que tendran los significados expuestos como se indica a continuacion.

Como se usa en el presente documento, el termino "que comprende" significa "incluyendo principalmente, pero no necesariamente unicamente". Ademas, las variaciones de la palabra "que comprende", tales como "comprender" y "comprende", tienen significados correspondientemente variados.

A menos que el contexto requiera otra cosa o especfficamente se establezca lo contrario, los enteros, etapas o elementos de la invencion que se mencionan en el presente documento como enteros, etapas o elementos singulares incluyen claramente formas tanto singulares como plurales de los enteros, etapas o elementos citados.

Como se usa en el presente documento, los terminos "tratar" y "tratamiento" se refieren a cualquiera y todos los usos que remedian una afeccion o sfntomas, impiden el establecimiento de una afeccion o enfermedad, o de otro modo previenen, dificultan, retrasan o invierten la progresion de una afeccion o enfermedad u otros sfntomas no deseados de cualquier manera que sea.

Se debe tener en cuenta que la referencia en el presente documento a uso en aplicaciones terapeuticas se entendera que es igualmente aplicable a aplicaciones humanas y no humanas, tales como veterinarias. Por lo tanto, se entendera que, salvo que se indique lo contrario, una referencia a un paciente, sujeto o individuo significa un ser humano o no humano, tal como un individuo de cualquier especie de importancia social, economica o de investigacion, incluyendo, pero sin limitacion, una especie aviar, lagomorfo, ovino, bovino, equino, porcino, felino, canino, primate y roedor.

En el contexto de esta memoria descriptiva, el termino "cantidad eficaz" incluye dentro de su significado una cantidad suficiente pero no toxica de un compuesto o composicion de la invencion para proporcionar el efecto deseado. La cantidad exacta requerida variara de un sujeto a otro dependiendo de factores tales como el efecto deseado, la especie que se esta tratando, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la afeccion a tratar, el agente en particular que se esta administrando, el modo de administracion, etc. Por lo tanto, no es posible especificar una "cantidad eficaz" exacta. Sin embargo, para cualquier caso dado, un experto en la tecnica puede determinar una "cantidad eficaz" apropiada utilizando solo la experimentacion rutinaria.

Como se usa en el presente documento, el termino "monosacarido" incluye dentro de su significado un azucar o carbohidrato de fórmula general CⁿHhⁿOⁿ. Por ejemplo, el termino monosacarido incluye, pero sin limitacion, glucosa, galactosa, fructosa, eritrosa, treosa, eritrulosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, manosa, gulosa, idosa, talosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, sorbosa, tagatosa y sedoheptulosa. Los monosacaridos pueden ser tanto naturales como sinteticos. La mayorfa de los monosacaridos existen como un monosacarido de anillo abierto o un monosacarido cfclico.

Como se usa en el presente documento, el termino "monosacarido desoxi" o "azucar desoxi" incluye dentro de su significado un azucar que contiene menos atomos de oxfgeno que atomos de carbono, dando como resultado uno o mas carbonos en la molecula que carecen de un grupo hidroxilo unido. Por ejemplo, el termino monosacarido desoxi incluye, pero sin limitacion, fucosa, desoxirribosa y ramnosa.

Como se usa en el presente documento, el termino "alcohol de azucar" incluye en su significado una forma hidrogenada de carbohidrato o monosacarido, cuyo grupo carbonilo (aldehfdo o cetona) se ha reducido a un grupo hidroxilo primario o secundario (por lo tanto, el alcohol). Los alcoholes de azucar tienen la formula general H(HCHO)^{n i}H. Por ejemplo, el termino alcohol de azucar incluye, pero sin limitacion, glicol, glicerol, eritritol, treitol, ribitol, arabitol, xilitol, sorbitol (glucitol), manitol, dulcitol (galactitol), iditol y fucitol.

Como se usa en el presente documento, el termino "oligosacarido" incluye dentro de su significado carbohidratos que estan compuestos por dos a diez residuos de monosacaridos unidos a traves de enlaces glucosfdicos, que pueden hidrolizarse por acido para dar las unidades constitutivas de monosacaridos.

Como se usa en el presente documento, el termino "polisacarido" incluye dentro de su significado polfmeros de monosacaridos que contienen diez o mas residuos de residuos de monosacaridos unidos a traves de enlaces glucosfdicos, que pueden hidrolizarse por acido para dar las unidades de monosacaridos constituyentes.

Como se usa en el presente documento, el termino "alquilo" incluye en su significado radicales hidrocarburo monovalentes de cadena lineal o cadena ramificada que tienen de 1 a 18 atomos de carbono, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 atomos de carbono. Por ejemplo, el termino alquilo incluye, pero sin limitacion, metilo, etilo, 1-propilo, isopropilo, 1-butilo, 2-butilo, isobutilo, terc-butilo, amilo, 1,2-dimetilpropilo, 1,1-dimetilpropilo, pentilo, isopentilo, hexilo, 4-metilpentilo, 1-metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, 1,2,2-trimetilpropilo, 1,1,2-trimetilpropilo, 2-etilpentilo, 3-etilpentilo, heptilo, 1-metilhexilo, 2,2-dimetilpentilo, 3,3-dimetilpentilo, 4,4-dimetilpentilo, 1,2-dimetilpentilo, 1,3-dimetilpentilo, 1,4­ dimetilpentilo, 1,2,3-trimetilbutilo, 1,1,2-trimetilbutilo, 1,1,3-trimetilbutilo, 5-metilheptilo, 1-metilheptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, triskaidecilo, tetradecilo, quindecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo y similares.

Como se usa en el presente documento, el termino "alquileno" incluye dentro de su significado radicales hidrocarburo saturados, de cadena lineal, divalentes.

Como se usa en el presente documento, el termino "arilo" incluye en su significado radicales hidrocarburo aromaticos monovalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y fusionados, por ejemplo, fenilo, naftilo, antracenilo, pirenilo, fenantracenilo.

Como se usa en el presente documento, el termino "arileno" incluye dentro de su significado radicales hidrocarburo aromaticos divalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y fusionados.

Como se usa en el presente documento, el termino "aralquilo" incluye en su significado un residuo alquilo inferior sustituido por uno o mas grupos arilo o arilo sustituido, tales como, por ejemplo, bencilo, fenilmetilo, feniletilo, fenilpropilo, fenilisopropilo, fenil-butilo terciario, y similares.

El termino "alquenilo" se refiere a un radical hidrocarburo que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Un grupo alquenilo C²-C⁶ es un grupo alquenilo que tiene de dos a seis atomos de carbono en el esqueleto de alquenilo lineal o ramificado. Los ejemplos de radicales alquenilo incluyen, sin limitacion, vinilo, propenilo, 2-butenilo y similares. Un grupo alquenilo puede estar sustituido con uno o restos como se describe para grupos alquilo.

El termino "alquinilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un radical hidrocarburo que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Un grupo alquinilo C²-C⁶ es un grupo alquinilo que tiene de dos a seis atomos de carbono en el esqueleto de alquinilo lineal o ramificado. Los restos de alquinilo ejemplares incluyen propinilo, 3-hexinilo y similares. Un grupo alquinilo puede estar sustituido con uno o restos como se describe para grupos alquilo.

Como se usa en el presente documento, el termino "opcionalmente sustituido" como se usa en el presente documento significa que el grupo al que se refiere este termino puede estar sin sustituir, o puede estar sustituido con uno o mas grupos seleccionados independientemente de alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquilo, halo, haloalquilo, haloalquinilo, hidroxilo, hidroxialquilo, alcoxi, tioalcoxi, alqueniloxi, haloalcoxi, haloalqueniloxi, grupos que contienen nitrogeno tales como NO² , NO^{3 '}, N(alquilo)² , NH(alquilo), nitroalquilo, nitroalquenilo, nitroalquinilo, nitroheterociclilo, alquilamino, dialquilamino, alquenilamina y alquinilamino, acilo, alquenoflo, alquinoflo, acilamino, diacilamino, aciloxi, alquilsulfoniloxi, heterocicloxi, heterocicloamino, haloheterocicloalquilo, alquilsulfenilo, alquilcarboniloxi, alquiltio, aciltio, grupos que contienen fosforo tales como fosfono y fosfinilo, arilo, heteroarilo, alquilarilo, aralquilo, alquilheteroarilo, ciano, cianato, isocianato, grupos que contienen azufre tales como SO³H, SO^{3 '}, OSO^{3 '}, SO³alquilo, SO³arilo, NHSO³H, y NHSO^{3 '}, CO² H, COO^' , CO²alquilo, C(O)NH² , -C(O)NH(alquilo), y -C(O)N(alquilo)². Los sustituyentes preferidos incluyen alquilo C^{1 -10} , alcoxi C^{1 -10} , -CH²-alcoxi (C^{1 - 10} ), arilo C^{6 -10} , por ejemplo, fenilo, -CH²-fenilo, halo, hidroxilo, hidroxi-alquilo (C^{1 - 10} ), y halo-alquilo (C^{1 -10} ), por ejemplo, CF³ , CH²CF³. Los sustituyentes particularmente preferidos incluyen alquilo C^{1 -10} , alcoxi C^{1 -10} , halo, hidroxilo, hidroxi-alquilo (C^{1 -10} ), por ejemplo, CH²OH, y halo-alquilo (C^{1 -10} ), por ejemplo, CF³ , CH²CF³.

Como se usa en el presente documento, el termino "sepsis" incluye dentro de su significado todos los estadios de la enfermedad o afeccion como se caracteriza por textos de referencia medica estandar y/o se conoce por un experto en la tecnica. Por ejemplo, la sepsis incluye la sepsis grave, sepsis aguda y cronica y choque septico. La sepsis tambien incluye episodios de sepsis asociados con pacientes con quemaduras, regfmenes terapeuticos para pacientes con cancer, complicaciones perinatales en pacientes de maternidad, profilaxis inmunosupresora para los receptores de injertos, y pacientes quirurgicos postoperatorios.

Como se usa en el presente documento, el termino "nanopartfcula" se refiere a cualquier partfcula solida de menos de 1 micrometro (1000 nm) de diametro. En particular, una nanopartfcula puede ser una nanopartfcula FibrinLite que consiste en plaquetas metalicas de radionuclido de tecnecio-99m encapsulado por una pluralidad de capas de carbono grafftico. El diametro de las nanopartfculas FibrinLite se distribuye log-normal en el intervalo de 20-400 nm con un diametro medio de aproximadamente 200 nm.

Descripcion detallada

La invencion se define en las reivindicaciones y se refiere a un polianion segun se reivindica para su uso en un metodo para el tratamiento de pacientes que padecen sepsis debida a una infeccion. Los polianiones forman complejos rapidamente y, por lo tanto, neutralizan o inhiben la actividad citotoxica de las protefnas de histonas extracelulares, por ejemplo, las que se encuentran en la circulacion sangufnea de los pacientes con sepsis. Ademas, los polianiones pueden formar complejos con las histonas extracelulares y prevenir la acumulacion de histonas en los organos, en particular en los pulmones. En formas de realización preferidas, los polianiones se seleccionan por su baja interferencia con la coagulacion sangufnea y la hemostasia, y/o su capacidad para persistir en la circulacion.

La presente invencion, como se define en las reivindicaciones, se basa en el descubrimiento de que los polianiones de oligosacaridos que tienen propiedades anticoagulantes insignificantes pueden formar complejos con las histonas en la circulacion de un animal vivo y evitar la union de las histonas a los organos. Estos polianiones proporcionan un nuevo medio de intervencion terapeutica en la sepsis y ofrecen alternativas mas atractivas al uso de anticuerpos neutralizantes, APC o heparina.

Sepsis

La sepsis es una reaccion sistemica caracterizada por hipotension arterial, acidosis metabolica, disminucion de la resistencia vascular sistemica, taquipnea y disfuncion organica. La sepsis (incluido el choque septico) es una respuesta inflamatoria sistemica a una infeccion o traumatismo asociada con y mediada por la activacion de varios mecanismos de defensa del huesped, incluida la red de citocinas, los leucocitos y los sistemas de complemento y coagulacion/fibrinolisis. La coagulacion intravascular diseminada (DIC) con deposicion generalizada de fibrina en la microvasculatura de diversos organos puede ser una manifestacion temprana de sepsis. DIC es un mediador importante en el desarrollo del sfndrome de insuficiencia organica multiple y contribuye al mal pronostico de los pacientes con choque septico.

La sepsis puede desarrollarse a partir de organismos, sus productos metabolicos o toxinas en el torrente sangufneo. Es decir, la sepsis incluye bacteriemia, fungemia, viremia y parasitemia. Por lo tanto, el choque septico (fallo circulatorio agudo que es resultado de la sepsis a menudo asociado con un fallo organico multiple y una alta tasa de mortalidad) puede ser causado por una serie de organismos o procesos patologicos. La sepsis tambien puede ser causada por estfmulos no infecciosos, tales como traumatismos, quemaduras graves, torsion intestinal, embolia de lfquido amniotico y trasplante de organos.

Muchos pacientes con sepsis presentan un rapido empeoramiento durante un periodo de 24-48 horas. Por lo tanto, el tratamiento rapido es esencial para el tratamiento eficaz de la sepsis. Desafortunadamente, el diagnostico del tipo de infeccion requiere un analisis microbiologico para identificar el patogeno que puede tardar varios dfas. Por lo tanto, la terapia para eliminar un patogeno (por ejemplo, una terapia con antibioticos) debe iniciarse sin conocer el tipo y la especie del patogeno, y sin ningun medio para conocer el alcance de la infeccion.

Se han realizado varios intentos para encontrar una nueva terapia eficaz para pacientes con sepsis, tales como anticuerpos monoclonales contra mediadores clave de la inflamacion y protefna C activada (APC). Sin embargo, estos tratamientos han tenido poco impacto clfnico y la APC se ha retirado recientemente del mercado. Se ha utilizado heparina de baja dosis en el tratamiento de pacientes con sepsis, aunque su uso en este contexto es complicado y controvertido debido al aumento reconocido del riesgo de sangrado en los pacientes con sepsis debido a los recuentos de plaquetas inferiores y/o factores de coagulacion agotados, especialmente cuando la sepsis ha inducido la coagulacion intravascular diseminada (DIC). El agotamiento de las plaquetas y/o los factores de coagulacion debido a la baja dosis de heparina puede conducir entonces a una disfuncion de la coagulacion y puede producirse una hemorragia catastrofica. La heparina tambien puede inducir en algunos pacientes una afeccion conocida como trombocitopenia inducida por heparina (HIT), en la que la destruccion de plaquetas mediada por anticuerpos tambien puede conducir a una hemorragia peligrosa.

Histonas

Las histonas son pequenas protefnas basicas con un alto contenido de lisina o arginina y funcionan en el empaquetamiento del ADN. Las histonas estan altamente conservadas y se pueden agrupar en cinco clases principales: H1/H5, H2A, H2B, H3, y H4 organizadas en dos superclases de las histonas centrales (H2A, H2B, H3 y H4) y las histonas enlazadoras (HI y H5).

Dos de cada histona central se ensamblan para formar partfculas centrales de nucleosoma octamericas envolviendo el ADN alrededor del complejo de protefnas. Las histonas enlazadoras se unen al nucleosoma y al ADN, donde entran y salen del nucleosoma, lo que bloquea el ADN en su lugar y facilita la formacion de una estructura de orden superior.

Como se describe en el presente documento, una histona puede ser una histona de longitud completa, un fragmento o variante de la misma. Una variante de histona puede modificarse, por ejemplo, mediante la eliminacion, adicion y/o sustitucion de aminoacidos. Como alternativa, una histona puede modificarse por acetilacion y/o metilacion de lisina y arginina. En general, las modificaciones no comprometen sustancialmente la naturaleza policationica de la histona o la capacidad de la histona para localizarse en un organo.

Las sustituciones de aminoacidos adecuadas incluyen, pero no estan necesariamente limitadas a, sustituciones de aminoacidos conocidas en la tecnica como "conservativas". Una sustitucion "conservativa" es aquella en la que un aminoacido se sustituye por otro aminoacido que tiene propiedades similares, de tal manera que un experto en la tecnica de la qufmica de peptidos esperarfa que la actividad biologica, la estructura secundaria y la naturaleza hidropatica del polipeptido esten sustancialmente inalteradas. Las sustituciones de aminoacidos se pueden hacer generalmente en base a la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipatica de los residuos. Por ejemplo, los aminoacidos cargados negativamente incluyen acido aspartico y acido glutamico; los aminoacidos cargados positivamente incluyen lisina, histidina y arginina; y los aminoacidos con grupos de cabeza polar sin carga que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoacidos que pueden representar cambios conservativos incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante de histona tambien puede contener, o como alternativa, cambios de aminoacidos no conservativos.

Una variante de histona puede modificarse mediante la eliminacion, adicion y/o sustitucion de uno o mas aminoacidos, y puede diferir de la secuencia no modificada por la sustitucion, eliminacion o adicion de cinco aminoacidos o menos, tal como, por ejemplo, cuatro o tres, o dos, o un aminoacido.

Como se usa en el presente documento, una "variante" de histona se refiere a una histona con una secuencia sustancialmente similar a la secuencia de histona de origen natural. En general, dos secuencias son "sustancialmente similares" si las dos secuencias tienen un porcentaje especffico de residuos de aminoacidos que son iguales (porcentaje de "identidad de secuencia"). Por consiguiente, una "variante" de una secuencia de histonas puede compartir al menos aproximadamente el 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 83% 85%, 88%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% de identidad de secuencia con una secuencia de histona de referencia. En general, las variantes de secuencias de histona poseen actividad biologica cualitativa en comun. Tambien se incluyen dentro del significado del termino "variante" los homologos de histonas. Un homologo de histona es tfpicamente de una especie diferente pero que comparte sustancialmente la misma funcion o actividad biologica que la histona correspondiente de otra especie. Por ejemplo, los homologos de las histonas incluyen, pero sin limitacion, los de diferentes especies de mamfferos o microorganismos.

Ademas, el termino "variante" tambien incluye analogos de secuencias de histona. Un "analogo" de histona es un polipeptido que es un derivado de una histona dada, cuyo derivado comprende la adicion, delecion, sustitucion de uno o mas aminoacidos, de manera que el polipeptido conserva sustancialmente la misma funcion. Como se ha apreciado anteriormente, el termino "sustitucion conservativa de aminoacidos" se refiere a una sustitucion o reemplazo de un aminoacido por otro aminoacido con propiedades similares dentro de una secuencia de histona. Una "variante" de una histona puede diferir en secuencia (de la histona relacionada) por sustitucion, delecion o adicion de cinco aminoacidos o menos, tal como, por ejemplo, cuatro, o tres, o dos, o un aminoacido.

En el presente documento tambien se describen fragmentos de histonas. Un "fragmento" de histona es un polipeptido que es un constituyente de una histona o una variante de la misma. Tfpicamente, el fragmento posee una actividad biologica cualitativa en comun con la histona de la que es un constituyente. Tfpicamente, el fragmento de histona puede tener una longitud mayor de 50 aminoacidos de longitud, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 residuos de aminoacidos de longitud, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 45 residuos de aminoacidos de longitud, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 residuos de aminoacidos de longitud, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 35 residuos de aminoacidos de longitud, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 30 residuos de aminoacidos de longitud, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 25 residuos de aminoacidos de longitud, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 residuos de aminoacidos de longitud, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 15 residuos de aminoacidos de longitud, o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10 residuos de aminoacidos de longitud. Un fragmento de un polipeptido puede tener 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o mas de 25 residuos de aminoacidos de longitud.

Polianiones

Los inventores proponen que, dado que las histonas son policationes con un alto punto isoelectrico, formaran complejos con polianiones distintos al ADN, tales como polisacaridos polianionicos sulfatados (por ejemplo, heparina), oligosacaridos y disacaridos polianionicos, polianiones lineales, polianiones de ciclitol y polianiones de arileno urea.

En algunas formas de realización, el polianion puede formar complejo con y, por lo tanto, inhibir la actividad biologica de las histonas circulantes sin ningun impacto en el sistema de coagulacion. Esto brindarfa al medico tratante la opcion de un rango de dosis mas amplio de un polianion que podrfa utilizarse completamente independiente del recuento plaquetario y el estado de coagulacion del paciente con sepsis, incluso cuando el DIC esta presente, sin aun promover el sangrado. Estos polianiones tampoco deben promover la destruccion de las plaquetas.

En formas de realización preferidas, el polianion es estable y no se degrada rapidamente in vivo. Ademas, los polianiones como se describen en el presente documento pueden ser estables a temperature ambiente y, por lo tanto, almacenarse durante largos periodos sin una degradacion sustancial.

Polisacaridos polianionicos

La heparina es un polisacarido sulfatado de origen que se usa ampliamente en la medicina clfnica como un anticoagulante. Su actividad anticoagulante se puede controlar, o incluso neutralizar, en pacientes mediante la administracion de un polication farmaceuticamente aceptable, tal como protamina.

Solo con fines ilustrativos, se propone que la heparina, un polianion, forme complejo con las histonas policationicas circulantes y, por lo tanto, sera beneficiosa para los pacientes con sepsis en una dosis suficiente para formar complejos con las histonas circulantes, pero insuficiente para tener un efecto anticoagulante aparente. Otros polisacaridos polianionicos conocidos por los expertos en la tecnica, tales como heparan sulfato, incluyendo los proteoglicanos perlecan y sindecan, sulfato de condroitina; sulfato de dermatan; El polisulfato de pentosano (Elmiron), sulodexida (HS/DS), acido hialuronico sobresulfatado, fucoidan y sulfato de condroitina sobresulfatado (Arteparon®) tambien se pueden usar en dosis que sean suficientes para formar complejos con las histonas circulantes, pero insuficientes para tener un efecto anticoagulante apreciable.

En otro aspecto, el polisacarido polianionico puede ser una heparina parcialmente desulfatada que ha sido modificada qufmicamente para eliminar algunos de los grupos sulfato, una heparina de bajo peso molecular o una heparina modificada qufmicamente (por ejemplo, peryodato tratado, heparina dividida con glicol) que carece de actividad anticoagulante significativa, pero mantiene la capacidad de complejarse rapidamente con histonas. El polisacarido polianionico puede seleccionarse del grupo que consiste en heparina N-acetilada, heparina dividida con glicol, heparina dividida con N glicol, enoxaparina, enoxaparina dividida con glicol, y heparina de bajo peso molecular (3 KDa) dividida con glicol.

Oligosacaridos polianionicos

Como se define en las reivindicaciones, el polianion de la invencion es un oligosacarido polianionico que tiene la estructura general (I):

A-(B)ⁿ-D (I)

en la que A y B son cada uno independientemente un monosacarido cfclico o un monosacarido desoxi cfclico;

D es un monosacarido cfclico, un monosacarido desoxi cfclico, un monosacarido de anillo abierto. o un alcohol de azucar;

n es un numero entero seleccionado de 0, 1 y 2; y

en la que cada uno del monosacarido cfclico, el monosacarido desoxi cfclico, el monosacarido de anillo abierto, o el alcohol de azucar esta independientemente sustituido opcionalmente con OSO^3", COO^- , OPO^3", un alquilo opcionalmente sustituido, un alquenilo opcionalmente sustituido, un alquinilo opcionalmente sustituido, un arilo opcionalmente sustituido, o un aralquilo opcionalmente sustituido; y

en la que el oligosacarido polianionico incluye al menos dos sustituyentes anionicos seleccionados del grupo que consiste en OSO^3", COO^- y OPO^3". El polianion no tiene actividad anticoagulante sustancial. En una forma de realización, el monosacarido cfclico se selecciona del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, manosa, gulosa, idosa, talosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, sorbosa, tagatosa y sedoheptulosa. En otra forma de realización, el monosacarido cfclico se selecciona del grupo que consiste en glucosa, galactosa y fructosa.

En una forma de realización, el monosacarido desoxi cfclico se selecciona del grupo que consiste en fucosa, desoxirribosa y ramnosa.

En una forma de realización, el alcohol de azucar se selecciona del grupo que consiste en glicol, glicerol, eritritol, treitol, ribitol, arabitol, xilitol, sorbitol (glucitol), manitol, dulcitol (galactitol), iditol y fucitol. En otra forma de realización, el alcohol de azucar se selecciona del grupo que consiste en sorbitol y dulcitol.

En una forma de realization, el monosacarido de anillo abierto se selecciona del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa, eritrosa, treosa, eritrulosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, manosa, gulosa, idosa, talosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, sorbosa, tagatosa y sedoheptulosa.

En una forma de realization, el monosacarido de anillo abierto puede aminarse de forma reductiva con aril o alquil aminas.

En una forma de realization, los monosacaridos cfclicos estan unidos por un enlace 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 o 1,6. En una forma de realization, los monosacaridos cfclicos estan unidos por un enlace 1,4 o 1,6. En una forma de realization, los monosacaridos cfclicos estan unidos por un enlace a. En otra forma de realization, los monosacaridos cfclicos estan unidos por un enlace p. En una forma de realization adicional, cuando estan presentes mas de 2 monosacaridos, cada uno de los monosacaridos esta unido por enlaces a. En una forma de realización adicional, cuando estan presentes mas de 2 monosacaridos, cada uno de los monosacaridos esta unido por enlaces p. En otra forma de realization, cuando estan presentes mas de 2 monosacaridos, los monosacaridos estan unidos por una combination de enlaces a y p.

En una forma de realization, A, B y D son cada uno un monosacarido cfclico seleccionado del grupo que consiste en glucosa, galactosa y fructosa, y cada grupo hidroxilo de la glucosa, galactosa o fructosa esta opcionalmente sustituido con SO^3" o PO^3".

El oligosacarido polianionico se puede seleccionar del grupo que comprende sulfato de maltosa, sulfato de maltotriosa, sulfato de maltotetraosa, sulfato de panosa, sulfato de isomaltotriosa, sulfato de erlosa, sulfato de celobiosa y sulfato de rafinosa.

En una forma de realization adicional, el oligosacarido polianionico puede ser sulfato de celobiosa.

En otra forma de realization, el polianion puede ser un oligosacarido polianionico que tiene la estructura general (I-a):

donde cada R¹ se selecciona independientemente de OSO^3- , COO^- , OPO^3- , OH o H; y n es un numero entero entre 0, 1 y 2; y en la que al menos dos de R¹ se seleccionan del grupo que consiste en OSO^3- , COO^- , y OPO^3- . En una forma de realization, n es 1 o 2. En una forma de realization, cada R¹ es OSO^3- .

En otra forma de realization, el polianion puede ser un oligosacarido polianionico que tiene la estructura general (I-b):

donde cada R1 se selecciona independientemente de OSO^{3 -}, COO^' , OPO^{3 -}, OH o H; y n es un numero entero entre 0, 1 y 2; y en la que al menos dos de R1 se seleccionan del grupo que consiste en OSO^{3 '}, COO^- , y OPO^{3 '}. En una forma de realización, n es 1 o 2. En una forma de realización, cada R1 es OSO^{3 '}.

En otra forma de realización, el oligosacarido polianionico se puede seleccionar del siguiente grupo:

donde cada R² se selecciona independientemente de OSO^{3 -}, COO^' , OPO^{3 -}, OH o H; y en los que al menos dos de R² se seleccionan del grupo que consiste en OSO^3- , COO^- , y OPO^3- .

En el presente documento tambien se describe una ciclodextrina polianionica que tiene la estructura general (II):

donde cada R³ se selecciona independientemente de un grupo O-alquilo, O-arilo, O-aralquilo, O-alquenilo, O-alquinilo opcionalmente sustituido, OSO^3- , COO^- , OPO^3- , OH o H y cada R⁴ se selecciona independientemente de OSO³ , COO^- , OPO^3- , OH o H; x es un numero entero entre 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, y 10, y en la que la ciclodextrina polianionica incluye al menos dos sustituyentes anionicos seleccionados del grupo que consiste en OSO^3- , COO^- , y OPO^3- .

x puede ser 4, 5 o 6. La ciclodextrina puede ser a-ciclodextrina, p-ciclodextrina o Y-ciclodextrina.

En otra forma de realización, el oligosacarido es un oligosacarido sulfatado o un oligosacarido de anillo abierto. En otras formas de realización, el polianion puede ser una forma de anillo abierto sulfatado del extremo de azucar reductor de un trisacarido o tetrasacarido tal como maltotriitol sulfatado y maltotetraitol, respectivamente. Los derivados de esos trisacaridos o tetrasacaridos pueden ser restos aminados en forma reductora con grupos alquilo y arilo, manteniendo o abriendo el anillo del azucar reductor.

En el presente documento tambien se describe un polianion que es un disacarido, oligosacarido, disacarido de anillo abierto u oligosacarido de anillo abierto que tiene la siguiente fórmula estructural:

E-(G)^a

en la que a es un numero entero entre 1 y 10; E se selecciona del grupo que consiste en: una diosa, una triosa, una tetraosa, una pentosa, una hexosa, una heptosa, una octosa y una nonosa, y cada G independiente se selecciona del grupo que consiste en: una diosa, una triosa, una tetraosa, una pentosa, una hexosa, una heptosa, una octosa y una nonosa;

en la que E y G, y donde a es un numero entero de 2 o mas, G y G, unidos a traves de un grupo seleccionado de: -O-(CH²)^x-O-, -O-, -OCH²-, -NH-, -S-, -NR(CH²)^x-Ar-(CH²)^xNRⁱ -,-NR(CH²)^xNRⁱ -, -O(CH²)^x-Ar-(CH²)^xO-, -C(O)-N(R²)-(CH²)^x-N(R²)-C(O)-, -N(R²)-C(O)-Ar-(CH²)^x-Ar-C(O)-N(R²)- y -N(R²)-(CH²)^x-N(R²)-; R, Rⁱ y R² se seleccionan del grupo que consiste en: hidrogeno, alquilo, arilo, heteroarilo y C(O)-alquilo; x es un numero entero entre 0 y 10;

en la que E y G pueden estar sustituidos con un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en: alquilo, alquenilo, arilo, halo, heteroarilo, un derivado amida tal como -NHCOCH³-, alcoxi tal como -OCH³- , -O- y -OH;

y en la que dicha diosa, triosa, tetraosa, pentosa, hexosa, heptosa, octosa y nonosa pueden sulfatarse, fosforilarse o carboxilarse.

E y cada G pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en una pentosa, una hexosa y una heptosa, y se unen a traves de un grupo seleccionado de: -O-(CH²)^x-O-, -O-, -OCH²-, -NR(CH²)^x-Ar-(CH²)^xNRⁱ -, -O(CH²)^x-Ar-(CH²)^xO-, -C(O)-N(R²)-(CH²)^x-N(R²)-C(O)-, -N(R²)-C(O)-Ar-(CH²)^x-Ar-C(O)-N(R²)-, y R, Rⁱ y R² se seleccionan del grupo que consiste en: hidrogeno, acetilo y alquilo, y x es un numero entero entre i y 6.

En otro aspecto, la hexosa puede seleccionarse del grupo que consiste en: glucosa, galactosa, manosa, fructosa, fucosa, e idosa, y la pentosa puede ser xilosa.

Polianiones lineales y unidos

En el presente documento tambien se describen polianiones que son una construction sulfatada de 2 azucares unidos de manera reductora, a traves de sus extremos reductores, que tienen por lo tanto anillos abiertos y que presentan una estructura de poliol lineal. Por ejemplo, el enlazador -NH²-CH²-CHOH-CH²-NH²- puede unir 2 unidades de glucosa o acido glucuronico reducidas. La longitud de la cadena y el numero de posibles grupos sulfato por molecula en este tipo de estructura tambien pueden extenderse mediante la election apropiada del tipo de azucar como las subunidades de partida, por ejemplo, una heptosa, tal como sedoheptulosa, en lugar de una hexosa, tal como glucosa. En otros aspectos, el polianion puede ser una construccion sulfatada con un enlazador entre el monosacarido cfclico y los monosacaridos de anillo abierto.

En otros aspectos, el polianion puede ser un poliol polianionico lineal de i2, i3, i3, i5, i6, i7 o i8 longitudes de cadena de atomos de carbono. El poliol polianionico lineal puede contener enlaces insaturados, cadenas ramificadas o estructuras de anillo que pueden estar saturadas o insaturadas. El poliol polianionico lineal puede estar opcionalmente sustituido. Los ejemplos de precursores alcoholicos son i,2,i3,i4-tetradecan-tetraol, 5-(hidroximetil)undecano-i,5,6,7,ii-pentol, octadecano-i,i8-diol, y derivados de escualeno hidrolizado. En un aspecto, el poliol lineal polianionico esta sulfatado. En otros aspectos, el poliol lineal polianionico incluye al menos 2 sustituyentes seleccionados de un grupo sulfato, un grupo carboxilato y un grupo fosfato.

En otros aspectos, el polianion puede ser un compuesto polianionico basado en alquil polioles o unido a anillos aromaticos, por ejemplo, suramina y derivados relacionados.

Polianiones de ciclitol

En el presente documento tambien se describe un polianion que es un ciclitol que tiene la siguiente formula ^estructural:

J

R 1 q ------------- H -------------R 11

en la que:

H se selecciona del grupo que consiste en: N, CH, O, S, o un enlazador seleccionado de -CO-NH-K-NH-CO-, -NH-CO-K-CO-NH-, -NH-K-NH-, -O-K-O-;

K se selecciona del grupo que consiste en alquileno y arileno;

Ri⁰ es un anillo carbocfclico de 4, 5, o 6 miembros que esta saturado o insaturado, en el que el anillo

i8

comprende al menos un grupo sulfato, al menos un grupo carboxilato, o al menos un grupo fosfato.

R¹¹ , se selecciona del grupo que consiste en: un anillo carbocfclico de 4, 5 o 6 miembros que esta saturado o insaturado, en el que el anillo comprende al menos un grupo sulfato, al menos un grupo carboxilato, o al menos un grupo fosfato, hidrogeno, arilo y alquilo;

J se selecciona del grupo que consiste en: hidrogeno, alquilo, arilo, -L-C(R^{i 2} )(Rⁱ³ ) y acetato;

L se selecciona del grupo que consiste en: -(CH²)^x-, -CH²-Ar-CH²-,-CH²CH(OH)CH²-, -(CH²)^x-Ar-(CH²)^x-, en los que el grupo L puede comprender opcionalmente uno o mas grupos sulfato, uno o mas grupos carboxilato, o uno o mas grupos fosfato.

R¹² y R¹³ se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: un anillo carbocfclico de 4, 5, o 6 miembros que esta saturado o insaturado, hidrogeno, arilo y alquilo, en el que R¹² y/o R¹³ pueden comprender uno o mas grupos sulfato, uno o mas grupos carboxilato o uno o mas grupos fosfato, y x es un numero entero entre 0 y 10.

En un aspecto, L se selecciona del grupo que consiste en: -(CH²)^x-, en la que x es un numero entero entre 2 y 10, CH²-Ar-CH² y CH²CH(OSO³H)CH².

En un aspecto alternative, R10

, R11, R12 y R13 pueden seleccionarse independientemente de los siguientes:

en los que T se selecciona independientemente del grupo que consiste en: SO³ H, SO^3- , COOH, COO^- , OPO³ H y OPO^3- .

Polianiones de arilen urea

Tambien se describe en el presente documento un polianion que es un arilen urea de la siguiente fórmula

en la que cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en: SO³ H, SO^3- , hidrogeno, alquilo, halo, fenilo, un derivado amida, -NHCOCH³ , NO^3- -O-, -OCH³ , COOH, COO^- , OPO³ H y OPO^3- . cada V se selecciona independientemente del grupo que consiste en: -(NHC(O)Ph)^z-, (CH²)^u y fenilo;

W es -NH-C(O)-NH-;

u y z pueden ser independientemente entre si un numero entero entre 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

En un aspecto, la arilen urea puede ser una suramina, o una sal de la misma.

Los ejemplos de polianiones para su uso de la invention incluyen los siguientes:

Otros polianiones se muestran a continuacion a modo de ejemplo solamente. Estos polianiones adicionales no forman parte de la invencion reivindicada.

Preparation de polianiones

Los polianiones como se definen en las reivindicaciones para su uso en los metodos de la invencion o como se describen en el presente documento solo a modo de ejemplo pueden comprarse o prepararse mediante metodos conocidos por los expertos en la tecnica.

Los compuestos de oligosacaridos sulfatados usados en los metodos y composiciones de la invencion pueden prepararse por sulfatacion de un oligosacarido correspondiente tambien por metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, el compuesto de oligosacarido se puede tratar con un agente de sulfatacion tal como el complejo de piridina-trioxido de azufre en presencia de un disolvente apropiado.

El polianion puede ser una mezcla de compuestos obtenidos por reaccion de un oligosacarido con complejo de piridina-trioxido de azufre.

El oligosacarido puede tener uno o mas grupos sulfato presentes. Estos grupos sulfato pueden reaccionar con diversas bases para formar sales. Los compuestos sulfatados son estables cuando estan en forma de sal. Los compuestos sulfatados en forma libre se pueden derivar de una sal de los mismos utilizando una resina de intercambio cationico tal como Dowex 50W-X8. Opcionalmente, una sal puede someterse a un intercambio ionico convencional para convertirla en una cualquiera de diversas otras sales deseables.

Los oligosacaridos que estan sulfatados pueden ser productos de origen natural, por ejemplo, rafinosa, estaquiosa o ciclodextrinas. Como alternativa, los polianiones pueden prepararse por sfntesis qufmica o los oligosacaridos pueden prepararse por degradacion enzimatica o qufmica de polisacaridos de origen natural seguido de la modificacion qufmica posterior.

Actividad anticoagulante de los polianiones

Algunos polianiones pueden tener una actividad anticoagulante. El termino "actividad anticoagulante" se refiere a una actividad de una sustancia que previene, inhibe o prolonga la coagulacion sangufnea en un ensayo de coagulacion sangufnea in vitro o in vivo.

Los ensayos de coagulacion sangufnea se conocen en la tecnica e incluyen ensayos que miden el tiempo requerido para la formacion de un coagulo de fibrina. Por ejemplo, el ensayo puede incluir tiempo de protrombina (PT), tiempo de tromboplastina parcial (PTT), tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), ensayo de fibrinogeno, tiempo de coagulacion de trombina (TCT) y tiempo de coagulacion activada (ACT).

La actividad anticoagulante de un polianion puede afectar a las aplicaciones clfnicas o las dosis eficaces del polianion util en los metodos descritos en el presente documento. Por lo tanto, como se define en las reivindicaciones, el polianion de la invencion no tiene una actividad anticoagulante sustancial, de modo que el polianion aumenta el tiempo de protrombina (PT), el tiempo de tromboplastina parcial (PTT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), el tiempo de coagulacion de la trombina (TCT), o el tiempo de coagulacion activada (ACT) en un 0% a un 10% del intervalo normal.

En otras formas de realización, el polianion aumentar el PT, PTT, APTT, TCT o ACT en aproximadamente el 1 a aproximadamente el 5% del rango normal. En una forma de realización adicional, el polianion aumentara el PT, PTT, APTT, TCT o ACT en aproximadamente el 2,5 a aproximadamente el 7,5% del rango normal. En aun una forma de realización adicional, el polianion aumentara el PT, PTT, APTT, TCT o ACT en aproximadamente el 5 a aproximadamente el 10% del rango normal.

Nanopartfculas

La Patente de Estados Unidos Numero 6.977.068 titulada "Method for detection of fibrin clots" describe metodos para el uso de nanopartfculas de radionuclidos encapsuladas con carbono en la deteccion de coagulos de fibrina. La solicitud de patente Internacional numero PCT/AU2006/000554, presentada el 28 de abril de 2006 y publicada como WO 2006/116798 A1, titulada "A method of forming an injectable radioactive composition of a carbon encapsulated radioactive particulate", describe un proceso para la produccion de una formulacion inyectable de nanopartfculas encapsuladas con carbono. El proceso descrito en el presente documento puede denominarse "proceso FibrinLite" y las nanopartfculas producidas de este modo pueden denominarse "FibrinLite".

Se entendera que un experto en la tecnica sera consciente de que los metodos para producir una dispersion acuosa de compuestos de nanopartfculas encapsuladas con carbono pueden incluir una etapa de captura acuosa de un aerosol radioactivo y que esta etapa se puede lograr de varias maneras. Por ejemplo, la etapa de captura acuosa de un aerosol radiactivo utilizado para hacer compuestos de nanopartfculas encapsuladas con carbono puede incluir, pero sin limitacion, la recoleccion del aerosol en un lavador Venturi, la concentracion del aerosol en un electrodo lfquido o el uso de un dispositivo ciclonico.

Descritos unicamente a modo de ejemplo, los compuestos de nanopartfculas encapsuladas con carbono pueden prepararse utilizando el proceso descrito en el documento de patente PCT/AU2006/00054, en el que el proceso implica la captura del aerosol radiactivo en agua utilizando un precipitador de Browitt descrito en la patente de Estados Unidos numero 5.792.241.

Como se ha descrito anteriormente, las nanopartfculas encapsuladas con carbono pueden proporcionar una alta radioactividad especffica y un alto marcado de avidez de macromoleculas tales como histonas.

Como se describe en el documento de patente PCT/AU2006/000554, se puede preparar una partfcula radiactiva encapsulada con carbono (nanopartfcula) cargando un crisol de carbono con tecnecio u otro isotopo, precalentando el crisol cargado, la emision instantanea de las partfculas, la captura de partfculas en agua u otras soluciones acuosas.

Como se describe en el documento de patente PCT/AU2006/000554, el isotopo se puede usar para cargar un crisol de grafito adecuado, ya sea mediante un metodo evaporativo, si la actividad especffica del isotopo es suficientemente alta, por ejemplo, 100 mCi/ml, simplemente colocando una alfcuota del isotopo en solucion en el crisol y evaporando el lfquido a sequedad mediante un calentamiento resistivo cuidadosamente regulado del crisol. Como alternativa, el crisol puede cargarse electrolfticamente usando el crisol como un catodo y un anodo de un alambre de platino fino en un tubo de suministro de fluido. El tubo administra una solucion de isotopos en el crisol (y facilita su recirculacion a traves del crisol) y el isotopo se puede concentrar en la superficie interna del crisol mediante la accion combinada de la electrolisis y el bombeo continuo.

Despues de cargar, el crisol se somete a una etapa de precalentamiento para eliminar cualquier vehfculo en la solucion de isotopos, por ejemplo, se elimina el cloruro de sodio, preferiblemente por evaporacion en un flujo de gas inerte, por ejemplo, argon. La etapa de precalentamiento reduce la cantidad de carbono libre que posteriormente se elimina del crisol, reduce el nivel de isotopos libres que contaminan las nanopartfculas y aumenta la proporcion de isotopos que esta presente en las fracciones de partfculas mas pequenas.

El crisol pretratado se calienta instantaneamente a, por ejemplo, 2740-2790°C durante 3 segundos por medio de un servo dispositivo electronico para producir un perfil de calentamiento del crisol estrechamente regulado que presenta un rapido tiempo de subida (por ejemplo, 0,3-0,7 segundos) seguido de una meseta plana que se mantiene, por ejemplo, a 2765°C ± 15°C durante un periodo de calentamiento predeterminado (por ejemplo, 2,5-15 segundos). Durante esta etapa, las nanoparffculas se eliminan de la superficie del crisol.

Las parffculas eliminadas del crisol se precipitan en agua que contiene una baja concentracion de un agente tensioactivo, por ejemplo, desoxicolato sodico 10 micromolar y condiciones de muy baja fuerza ionica (por ejemplo, menos de 100 micromolar). En un aspecto preferido, las nanoparffculas pueden precipitarse en una concentracion muy baja de un tampon debilmente acido o esto puede anadirse a la dispersion de nanoparffculas despues de la recogida del precipitador, por ejemplo, una concentracion final de dihidrogenocitrato sodico 300 micromolar a pH 4,1. Por consiguiente, las nanoparffculas pueden producirse como una dispersion acuosa estable con una concentracion de electrolitos muy baja, menos que el equivalente de NaCl 1,0 mM. Cualquiera de los metodos descritos en el documento de patente PCT/AU2006/000554 o derivados de los mismos para la preparacion de las parffculas puede utilizarse en la preparacion de las nanoparffculas descritas en el presente documento. En un ejemplo, esto se puede lograr, por ejemplo, calentando el crisol de grafito cargado con isotopos a aproximadamente 1600 - 1650°C durante 15 segundos para eliminar el cloruro de sodio del velffculo antes de la eliminacion del radioisotopo por encima de 2700°C. El punto de ebullicion del cloruro de sodio es solo de 1413°C, y el radioisotopo Tc-99m no es volatil a esta temperatura. Cuando se utilizan radioisotopos alternativos, el destinatario experto podra determinar la temperatura de eliminacion apropiada, tal como, por ejemplo, en el documento de patente PCT/AU2006/000554.

Las dispersiones acuosas de nanoparffculas fabricadas de acuerdo con el documento de patente PCT/AU2006/000554 no floculan, ni precipitan ni sedimentan en reposo durante, por ejemplo, 48 horas. La dispersion de nanoparffculas puede contener una concentracion muy baja (por ejemplo, en el rango de aproximadamente 1 micromolar a aproximadamente 20 micromolar, ffpicamente aproximadamente 10 micromolar) de un tensioactivo anionico, ffpicamente desoxicolato de sodio que es compatible con y puede inyectarse en la circulacion sangumea de un sujeto vivo (veanse las Figuras 5 y 6 en el presente documento). Las nanoparffculas pueden almacenarse de cualquier manera apropiada, preferiblemente para permitir la estabilidad de la dispersion, tal como mediante el almacenamiento a una concentracion baja de un tampon debilmente acido, tal como a una concentracion final de dihidrogenocitrato sodico 300 micromolar a pH 4,1. La dispersion de las nanoparffculas es estable y puede fraccionarse por tamano mediante el uso de filtros de membrana hidrofilos facilmente disponibles, tales como los filtros de jeringa de ester de celulosa mixta (MCE) Millipore, disponibles con una porosidad de 800, 450 y 220 nm. Mas del 90% de la radioactividad en una preparacion ffpica de nanoparffculas pasara a traves de un filtro MCE de 800 nm, y la cromatograffa en capa fina puede mostrar que la misma preparacion contiene ffpicamente menos del 5% de isotopo soluble.

Isotopos radioactivos

El experto en la tecnica apreciara que cualquier radioisotopo de un elemento metalico puede incorporarse en la nanoparffcula. Como se describe en los documentos de patente PCT/AU2006/000554 y PCT/AU2009/000508, se puede incorporar un rango diverso de radioisotopos en las nanoparffculas, incluyendo los que emiten radiacion gamma, tal como Tc-99m, Ga-67; los que emiten radiacion beta, tal como Y-90; los que emiten radiacion alfa, tal como Bi-213; y los que emiten radiacion de positrones, tal como Cu-64. Se puede utilizar cualquier isotopo radiactivo metalico adecuado, incluidos 198Au, 64Cu, 213Bi, 57Co, 51Cr, 165Dy, 169Er, 59Fe, 67Ga, 68Ga, 153Gd, 166Ho, 111In, 113mIn, 177Lu, 23Na, 24Na, 103Pd, 81Rb, 82Rb, 186Re, 188Re, 75Se, 153Sm, 117mSn, 89Sr, 201Th, 90Y, 169Yb, 192Ir.

El rango de isotopos que se pueden usar en las nanoparffculas, incluye aquellos que son ideales para aplicaciones de diagnostico por imagenes, tal como tomograffa computarizada de foton unico (SPECT) usando Tc-99m o Ga-67, y la tomograffa por emision de positrones (PET) utilizando Cu-64 o Zr-89 o gammagraffa.

Como se describe en los documentos de patente PCT/AU2006/000554 y PCT/AU2009/000508, un radionuclido ejemplar es Tc-99m. Cada una de las nanoparffculas puede transportar decenas de miles o mas de atomos de isotopos en su nucleo, de modo que se pueden obtener niveles muy altos de actividad espedfica que estan muy por encima de los que se pueden obtener con los metodos tradicionales de etiquetado. Para, y utilizando Tc-99m como el radioisotopo encapsulado modelo, puede prepararse una carga de Tc-99m en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mCi, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mCi, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 95 mCi, de aproximadamente 10 a aproximadamente 90 mCi, de aproximadamente 15 a aproximadamente 85 mCi de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 mCi, de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 mCi de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 mCi, de aproximadamente 35 a aproximadamente 65 mCi de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mCi, de aproximadamente 45 a aproximadamente 55 mCi, o de aproximadamente 50 a aproximadamente 55 mCi. Una preparacion ffpica de partfculas se puede hacer facilmente para contener entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 mCi en 2 ml de suspension acuosa, segun se desee. A partir de la caracterizacion en fase de vapor de las partfculas mediante la medicion de las partfculas de movilidad de barrido (SMPS), se puede demostrar que la suspension puede contener aproximadamente 50 pg de material de nanopartfculas, de modo que la actividad especffica se puede realizar hasta 600 mCi/mg, o por encima de 22 GBq/mg. La actividad especffica de la preparacion se puede ajustar segun se desee variando la actividad del isotopo utilizado para cargar el crisol en el generador de aerosol.

Etiquetado de histonas con nanopartfculas

En el aspecto preferido, el etiquetado de las histonas es sustancialmente irreversible en condiciones tfpicas encontradas por la histona marcada in vivo. Tfpicamente, el etiquetado de alta avidez de la histona es tal que hay menos de aproximadamente un 10% de disociacion en condiciones in vivo. La Solicitud de Patente Internacional Numero PCT/AU2009/000508 presentada el 23 de abril 2009 y publicada como WO 2009/129577 A1, titulada "Methods for radiolabelling macromolecules", describe un proceso para el etiquetado de macromoleculas biologicas, tales como polipeptidos.

El documento de patente PCT/AU2009/000508 describe un metodo mediante el cual se pueden preparar macromoleculas radiomarcadas utilizando nanopartfculas, los presentes inventores aprovechan el proceso de encapsulacion de carbono (vease PCT/AU2006/000554) que envuelve un isotopo metalico en una jaula de carbono, por lo que se afsla ffsicamente del contacto con su entorno externo, una propiedad especialmente valiosa para las partfculas y, por lo tanto, para la macromolecula, particularmente cuando se van a usar in vivo. El potencial de lixiviacion y bio-captacion de los iones metalicos radioactivos in vivo de la macromolecula radiomarcada es virtualmente inexistente porque solo el exterior de carbono del compuesto de nanopartfculas esta expuesto al entorno biologico in vivo .

El documento de patente PCT/AU2009/000508 describe metodos mediante los cuales las nanopartfculas pueden revestirse con policationes tales como una histona, de modo que las partfculas resultantes tengan un nucleo de alta actividad especffica de radiomarcador detectable, asf como una histona estrechamente unida.

La histona radiomarcada se puede usar para localizar un isotopo facilmente detectable en un sitio predeterminado in vivo, basado en la interaccion biologica especffica que la histona tiene con un organo, tal como el pulmon. Por ejemplo, como se demuestra en el presente documento, las nanopartfculas de Tc99m en complejos con histonas de timo de ternera son selectivas para el tejido pulmonar, y cuando se administran a un sujeto se dirigiran preferiblemente al pulmon, segun se visualiza mediante gammagraffa. De esta manera, las nanopartfculas revestidas con histona pueden usarse como un agente de cribado para probar la capacidad de los compuestos candidatos para inhibir la acumulacion de histonas en el pulmon.

Condiciones para el radiomarcado de histonas utilizando nanoparticulas

Las nanopartfculas producidas u obtenidas de este modo pueden usarse en los metodos descritos en el documento de patente PCT/AU2009/000508 para radioetiquetar histonas.

Las interfaces hidrofobas, tales como una interfaz aire-agua, interfaces hidrocarburo-agua y, por inferencia, una interfaz grafito-agua como en las suspensiones acuosas de nanopartfculas, generalmente atraen un ligero predominio de iones hidroxilo en agua pura. El resultado es que estas interfaces se comportan como ligeramente cargadas negativamente, aunque los potenciales superficiales suelen ser muy bajos (decenas de milivoltios). Las nanopartfculas tambien pueden llevar una carga negativa aumentada en su superficie debido a la adsorcion del tensioactivo anionico, tfpicamente desoxicolato, que se usa en su preparacion. Si las partfculas y una macromolecula estan cargadas negativamente de manera similar en el mismo medio acuoso, pueden repelerse debilmente entre sf en la escala de decenas de nanometros cuando sus capas dobles difusas de cargas se superponen. Sin embargo, la seleccion de un pH del medio acuoso en el que la carga neta en la histona es sustancialmente cero, tal como en el pl de la histona, criba muy rapidamente este potencial, de modo que ofrece poca barrera energetica a la adsorcion y cohesion de partfculas a una macromolecula en estos sistemas. Dicho cribado, con longitudes de Debye <10 nm, producira una situacion en la que la dispersion atractiva, la correlacion ionica o las fuerzas hidrofobas generalmente dominaran la energfa de interaccion total de estas superficies. El resultado es que las partfculas, una vez acopladas con la histona, se adheriran tenazmente a esa macromolecula de una manera esencialmente irreversible. Las condiciones promueven de este modo la union avida de la histona y el compuesto de nanopartfculas. En aspectos preferidos, el medio en el que se produce el contacto puede comprender un pH y una concentracion de electrolito que promueve la influencia de las fuerzas atractivas de corto alcance entre las nanopartfculas y la histona sobre las fuerzas repulsivas electrostaticas de largo alcance al disminuir esta ultima en extension y magnitud. Como resultado de un contacto exitoso, la macromolecula puede describirse como asociada o en complejo con el compuesto de nanopartfculas. La entidad resultante tambien puede denominarse complejo. Se observa que los terminos "complejo" y "en complejo con" en el presente contexto no pretenden implicar ninguna disposicion estructural particular de la histona y el compuesto de nanopartfculas distinto de lo que ocurre como resultado de un contacto exitoso en el que se unen estrechamente.

Las nanopartfculas se pueden usar para etiquetar una histona poniendose en contacto con las nanopartfculas y la macromolecula en condiciones de pH adecuado y preferiblemente tambien una concentracion de electrolito adecuada. Se pueden seleccionar condiciones de solucion adecuadas que faciliten el proceso de cribado descrito anteriormente y, por lo tanto, permitan que las fuerzas atractivas de corto alcance dominen sobre las fuerzas electrostaticas repulsivas, de modo que las nanopartfculas se unen virtualmente de forma irreversible a una macromolecula. En vista de la divulgacion en el presente documento, se apreciara que pueden determinarse empfricamente las condiciones de union apropiadas y, si se desea, optimas, tales como el pH y la concentracion de electrolito, para un contacto deseado entre nanopartfculas y una histona.

El contacto puede producirse en cualquier medio adecuado, aunque normalmente se preferira un medio acuoso. Antes del contacto, las nanopartfculas pueden prepararse o almacenarse en un medio de almacenamiento adecuado, generalmente seleccionado para permitir la estabilidad de la dispersion. Por lo tanto, la dispersion de nanopartfculas puede contener una concentracion muy baja (por ejemplo, aproximadamente 10 micromolar) de un tensioactivo anionico, tal como desoxicolato de sodio. Antes de la etapa de contacto del metodo descrito en el presente documento, las nanopartfculas se pueden tratar previamente para ajustar las condiciones de la dispersion para favorecer la union de las nanopartfculas y la histona. Por ejemplo, se pueden ajustar condiciones tales como el tipo de tampon, el pH, la concentracion de electrolitos y el tipo, la presencia o ausencia de tensioactivo y la concentracion de cualquier componente, incluidas las nanopartfculas. El ajuste del pH y la fuerza ionica del medio pueden tener lugar en presencia o ausencia de la histona. Tfpicamente, el ajuste del pH y la fuerza ionica del medio, cuando se encuentre en presencia de las nanopartfculas, ocurrira tambien en presencia de la macromolecula para promover la union entre las nanopartfculas y la macromolecula, en lugar de la union entre las nanopartfculas que causara agregacion y agrupamiento.

La union de nanopartfculas a una histona se puede lograr mediante el uso de un pH cercano al pi de la macromolecula y una concentracion adecuada del electrolito simple NaCl, que es eficaz para inducir una union avida de las nanopartfculas a la macromolecula a concentraciones de mas de aproximadamente 1 mM de NaCl. Como se apreciara, las condiciones apropiadas para inducir una union avida de nanopartfculas a una histona pueden lograrse utilizando uno cualquiera o mas de una gran diversidad de electrolitos. Se puede usar una concentracion de electrolito simple superior a aproximadamente 1 milimolar para inducir una union avida de nanopartfculas a una histona y, por lo tanto, cuando las nanopartfculas tienen un nucleo de partfculas radiactivas, para la preparacion de una histona radiomarcada. En general, se espera que la concentracion de electrolito simple de la solucion o medio para el contacto este en el intervalo de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 200 milimolar; tfpicamente, de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 175 milimolar; de aproximadamente 20 milimolar a aproximadamente 150 milimolar; de aproximadamente 50 milimolar a aproximadamente 150 milimolar. Mas tfpicamente, se espera que la concentracion de electrolito de la solucion este en el intervalo de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 200 milimolar; tfpicamente de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 175 milimolar; de aproximadamente 20 milimolar a aproximadamente 150 milimolar; de aproximadamente 40 milimolar a aproximadamente 150 milimolar; de aproximadamente 50 milimolar a aproximadamente 150 milimolar; de aproximadamente 75 milimolar a aproximadamente 150 milimolar; de aproximadamente 90 milimolar a aproximadamente 150 milimolar; de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 150 milimolar; aproximadamente 150 milimolar. Un experto en la tecnica entendera que la fuerza ionica de una solucion de electrolito o medio para la etapa de contacto descrita en el presente documento se puede lograr, por ejemplo, utilizando NaCl, en donde se puede lograr una fuerza ionica adecuada con una concentracion de NaCl de aproximadamente 150 mM o, por ejemplo, una concentracion de MgSCM de menos de aproximadamente 75 mM. Un experto en la tecnica tambien entendera que se puede lograr una fuerza ionica adecuada de una solucion de electrolito mediante el uso de varias especies ionicas diferentes, por ejemplo, una mezcla de NaCl y MgSO4. Ademas, un experto en la tecnica entendera que la fuerza ionica se puede lograr mediante el uso de al menos una especie ionica y al menos una especie no ionica, tal como un polfmero de osmolito o de alto peso molecular, tal como polietilenglicol. Por ejemplo, cuando se reduce la concentracion eficaz del agua, puede ser necesario aumentar la concentracion de electrolito, por ejemplo, a aproximadamente 250 mM.

Se puede usar cualquier especie ionica adecuada. Por ejemplo, las especies ionicas pueden seleccionarse del grupo que comprende sales de Na, Ni, Al, Ru, Pt, Os, Ir, Fe, Se, Sn, K, Te, Mn, Mo, V, Mg, Zn, Ca, Cu, Co. En aspectos preferidos, las especies ionicas se limitaran tfpicamente a aquellas que no son toxicas en las concentraciones eficaces, por ejemplo, Na, K, Ca.

El tampon usado en la etapa de contacto puede ser de cualquier pH adecuado seleccionado como adecuado para promover fuerzas de atraccion de corto alcance entre las nanopartfculas y la histona al suprimir las fuerzas electrostaticas repulsivas. Preferiblemente, el tampon estara en el intervalo de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 10 o mas, de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 8, de aproximadamente pH 3,5 a aproximadamente pH 8,5, de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 8, de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente pH 7,5, de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 7. Mas preferiblemente, el pH de la etapa de contacto, tal como el pH del medio acuoso, estara cerca del pi de la macromolecula a utilizar en el contacto, tal como un polipeptido. Aun mas preferiblemente, el pH de la etapa de contacto estara sustancialmente en el pi de la macromolecula que se utilizara en el contacto. Como se describe en el presente documento, el destinatario experto puede determinar el pH optimo y deseado teniendo en cuenta otras condiciones de reaccion, tal como el tipo y la concentracion de electrolitos y la macromolecula o macromoleculas.

El contacto puede comprender la modificacion de las condiciones durante el transcurso del contacto, tal como un aumento o disminucion de la temperatura de incubacion durante el contacto, o un aumento o disminucion de la agitacion del medio o la mezcla durante el contacto.

La histona radiomarcada puede someterse a una o mas etapas de purificacion posteriores al contacto. Esto puede comprender separar la macromolecula radiomarcada de la macromolecula no marcada y/o del compuesto de nanopartfculas libres. En una reaccion tfpica, el contacto puede dar como resultado una union satisfactoria de las nanopartfculas a una histona para proporcionar histona radiomarcada, mientras se retiene en los medios acuosos de los componentes sin reaccionar de la etapa de contacto, tfpicamente una proporcion de compuesto de nanopartfculas que no se han adherido a la histona. La eliminacion de componentes sin reaccionar puede ser deseable, por ejemplo, en circunstancias en las que el compuesto de nanopartfculas libres serfa perjudicial, tal como el transporte de sangre a organos no diana. La eliminacion de la macromolecula no unida es deseable en el caso de que, de otro modo, compita con la macromolecula marcada por sitios de union especfficos, tales como receptores celulares o sitios de antfgenos, y por lo tanto disminuya la capacidad de obtencion de imagenes o la sensibilidad de cribado. La eliminacion de componentes sin reaccionar puede ser parcial, sustancialmente completa o completa. En este contexto, se entendera que la eliminacion "parcial" incluye la eliminacion de cualquier cantidad de uno o mas componentes sin reaccionar o no deseados, mas tfpicamente la eliminacion de hasta aproximadamente el 80%, 90% o el 95% de uno o mas componentes sin reaccionar o no deseados, y la eliminacion "completa" se entendera como la eliminacion de mas del 95% de uno o mas componentes sin reaccionar o no deseados. Tfpicamente, se prefiere la eliminacion de al menos el 95% de los componentes sin reaccionar o no deseados, mas preferiblemente la eliminacion de mas de aproximadamente el 96%, 97%, 98% o el 99% de los componentes sin reaccionar o no deseados.

Por lo tanto, se entendera que la referencia a "purificacion" en este contexto significa cualquier grado de purificacion, por lo que la macromolecula radiomarcada (o macromolecula "marcada" con un progenitor inactivo de un radioisotopo) despues de una etapa de "purificacion" contiene menos impurezas, tal como componentes sin reaccionar o no deseados del contacto, en comparacion con antes de la etapa de purificacion.

Cualquier metodo capaz de separar histona radiomarcada de componentes sin reaccionar o no deseados, tales como nanopartfculas radiactivas no unidas o histona, puede usarse en una etapa de purificacion. Por ejemplo, el metodo puede comprender lavar uno o mas componentes no deseados de la histona radiomarcada, o puede comprender extraer la histona radiomarcada de uno o mas componentes no deseados, o puede comprender una centrifugacion a alta velocidad, o puede comprender una combinacion de tales etapas.

Metodos para el revestimiento de compuestos de nanopartfculas con histonas

Los compuestos de nanopartfculas de radionuclidos encapsulados con carbono pueden prepararse de acuerdo con el documento de patente PCT/AU2006/000554. Se puede producir una dispersion acuosa estable de pH neutro o ligeramente acido de nanopartfculas que comprenden radionuclido encapsulado con carbono (por ejemplo, Tc-99m La dispersion de nanopartfculas tambien puede contener una concentracion muy baja (por ejemplo, 10 micromolar) de un tensioactivo anionico, desoxicolato de sodio, que es compatible con y puede inyectarse en la circulacion sangufnea de un sujeto vivo (veanse las Figuras 5 y 6 enel presente documento). Estas partfculas pueden transportar decenas de miles o mas de atomos de isotopos como la fuente de marcado, de modo que se pueden obtener niveles muy altos de actividad especffica que estan muy por encima de los que se pueden obtener con los metodos tradicionales de etiquetado. Para compuestos de nanopartfculas con Tc-99m como el radioisotopo encapsulado modelo, se puede hacer facilmente una preparacion tfpica de nanopartfculas para contener entre 1 y 30 mCi en 2 ml de suspension acuosa, segun se desee. A partir de la caracterizacion en fase de vapor de las partfculas mediante tecnicas de medicion de las partfculas de movilidad de barrido (SMPS), se puede demostrar que esta suspension contiene aproximadamente 50 pg de material de nanopartfculas, de modo que la actividad especffica se puede realizar hasta 600 mCi/mg, o por encima de 22 GBq/mg.

El proceso de encapsulacion por carbono envuelve el isotopo metalico en una jaula de carbono, de modo que se afsla ffsicamente del contacto con su entorno externo, una propiedad especialmente valiosa para las partfculas cuando se van a usar in vivo. El potencial de lixiviacion y bio-captacion de los iones metalicos radiactivos in vivo es virtualmente inexistente. Solo el exterior de carbono del compuesto de nanopartfculas esta expuesto al entorno biologico in vivo. Debido a que el carbono esta en una forma grafftica, tiene propiedades adsorbentes naturales, y esto puede usarse como base para la adsorcion ffsica de polipeptidos seleccionados. Sin embargo, primero se requiere determinar las condiciones apropiadas que favoreceran la union de los polipeptidos, y los siguientes estudios y ejemplos ilustran como se pueden determinar estas condiciones.

Los compuestos de nanopartfculas son aptos para una union de alta avidez a traves de interacciones hidrofobas o de dispersion, que implican su superficie grafftica. Para que la superficie grafftica forme interacciones hidrofobas con macromoleculas, tal como los polipeptidos, el polipeptido debe poder acercarse a la superficie del grafito en un rango muy cercano, lo que a su vez requiere que se supriman las fuerzas electrostaticas repulsivas. Los inventores muestran que esta condicion puede cumplirse cuando el polipeptido se presenta en las preparaciones de nanopartfculas con una carga superficial neta minima, ya sea ajustando el pH cerca del punto isoelectrico del polipeptido, o protegiendo la carga del polipeptido con una concentracion apropiada de contraiones electrolfticos. Se pueden usar experimentos de union empfricos para establecer las condiciones de union apropiadas.

Metodos de cribado

En el presente documento tambien se describen metodos para cribar un compuesto que modula la actividad de una o mas histonas. En general, estos metodos comprenden poner en contacto la histona con un compuesto candidato en condiciones adecuadas para permitir la interaccion del compuesto candidato y la histona y ensayar la actividad o perdida de actividad de la histona.

La histona puede seleccionarse de H1, H2A, H2B, H3, H4 o H5. La histona tambien puede comprender una mezcla de diferentes histonas, por ejemplo, histonas de timo de ternera. En algunos aspectos se pueden usar variantes, fragmentos y analogos de una histona.

En un aspecto se proporciona un metodo para cribar compuestos de union a histonas. El metodo utiliza la administracion de una o mas histonas radiomarcadas a un sujeto de ensayo, seguido de la administracion de uno o mas compuestos candidatos al sujeto de ensayo. Despues, se toma una imagen de la histona radiomarcada y la ubicacion de la histona radiomarcada permite evaluar la capacidad de los compuestos candidatos para inhibir la acumulacion de histonas en un organo tal como el pulmon.

En otro aspecto, el compuesto candidato puede administrarse al sujeto de ensayo antes o al mismo tiempo que la histona radiomarcada. Como alternativa, el compuesto candidato puede mezclarse con la histona radiomarcada antes de la administracion de la mezcla al sujeto de ensayo.

Se pueden usar imagenes externas mediante metodos conocidos en la tecnica, tales como tomograffa computarizada de foton unico (SPECT), tomograffa por emision de positrones (PET) o gammagraffa. En otros aspectos, las histonas se pueden marcar con tintes fluorescentes, tal como FITC (isotiocianato de fluorescefna) o puntos cuanticos. En otro ejemplo, la histona puede estar marcada con un resto bioluminiscente. La ubicacion y la concentracion de la histona marcada se pueden determinar in vivo.

La formacion de imagenes por cualquier modalidad conocida en la tecnica puede revelar la presencia o el exceso de la histona marcada en un sitio de tejido u organo que puede deberse a un fracaso de un compuesto candidato para inhibir la acumulacion de histonas. De manera similar, una disminucion en la abundancia de la histona marcada en un tejido u organo, en comparacion con una histona marcada de control en ausencia del compuesto de ensayo, indica que un compuesto candidato inhibe la histona y evita la acumulacion en el tejido u organo.

Debe observarse que cuando se inyectan por via intravenosa, los compuestos de nanopartfculas sin marcar se eliminan casi por completo de la circulacion en 20 minutos mediante el sistema reticuloendotelial, es decir, las celulas fagocfticas, tal como las celulas de Kupffer del hfgado. Por lo tanto, la presencia o el exceso de la histona marcada en el hfgado, el bazo y la medula osea puede indicar la rapida depuracion de las nanopartfculas circulantes por el sistema reticuloendotelial que puede deberse a un compuesto candidato que inhibe la union de las histonas al pulmon, por ejemplo.

Las histonas, variantes, fragmentos y analogos de las mismas son utiles para el cribado e identificacion de compuestos y agentes que interactuan con estas moleculas. En particular, los compuestos deseables son aquellos que modulan la actividad de estas moleculas. Dichos compuestos pueden ejercer un efecto modulador al inhibir la funcion de la histona, variantes, fragmentos y analogos de los mismos. Ademas, las variantes de histonas, fragmentos y analogos de los mismos son utiles para el cribado e identificacion de compuestos y agentes que promueven la degradacion de las histonas. Los compuestos adecuados pueden ejercer su efecto en virtud de una interaccion directa (por ejemplo, union) o indirecta. Como alternativa o adicionalmente, los compuestos adecuados pueden ejercer su efecto modulando la interaccion de histonas, variantes, fragmentos y analogos de los mismos con otras protefnas o peptidos.

Los compuestos que se unen, o que de otra manera interactuan con histonas, y especfficamente compuestos que modulan su actividad o promueven su degradacion, pueden identificarse mediante una diversidad de metodos adecuados. Los metodos no limitantes incluyen, co-inmunoprecipitacion, metodos de deteccion basados en inmunologfa tales como transferencia de Western, cromatograffa de afinidad, filtracion en gel, ensayos de movilidad en gel, espectroscopfa de masas, purificacion por afinidad en tandem, presentacion de fagos, transferencia de marcadores, micromatrices de protefnas.

Ademas, la capacidad de los compuestos candidatos que se unen, o que de otra manera interactuan con las histonas y que modulan la actividad o promueven la degradacion de las histonas, puede evaluarse por el efecto de esos compuestos candidatos sobre la funcion de las histonas. La funcion puede medirse de acuerdo con cualquier metodo conocido en la tecnica.

Cromatograffa de afinidad

La cromatograffa de afinidad se puede usar para determinar si un agente candidato o una pluralidad de agentes candidatos interactuan o se unen con una histona o una variante o fragmento de la misma. Por ejemplo, la histona, variantes, fragmentos o analogos de la misma, pueden inmovilizarse en un soporte (como la Sepharose) y los compuestos candidatos, ya sea solos o en mezclas, se pasan por la columna. Los compuestos que se unen al polipeptido de histona inmovilizado o una variante o fragmento del mismo, se pueden eluir de la columna e identificar, por ejemplo, mediante espectrometrfa de masas.

De esta manera, pueden identificarse protefnas u otros compuestos que no interaccionan directamente con histonas, fragmentos de variantes o analogos de las mismas. Por ejemplo, un compuesto que interactua directamente con una histona puede a su vez estar asociado con un agente que puede modular la actividad de la histona sin interaccion directa con la histona. La interaccion del complejo del compuesto y el agente asociado con el polipeptido de histona inmovilizado o una variante o fragmento del mismo, facilitara la identificacion de compuestos que pueden modular la actividad de la histona sin interaccion directa con la histona.

Los moduladores potenciales de la actividad de la histona pueden generarse para el cribado por los metodos anteriores mediante una serie de tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, se pueden usar metodos tales como cristalograffa de rayos X y espectroscopia de resonancia magnetica nuclear para modelar la estructura de histonas, fragmentos de variantes o analogos de las mismas, facilitando asf el diseno de posibles agentes moduladores utilizando el modelado basado en ordenador. Tambien se pueden usar diversas formas de qufmica combinatoria para generar moduladores putativos.

Las histonas, variantes, fragmentos o analogos de las mismas pueden usarse en cribas de alto rendimiento para ensayar compuestos candidatos para determinar la capacidad de unirse o interactuar de otro modo con los mismos. Estos compuestos candidatos pueden cribarse adicionalmente frente a histonas funcionales, fragmentos de variantes o analogos de las mismas, para determinar el efecto del compuesto sobre la actividad enzimatica.

Metodos inmunologicos

Los metodos inmunologicos pueden usarse para determinar si un agente candidato o una pluralidad de agentes candidatos interaction o se unen con una histona o una variante o fragmento de la misma. En un aspecto, una histona o una variante o fragmento de la misma, puede ponerse en contacto con al menos un compuesto candidato antes de usar la inmunoprecipacion para determinar si un agente candidato o la pluralidad de agentes candidatos interaction o se unen con una histona o una variante o fragmento de la misma. Usando esta tecnica, al menos un compuesto candidato puede ponerse en contacto con una histona o una variante o fragmento, tfpicamente mezclando soluciones de cada uno. Esa mezcla (muestra) puede incubarse entonces con un anticuerpo especffico para el compuesto candidato o la histona que puede inmunoprecipitarse de la solucion, por ejemplo, mediante captura con una protefna de union a anticuerpo unida a un soporte solido. La inmunoprecipitacion de una protefna mediante este metodo facilita la co-inmunoprecipitacion de un agente asociado con esa protefna. La identificacion de un agente asociado se puede establecer mediante una serie de metodos conocidos en la tecnica, incluyendo, pero sin limitacion, SDS-PAGE, transferencia Western y espectrometrfa de masas.

Los anticuerpos especfficos para un compuesto candidato o una histona pueden inmovilizarse sobre un soporte. Detectar un compuesto candidato asociado con la histona tfpicamente implica poner en contacto el anticuerpo inmovilizado con una muestra que contiene supuestamente un compuesto candidato asociado con una histona en condiciones adecuadas para la union entre el anticuerpo inmovilizado y la histona o compuesto candidato, y aclarar el soporte con un reactivo adecuado para eliminar la muestra no unida. Posteriormente, la muestra unida que contiene supuestamente un compuesto candidato asociado con una histona se puede eluir, por ejemplo, mediante aclarado con un desnaturalizante, y la identidad de los componentes de la muestra unida se puede establecer utilizando varios metodos conocidos en la tecnica, incluidos, pero sin limitacion, SDS-PAGE, transferencia Western, y espectrometrfa de masas.

El anticuerpo puede inmovilizarse sobre el soporte por union directa, o unirse indirectamente al soporte a traves de uno o mas compuestos adicionales. Los ejemplos no limitantes de soportes adecuados incluyen placas de ensayo (por ejemplo, placas de microtitulacion) o tubos de ensayo fabricados con polietileno, polipropileno o poliestireno, cloruro de polivinilo, membranas (por ejemplo, membranas de nitrocelulosa), perlas/discos (incluidas perlas magneticas y discos) y materiales en partfculas tales como papel de filtro, membrana de nitrocelulosa, Sepharose, agarosa, dextrano reticulado y otros polisacaridos.

En ciertos aspectos, la deteccion de un agente candidato o una pluralidad de agentes candidatos que interaction o se unen con una histona o una variante o fragmento de la misma se realiza como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). En general, el ensayo implica el revestimiento de un reactivo de captura adecuado sobre un soporte solido, tal como los pocillos de una placa de microtitulacion o una columna, fabricados a partir de un material tal como polietileno, polipropileno, poliestireno y similares. En un aspecto, se usa un anticuerpo anti-histona como reactivo de captura. En otro ejemplo, el reactivo de captura se prepara revistiendo al menos un compuesto candidato sobre el soporte solido. En un aspecto adicional, el reactivo de captura puede ser heparina, heparan sulfato, heparan sulfato conjugado con albumina serica bovina, heparan sulfato proetoglicano (por ejemplo, perlecan), celulas de mamfferos o similares. En otro aspecto, la histona se puede usar como reactivo de captura. El reactivo de captura puede estar unido a la superficie del soporte, por ejemplo, mediante una interaccion no covalente o covalente o un enlace ffsico. Si se usa un enlace covalente, el agente de reticulacion se puede utilizar para unir el reactivo de captura al soporte (por ejemplo, glutaraldehfdo, esteres de N-hidroxi-succinimida, maleimidas bifuncionales).

El soporte puede tratarse con un agente de bloqueo (por ejemplo, leche desnatada, albumina de suero bovino, casefna, albumina de huevo) para evitar la union no deseada del material a los sitios en exceso en la superficie del soporte.

La muestra puede administrarse a la superficie del soporte despues del revestimiento y el bloqueo. En general, la muestra se diluye a un nivel apropiado utilizando un tampon adecuado. El grado de dilucion de la muestra y la seleccion de un tampon apropiado dependeran de factores tales como la muestra bajo analisis y el tipo de soporte y reactivo de captura utilizado en el ensayo. Estos pueden determinarse sin esfuerzo inventivo por los expertos en la tecnica.

Una vez aplicada al soporte revestido con reactivo de captura, la muestra generalmente se incuba en condiciones adecuadas para maximizar la sensibilidad del ensayo y para minimizar la disociacion. La incubacion se puede realizar a una temperatura generalmente constante, que varfa de aproximadamente 0°C a aproximadamente 40°C, y preferiblemente que varfa de aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C. El pH de la mezcla de incubacion puede estar en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 10, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, y mas preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8. En una forma de realización, la mezcla de incubacion es a pH 7,4. Pueden emplearse diversos tampones para lograr y mantener el pH objetivo durante la incubacion, cuyos ejemplos no limitativos incluyen Trisfosfato, Tris-HCl, borato, fosfato, acetato y carbonato. El tiempo de incubacion generalmente se asocia con la temperatura y puede ser inferior a aproximadamente 12 horas para evitar la union no especffica. Preferiblemente, el tiempo de incubacion es de aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 3 horas, y mas preferiblemente de aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 1,5 horas a temperatura ambiente.

Despues de la incubacion, la muestra biologica se puede eliminar del reactivo de captura inmovilizado para eliminar la muestra no unida, por ejemplo, lavando/aclarando el soporte. El pH de un tampon de lavado adecuado puede estar en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 9 y preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8. El lavado/aclarado puede realizarse tres o mas veces. El lavado/aclarado se puede realizar usando un tampon de lavado generalmente a temperaturas de aproximadamente 0°C a aproximadamente 40°C, y preferiblemente de aproximadamente 4°C a aproximadamente 30°C.

En una etapa posterior, los componentes inmovilizados de la muestra unida al reactivo de captura pueden ponerse en contacto con un reactivo de deteccion. La eleccion del reactivo detectable puede depender de factores que incluyen el reactivo de captura utilizado y el tipo de muestra bajo analisis. Preferiblemente, las moleculas inmovilizadas de la muestra unida al reactivo de captura se ponen en contacto con un reactivo de deteccion a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C, y preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C. En un aspecto, las moleculas inmovilizadas de la muestra unida al reactivo de captura se ponen en contacto con un reactivo de deteccion a temperatura ambiente (TA) durante aproximadamente una hora. El reactivo de deteccion puede ser un anticuerpo. En aplicaciones en las que el reactivo detectable es un anticuerpo, es preferible un exceso molar del anticuerpo con respecto a la concentracion maxima de las moleculas de la muestra inmovilizada sobre el soporte. El anticuerpo puede detectarse directa o indirectamente. El anticuerpo puede tener una etiqueta colorimetrica o una etiqueta fluorometrica. Se puede usar un anticuerpo adicional que se una al reactivo de deteccion. El anticuerpo adicional puede tener una etiqueta colorimetrica o una etiqueta fluorometrica.

La determinacion de la presencia y los niveles de una muestra unida al reactivo de captura se puede lograr usando metodos conocidos en la tecnica, y dependera del reactivo de deteccion utilizado. Por ejemplo, la deteccion puede incluir colorimetrfa, quimioluminiscencia o fluorometrfa. La deteccion y las mediciones cuantitativas se pueden realizar en funcion de la senal derivada del reactivo o reactivos de deteccion en comparacion con la senal de fondo derivada de las muestras de control.

Tratamiento de la sepsis

El tratamiento de la sepsis tfpicamente implica el tratamiento de la causa subyacente de la afeccion, por ejemplo, mediante terapia con antibioticos. Si bien se han desarrollado tratamientos alternativos, como la protefna C activada (APC), estos han tenido poco impacto clfnico debido a las propiedades anticoagulantes de la terapia o al modo de accion lento en relacion con la rapida progresion de la sepsis.

La toxicidad de la histona se ha identificado recientemente como un mediador de la disfuncion de las celulas endoteliales, la insuficiencia organica y la muerte en la sepsis. Los inventores han descubierto que los polianiones de oligosacaridos, que tienen propiedades anticoagulantes insignificantes, pueden formar complejos con las histonas en la circulacion de un animal vivo y prevenir la acumulacion de histonas en los organos. Esto proporciona la base para un tratamiento de la sepsis que tfpicamente implica la administracion de al menos un polianion a un paciente que necesita dicho tratamiento, aunque el metodo de tratamiento no forma parte de la invencion reivindicada.

Composiciones, dosificaciones y rutas de administracion

Solo a modo de ejemplo, el polianion o polianiones para su uso en la presente invencion se pueden administrar como composiciones terapeutica o preventivamente. En una aplicacion terapeutica, las composiciones se administran a un sujeto que ya padece una enfermedad (por ejemplo, sepsis), en una cantidad suficiente para resolver o detener parcialmente la enfermedad y/o sus complicaciones o para mejorar la supervivencia de un paciente.

En general, las composiciones adecuadas pueden prepararse de acuerdo con metodos que son conocidos por los expertos en la tecnica y, por consiguiente, pueden incluir un vehfculo, diluyente, y/o adyuvante farmaceuticamente aceptable.

Los metodos para preparar composiciones administrables son evidentes para los expertos en la tecnica, y se describen con mas detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.

El polianion puede estar presente como una sal farmaceuticamente aceptable. Por "sal farmaceuticamente aceptable" se entiende aquellas sales que, dentro del alcance de un buen criterio medico, son adecuadas para su uso en contacto con tejidos de seres humanos y animales inferiores sin demasiada toxicidad, irritacion, respuesta alergica, y similares, y son proporcionales con una relacion beneficio/riesgo razonable. Las sales farmaceuticamente aceptables son bien conocidas en la tecnica.

La cantidad terapeuticamente eficaz de un polianion divulgado en el presente documento para cualquier sujeto particular dependera de una diversidad de factores incluyendo: la gravedad de la sepsis; actividad de las composiciones empleadas; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administracion; la via de administracion; la tasa de secuestro de las composiciones; la duracion del tratamiento; farmacos utilizados en combinacion o coincidentes con el tratamiento, junto con otros factores relacionados bien conocidos en medicina.

Un experto en la tecnica podrfa, por experimentacion rutinaria, determinar una cantidad eficaz, no toxica de los componentes de las formulaciones que se requerirfan para lograr el resultado deseado.

Generalmente, se espera que una dosificacion eficaz de polianion este en el intervalo de aproximadamente 0,0001 mg a aproximadamente 1000 mg por kg de peso corporal por 24 horas; tfpicamente, de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 750 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 500 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 250 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 250 mg por kg de peso corporal por 24 horas. Mas tfpicamente, se espera que una dosis eficaz este en el intervalo de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 200 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 50 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 25 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 5,0 mg a aproximadamente 50 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 5,0 mg a aproximadamente 20 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 5,0 mg a aproximadamente 15 mg por kg de peso corporal por 24 horas.

Como alternativa, la dosificacion eficaz de polianion puede ser de hasta aproximadamente 500 mg/m2. Generalmente, se espera que una dosificacion eficaz este en el intervalo de aproximadamente 25 a aproximadamente 500 mg/m2, preferiblemente de aproximadamente 25 a aproximadamente 350 mg/m2, mas preferiblemente de aproximadamente 25 a aproximadamente 300 mg/m2, aun mas preferiblemente de aproximadamente 25 a aproximadamente 250 mg/m2, incluso mas preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 mg/m2, y todavfa incluso mas preferiblemente de aproximadamente 75 a aproximadamente 150 mg/m2.

Ademas, sera evidente para un experto en la tecnica que la cantidad y el espaciado optimos de las dosificaciones individuales se determinaran por la naturaleza y extension de la sepsis que se trata, la forma, la ruta y el sitio de administracion, y la naturaleza del individuo en particular que se trata. Ademas, dichas condiciones optimas pueden determinarse mediante tecnicas convencionales. En algunas aplicaciones terapeuticas, el tratamiento sera por la duracion de la sepsis, aunque el metodo de tratamiento no forma parte de la invencion reivindicada.

Tambien sera evidente para un experto en la tecnica que el transcurso optimo de tratamiento, tal como el numero de dosis del polianion administrado por hora o dfa durante un numero definido de horas o dfas, puede determinarse por los expertos en la tecnica usando el transcurso convencional de las pruebas de determinacion de tratamiento.

En general, las composiciones adecuadas pueden prepararse de acuerdo con metodos que son conocidos por los expertos en la tecnica y, por consiguiente, pueden incluir un vehfculo, diluyente, y/o adyuvante farmaceuticamente aceptable.

Los modos convenientes de administracion incluyen inyeccion (subcutanea, intravenosa, intraarterial, etc.), administracion oral, intranasal o inhalacion. Dependiendo de la via de administracion, la formulacion y/o el polianion pueden recubrirse con un material para proteger el polianion de la accion de enzimas, acidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar la actividad terapeutica del compuesto. El polianion tambien se puede administrar por via parenteral o intraperitoneal.

Las dispersiones de uno o mas polianiones tambien se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles lfquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, las preparaciones farmaceuticas pueden contener un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las composiciones farmaceuticas adecuadas para inyeccion incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles (en los casos donde sean hidrosolubles) y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Idealmente, la composicion es estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y puede incluir un conservante para estabilizar la composicion contra la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.

En un aspecto, el polianion o polianiones se pueden administrar por via oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehnculo comestible asimilable. El polianion o polianiones y otros ingredientes tambien pueden incluirse en una capsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en comprimidos o incorporarse directamente en la dieta de un individuo. Para la administracion terapeutica oral, el polianion o polianiones pueden incorporarse con excipientes en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Adecuadamente, dichas composiciones y preparaciones pueden contener al menos el 1% en peso de polianion activo. El porcentaje del polianion en composiciones y preparaciones farmaceuticas puede variar, por supuesto, y, por ejemplo, puede variar convenientemente de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 75%, de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 65%; de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 60%, de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 50%, de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 45%, o de aproximadamente el 35% a aproximadamente el 45%, del peso de la unidad de dosificacion. La cantidad de polianion en composiciones terapeuticamente utiles es tal que se obtendra una dosis adecuada.

En otro aspecto, el polianion se puede administrar en forma de liposomas. Los liposomas generalmente se derivan de fosfolfpidos u otras sustancias lipfdicas, y estan formados por cristales lfquidos hidratados mono o multilamelares que se dispersan en un medio acuoso. Se puede usar cualquier lfpido no toxico, fisiologicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. Las composiciones en forma de liposomas pueden contener estabilizantes, conservantes, excipientes y similares. Los lfpidos preferidos son los fosfolfpidos y las fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturales como sinteticos. Los metodos para formar liposomas son conocidos en la tecnica, y en relacion con esto, se hace referencia espedfica a: Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, Nueva York, N.Y. (1976), pag. 33 et seq.

La expresion "vehnculo farmaceuticamente aceptable" pretende incluir disolventes, medios de dispersion, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y de retardo de la absorcion, y similares. Los ejemplos de vehnculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables son agua desmineralizada o destilada; solucion salina; aceites de origen vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite de cartamo, aceite de oliva, aceite de semilla de algodon, aceite de mafz, aceite de sesamo, aceite de mam o aceite de coco; aceites de silicona, incluyendo polisiloxanos, tales como metil polisiloxano, fenil polisiloxano y metilfenil polisolpoxano; siliconas volatiles; aceites minerales tales como parafina lfquida, parafina blanda o escualano; derivados de celulosa tales como metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica o hidroxipropilmetilcelulosa; alcanoles inferiores, por ejemplo, etanol o isopropanol; aralcanoles inferiores; polialquilenglicoles inferiores o alquilenglicoles inferiores, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol, etilenglicol, propilenglicol, 1,3-butilenglicol o glicerina; esteres de acidos grasos tales como palmitato de isopropilo, miristato de isopropilo u oleato de etilo; polivinilpirrolidona; agar; carragenano; goma de tragacanto o goma arabiga, y vaselina. Tfpicamente, el vetnculo o vehnculos formaran del 10% al 99,9% en peso de las composiciones.

El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas se conoce en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el polianion, se contempla su uso en las composiciones terapeuticas y en los metodos de tratamiento y profilaxis. Pueden incorporarse tambien compuestos activos suplementarios en las composiciones de acuerdo con la presente invencion. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificacion para facilitar la administracion y uniformidad de la dosificacion. La "forma de unidad de dosificacion" como se usa en el presente documento se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el individuo a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de polianion o polianiones que se calcula para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehfculo farmaceutico requerido. El polianion o polianiones pueden formularse para una administracion conveniente y eficaz en cantidades eficaces con un vehfculo farmaceuticamente aceptable adecuado en una unidad de dosificacion aceptable. En el caso de composiciones que contienen principios activos complementarios, las dosis se determinan por referencia a la dosis habitual y la forma de administracion de dichos ingredientes.

En una forma de realización, el vehfculo puede ser un vehfculo administrable por via oral.

Otra forma de una composicion farmaceutica es una forma de dosificacion formulada como granulos recubiertos entericamente, comprimidos o capsulas adecuadas para la administracion oral.

Tambien se incluyen en el alcance de esta invencion formulaciones de liberacion retardada.

El polianion tambien se puede administrar en forma de un "profarmaco". Un profarmaco es una forma inactiva de un compuesto que se transforma in vivo en la forma activa. Los profarmacos adecuados incluyen esteres, esteres de fosfonato, etc., de la forma activa del polianion.

Algunos ejemplos de vehfculos, diluyentes, excipientes y adyuvantes adecuados para su uso oral incluyen aceite de cacahuete, parafina lfquida, carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, alginato sodico, goma de acacia, goma de tragacanto, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, gelatina y lecitinina. Ademas, estas formulaciones orales pueden contener agentes saporfferos y colorantes adecuados. Cuando se usan en forma de capsula, las capsulas pueden recubrirse con compuestos tales como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, que retrasan la desintegracion.

En un aspecto, el compuesto se puede administrar por inyeccion. En el caso de soluciones inyectables, el vehfculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de una dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de los microorganismos se puede lograr incluyendo diversos agentes antibacterianos y/o antifungicos. Los agentes adecuados se conocen bien por los expertos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, alcohol bencflico, acido ascorbico, tiomerosal y similares. En muchos casos, puede ser preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio, en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando el polianion en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el analogo en un vehfculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente.

Los comprimidos, trociscos, pfldoras, capsulas, y similares, tambien pueden contener lo siguiente: una aglutinante, tal como goma de tragacanto, goma arabiga, almidon de mafz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicalcico; un agente disgregante tal como almidon de mafz, almidon de patata, acido algfnico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina, o un agente saporffero tal como menta, aceite de gaulteria o aroma de cereza. Cuando la forma de unidad de dosificacion es una capsula, puede contener, ademas de los materiales del tipo anterior, un vehfculo lfquido. Pueden estar presentes otros materiales diversos como revestimientos o para modificar de otro modo la forma ffsica de la unidad de dosificacion. Por ejemplo, los comprimidos, pfldoras o capsulas se pueden cubrir con laca, azucar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el analogo, sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un tinte y saborizante tal como aroma a cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparacion de cualquier forma de unidad de dosificacion debe ser farmaceuticamente puro y sustancialmente no toxico en las cantidades empleadas. Ademas, el analogo se puede incorporar en preparaciones y formulaciones de liberacion sostenida.

Las composiciones farmaceuticas pueden incluir ademas un tampon adecuado para minimizar la hidrolisis acida. Los agentes de agente tampon adecuados se conocen bien por los expertos en la tecnica e incluyen, pero sin limitacion, fosfatos, citratos, carbonatos y mezclas de los mismos.

Se pueden realizar administraciones unicas o multiples de las composiciones farmaceuticas. Un experto en la tecnica podrfa, mediante experimentacion rutinaria, determinar niveles de dosificacion eficaces y no toxicos del polianion y/o un patron de administracion que serfa adecuado para tratar la sepsis.

Regfmenes de combination

Las ventajas terapeuticas pueden realizarse a traves de regfmenes de combinacion. Los expertos en la materia apreciaran que los polianiones descritos en el presente documento pueden administrarse como parte de un enfoque de terapia de combinacion para el tratamiento de la sepsis, aunque los metodos de tratamiento no forman parte de la invencion reivindicada. En la terapia de combinacion, los agentes respectivos pueden administrarse simultanea o secuencialmente en cualquier orden. Cuando se administran secuencialmente, se puede preferir que los componentes se administren por la misma ruta.

Como alternativa, los componentes pueden formularse juntos en una sola unidad de dosificacion como un producto de combinacion. Los agentes adecuados que pueden usarse en combinacion con las composiciones de la presente invencion seran conocidos por los expertos en la tecnica.

Los usos en los metodos de tratamiento descritos en el presente documento pueden aplicarse junto con la terapia convencional. La terapia convencional tambien puede comprender la administracion de agentes antiinflamatorios, agentes antibioticos, agentes antivirales, agentes antifungicos u otras formas de intervencion medica, por ejemplo, el uso de APC. Esto no forma parte de la invencion reivindicada.

Los ejemplos de agentes antiinflamatorios incluyen esteroides, corticosteroides, inhibidores de COX-2, agentes antiinflamatorios no esteroideos (AINE), aspirina o cualquier combinacion de los mismos.

Los ejemplos de agentes antibioticos incluyen aminoglucosidos, ansamicinas, carbacefems, carbapenems, cefalosporinas, glucopeptidos, lincosamidas, macrolidos, monobactamas, penicilinas, polipeptidos, quinolonas, sulfonamidas y tetraciclinas.

Los ejemplos de agentes antivirales incluyen inhibidores no nucleosfdicos de la transcriptasa inversa, inhibidores nucleosfdicos de la transcriptasa inversa (por ejemplo, analogos de los nucleosidos), inhibidores de la proteasa e inhibidores analogos nucleotfdicos de la transcriptasa inversa.

Los ejemplos de agentes antifungicos incluyen imidazoles, triazoles, tiazoles, alilaminas y equinocandinas.

Los polianiones divulgados en el presente documento pueden administrarse terapeutica o preventivamente. En una aplicacion terapeutica, los compuestos y las composiciones se administran a un paciente que ya padece sepsis, en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, la sepsis y sus sfntomas y/o complicaciones. El compuesto o la composicion debe proporcionar una cantidad del compuesto activo suficiente para tratar al paciente de manera eficaz.

Los polianiones divulgados en el presente documento pueden administrarse a pacientes antes de que la sepsis sea clfnicamente evidente, por ejemplo, en pacientes con riesgo de desarrollar sepsis. Sin embargo, los metodos de tratamiento practicados en el cuerpo humano o animal no forman parte de la invencion reivindicada.

Vehfculos, diluyentes, excipientes y adyuvantes

Los vehfculos, diluyentes, excipientes y adyuvantes deben ser "aceptables" en terminos de ser compatibles con los otros ingredientes de la composicion, y no ser perjudiciales para el receptor de los mismos. Dichos vehfculos, diluyentes, excipientes y adyuvantes se pueden usar para mejorar la integridad y la semivida de las composiciones de la presente invencion. Estos tambien se pueden usar para mejorar o proteger las actividades biologicas de las composiciones de la presente invencion.

Los ejemplos de vehfculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables son agua desmineralizada o destilada; solucion salina; aceites de origen vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite de cartamo, aceite de oliva, aceite de semilla de algodon, aceite de mafz, aceite de sesamo, aceite de manf o aceite de coco; aceites de silicona, incluyendo polisiloxanos, tales como metil polisiloxano, fenil polisiloxano y metilfenil polisolpoxano; siliconas volatiles; aceites minerales tales como parafina lfquida, parafina blanda o escualano; derivados de celulosa tales como metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica o hidroxipropilmetilcelulosa; alcanoles inferiores, por ejemplo, etanol o isopropanol; aralcanoles inferiores; polialquilenglicoles inferiores o alquilenglicoles inferiores, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol, etilenglicol, propilenglicol, 1,3-butilenglicol o glicerina; esteres de acidos grasos tales como palmitato de isopropilo, miristato de isopropilo u oleato de etilo; polivinilpirrolidona; agar; goma de tragacanto o goma arabiga, y vaselina. Tfpicamente, el vehfculo o vehfculos formaran del 10% al 99,9% en peso de las composiciones.

Los vehfculos tambien pueden incluir protefnas de fusion o compuestos qufmicos que estan unidos covalentemente a los compuestos de la presente invencion. Dichos vehfculos biologicos y qufmicos se pueden usar para mejorar la administracion de los compuestos a los objetivos o mejorar las actividades terapeuticas de los compuestos. Los metodos para la produccion de protefnas de fusion se conocen en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987) y Sambrook et al (In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Tercera Edicion 2001). Las composiciones de la invencion pueden estar en una forma adecuada para la administracion por inyeccion, en forma de una formulacion adecuada para ingestion oral (tales como capsulas, comprimidos, comprimidos masticables, elixires, por ejemplo), en forma de un unguento, crema o locion adecuada para la administracion topica, en una forma adecuada para la administracion como una gota ocular, en forma de aerosol adecuada para la administracion por inhalacion, tal como por inhalacion intranasal o inhalacion oral, en una forma adecuada para la administracion parenteral, es decir, inyeccion subcutanea, intramuscular o intravenosa.

Para la administracion como solucion o suspension inyectable, los diluyentes o vehfculos no toxicos parenteralmente aceptables pueden incluir solucion de Ringer, solucion salina isotonica, solucion salina tamponada con fosfato, etanol y 1,2 propilenglicol.

Algunos ejemplos de vehfculos, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes adecuados para su uso oral incluyen aceite de cacahuete, parafina lfquida, carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, alginato sodico, goma de acacia, goma de tragacanto, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, gelatina y lecitinina. Ademas, estas formulaciones orales pueden contener agentes saporfferos y colorantes adecuados. Cuando se usan en forma de capsula, las capsulas pueden recubrirse con compuestos tales como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, que retrasan la desintegracion.

Las formas solidas para administracion oral pueden contener aglutinantes aceptables en la practica farmaceutica humana y veterinaria, edulcorantes, agentes desintegrantes, diluyentes, saporfferos, agentes de recubrimiento, conservantes, lubricantes y/o agentes de retardo de tiempo. Los aglutinantes adecuados incluyen goma arabiga, gelatina, almidon de mafz, goma de tragacanto, alginato de sodio, carboximetilcelulosa o polietilenglicol. Los edulcorantes adecuados incluyen sacarosa, lactosa, glucosa, aspartamo o sacarina. Los agentes desintegrantes adecuados incluyen almidon de mafz, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, goma guar, goma xantana, bentonita, acido algfnico o agar. Los diluyentes adecuados incluyen lactosa, sorbitol, manitol, dextrosa, caolfn, celulosa, carbonato de calcio, silicato de calcio o fosfato dicalcico. Los agentes saporfferos adecuados incluyen aceite de menta, aceite de gaulteria, aroma de cereza, naranja o frambuesa. Los agentes de recubrimiento adecuados incluyen polfmeros o copolfmeros de acido acrflico y/o acido metacrflico y/o sus esteres, ceras, alcoholes grasos, zefna, laca o gluten. Los conservantes adecuados incluyen benzoato de sodio, vitamina E, alfa-tocoferol, acido ascorbico, metilparabeno, propilparabeno o bisulfito de sodio. Los lubricantes adecuados incluyen estearato de magnesio, acido estearico, oleato de sodio, cloruro de sodio o talco. Los agentes de retardo de tiempo adecuados incluyen monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las formas lfquidas para administracion oral pueden contener, ademas de los agentes anteriores, un vehfculo lfquido. Los vehfculos lfquidos adecuados incluyen agua, aceites tales como aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de sesamo, aceite de girasol, aceite de cartamo, aceite de manf, aceite de coco, parafina lfquida, etilenglicol, polietilenglicol, etanol, propanol, isopropanol, glicerol, alcoholes grasos, trigliceridos o mezclas de los mismos.

Las suspensiones para administracion oral pueden comprender ademas agentes dispersantes y/o agentes de suspension. Los agentes de suspension adecuados incluyen carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, poli-vinil-pirrolidona, alginato de sodio o alcohol acetflico. Los agentes dispersantes adecuados incluyen lecitina, esteres de polioxietileno de acidos grasos tales como acido estearico, mono- o dioleato, estearato o laurato de polioxietilen sorbitol, mono- o di-oleato, estearato o laurato de polioxietilen sorbitol, y similares. Las emulsiones para administracion oral pueden comprender ademas uno o mas agentes emulsionantes. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen agentes dispersantes como se ha ilustrado anteriormente, o gomas naturales tales como goma guar, goma arabiga o goma tragacanto.

Programacion de las terapias

Los expertos en la tecnica apreciaran que los polianiones pueden administrarse como un agente unico o como parte de un enfoque de terapia de combinacion para el tratamiento de la sepsis en el momento del diagnostico o posteriormente, por ejemplo, como tratamiento de seguimiento o terapia de consolidacion, como complemento a las terapias actualmente disponibles para la sepsis. Los pacientes que se sabe que tienen un alto riesgo de sepsis tambien pueden tratarse con polianiones no toxicos como parte de la profilaxis, por ejemplo, junto con los antibioticos, contra el desarrollo de la sepsis. Sin embargo, esto se describe solo con fines ilustrativos; los metodos de tratamiento practicados en el cuerpo humano o animal no forman parte de la invencion reivindicada.

Los polianiones para su uso de la invencion junto con otros polianiones descritos en el presente documento solo a modo de ejemplo ahora se describiran con mas detalle, solo a modo de ilustracion, con respecto a los siguientes ejemplos. Los ejemplos pretenden servir para ilustrar esta invencion y no deben interpretarse como limitantes de la generalidad de la divulgacion de la descripcion a lo largo de esta memoria descriptiva.

Ejemplos

Ejemplo 1: Inhibicion por diferentes polianiones de la accion citotoxica de las histonas en celulas endoteliales humanas

Se evaluaron inicialmente diferentes concentraciones de histonas de timo de ternera para determinar su toxicidad para las celulas endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y las celulas endoteliales microvasculares humanas (HMEC). Se dispensaron suspensiones de HUVEC/HMEC en Medio199/suero de ternera fetal al 20% (FCS) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (1 x 105 celulas/pocillo en 50 pl de medio). Despues, se anadieron histonas de timo de ternera (50 pl/pocillo en M199/FCS al 20%) para dar una concentracion final de 100-800 pg/ml seguido de 25 pl/pocillo de Calcefna-AM en PBS (concentracion final de 0,04 pM) y 25 pl/pocillo de yoduro de propidio (PI) en PBS (concentracion final 2,5 pg/ml). Cada placa de 96 pocillos se incubo a 37°C durante 60 min en una incubadora con CO² al 5%, se puso en hielo y se analizo el contenido de cada pocillo mediante citometrfa de flujo para detectar celulas viables y muertas. Las celulas viables se detectaron como Calcefna-AM-brillantes y PI-tenues y las celulas muertas como Calcefna-AM-tenues y Pl-brillantes. La Figura 1 representa un ensayo de viabilidad tfpico que compara HUVEC cultivadas en solitario (9,15% muertas, 78,6% viables) con HUVEC cultivadas durante 60 minutos con 200 pg/ml de histonas de timo de ternera (50,4% muertas, 35,6% viables). La toxicidad de las histonas de timo de ternera para HUVEC y HMEC se muestra en detalle en la Figura 2, siendo la toxicidad de las histonas para HUVEC (Figura 2^a ) y HMEC (Figura 2B) altamente dependiente de la concentracion, aunque HMEC fueron mas resistentes a la toxicidad de las histonas que HUVEC. Por lo tanto, a 100 pg/ml, las histonas destruyeron el 15-20% de las HUVEC, pero no tuvieron efecto en la viabilidad de las HMEC, mientras que a 800 pg/ml, las histonas destruyeron >85% de las HUVEC y -55% de las HMEC (Figura 1). En experimentos de inhibicion posteriores, se utilizaron histonas de timo de ternera a 200 pg/ml para HUVEC y 400 pg/ml para HMEC, dando como resultado estas concentraciones -50% de destruccion de ambas poblaciones de celulas endoteliales.

En los experimentos de inhibicion, el inhibidor (concentracion final que varfa de 1,6-100 pg/ml) se mezclo con histonas de timo de ternera (concentracion final 200 o 400 pg/ml) antes de la adicion de HUVEC/HMEC, Calcefna-AM y PI a cada pocillo. Se encontro que el sulfato de maltotriosa y el sulfato de maltopentosa eran potentes inhibidores de la citotoxicidad de las histonas para HUVEC, inhibiendo completamente la toxicidad de las histonas a 100 pg/ml y aun siendo altamente eficaces a 25 pg/ml (Figuras 3 y 4). Algunos de los datos de citometrfa de flujo primarios para el sulfato de maltotriosa se presentan en la Figura 5 para destacar aun mas la potente actividad inhibitoria de este trisacarido sulfatado. En contraste, el disacarido sulfato de maltosa fue un inhibidor debil de la citotoxicidad de las histonas (Figuras 3 y 4), lo que indica que con la serie de maltosa de polianiones, la longitud de la cadena de oligosacaridos desempena un papel importante en la actividad inhibidora. El sulfato de isomaltotriosa (glucosa ligada a a1-6), sin embargo, fue un inhibidor menos activo que el sulfato de maltotriosa (glucosa ligada a a1-4), lo que sugiere que el enlace del azucar tambien puede influir en la actividad inhibitoria (Figura 3). Sin embargo, el sulfato de p-ciclodextrina cfclica (heptaglucosa ligada a a1-4 cfclica) fue casi tan activo como las moleculas de sulfato de maltotriosa lineal y sulfato de maltopentosa (Figura 3).

Utilizando HMEC como la diana celular endotelial, se observaron efectos inhibidores similares del sulfato de maltotriosa (Figura 6) y los otros oligosacaridos sulfatados (Tabla 1) sobre la toxicidad de las histonas. De hecho, en la Tabla 1 se muestra un analisis mas detallado de la actividad inhibitoria de un rango de polianiones sobre la toxicidad de las histonas, utilizando HMEC como la celula endotelial objetivo.

1_____ Tabla 1 Capacidad de diferentes polianiones para inhibir la destruccion por las histonas de HMEC

Diferentes disacaridos sulfatados difirieron en su actividad inhibitoria, siendo el sulfato de celobiosa (glucosa ligada a (31-4) un potente inhibidor de la toxicidad de las histonas mientras que el sulfato de maltosa (glucosa ligada a a1-4) y octasulfato de sacarosa (fructosa ligada a glucosa p1-4) fueron inhibidores mas debiles (Tabla 1). Sin embargo, la actividad inhibitoria del maltitol, una forma de maltosa de anillo abierto, fue mayor que la maltosa. Los trisacaridos sulfatados tambien variaron en su actividad inhibitoria, siendo la maltotriosa sulfatada, la rafinosa y la panosa mas activas que la isomaltotriosa sulfatada. El analisis tambien revelo que las moleculas de glucosa unidas a sulfato presentan alguna actividad inhibitoria (por ejemplo, propanil b/s-gluconamida SO⁴), p-ciclodextrina sulfatada esta activa, pero p-ciclodextrina carboxilada no, y la heparina, heparina de bajo peso molecular y algunas variantes qufmicas (por ejemplo, N-desacetiladas, divididas con glicol) estan activas (Tabla 1).

Estudios adicionales revelaron que la citotoxicidad de las histonas no depende del heparan sulfato de la superficie celular. Asf, el tratamiento de HMEC con heparanasa plaquetaria humana (4 pg/ml, 37°C, 1 h) o heparitinasa I, II y III de Flavobacter/um hepar/num (0,25 unidades/ml, 37°C, 1 h), procedimientos enzimaticos que eliminan el heparan sulfato de la superficie celular, no tuvo ningun efecto sobre la susceptibilidad de las HMEC con respecto a la citotoxicidad de las histonas (Figura 7). De manera similar, la comparacion de celulas de ovario de hamster chino de tipo silvestre (CHO-K1) y una variante deficiente en heparan sulfato de esta lfnea celular (pgsA-745), revelo que ambas lfneas celulares son igualmente susceptibles a la citotoxicidad de las histonas (Figura 8).

Ejemplo 2: Las histonas inyectadas por via intravenosa se acumulan en los pulmones de los conejos Las histonas de timo de ternera se marcaron radiactivamente por adsorcion sobre la superficie de nanopartfculas de Tc99m. Una suspension coloidal acuosa (3 ml) de nanopartfculas de Tc99m (aproximadamente 50 pg; 4 mCi) se trato con histonas (10 pg/ml) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las histonas radiomarcadas se inyectaron en una vena de la oreja de un conejo anestesiado colocado en una camara gamma, y se obtuvieron imagenes dinamicas como una serie de adquisiciones de 30 segundos, comenzando desde el inicio de la inyeccion. Las imagenes en la Figura 9A muestran una acumulacion rapida y selectiva de histonas en el pulmon, en consonancia con la localizacion pulmonar del dano tisular inducido por histonas. Nanopartfculas radiomarcadas sin histonas unidas localizadas en el hfgado, el bazo y la medula osea (vease la Figura 9B), como se espera para la rapida depuracion de partfculas extranas en circulacion por el sistema reticuloendotelial.

Ejemplo 3: Inhibicion competitiva de la acumulacion de histonas en el pulmon.

Las histonas de timo de ternera se marcaron radiactivamente por adsorcion sobre la superficie de nanopartfculas de Tc99m. Esta preparacion radiomarcada se dividio luego por la mitad. La primera mitad se inyecto en una vena de la oreja de un conejo anestesiado de control colocado en una camara gamma, y se obtuvieron imagenes dinamicas como una serie de adquisiciones de 30 segundos, comenzando desde el inicio de la inyeccion. Como en el Ejemplo 2 anterior, las imagenes en la Figura 10A muestran una acumulacion rapida y selectiva de histonas radiomarcadas en el pulmon del conejo de control. La segunda mitad de la preparacion de histonas radiomarcadas se inyecto en una vena de la oreja de un conejo anestesiado al que se habfa inyectado por via intravenosa 15 minutos antes 15 mg/kg de maltohexaosa sulfato de sodio. Las imagenes gamma de este conejo pretratado desde el inicio de la inyeccion de radiomarcado mostraron que la acumulacion de histonas radiomarcadas en el pulmon estaba bloqueada (Figura 10B La histona radiomarcada paso a traves de los pulmones y se localizo en el hfgado y el bazo.

Ejemplo 4: Bloqueo de la acumulacion de histonas en pulmones de conejo por sulfato de maltotetraosa. Se inyecto una preparacion de histona radiomarcada en una vena de la oreja de un conejo anestesiado al que se habfa inyectado por via intravenosa 15 minutos antes 15 mg/kg de maltotetraosa sulfato de sodio. La imagen gamma de este conejo pretratado (Figura 11) desde el inicio de la inyeccion de radiomarcado mostro que la acumulacion de histonas radiomarcadas en los pulmones estaba bloqueada; la histona radiomarcada paso a traves de los pulmones sin unirse y se localizo en el hfgado y el bazo. Las tramas 1-4 de la Figura 11 son adquisiciones de 30 segundos, mientras que las tramas 5-8 son adquisiciones de 60 segundos.

Ejemplo 5: Bloqueo de la acumulacion de histonas en pulmones de conejo por sulfato de celobiosa

Se inyecto una preparacion de histona radiomarcada en una vena de la oreja de un conejo anestesiado al que se habfa inyectado por via intravenosa 15 minutos antes 15 mg/kg de celobiosa sulfato de sodio. La imagen gamma de este conejo pretratado (Figura 12) desde el inicio de la inyeccion de radiomarcado mostro que la acumulacion de histonas radiomarcadas en los pulmones estaba bloqueada; la histona radiomarcada paso a traves de los pulmones sin unirse y se localizo en el hfgado y el bazo. Las tramas 1-4 de la Figura 12 son adquisiciones de camaras gamma de 30 segundos.

Ejemplo 6: Estudio de sepsis inducida por LPS en ratones

Se realizo un estudio para evaluar la eficacia in vivo de los artfculos de ensayo 1 (sulfato de maltotriosa; TA1), 2 (sulfato de celobiosa; TA2) y 3 (heparina; TA3) en un modelo de sepsis de raton inducido por lipopolisacarido (LPS). La endotoxemia se indujo mediante inyeccion intraperitoneal (i.p.) con LPS el dfa 1. Los artfculos de ensayo se administraron conjuntamente i.p. el dfa 1, y luego se dosificaron a diario i.p. durante 2 dfas mas. Los artfculos de ensayo 1 y 2 se evaluaron a 2 concentraciones de dosis, y el artfculo de ensayo 3 a una concentracion, como se muestra en la Tabla 2 a continuacion.

Tabla 2:

Resultados: Los tiempos hasta que los animales fueron encontrados muertos o tuvieron que ser sacrificados, se muestran en el grafico de Kaplan-Meier en la Figura 13. La dosis alta (100 mg/kg) de sulfato de maltotriosa (TA1) utilizada en este estudio parecio producir cierta toxicidad (grupo de muertes) despues de la tercera dosis, pero la dosis baja (15 mg/kg) fue mejor tolerada. El sulfato de celobiosa (TA2) en ambas dosis fue bien tolerado, al igual que la dosis baja elegida para la heparina (TA3; 1,1 mg/kg). Los graficos de Kaplan-Meier en la Figura 13 indicaron que se obtuvo una supervivencia extendida para la dosis baja de sulfato de maltotriosa (TA1) y ambas dosis de sulfato de celobiosa (TA2). En el caso de la heparina (TA3), no hubo ningun cambio aparente en el grafico de supervivencia en comparacion con el control (vease la Figura 13).

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un polianion para su uso en un metodo para tratar sepsis inhibiendo la actividad citotoxica de histonas extracelulares en un sujeto, en el que el polianion no tiene una actividad anticoagulante sustancial, de modo que el polianion aumenta el tiempo de protrombina (PT), el tiempo de tromboplastina parcial (PTT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), el tiempo de coagulation de la trombina (TCT), o el tiempo de coagulation activada (ACT) en un 0% a un 10% del intervalo normal; y

en el que el polianion es un oligosacarido polianionico que tiene la estructura general (I):

A-(B)n-D (I)

en la que A y B son cada uno independientemente un monosacarido cfclico o un monosacarido desoxi cfclico;

D es un monosacarido cfclico, un monosacarido desoxi cfclico, un monosacarido de anillo abierto. o un alcohol de azucar;

n es un numero entero seleccionado de 0, 1 y 2; y

en la que cada uno del monosacarido cfclico, el monosacarido desoxi cfclico, el monosacarido de anillo abierto, o el alcohol de azucar esta independientemente sustituido opcionalmente con OSO³-, COO-, OPO³-, un alquilo opcionalmente sustituido, un alquenilo opcionalmente sustituido, un alquinilo opcionalmente sustituido, un arilo opcionalmente sustituido, o un aralquilo opcionalmente sustituido; y

en la que el oligosacarido polianionico incluye al menos dos sustituyentes anionicos seleccionados del grupo que consiste en OSO³-, COO- y OPO³-.

2. El polianion para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el monosacarido cfclico se selecciona del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, manosa, gulosa, idosa, talosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, sorbosa, tagatosa y sedoheptulosa.

3. El polianion para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el monosacarido cfclico se selecciona del grupo que consiste en glucosa, galactosa y fructosa.

4. El polianion para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el monosacarido desoxi cfclico se selecciona del grupo que consiste en fucosa, desoxirribosa y ramnosa.

5. El polianion para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el alcohol de azucar se selecciona del grupo que consiste en glicol, glicerol, eritritol, treitol, ribitol, arabitol, xilitol, sorbitol (glucitol), manitol, dulcitol (galactitol), iditol y fucitol.

6. El polianion para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el monosacarido de anillo abierto se selecciona del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa, eritrosa, treosa, eritrulosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, manosa, gulosa, idosa, talosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, sorbosa, tagatosa y sedoheptulosa.

7. El polianion para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el oligosacarido polianionico tiene la estructura general (l-a):

en la que cada R1 se selecciona independientemente de OSO³-, COO-, OPO³-, OH o H; y n es un numero entero entre 0, 1 y 2; y en la que al menos dos de R1 se seleccionan del grupo que consiste en OSO³-, COO-, y OPO³-.

8. El polianion para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el oligosacarido polianionico tiene la estructura general (I-b):

donde cada R1 se selecciona independientemente de OSO³-, COO', OPO³-, OH o H; y n es un numero entero entre 0, 1 y 2; y en la que al menos dos de R1 se seleccionan del grupo que consiste en OSO³', COO-, y OPO³'.

9. El polianion para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el oligosacarido polianionico se selecciona del grupo que consiste en:

y

en los que cada R2 se selecciona independientemente de OSO³', COO', OPO³', OH o H; y en los que al menos dos de R2 se seleccionan del grupo que consiste en OSO³', COO', y OPO³'.

10. El polianion para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el oligosacarido polianionico se selecciona del grupo que consiste en sulfato de maltosa, sulfato de maltotriosa, sulfato de maltotetraosa, sulfato de panosa, sulfato de isomaltotriosa, sulfato de erlosa, sulfato de celobiosa y sulfato de rafinosa.

11. El polianion para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el oligosacarido polianionico es sulfato de celobiosa.