KR101956335B1 - 히스톤 억제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유효량의 다음이온을 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 피험체에서 세포외 히스톤의 세포독성 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 패혈증을 앓고 있는 환자의 치료하기 위한 방법에 관한 것이고, 세포외 히스톤 단백질, 예를 들면, 패혈증 환자의 혈류에서 발견되는 것과 신속히 복합체를 형성하고 따라서 이를 중화시키거나 이의 세포독성 활성을 억제하도록 다음이온을 사용한다.

Description

히스톤 억제{HISTONE INHIBITION}

본 발명은 히스톤의 세포독성 활성을 억제하기 위한 다음이온의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 히스톤의 세포독성 활성을 억제하는 다음이온을 스크리닝하기 위한 나노입자로 라벨링된 히스톤의 용도 및 패혈증의 치료에서 히스톤의 세포독성 활성을 억제하기 위한 다음이온의 용도에 관한 것이다.

패혈증은 사이토카인 네트워크, 백혈구 및 보체 및 응고/섬유소용해 시스템을 비롯한 여러 숙주 방어 기전의 활성화와 관련되고 이에 의해 매개되는 감염 또는 외상에 대한 전신 염증 반응이다. 패혈증은 박테리아, 진균, 바이러스 및 다른 감염뿐만 아니라 다발성 외상, 중증 화상 및 기관 이식과 같은 비 감염성 자극에 의해 야기될 수 있다. 수시간 또는 수일 내에 패혈증은 혈관에서의 자발적 응고, 중증 저혈압, 다발성 기관 부전 및 사망으로 진행할 수 있다.

현대의 항생제의 임상 사용에도 불구하고, 패혈증을 앓고 있는 환자의 비효과적인 치료로 인해 사망률의 수준은 여전히 상당하다. 예를 들면, 이식편 거부에 대한 예방으로 인해 면역 손상된 환자는 또한 위험이 증가한다. 더 많은 백혈병 환자가 백혈병보다는 패혈증 때문에 사망한다. 대략 35% 사망률로 미국에서 매년 500,000건의 패혈증 에피소드가 있고, 40∼70% 사망률로 200,000건의 패혈성 쇼크의 에피소드가 있는 것으로 예상된다. 패혈증은 비관상동맥 중환자실에서의 주요 사망 원인이다. 손상 후 병원 사망 중 40%는 패혈증에 의해 야기되는 다발성 기관 기능장애 증후군 때문이다.

최근에 패혈증 환자를 위한 효과적인 새로운 치료를 발견하기 위한 여러 시도가 이루어지고 있다. 염증의 중요한 매개자에 대한 단일클론 항체, 예를 들면 항종양 괴사 인자 단일클론 항체를 생성하기 위한 상당한 노력이 이루어지고 있지만, 이는 임상적으로 비효과적인 것으로 입증되었고 또한 패혈증 환자에서 해로운 부작용을 갖는 것으로 밝혀졌다. 다른 접근법은 재조합 인간 APC(예를 들면, Xigris^®)을 비롯하여 활성화 단백질 C(APC)와 같은 정제된 인간 응고 인자를 사용하였다. 그러나, 이러한 APC 기반 패혈증 치료법은 임상 효과가 거의 없었다. 출혈의 위험 증가를 야기하는 APC의 항응고 활성을 비롯하여 이에 대한 여러 이유가 존재하여서, 이 약물은 수술 후 또는 외상 후 환자에서 발생하는 패혈증에서 제외된다. 동일한 이유로 APC 기반 패혈증 치료법은 출혈의 위험이 높은 백혈병 환자에서 제외된다. 패혈증은 신속히 진행할 수 있고, APC 기반 패혈증 치료법의 비교적 느린 작용 방식은 급성 패혈증의 신속한 진행에 대한 단점이다. Xigris는 2011년 10월 25일에 시장에서 철수되었다.

히스톤은 유전자 발현을 조절하고 DNA와 복합체화하여 염색질 구조로 조립되는 뉴클레오솜을 형성하도록 세포 핵에서 작용하는 작은 기본 단백질이다. Xu 등(Nat Med. 2009. 15:1318-21)은 패혈증에서의 내피 세포 기능장애, 기관 부전 및 사명의 매개자로서 작용하는 세포외 히스톤에 의한 염증 과정에 반응하여 방출되는 히스톤에 대한 세포독성 활성을 보고하였다.

본 발명은 다음이온이 살아있는 동물의 순환시 세포외 히스톤과 복합체화할 수 있고 이의 세포독성 활성을 억제할 수 있다는 발견에 입각한다. 또한, 다음이온은 세포외 히스톤과 복합체화할 수 있고 기관에서의 히스톤 축적을 방지할 수 있다. 추가로, 이 다음이온은 무시할만한 항응고 특성을 가질 수 있다.

본 발명자들은 세포외 히스톤의 세포독성 활성 및 기관에서의 세포외 히스톤 축적이 올리고사카라이드 다음이온의 투여에 의해 억제될 수 있다는 것을 확인하였다. 올리고사카라이드 다음이온의 투여는 현재 이용 가능한 패혈증 치료의 적어도 여러 결함을 완화하는 수단을 제공한다. 추가로, 나노입자로 라벨링된 히스톤의 사용은 기관에서의 히스톤 축적을 억제할 수 있는 화합물을 스크리닝하는 수단을 제공한다.

제1 양태에서, 피험체에서 세포외 히스톤의 세포독성 활성을 억제하는 방법으로서, 상기 피험체에게 유효량의 다음이온을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

제2 양태에서, 피험체에서 세포외 히스톤 축적을 억제하는 방법으로서, 상기 피험체에게 유효량의 다음이온을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

제3 양태에서, 피험체에서 세포외 히스톤의 세포독성 활성을 억제함으로써 패혈증을 치료하는 방법으로서, 상기 피험체에게 유효량의 다음이온을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

제4 양태에서, 세포외 히스톤의 세포독성 활성을 억제함으로써 패혈증을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 유효량의 다음이온의 용도가 제공된다.

제5 양태에서, 패혈증의 치료에 사용하기 위한 유효량의 다음이온이 제공된다.

일 실시양태에서, 다음이온은 실질적인 항응고 활성을 갖지 않는다.

일 실시양태에서, 다음이온은 실질적으로 비면역원성일 수 있다.

일 실시양태에서, 다음이온은 하기 일반 구조 (Ⅰ)을 갖는 다음이온성 올리고사카라이드일 수 있다:

A-(B)_n-D (Ⅰ)

[식 중,

A 및 B는 각각 독립적으로 사이클릭 모노사카라이드 또는 사이클릭 데옥시 모노사카라이드이고,

D는 사이클릭 모노사카라이드, 사이클릭 데옥시 모노사카라이드, 개환 모노사카라이드 또는 당 알콜이고,

n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로부터 선택되는 정수이고,

사이클릭 모노사카라이드, 사이클릭 데옥시 모노사카라이드, 개환 모노사카라이드 또는 당 알콜의 각각은 독립적으로 OSO₃ ^-, COO^-, OPO₃ ^-, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 아르알킬로 임의로 치환되고,

다음이온성 올리고사카라이드는 OSO₃ ^-, COO^- 및 OPO₃ ^-로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개 이상의 음이온성 치환기를 포함한다].

일 실시양태에서, 사이클릭 모노사카라이드는 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 리보스, 아라비노스, 크실로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 만노스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 리불로스, 크실룰로스, 푸시코스, 소르보스, 타가토스 및 세도헵툴로스로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

다른 실시양태에서, 사이클릭 모노사카라이드는 글루코스, 갈락토스 및 프럭토스로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

다른 실시양태에서, 사이클릭 데옥시 모노사카라이드는 푸코스, 데옥시리보스 및 람노스로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

다른 실시양태에서, 당 알콜은 글리세롤, 에리스리톨, 트레이톨, 리비톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨(글루시톨), 만니톨, 둘시톨(갈락티톨), 이디톨 및 푸시톨로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

다른 실시양태에서, 개환 모노사카라이드는 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 에리트로스, 트레오스, 에리트룰로스, 리보스, 아라비노스, 크실로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 만노스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 리불로스, 크실룰로스, 푸시코스, 소르보스, 타가토스 및 세도헵툴로스로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

다른 실시양태에서, 다음이온은 하기 일반 구조 (I-a)를 갖는 다음이온성 올리고사카라이드일 수 있다:

[식 중,

각각의 R¹은 독립적으로 OSO₃ ^-, COO^-, OPO₃ ^-, OH 또는 H로부터 선택되고,

n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 사이의 정수이고,

R¹ 중 2개 이상은 OSO₃ ^-, COO^- 및 OPO₃ ^-로 이루어지는 군으로부터 선택된다].

다른 실시양태에서, 다음이온은 하기 일반 구조 (I-b)를 갖는 다음이온성 올리고사카라이드일 수 있다:

[식 중,

각각의 R¹은 독립적으로 OSO₃ ^-, COO^-, OPO₃ ^-, OH 또는 H로부터 선택되고,

n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 사이의 정수이고,

R¹ 중 2개 이상은 OSO₃ ^-, COO^- 및 OPO₃ ^-로 이루어지는 군으로부터 선택된다].

다른 실시양태에서, 다음이온은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 다음이온성 올리고사카라이드일 수 있다:

및

[식 중,

각각의 R²는 독립적으로 OSO₃ ^-, COO^-, OPO₃ ^-, OH 또는 H로부터 선택되고,

R² 중 2개 이상은 OSO₃ ^-, COO^- 및 OPO₃ ^-로 이루어지는 군으로부터 선택된다].

다른 실시양태에서, 다음이온은 말토스 설페이트, 말토트리오스 설페이트, 말토테트라오스 설페이트, 말토펜타오스 설페이트, 말토헥사오스 설페이트, 말토헵타오스 설페이트, 말토옥타오스 설페이트, 말토노나오스 설페이트 및 말토데카오스 설페이트, 파노스 설페이트, 이소말토트리오스 설페이트, 에를로스 설페이트, 셀로비오스 설페이트 및 라피노스 설페이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 다음이온성 올리고사카라이드일 수 있다.

추가의 실시양태에서, 다음이온은 다음이온성 올리고사카라이드 셀로비오스 설페이트일 수 있다.

일 실시양태에서, 다음이온은 하기 일반 구조 (Ⅱ)를 갖는 다음이온성 시클로덱스트린일 수 있다:

[식 중,

각각의 R³은 독립적으로 임의로 치환된 O-알킬, O-아릴, O-아르알킬, O-알케닐, O-알키닐 기, OS0₃ ^-, COO^-, OP0₃ ^-, OH 또는 H로부터 선택되고,

각각의 R⁴는 독립적으로 OS0₃ ^-, COO^-, OP0₃ ^-, OH 또는 H로부터 선택되고,

x는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 사이의 정수이고,

다음이온성 시클로덱스트린은 OS0₃ ^-, COO^- 및 OPO₃ ^-로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개 이상의 음이온성 치환기를 포함한다].

시클로덱스트린은 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린 또는 γ-시클로덱스트린일 수 있다.

다른 실시양태에서, 히스톤 억제제를 스크리닝하는 방법으로서,

(ⅰ) 히스톤을 후보물질 화합물과 접촉시키는 단계,

(ⅱ) 상기 히스톤에 대한 상기 후보물질 화합물의 결합을 결정하는 단계,

(ⅲ) 상기 히스톤에 결합하는 상기 후보물질 화합물을 선택하는 단계

를 포함하는 방법이 제공된다.

다른 실시양태에서, 히스톤 억제제를 스크리닝하는 방법으로서,

(ⅰ) 나노입자로 라벨링된 히스톤을 제공하는 단계,

(ⅱ) 상기 라벨링된 히스톤을 시험 피험체에게 투여하는 단계,

(ⅲ) 후보물질 화합물을 상기 시험 피험체에게 투여하는 단계,

(ⅳ) 대조 피험체에 대한 기관에서의 히스톤 위치선정을 모니터하는 단계,

(ⅴ) 대조 피험체에 대한 기관에서의 히스톤 위치선정을 변경하는 상기 후보물질 화합물을 선택하는 단계

를 포함하는 방법이 제공된다.

일 실시양태에서, 라벨링된 히스톤을 시험 화합물 전에, 후에 또는 동시에 시험 피험체에게 투여할 수 있다.

추가의 실시양태에서, 히스톤 억제제를 스크리닝하는 방법으로서,

(ⅰ) 나노입자로 라벨링된 히스톤을 제공하는 단계,

(ⅱ) 상기 나노입자로 라벨링된 히스톤을 후보물질 화합물과 접촉시키는 단계,

(ⅲ) 상기 라벨링된 히스톤 및 상기 시험 화합물을 시험 피험체에게 투여하는 단계,

(ⅳ) 대조 피험체에 대한 상기 시험 피험체의 기관에서의 히스톤 위치선정을 모니터하는 단계.

(ⅴ) 대조 피험체에 대한 기관에서의 히스톤 위치선정을 변경하는 상기 후보물질 화합물을 선택하는 단계

를 포함하는 방법이 제공된다.

일 실시양태에서, 후보물질 화합물은 다음이온이다.

상기 양태 중 어느 하나의 일 실시양태에서, 다음이온은 세포, 조직 또는 기관에 대한 히스톤의 결합을 억제한다.

본 발명의 바람직한 실시양태는 첨부된 도면을 참조하여 오직 예의 방식으로 이제 기술할 것이다.
도 1은 히스톤 세포독성에 대한 유세포 분석법 평가를 이용하여 생성된 데이터의 예를 도시한 것이고, 이 경우 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)는 실험실내 1 시간 동안 단독으로(왼쪽 패널) 또는 200 ㎍/㎖의 송아지 흉선 히스톤과 함께(오른쪽 패널) 항온처리된다. 각각의 패널에서의 도면은 각각의 사분면에서의 HUVEC의 백분율을 나타내고, 생존(Calcein-AM-bright, PI-dull) 및 사멸(Calcein-AM-dull, PI-bright) 세포 사분면이 표시되어 있다.
도 2는 실험실내 1 시간 노출 후 (A) HUVEC 및 (B) 인간 미세혈관 내피 세포(HMEC)의 사멸을 발생시키는 상이한 농도의 송아지 흉선 히스톤(100∼800 ㎍/㎖)의 능력을 도시한 것이다.
도 3은 HUVEC에 대한 송아지 흉선 히스톤(200 ㎍/㎖)의 실험실내 세포독성을 억제하는 상이한 농도(6.25∼100 ㎍/㎖)의 말토스 설페이트, 말토트리오스 설페이트, 말토펜타오스 설페이트, 이소말토트리오스 설페이트 및 β-시클로덱스트린 설페이트의 능력을 도시한 것이다.
도 4는 HUVEC에 대한 송아지 흉선 히스톤(200 ㎍/㎖)의 실험실내 세포독성을 억제하는 더 넓은 농도 범위(1.6∼100 ㎍/㎖)의 말토스 설페이트, 말토트리오스 설페이트 및 말토펜타오스 설페이트의 능력을 도시한 것이다.
도 5는 25 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖에서의 말토트리오스 설페이트가 HUVEC에 대한 송아지 흉선 히스톤(200 ㎍/㎖)의 실험실내 세포독성 효과를 급격히 억제할 수 있다는 것을 보여주는 1차 유세포 분석법 데이터를 도시한 것이다. 각각의 패널에서의 도면은 각각의 사분면에서의 HUVEC의 백분율을 나타내고, 생존(Calcein-AM-bright, PI-dull) 및 사멸(Calcein-AM-dull, PI-bright) 세포 사분면이 표시되어 있다.
도 6은 25 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖에서의 말토트리오스 설페이트가 HMEC에 대한 송아지 흉선 히스톤(400 ㎍/㎖)의 실험실내 세포독성 효과를 각각 완전히 그리고 부분적으로 억제할 수 있다는 것을 보여주는 1차 유세포 분석법 데이터를 도시한 것이다. 각각의 패널에서의 도면은 각각의 사분면에서의 HMEC의 백분율을 나타내고, 생존(Calcein-AM-bright, PI-dull) 및 사멸(Calcein-AM-dull, PI-bright) 세포 사분면이 표시되어 있다.
도 7은 인간 혈소판 헤파라나제 또는 플라보박테리아 헤파리티나아제에 의한 HMEC로부터의 세포 표면 헤파란 설페이트의 제거가 HMEC에 대한 송아지 흉선 히스톤(400 ㎍/㎖)의 실험실내 세포독성에 대해 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
도 8은 세포 표면 헤파란 설페이트를 발현하는 야생형 CHO-1 세포주 및 헤파란 설페이트가 결핍된 돌연변이체 CHO 세포주(pgsA-745)가 송아지 흉선 히스톤의 실험실내 세포독성에 동등하게 감수성이라는 것을 보여준다.
도 9a는 마취된 래빗의 귀 정맥으로의 Tc99m-나노입자로 라벨링된 히스톤의 주사로 시작하는 감마 섬광조영술로부터 얻은 일련의 30 초 획득이다.
도 9b는 마취된 래빗의 귀 정맥으로의 Tc99m-나노입자의 주사로 시작하는 감마 섬광조영술로부터 얻은 일련의 30 초 획득이다.
도 10a는 마취된 래빗의 귀 정맥으로의 Tc99m-나노입자로 라벨링된 히스톤의 주사로 시작하는 감마 섬광조영술로부터 얻은 일련의 30 초 획득이다.
도 10b는 15 ㎎/㎏의 나트륨 말토헥사오스 설페이트로 전처리된 마취된 래빗의 귀 정맥으로의 Tc99m-나노입자로 라벨링된 히스톤의 주사로 시작하는 감마 섬광조영술로부터 얻은 일련의 30 초 획득이다.
도 11은 15 ㎎/㎏의 나트륨 말토테트라오스 설페이트로 전처리된 마취된 래빗의 귀 정맥으로의 Tc99m-나노입자로 라벨링된 히스톤의 주사로 시작하는 감마 섬광조영술로부터 얻은 일련의 30 초 획득(1∼4 프레임) 및 60 초 획득(5∼8 프레임)이다.
도 12는 15 ㎎/㎏의 나트륨 셀로비오스 설페이트로 전처리된 마취된 래빗의 귀 정맥으로의 Tc99m-나노입자로 라벨링된 히스톤의 주사로 시작하는 감마 섬광조영술로부터 얻은 일련의 30 초 획득이다.
도 13은 시험 물품 1(말토트리오스 설페이트; TA1), 시험 물품 2(셀로비오스 설페이트; TA2) 및 시험 물품 3(헤파린; TA3)의 생체내 효율의 평가 및 패혈증의 리포폴리사카라이드(LPS) 유래 마우스 모델에 대한 Kaplan-Meier 생존 도면이다. 시험 물품을 LPS(50 ㎎/㎏)에 의한 1 일자에 i.p. 병용 투여하고, 이후 추가 2 일 동안 매일 i.p. 투여한다. 시험 물품 1 및 2를 2 용량 농도(고용량, 100 ㎎/㎏ 및 저용량, 15 ㎎/㎏)에서 평가하고, 시험 물품 3을 1 용량(1.1 ㎎/㎏)에서 평가하였다. 도면에 표시된 사건은 마우스가 사멸하거나 안락사 되어야 하는 것으로 발견될 때까지의 시간을 기록한 것이다.

정의

하기와 같은 기재된 의미를 갖는 특정 용어가 본원에 사용된다.

본원에 사용되는 용어 "포함하는"은 "원칙적으로 포함하지만, 오직 필수적은 아니다"라는 것을 의미한다. 더욱이, "포함한다"와 같은 "포함하는" 단어의 변형은 상응하게 변화된 의미를 갖는다.

문맥이 달리 요구하지 않거나, 구체적으로 반대로 기술되지 않은 한, 단일 정수, 단계 또는 부재로서 본원에 언급된 본 발명의 정수, 단계 또는 부재는 명확히 언급된 정수, 단계 또는 부재의 단수 형태 및 복수 형태 둘 다를 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "치료하는" 및 "치료"는 병증 또는 증상을 치료하는, 병증 또는 질환의 확립을 예방하는, 또는 그렇지 않으면, 어떠하든 임의의 방식으로 병증 또는 질환 또는 다른 원치않는 증상의 진행을 예방하거나, 방해하거나, 지연시키거나, 역전시키는 임의의 그리고 모든 사용을 의미한다.

치료 용도에서의 사용에 대한 본원에서의 언급은 인간 및 비인간, 예컨대 수의과 용도에 동등하게 적용되는 것으로 이해된다는 것에 유의한다. 그러므로, 달리 기재된 것을 제외하고, 환자, 피험체 또는 개인에 대한 언급은 인간 또는 비인간, 예컨대 조류, 토끼목, 양과, 소과, 말과, 돼지과, 고양이과, 개과, 영장류 및 설치류 종(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 사회적으로, 경제적으로 또는 연구적으로 중요한 임의의 종의 개체를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에 있어서, 용어 "유효량"은 이의 의미 내에 원하는 효과를 제공하기 위한 본 발명의 화합물 또는 조성물의 충분하지만 비독성인 양을 포함한다. 필요한 정확한 양은 원하는 효과, 치료되는 종, 피험체의 연령 및 일반적인 건강상태, 치료되는 병증의 중증도, 투여되는 특정 제제, 투여 방식 등과 같은 인자에 따라 피험체마다 변할 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 기재할 수 없다. 그러나, 임의의 소정의 사례에서, 오직 일상적인 실험을 이용하여 당업자가 적절한 "유효량"을 결정할 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "모노사카라이드"는 이의 의미 내에 일반식 C_nH_2nO_n의 당 또는 탄수화물을 포함한다. 예를 들면, 용어 모노사카라이드는 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 에리트로스, 트레오스, 에리트룰로스, 리보스, 아라비노스, 크실로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 만노스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 리불로스, 크실룰로스, 푸시코스, 소르보스, 타가토스 및 세도헵툴로스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 모노사카라이드는 천연 또는 합성 둘 다 일 수 있다. 대부분의 모노사카라이드는 개환 모노사카라이드 또는 사이클릭 모노사카라이드로서 존재한다.

본원에 사용되는 용어 "데옥시 모노사카라이드" 또는 "데옥시 당"은 이의 의미 내에 탄소 원자보다 적은 산소 원자를 포함하여, 분자 내 부착된 히드록실 기가 부족한 1개 이상의 탄소를 발생시키는 당을 포함한다. 예를 들면, 용어 데옥시 모노사카라이드는 푸코스, 데옥시리보스 및 람노스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

본원에 사용되는 용어 "당 알콜"은 이의 의미 내에 카보닐 기(알데하이드 또는 케톤)가 1차 또는 2차 히드록실 기로 환원된(그러므로, 알콜) 탄수화물 또는 모노사카라이드의 수소화 형태를 포함한다. 당 알콜은 일반식 H(HCHO)_n+1H를 갖는다. 예를 들면, 용어 당 알콜은 글리콜, 글리세롤, 에리스리톨, 트레이톨, 리비톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨(글루시톨), 만니톨, 둘시톨(갈락티톨), 이디톨 및 푸시톨을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

본원에 사용되는 용어 "올리고사카라이드"는 이의 의미 내에 산에 의해 가수분해되어 구성성분인 모노사카라이드 단위를 생성할 수 있는 글리코시드 결합을 통해 연결된 2개 내지 10개의 모노사카라이드 잔기로 이루어지는 탄수화물을 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "폴리사카라이드"는 이의 의미 내에 산에 의해 가수분해되어 구성성분인 모노사카라이드 단위를 생성할 수 있는 글리코시드 결합을 통해 연결된 10개 이상의 모노사카라이드 잔기를 포함하는 모노사카라이드의 중합체를 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "알킬"은 이의 의미 내에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개 또는 18개의 탄소 원자와 같은 1개 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 1가 직쇄 또는 측쇄 포화 탄화수소 라디칼을 포함한다. 예를 들면, 용어 알킬은 메틸, 에틸, 1-프로필, 이소프로필, 1-부틸, 2-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 아밀, 1,2-디메틸프로필, 1,1-디메틸프로필, 펜틸, 이소펜틸, 헥실, 4-메틸펜틸, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 1,2,2-트리메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 2-에틸펜틸, 3-에틸펜틸, 헵틸, 1-메틸헥실, 2,2-디메틸펜틸, 3,3-디메틸펜틸, 4,4-디메틸펜틸, 1,2-디메틸펜틸, 1,3-디메틸펜틸, 1,4-디메틸펜틸, 1,2,3-트리메틸부틸, 1,1,2-트리메틸부틸, 1,1,3-트리메틸부틸, 5-메틸헵틸, 1-메틸헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리스카이데실, 테트라데실, 퀸데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

본원에 사용되는 용어 "알킬렌"은 이의 의미 내에 2가, 포화, 직쇄 탄화수소 라디칼을 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "아릴"은 이의 의미 내에 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 피레닐, 페난트라세닐과 같은 1가, 단일, 다핵성, 공액 및 축합 방향족 탄화수소 라디칼을 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "아릴렌"은 이의 의미 내에 2가, 단일, 다핵성, 공액 및 축합 방향족 탄화수소 라디칼을 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "아르알킬"은 이의 의미 내에 예를 들면 벤질, 페닐 메틸, 페닐에틸, 페닐프로필, 페닐이소프로필, 페닐-3차 부틸 등과 같은 1개 이상의 아릴 또는 치환 아릴 기에 의해 치환된 저급 알킬 잔기를 포함한다.

용어 "알케닐"은 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 탄화수소 라디칼을 의미한다. C₂-C₆ 알케닐 기는 직쇄 또는 측쇄 알케닐 골격에서 2개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 기이다. 알케닐 라디칼의 예는, 제한함이 없이, 비닐, 프로페닐, 2-부테닐 등을 포함한다. 알케닐 기는 알킬 기에 대해 기재된 1개 이상의 모이어티로 치환될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "알키닐"은 1개 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 탄화수소 라디칼을 의미한다. C₂-C₆ 알키닐 기는 직쇄 또는 측쇄 알키닐 골격에서 2개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 기이다. 예시적인 알키닐 잔기는 프로피닐, 3-헥시닐 등을 포함한다. 알키닐 기는 알킬 기에 대해 기재된 1개 이상의 모이어티로 치환될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "임의로 치환된"은 이 용어가 언급하는 기가 비치환될 수 있거나, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 헤테로시클로알킬, 할로, 할로알킬, 할로알키닐, 히드록실, 히드록시알킬, 알콕시, 티오알콕시, 알케닐옥시, 할로알콕시, 할로알케닐옥시, 질소 함유 기, 예컨대 N0₂, NO₃ ^-, N(알킬)₂, NH(알킬), 니트로알킬, 니트로알케닐, 니트로알키닐, 니트로헤테로시클릴, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알케닐아민 및 알키닐아미노, 아실, 알케노일, 알키노일, 아실아미노, 디아실아미노, 아실옥시, 알킬설포닐옥시, 헤테로시클록시, 헤테로시클로아미노, 할로헤테로시클로알킬, 알킬설페닐, 알킬 카보닐옥시, 알킬티오, 아실티오, 인 함유 기, 예컨대 포스포노 및 포스피닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 아르알킬, 알킬헤테로아릴, 시아노, 시아네이트, 이소시아네이트, 황 함유 기, 예컨대 SO₃H, SO₃ ^-, OS0₃ ^-, SO₃알킬, S0₃아릴, NHSO₃H 및 NHS0₃ ^-, C0₂H, COO^-, CO₂알킬, C(0)NH₂, -C(0)NH(알킬) 및 -C(0)N(알킬)₂로부터 독립적으로 선택되는 1개 이상의 기로 치환될 수 있는 기를 의미한다. 바람직한 치환기는 C_{1 - 10}알킬, C_{1 -10}알콕시, -CH₂-(C_{1 -10})알콕시, C_{6 - 10}아릴, 예를 들면 페닐, -CH₂-페닐, 할로, 히드록실, 히드록시(C_1-10)알킬 및 할로-(C_{1 -10})알킬, 예를 들면 CF₃, CH₂CF₃을 포함한다. 특히 바람직한 치환기는 C_{1 - 10}알킬, C_{1 - 10}알콕시, 할로, 히드록실, 히드록시(C_1-10)알킬, 예를 들면 CH₂OH 및 할로-(CM0)알킬, 예를 들면 CF₃, CH₂CF₃을 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "패혈증"은 이의 의미 내에 표준 의학 교재에 규정되어 있고/있거나 당업자에게 공지된 질환 또는 병증의 모든 병기를 포함한다. 예를 들면, 패혈증은 중증 패혈증, 급성 및 만성 패혈증 및 패혈성 쇼크를 포함한다. 패혈증은 또한 화상 환자와 관련된 패혈증 에피소드, 암 환자에 대한 치료 섭생, 임산부 환자에서의 주산기 합병증, 이식편 수여자에 대한 면역억제 예방 및 시술후 수술 환자를 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "나노입자"는 1 마이크론(1000 ㎚) 미만의 직경의 임의의 고체 미립자를 의미한다. 특히, 나노입자는 흑연질 탄소의 복수의 층에 의해 캡슐화된 테크네튬-99m 방사성 핵종의 금속 혈소판으로 이루어지는 피브린라이트(FibrinLite) 나노입자일 수 있다. 피브린라이트 나노입자의 직경은 약 200 ㎚의 중앙 직경으로 20∼400 ㎚ 범위에 걸쳐 대수 정규 분포된다.

상세한 설명

본 발명은 감염으로 인해 패혈증을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 방법에 관한 것이고, 세포외 히스톤 단백질, 예를 들면, 패혈증 환자의 혈류에서 발견되는 것과 신속히 복합체를 형성하고 따라서 이를 중화시키거나 이의 세포독성 활성을 억제하도록 다음이온을 사용한다. 또한, 다음이온은 세포외 히스톤을 복합체화할 수 있고, 기관, 특히 폐에서의 히스톤 축적을 방지할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 다음이온은 혈액 응고 및 지혈과의 이의 적은 상호작용 및/또는 혈류를 지속시키는 이의 능력에 대해 선택된다.

본 발명은 무시할만한 항응고 특성을 가질 수 있는 올리고사카라이드 다음이온이 살아있는 동물의 순환시 히스톤과 복합체화할 수 있고 히스톤이 기관에 결합하는 것을 방지한다는 사실에 입각한다. 이 다음이온은 패혈증에서의 치료학적 중재의 새로운 수단을 제공하고 항체, APC 또는 헤파린을 중화시키기는 용도에 대한 더 매력적인 대안을 제공한다.

패혈증

패혈증은 동맥 저혈압, 대사성 산증, 전신 혈관 저항 감소, 빈호흡 및 기관 기능이상을 특징으로 하는 전신 반응이다. (패혈성 쇼크를 비롯한) 패혈증은 사이토카인 네트워크, 백혈구 및 보체 및 응고/섬유소용해 시스템을 비롯한 여러 숙주 방어 기전의 활성화와 관련되고 이에 의해 매개되는 감염 또는 외상에 대한 전신 염증 반응이다. 다양한 기관의 미소혈관계에서 피브린이 널리 퍼져 침착된 파종성 혈관내 응고(DIC; disseminated intravascular coagulation)는 패혈증의 초기 발현일 수 있다. DIC는 다발성 기관 부전 증후군의 진행에서 중요한 매개자이고 패혈성 쇼크를 앓고 있는 환자의 빈약한 예후에 기여한다.

패혈증은 혈류에서의 유기체, 이의 대사 산물 또는 독소로부터 진행될 수 있다. 즉, 패혈증은 균혈증, 진균혈증, 바이러스혈증 및 기생충혈증을 포함한다. 따라서, 패혈성 쇼크(높은 사망률 및 다발성 기관 부전과 종종 관련되는 패혈증으로부터 생긴 급성 순환 부전)는 다수의 유기체 또는 질환 과정에 의해 야기될 수 있다. 패혈증은 또한 비감염성 자극, 예컨대 외상, 중증 화상, 소장 염전, 양수 색전증 및 기관 이식에 의해 야기될 수 있다.

패혈증을 앓는 많은 환자는 24∼48 시간 기간에 걸쳐 신속히 쇠약해진다. 따라서, 신속한 치료는 효과적인 패혈증 치료에 필수적이다. 불행하게도, 감염의 유형의 진단은 수일이 걸릴 수 있는 병원균을 확인하기 위한 미생물학적 분석을 요한다. 따라서, 병원균을 제거하기 위한 치료(예를 들면, 항생제 치료)를 병원균의 유형 및 종의 지식 없이 그리고 감염의 정도를 아는 수단 없이 개시할 수 있다.

패혈증 환자를 위한 효과적인 새로운 치료법, 예컨대 활성화 단백질 C(APC) 및 염증의 중요한 매개자에 대한 단일클론 항체를 발견하기 위한 여러 시도가 이루어졌다. 그러나, 이러한 치료는 임상적인 영향을 거의 갖지 않고, APC는 최근에 시장으로부터 철수되었다. 저용량 헤파린은 패혈증의 치료 환자에서 사용되지만, 이의 설정에서의 이의 사용은 복잡하고 특히 패혈증이 파종성 혈관내 응고(DIC)를 유도할 때 더 낮은 혈소판 수 및/또는 고갈된 응고 인자로 인해 패혈증 환자에서의 널리 인식된 출혈 위험의 증가로 인해 논란이 된다. 이후, 저용량 헤파린에 의한 혈소판 및/또는 응고 인자의 고갈은 응고 질환을 야기할 수 있고 비극적인 출혈이 발생할 수 있다. 헤파린은 또한 몇몇 환자에서 헤파린 유도 저혈소판증(HIT)으로 공지된 병증을 유도할 수 있고, 혈소판의 항체 매개 파괴는 위험한 출혈을 또한 야기할 수 있다.

히스톤

히스톤은 리신 또는 아르기닌의 함량이 높고 DNA의 팩키징에서 기능하는 작은 기본 단백질이다. 히스톤은 고도로 보존되고, 코어 히스톤(H2A, H2B, H3 및 H4) 및 링커 히스톤(HI 및 H5)의 2개의 슈퍼클래스로 분류되는 5개의 주요 종류: H1/H5, H2A, H2B, H3 및 H4로 그룹화될 수 있다.

각각의 코어 히스톤의 2개는 조립되어 단백질 복합체 주위에 DNA를 랩핑함으로써 옥타머 뉴클레오솜 코어 입자를 형성한다. 링커 히스톤은 뉴클레오솜 및 DNA를 결합시키고, 여기서 이것은 뉴클레오솜에 진입하고 이로부터 나와 DNA를 제자리에 잡아두고 더 높은 질서 구조의 형성을 수월하게 한다.

본원에 기재된 히스톤은 전장 히스톤, 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 히스톤 변이체는 예를 들면 아미노산(들)의 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 대안적으로, 히스톤은 리신 및 아르기닌의 아세틸화 및/또는 메틸화에 의해 변형될 수 있다. 일반적으로, 변형은 히스톤의 다양이온 성질 또는 기관에서 국부화하는 히스톤의 능력을 실질적으로 손상시키지 않는다.

적합한 아미노산 치환은 "보존적"으로 당해 분야에 공지된 아미노산 치환을 포함하지만, 반드시 이것으로 제한되지는 않는다. "보존적" 치환은, 펩타이드 화학의 당업자가 폴리펩타이드의 생물학적 활성, 2차 구조 및/또는 수치요법 성질이 실질적으로 변하지 않는다고 예상할 수 있도록, 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산에 대해 치환된 것이다. 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 리신, 히스티딘 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 비하전 극성 헤드 기를 갖는 아미노산은 류신, 이소류신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 굴루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 보존적 변화를 나타낼 수 있는 아미노산의 다른 기는 (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his를 포함한다. 히스톤 변이체는, 또한, 또는 대안적으로, 비보존적 아미노산 변화를 포함할 수 있다.

특정한 실시양태에서, 히스톤 변이체는 아미노산(들)의 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있고, 5개의 아미노산 또는 더 적은, 예컨대 4개 또는 3개 또는 2개 또는 1개의 아미노산(들)의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 비변형 서열과 상이하다.

본원에 사용되는 히스톤 "변이체"는 천연 히스톤 서열과 실질적으로 유사한 서열을 갖는 히스톤을 의미한다. 일반적으로, 2개의 서열이 동일한 아미노산 잔기의 특정 백분율("서열 동일성"의 백분율)을 갖는 경우 2개의 서열은 "실질적으로 유사하다". 따라서, 히스톤 서열의 "변이체"는 기준 히스톤 서열과 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 83% 85%, 88%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있다.

일반적으로, 히스톤 서열 변이체는 공통적인 정량적 생물학적 활성을 보유한다. 또한 용어 "변이체"의 의미 내에 히스톤의 동족체가 포함된다. 히스톤 동족체는 통상적으로 상이한 종 유래이지만 다른 종으로부터 상응하는 히스톤과 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 공유한다. 예를 들면, 히스톤의 동족체는 포유동물 또는 미생물의 상이한 종 유래의 것을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

추가로, 용어 "변이체"는 또한 히스톤 서열의 유사체를 포함한다. 히스톤 "유사체"는 소정의 히스톤의 유도체인 폴리펩타이드이고, 유도체는 1개 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 치환을 포함하여서, 폴리펩타이드는 실질적으로 동일한 기능을 보유한다. 상기 기재된 바대로, 용어 "보존적 아미노산 치환"은 1개의 아미노산의 히스톤 서열 내에 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산에 대한 치환 또는 대체를 의미한다.

특정한 실시양태에서, 히스톤의 "변이체"는 5개의 아미노산 또는 더 적은, 예컨대 4개 또는 3개 또는 2개 또는 1개의 아미노산(들)의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 (관련 히스톤으로부터) 서열이 상이하다.

히스톤의 단편은 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 히스톤 "단편"은 히스톤 또는 이의 변이체의 구성성분인 폴리펩타이드이다. 통상적으로, 단편은 구성성분인 히스톤과 공통적인 정량적 생물학적 활성을 보유한다. 통상적으로, 히스톤 단편은 50개 초과의 길이의 아미노산, 약 5개 내지 약 50개의 길이의 아미노산 잔기, 약 5개 내지 약 45개의 길이의 아미노산 잔기, 약 5개 내지 약 40개의 길이의 아미노산 잔기, 약 5개 내지 약 35개의 길이의 아미노산 잔기, 약 5개 내지 약 30개의 길이의 아미노산 잔기, 약 5개 내지 약 25개의 길이의 아미노산 잔기, 약 5개 내지 약 20개의 길이의 아미노산 잔기, 약 5개 내지 약 15개의 길이의 아미노산 잔기, 또는 약 5개 내지 약 10개의 길이의 아미노산 잔기일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 단편은 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 25개 초과의 길이의 아미노산 잔기이다.

다음이온

본 발명자들은 히스톤이 높은 등전점을 갖는 다양이온이므로, 이것이 황산화 다음이온성 폴리사카라이드, (예를 들면, 헤파린) 다음이온성 올리고사카라이드 및 디사카라이드, 선형 다음이온, 시클리톨 다음이온 및 아릴렌 우레아 다음이온과 같은 DNA 이외의 다음이온과 복합체를 형성할 것이라는 것을 제안하였다.

몇몇 실시양태에서, 다음이온은 응고 시스템에 어떠한 영향 없이 히스톤과 복합체화할 수 있고 따라서 순환하는 히스톤의 생물학적 활성을 억제할 수 있다. 이는, 심지어 DIC가 존재할 때, 출혈이 없거나 여전히 이를 촉진하지 않으면서, 패혈증 환자의 응고 상태 및 혈소판 수와 완전히 독립적으로 사용될 수 있는 더 넓은 용량 범위의 다음이온의 옵션을 주치의에게 제공한다. 이 다음이온은 또한 혈소판의 파괴를 촉진하지 않아야 한다.

바람직한 실시양태에서, 다음이온은 안정하고 생체내 신속히 분해되지 않는다. 추가로, 본원에 기재된 다음이온은 실온에서 안정할 수 있고 따라서 실질적인 분해 없이 장기간 동안 저장될 수 있다.

다음이온성 폴리사카라이드

헤파린은 응고방지제로서 임상 약제에서 배타적으로 사용되는 천연 황산화 폴리사카라이드이다. 이의 항응고 활성은 프로타민과 같은 약학적으로 허용되는 다양이온의 투여에 의해 환자에서 제어되거나 심지어 중화될 수 있다.

다음이온인 헤파린이 순환하는 다양이온 히스톤과 복합체화할 것이고, 따라서 순환하는 히스톤과 복합체화하기에 충분하지만 명확한 항응고 효과를 갖기에 불충분한 용량으로 패혈증 환자에 유리한 것으로 제안되었다. 프로테오글리칸 퍼레칸 및 신데칸, 콘드로이틴 설페이트; 더마탄 설페이트; 펜토산 폴리설페이트(Elmiron), 설로덱사이드(HS/DS), 과황산화 히알우론산, 푸코이단 및 과황산화 콘드로이틴 설페이트(Arteparon^®)를 비롯한 헤파란 설페이트와 같은 당업자에게 공지된 다른 다음이온성 폴리사카라이드를 또한 순환하는 히스톤과 복합체화하기에 충분하지만 상당한 항응고 효과를 갖기에 불충분한 투약량으로 사용할 수 있다.

다른 실시양태에서, 다음이온성 폴리사카라이드는 상당한 항응고 활성이 부족하지만 히스톤과 효과적으로 신속히 복합체화하는 능력을 유지하는, 설페이트 기의 일부를 제거하도록 화학 변형된 부분 탈황산화 헤파린, 저분자량 헤파린, 또는 화학 변형 헤파린(예를 들면, 페리오데이트 처리된, 글리콜 스플릿 헤파린)일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 다음이온성 폴리사카라이드는 N-아세틸화 헤파린, 글리콜 스플릿 헤파린, 글리콜 스플릿 N-아세틸화 헤파린, 엔독사파린, 글리콜 스플릿 엔독사파린 및 글리콜 스플릿 저분자량 헤파린(3 KDa)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

다음이온성 올리고사카라이드

일 실시양태에서, 다음이온은 하기 일반 구조 (Ⅰ)을 갖는 다음이온성 올리고사카라이드이다:

A-(B)_n-D (Ⅰ)

[식 중,

A 및 B는 각각 독립적으로 사이클릭 모노사카라이드 또는 사이클릭 데옥시 모노사카라이드이고,

D는 사이클릭 모노사카라이드, 사이클릭 데옥시 모노사카라이드, 개환 모노사카라이드 또는 당 알콜이고,

n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로부터 선택되는 정수이고,

사이클릭 모노사카라이드, 사이클릭 데옥시 모노사카라이드, 개환 모노사카라이드 또는 당 알콜의 각각은 독립적으로 OSO₃ ^-, COO^-, OPO₃ ^-, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 아르알킬로 임의로 치환되고,

다음이온성 올리고사카라이드는 OSO₃ ^-, COO^- 및 OPO₃ ^-로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개 이상의 음이온성 치환기를 포함한다].

일 실시양태에서, 사이클릭 모노사카라이드는 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 리보스, 아라비노스, 크실로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 만노스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 리불로스, 크실룰로스, 푸시코스, 소르보스, 타가토스 및 세도헵툴로스로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 사이클릭 모노사카라이드는 글루코스, 갈락토스 및 프럭토스로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일 실시양태에서, 사이클릭 데옥시 모노사카라이드는 푸코스, 데옥시리보스 및 람노스로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일 실시양태에서, 당 알콜은 글리콜, 글리세롤, 에리스리톨, 트레이톨, 리비톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨(글루시톨), 만니톨, 둘시톨(갈락티톨), 이디톨 및 푸시톨로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 당 알콜은 소르비톨 및 둘시톨로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일 실시양태에서, 개환 모노사카라이드는 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 에리트로스, 트레오스, 에리트룰로스, 리보스, 아라비노스, 크실로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 만노스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 리불로스, 크실룰로스, 푸시코스, 소르보스, 타가토스 및 세도헵툴로스로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일 실시양태에서, 개환 모노사카라이드는 아릴 또는 알킬 아민에 의해 환원 아미노화될 수 있다.

일 실시양태에서, 사이클릭 모노사카라이드는 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 또는 1,6 결합에 의해 연결된다. 일 실시양태에서, 사이클릭 모노사카라이드는 1,4 또는 1,6 결합에 의해 연결된다. 일 실시양태에서, 사이클릭 모노사카라이드는 α 결합에 의해 연결된다. 다른 실시양태에서, 사이클릭 모노사카라이드는 β 결합에 의해 연결된다. 2개 초과의 모노사카라이드가 존재하는 추가의 실시양태에서, 모노사카라이드의 각각은 α 결합에 의해 연결된다. 2개 초과의 모노사카라이드가 존재하는 추가의 실시양태에서, 모노사카라이드의 각각은 β 결합에 의해 연결된다. 2개 초과의 모노사카라이드가 존재하는 다른 실시양태에서, 모노사카라이드는 α 결합 및 β 결합의 조합에 의해 연결된다.

일 실시양태에서, A, B 및 D는 각각 글루코스, 갈락토스 및 프럭토스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 사이클릭 모노사카라이드이고, 글루코스, 갈락토스 또는 프럭토스의 각각의 히드록실 기는 SO₃ ^- 또는 PO₃ ^-로 임의로 치환된다.

다음이온성 올리고사카라이드는 말토스 설페이트, 말토트리오스 설페이트, 말토테트라오스 설페이트, 말토펜타오스 설페이트, 말토헥사오스 설페이트, 말토헵타오스 설페이트, 말토옥타오스 설페이트, 말토노나오스 설페이트 및 말토데카오스 설페이트, 파노스 설페이트, 이소말토트리오스 설페이트, 에를로스 설페이트, 셀로비오스 설페이트 및 라피노스 설페이트를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

추가의 실시양태에서, 다음이온성 올리고사카라이드는 셀로비오스 설페이트일 수 있다.

다른 실시양태에서, 다음이온은 하기 일반 구조 (I-a)를 갖는 다음이온성 올리고사카라이드일 수 있다:

[식 중,

각각의 R¹은 독립적으로 OSO₃ ^-, COO^-, OPO₃ ^-, OH 또는 H로부터 선택되고,

n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 사이의 정수이고,

R¹ 중 2개 이상은 OSO₃ ^-, COO^- 및 OPO₃ ^-로 이루어지는 군으로부터 선택된다].

일 실시양태에서, n은 1, 2, 3 또는 4이다. 다른 실시양태에서, n은 1 또는 2이다. 일 실시양태에서, R¹의 각각은 OSO₃ ^-이다.

다른 실시양태에서, 다음이온은 하기 일반 구조 (I-b)를 갖는 다음이온성 올리고사카라이드일 수 있다:

[식 중,

각각의 R¹은 독립적으로 OSO₃ ^-, COO^-, OPO₃ ^-, OH 또는 H로부터 선택되고,

n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 사이의 정수이고,

R¹ 중 2개 이상은 OSO₃ ^-, COO^- 및 OPO₃ ^-로 이루어지는 군으로부터 선택된다].

일 실시양태에서, n은 1, 2, 3 또는 4이다. 다른 실시양태에서, n은 1 또는 2이다. 일 실시양태에서, R¹의 각각은 OSO₃ ^-이다.

다른 실시양태에서, 다음이온성 올리고사카라이드는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다:

[식 중,

각각의 R²는 독립적으로 OSO₃ ^-, COO^-, OPO₃ ^-, OH 또는 H로부터 선택되고,

R² 중 2개 이상은 OSO₃ ^-, COO^- 및 OPO₃ ^-로 이루어지는 군으로부터 선택된다].

추가의 실시양태에서, 다음이온은 하기 일반 구조 (Ⅱ)를 갖는 다음이온성 시클로덱스트린일 수 있다:

[식 중,

각각의 R³은 독립적으로 임의로 치환된 O-알킬, O-아릴, O-아르알킬, O-알케닐, O-알키닐 기, OS0₃ ^-, COO^-, OP0₃ ^-, OH 또는 H로부터 선택되고,

R⁴의 각각은 독립적으로 OS0₃ ^-, COO^-, OP0₃ ^-, OH 또는 H로부터 선택되고,

x는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 사이의 정수이고,

다음이온성 시클로덱스트린은 OS0₃ ^-, COO^- 및 OPO₃ ^-로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개 이상의 음이온성 치환기를 포함한다].

일 실시양태에서, x는 4, 5 또는 6이다. 시클로덱스트린은 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린 또는 γ-시클로덱스트린일 수 있다.

다른 실시양태에서, 올리고사카라이드는 황산화 올리고사카라이드 또는 개환 올리고사카라이드이다.

다른 실시양태에서, 다음이온은 각각 황산화 말토트리이톨 및 말토테트라이톨과 같은 트리사카라이드 또는 테트라사카라이드의 환원 당 말단의 황산화 개환 형태일 수 있다. 이 트리사카라이드 또는 테트라사카라이드의 유도체는, 환원 당의 환을 유지시키거나 개환시키는, 알킬 및 아릴 기를 갖는 환원 아미노화된 잔기일 수 있다.

다른 실시양태에서, 다음이온은 하기 구조식을 갖는 디사카라이드, 올리고사카라이드, 개환 디사카라이드 또는 개환 올리고사카라이드이다:

E-(G)_a

[식 중,

a는 1 내지 10의 정수이고,

E는 디오스, 트리오스, 테트라오스, 펜토스, 헥소스, 헵토스, 옥토스 및 노노스로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

각각의 독립적인 G는 디오스, 트리오스, 테트라오스, 펜토스, 헥소스, 헵토스, 옥토스 및 노노스로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

E 및 G 및, a가 2 이상의 정수인 경우, G 및 G는 -O-(CH₂)_x-O-, -O-, -OCH₂-, -NH-, -S-, -NR(CH₂)_x-Ar-(CH₂)_xNR₁-, -NR(CH₂)_xNR₁-, -0(CH₂)_x-Ar-(CH₂)_xO-, -C(0)-N(R₂)-(CH₂)_x-N(R₂)-C(0)-, -N(R₂)-C(0)-Ar-(CH₂)_x-Ar-C(0)-N(R₂)- 및 -N(R₂)-(CH₂)_x-N(R₂)-로부터 선택되는 군을 통해 연결되고; R, R¹ 및 R²는 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 C(0)-알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

x는 0 내지 10의 정수이고,

E 및 G는 알킬, 알케닐, 아릴, 할로, 헤테로아릴, 아미드 유도체, 예컨대 - NHCOCH₃-, 알콕시 예컨대 -OCH₃-, -O- 및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택되는 작용기로 치환될 수 있고,

상기 디오스, 트리오스, 테트라오스, 펜토스, 헥소스, 헵토스, 옥토스 및 노노스는 황산화, 포스포릴화 또는 카복실화될 수 있다].

일 실시양태에서, E 및 각각의 G는 독립적으로 펜토스, 헥소스 및 헵토스로 이루어지는 군으로부터 선택되고, -O-(CH₂)_x-O-, -O-, -OCH₂-, -NR(CH₂)_x-Ar-(CH₂)_xNR₁-, -O(CH₂)_x-Ar-(CH₂)_xO-, -C(O)- N(R₂)-(CH₂)_x-N(R₂)-C(0)-, -N(R₂)-C(0)-Ar-(CH₂)_x-Ar-C(0)-N(R₂)-로부터 선택되는 군을 통해 연결되고, R, R₁ 및 R₂는 수소, 아세틸 및 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되고, x는 1 내지 6의 정수이다.

다른 실시양태에서, 헥소스는 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스, 푸코스 및 이도스로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고, 펜토스는 크실로스일 수 있다.

선형 및 연결 다음이온

다른 실시양태에서, 다음이온이 이의 환원 말단을 통해 2개의 각각 연결된 당의 황산화 구성체일 수 있어서 개환을 갖고 선형 폴리올 구조를 제시한다. 예를 들면, 선형 -NH₂-CH₂-CHOH-CH₂-NH₂-는 2개의 환원된 글루코스 또는 굴루쿠론산 단위를 연결할 수 있다. 이 유형의 구조 내의 분자마다 가능한 설페이트 기의 수 및 쇄 길이는 또한 글루코스와 같은 헥소스 대신에 세도헵툴로스와 같은 헵토스와 같은 시작 아단위로서 당의 유형의 적절한 선택에 의해 연장될 수 있다. 다른 실시양태에서, 다음이온은 사이클릭 모노사카라이드와 개환 모노사카라이드 사이의 링커를 갖는 황산화 구성체일 수 있다.

다른 실시양태에서, 다음이온은 12개, 13개, 14, 15개, 16개, 17개 또는 18개의 탄소 원자 쇄 길이의 다음이온성 선형 폴리올일 수 있다. 다음이온성 선형 폴리올은 불포화 결합, 측쇄 또는 포화 또는 불포화일 수 있는 환 구조를 가질 수 있다. 다음이온성 선형 폴리올은 임의로 치환될 수 있다. 알콜 전구체 예는 1,2,13,14-테트라데칸-테트라올, 5-(히드록시메틸)운데칸-1,5,6,7,11-펜톨, 옥타데칸-1,18-디올 및 가수분해된 스쿠알렌 유도체이다. 일 실시양태에서, 다음이온성 선형 폴리올은 황산화된다. 다른 실시양태에서, 다음이온성 선형 폴리올은 설페이트 기, 카복실레이트 기 및 포스페이트 기로부터 선택되는 2개 이상의 치환기를 포함한다.

다른 실시양태에서, 다음이온은 수라민 및 관련 유도체와 같은 방향족 환에 부착되거나 알킬 폴리올에 기초하는 다음이온성 화합물일 수 있다.

시클리톨 다음이온

추가의 실시양태에서, 다음이온은 하기 구조식을 갖는 시클리톨이다:

[식 중,

H는 N, CH, O, S, 또는 -CO-NH-K-NH-CO-, -NH-CO-K-CO-NH-, -NH-K-NH-, -0-K-0-로부터 선택되는 링커로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

K는 알킬렌 및 아릴렌으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

R₁₀은 포화 또는 불포화인 4원, 5원 또는 6원 카보사이클릭 환이고, 환은 1개 이상의 설페이트 기, 1개 이상의 카복실레이트 기 또는 1개 이상의 포스페이트 기를 포함하고,

R₁₁은 포화 또는 불포화인 4원, 5원 또는 6원 카보사이클릭 환, 수소, 아릴 및 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기서 환은 1개 이상의 설페이트 기, 1개 이상의 카복실레이트 기 또는 1개 이상의 포스페이트 기를 포함하고,

J는 수소, 알킬, 아릴, -L-C(R₁₂)(R₁₃) 및 아세테이트로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

L은 -(CH₂)_x-, -CH₂-Ar-CH₂-, -CH₂CH(OH)CH₂-, -(CH₂)_x-Ar-(CH₂)_x-로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기서 L 기는 1개 이상의 설페이트 기, 1개 이상의 카복실레이트 기 또는 1개 이상의 포스페이트 기를 임의로 포함할 수 있다].

R₁₂ 및 R₁₃은 독립적으로 포화 또는 불포화인 4원, 5원 또는 6원 카보사이클릭 환, 수소, 아릴 및 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기서 R₁₂ 및/또는 R₁₃은 1개 이상의 설페이트 기, 1개 이상의 카복실레이트 기 또는 1개 이상의 포스페이트 기를 포함할 수 있고, x는 0 내지 10의 정수이다.

일 실시양태에서, L은 -(CH₂)_x-(여기서, x는 2 내지 10의 정수임), CH₂-Ar-CH₂ 및 CH₂CH(OS0₂H)CH₂로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

대안적인 실시양태에서, R₁₀, R₁₁, R₁₂ 및 R₁₃은 독립적으로 하기로부터 선택될 수 있다:

[식 중,

T는 독립적으로 SO₃H, SO₃ ^-, COOH, COO^-, OPO₃H 및 OPO₃ ^-로 이루어지는 군으로부터 선택된다].

아릴렌 우레아 다음이온

제1 양태의 추가의 실시양태에서, 다음이온은 하기 화학식의 아릴렌 우레아이다:

[식 중,

각각의 Y는 독립적으로 SO₃H, SO₃ ^-, 수소, 알킬, 할로, 페닐, 아미드 유도체, -NHCOCH₃, NO₃ ^-, -0-, -OCH₃, COOH, COO^-, OPO₃H 및 OP0₃ ^-로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

각각의 V는 독립적으로 -(NHC(0)Ph)_z-, (CH₂)_u 및 페닐로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

W는 -NH-C(0)-NH-이고,

u 및 z는 서로 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 사이의 정수일 수 있다].

일 실시양태에서, 아릴렌 우레아는 수라민 또는 이의 염일 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 다음이온의 예는 하기를 포함한다:

다음이온의 제조

본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 다음이온을 구입하거나 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물에서 사용되는 황산화 올리고사카라이드 화합물을 상응하는 올리고사카라이드의 황산화에 의해 또한 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 올리고사카라이드 화합물을 적절한 용매의 존재 하에 피리딘-삼산화황 착체와 같은 황산화제로 처리할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 다음이온은 올리고사카라이드와 피리딘-삼산화황 착체와의 반응에 의해 얻은 화합물의 혼합물일 수 있다.

올리고사카라이드는 존재하는 1개 이상의 설페이트 기를 가질 수 있다. 이 설페이트 기는 다양한 염기와 반응하여 염을 형성할 수 있다. 황산화 화합물은 염 형태일 때 안정하다. 유리 형태의 황산화 화합물은 Dowex 50W-X8과 같은 양이온 교환 수지를 이용함으로써 이의 염으로부터 유도될 수 있다. 임의로, 염을 다양한 다른 원하는 염 중 임의의 하나로 전환하기 위해 종래의 이온 교환으로 처리할 수 있다.

황산화된 올리고사카라이드는 천연 생성물, 예를 들면 라피노스, 스타키오스 또는 시클로덱스트린일 수 있다. 대안적으로, 다음이온을 화학 합성에 의해 제조할 수 있거나, 올리고사카라이드를 천연 폴리사카라이드의 효소 또는 화학 분해에 이어, 후속 화학 변형에 의해 제조할 수 있다.

다음이온의 항응고 활성

몇몇 다음이온은 항응고 활성을 가질 수 있다. 용어 "항응고 활성"이란 실험실내 또는 생체내 혈액 응고 검정에서 혈액 응고를 방지하거나, 억제하거나, 지연시키는 물질의 활성을 의미한다.

혈액 응고 검정은 당해 분야에 공지되어 있고, 피브린 응고물의 형성에 필요한 시간을 측정하는 검정을 포함한다. 예를 들면, 검정은 프로트롬빈 시간(PT), 부분 트롬보플라스틴 시간(PTT), 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT), 피브리노겐 검정, 트롬빈 응고 시간(TCT) 및 활성화 응고 시간(ACT)을 포함할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 다음이온의 항응고 활성은 본원에 기재된 방법에서 유용한 다음이온의 임상 적용 또는 유효 용량에 영향을 미친다. 그러나, 항응고 활성을 갖는 다음이온은 본원에 기재된 방법에서 여전히 유용하다. 바람직한 실시양태에서, 다음이온은 실질적인 항응고 활성을 갖지 않는다.

실질적인 항응고 활성 없이 다음이온은 정상 범위와 비교하여 PT, PTT, APTT, TCT 또는 ACT를 실질적으로 증가시키지 않는다. 예를 들면, 실질적인 항응고 특성을 갖지 않는 다음이온은 PT, PTT, APTT, TCT 또는 ACT를 증가시키지 않거나, 다음이온은 정상 범위의 0 내지 약 10%로 PT, PTT, APTT, TCT 또는 ACT를 증가시킨다. 다른 실시양태에서, 다음이온은 정상 범위의 약 1 내지 약 5%로 PT, PTT, APTT, TCT 또는 ACT를 증가시킨다. 추가의 실시양태에서, 다음이온은 정상 범위의 약 2.5 내지 약 7.5%로 PT, PTT, APTT, TCT 또는 ACT를 증가시킨다. 추가의 다른 실시양태에서, 다음이온은 정상 범위의 약 5 내지 약 10%로 PT, PTT, APTT, TCT 또는 ACT를 증가시킨다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 다음이온은 정상 범위의 약 12.5 내지 약 15%로 PT, PTT, APTT, TCT 또는 ACT를 증가시킨다. 다른 실시양태에서, 다음이온은 정상 범위의 약 15 내지 약 20%로 PT, PTT, APTT, TCT 또는 ACT를 증가시킨다.

나노입자

발명의 명칭이 "Method for detection of fibrin clots"인 미국 특허 제6,977,068호는 피브린 응고물의 검출에서 탄소 캡슐화 방사성 핵종 나노입자의 사용 방법을 기재하고 있다. 2006년 4월 28일에 출원되고 WO 2006/116798 A1로 공개된 발명의 명칭이 "A method of forming an injectable radioactive composition of a carbon encapsulated radioactive particulate"인 국제 특허 출원 제PCT/AU2006/000554호는 탄소 캡슐화 나노입자의 주사용 제제의 제조 방법을 기재하고 있다. 여기 기재된 방법을 "피브린라이트(FibrinLite) 공정"이라 칭할 수 있고, 이렇게 제조되는 나노입자를 "피브린라이트"라 칭할 수 있다.

허용되는 정도로, US 제6,977,068호 및 PCT/AU2006/000554(WO 2006/116798)의 전체 내용이 참조문헌으로 본원에 포함된다.

탄소 캡슐화 나노입자 복합체의 수성 분산액을 제조하는 방법이 방사성 에어로졸의 수성 포획의 단계를 포함할 수 있고, 이 단계가 다수의 방식으로 성취될 수 있다는 것을 당업자가 알고 있는 것을 이해된다. 예를 들면, 탄소 캡슐화 나노입자 복합체를 제조하기 위해 사용되는 방사성 에어로졸의 수성 포획의 단계가 벤투리(Venturi) 스크러버 내의 에어로졸의 수집, 액체 전극 상의 에어로졸의 농축 또는 시클론 디바이스의 사용을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.

일 실시양태에서, 탄소 캡슐화 나노입자 복합체를 PCT/AU2006/00054에 기재된 공정을 사용하여 제조할 수 있고, 여기서 공정은 US 특허 제5,792,241호(이의 전체 내용은 본원에 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 Browitt 침전제를 사용하는 물 중의 방사성 에어로졸의 포획을 포함한다.

이전에 기재된 바대로, 탄소 캡슐화 나노입자는 히스톤과 같은 마크로분자의 높은 비방사능 및 높은 아비디티(avidity) 라벨링을 제공할 수 있다.

PCT/AU2006/000554에 기재된 바대로, 탄소 도가니에 테크네튬 또는 다른 동위원소를 로딩하고, 로딩된 도가니를 예열하고, 입자의 플래쉬 발광, 물 또는 다른 수성 용액 중의 입자 포획에 의해 탄소 캡슐화 방사성 미립자(나노입자)를 제조할 수 있다.

PCT/AU2006/000554에 기재된 바대로, 동위원소의 비활성이 100 mCi/㎖와 같이 충분히 높은 경우 증발 방법에 의해, 단순히 도가니 내에 용액 중에 동위원소의 분액을 위치시키고 도가니의 조심스럽게 조절되는 저항 가열에 의해 액체를 증발 건조시킴으로써 적합한 흑연 도가니에 로딩하기 위해 동위원소를 사용할 수 있다. 대안적으로, 유체 전달관에서 미세한 백금 와이어의 애노드 및 캐소드로서의 도가니를 사용함으로써 도가니를 전기분해로 로딩할 수 있다. 상기 관은 동위원소 용액을 도가니로 전달하고(그리고 도가니를 통한 이의 재순환을 수월하게 하고), 동위원소를 전기분해 및 연속 펌핑의 합한 작용에 의해 도가니의 내면에 농축시킬 수 있다.

로딩 후, 도가니를 예열 단계로 처리하여 동위원소 용액 중의 임의의 담체를 제거하고, 예를 들면 염화나트륨을 아르곤과 같은 불활성 가스의 흐름으로 바람직하게는 증발에 의해 제거한다. 예열 단계는 후속하여 도가니로부터 삭마된 자유 탄소의 양을 감소시키고, 나노입자를 오염시키는 자유 동위원소의 수준을 감소시키고, 더 작은 입자 분획으로 존재하는 동위원소의 비율을 증가시킨다.

예열된 도가니를 신속한 상승 시간(예를 들면, 0.3∼0.7 초)에 이어 소정의 가열 기간(예를 들면, 2.5∼15 초) 동안 예를 들면 2765℃±15℃를 유지하는 편평한 플래토를 특징으로 하는 단단히 조절되는 도가니 가열 프로필을 생성하도록 전자 서보(electronic servo) 디바이스에 의해 3 초 동안 예를 들면 2740∼2790℃로 플래쉬 가열한다. 이 단계 동안 나노입자를 도가니의 표면으로부터 삭마한다.

도가니로부터 삭마된 입자를 저농도의 계면활성제, 예를 들면, 10 마이크로몰 나트륨 데옥시클로로에이트 및 매우 낮은 이온성 농도 조건(예를 들면, 100 마이크로몰 미만)을 포함하는 물 중에 침전시킨다. 바람직한 실시양태에서, 나노입자를 저농도의 약산인 완충제 중에 침전시키거나, 이를 예를 들면 pH 4.1에서 300 마이크로몰 나트륨 디하이드로겐 시트레이트의 최종 농도에서 침전제로부터 수집 후 나노입자 분산액에 첨가할 수 있다.

따라서, 나노입자를 1.0 mM NaCl의 당량보다 적은 매우 낮은 전해질 농도를 갖는 안정한 수성 분산액으로서 제조할 수 있다. PCT/AU2006/000554에 기재되어 있거나 입자의 제조를 위해 이로부터 유도 가능한 임의의 방법을 본 발명에서 사용하기 위한 나노입자의 제제에서 이용할 수 있다. 일 실시양태에서, 예를 들면 15 초 동안 약 1600∼1650℃에서 동위원소 로딩된 흑연 도가니를 가열하여 2700℃ 초과의 방사성 동위원소의 삭마 전에 담체 염화나트륨을 제거함으로써 이를 성취할 수 있다. 염화나트륨의 비점은 불과 1413℃이고, Tc-99m 방사성 동위원소는 이 온도에서 휘발성이 아니다. 대안적인 방사성 동위원소가 본 발명의 방법에서 사용되는 경우, 당업자는 예컨대 PCT/AU2006/000554를 참조하여 삭마의 적절한 온도를 결정할 수 있다.

PCT/AU2006/000554에 따라 제조된 나노입자의 수성 분산액은 예를 들면 48 시간 동안의 정치시 응집되거나, 침전하거나, 침강하지 않는다. 나노입자의 분산액은 또한 살아 있는 피험체의 혈류와 상용성이고 이로 주사될 수 있는 매우 낮은(예를 들면, 약 1 마이크로몰 내지 약 20 마이크로몰, 통상적으로 약 10 마이크로몰 범위) 농도의 음이온성 계면활성제, 통상적으로 나트륨 데옥시콜레이트를 포함할 수 있다(본원의 도 5 및 도 6 참조). 나노입자는 바람직하게는 예컨대 pH 4.1에서의 300 마이크로몰 나트륨 디하이드로겐 시트레이트의 최종 농도에서 예컨대 저농도의 약산성 완충제 중의 분산액의 안정성을 허용하도록 임의의 적절한 방식으로 저장될 수 있다. 나노입자의 분산액은 안정하고, 용이하게 이용 가능한 친수성 막 필터, 예컨대 800, 450 및 220 ㎚의 기공도로 이용 가능한 Millipore 혼합 셀룰로스 에스테르(MCE) 주사기 필터의 사용에 의해 크기 분별할 수 있다. 통상적인 나노입자 제제 중의 90% 초과의 방사성이 800 ㎚ MCE 필터를 통해 통과할 것이고, 동일한 제제는 박층 크로마토그래피에 의해 5% 미만의 수용성 동위원소를 통상적으로 포함하는 것으로 나타날 수 있다.

방사성 동위원소

당업자는 금속 원소의 임의의 방사성 동위원소를 나노입자에 도입할 수 있다는 것을 이해할 것이다. PCT/AU2006/000554 및 PCT/AU2009/000508에 기재된 바대로, Tc-99m, Ga-67과 같은 감마 방사선을 방출하는 것; 예컨대 Y-90과 같은 베타 방사선을 방출하는 것; Bi-213과 같은 알파 방사선을 방출하는 것; 및 Cu-64와 같은 양전자 방사선을 방출하는 것과 같은 다양한 범위의 방사성 동위원소를 나노입자에 도입할 수 있다. ¹⁹⁸Au, ⁶⁴Cu, ²¹³Bi, ⁵⁷Co, ⁵¹Cr, ¹⁶⁵Dy, ¹⁶⁹Er, ⁵⁹Fe, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹⁵³Gd, ¹⁶⁶Ho, ¹¹¹In, ^{113 m}In, ¹⁷⁷Lu, ²³Na, ²⁴Na, ¹⁰³Pd, ⁸¹Rb, ⁸²Rb, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁷⁵Se, ¹⁵³Sm, ^117mSn, ⁸⁹Sr, ²⁰¹Th, ⁹⁰Y, ¹⁶⁹Yb, ¹⁹²Ir과 같은 임의의 적합한 금속 방사성 동위원소를 사용할 수 있다.

나노입자에서, 그러므로 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 동위원소의 범위는 Tc-99m 또는 Ga-67을 사용하는 단일 광자 단층 촬영(SPECT; single photon computed tomography) 및 Cu-64 또는 Zr-89을 사용하는 양전자 방출 단층 촬영(PET; positron emission tomography) 또는 감마 섬광조영술과 같은 진단 영상 분야에 이상적으로 적합한 것을 포함한다.

PCT/AU2006/000554 및 PCT/AU2009/000508에 기재된 바대로, 예시적인 방사성 핵종은 Tc-99m이다. 나노입자는 각각 이의 코어 내에 수 만개 이상의 동위원소 원자를 운반할 수 있어서, 전통적인 라벨링 방법에 의해 얻을 수 있는 것을 초과하는 매우 높은 수준의 비활성을 용이하게 얻을 수 있다. 모델 캡슐화 방사성 동위원소로서의 Tc-99m의 경우 및 이를 사용하여, 약 1 내지 약 100 mCi, 약 5 내지 약 100 mCi, 약 7.5 내지 약 95 mCi, 약 10 내지 약 90 mCi, 약 15 내지 약 85 mCi, 약 20 내지 약 80 mCi, 약 25 내지 약 75 mCi, 약 30 내지 약 70 mCi, 약 35 내지 약 65 mCi, 약 40 내지 약 60 mCi, 약 45 내지 약 55 mCi, 또는 약 50 내지 약 55 mCi 범위의 Tc-99m 로딩을 제조할 수 있다. 원하는 바대로 2 mL 수성 현탁액 중의 약 1 내지 약 30 mCi를 포함하도록 입자의 통상적인 제제를 용이하게 제조할 수 있다. 주사 이동도 입자 크기(SMPS; scanning mobility size sizing) 기술을 이용한 입자의 기상 특성으로부터, 현탁액이 약 50 ㎍의 나노입자 물질을 포함하여서, 600 mCi ㎎만큼 높거나, 22 GBq/㎎ 초과인 비활성이 얻어질 수 있다는 것을 볼 수 있다. 에어로졸 생성기 내에 도가니를 로딩하도록 사용되는 동위원소의 활성을 변화시킴으로써 제제의 비활성을 원하는 대로 조정할 수 있다.

나노입자에 의한 히스톤의 라벨링

바람직한 실시양태에서, 히스톤의 라벨링은 생체내 라벨링된 히스톤에 의해 통상적으로 마주하는 조건 하에 실질적으로 비가역적이다. 통상적으로, 히스톤의 높은 아비디티 라벨링은 생체내 조건 하에 약 10% 미만의 해리가 있는 것이다. 발명의 명칭이 "Methods for radiolabelling macromolecules"인 2009년 4월 23일자 출원되고 WO 2009/129577 A1로 공개된 국제 특허 출원 제PCT/AU20O9/000508호는 폴리펩타이드와 같은 생물학적 마크로분자의 라벨링에 대한 방법을 기재하고 있다. 허용되는 정도로, PCT/AU2009/000508(WO 2009/129577)의 전체 내용은 본원에 참조문헌으로 포함된다.

PCT/AU2009/000508은 방사선 라벨링된 마크로분자를 나노입자를 사용하여 제조할 수 있는 방법을 기재하고, 본 발명자들은 탄소 케이지에서 금속 동위원소를 랩핑하여서, 특히 이것이 생체내 사용되게 될 때 특히 입자 및 따라서 마크로분자에 대한 귀중한 특성인 이의 외부 환경과의 접촉으로부터 이것이 물리적으로 분리되는 탄소 캡슐화 공정(PCT/AU2006/000554 참조)의 이점을 취한다. 방사선 라벨링된 마크로분자의 생체내 방사성 금속 이온의 침출 및 생체 흡수에 대한 잠재력은 실질적으로 실재하지 않는데, 왜냐하면 나노입자 복합체의 탄소 외부만이 생체내 생물학적 환경에 노출되기 때문이다.

PCT/AU2009/000508은 나노입자를 히스톤과 같은 다양이온으로 코팅할 수 있어서, 생성된 입자가 단단히 결합된 히스톤 뿐만 아니라 검출 가능한 방사성 라벨의 높은 비활성의 코어를 갖는 방법을 기재한다.

히스톤이 폐와 같은 기관과 갖는 특정한 생물학적 상호작용에 기초하여 생체내 소정의 부위에서 용이하게 검출 가능한 동위원소를 국부화하기 위해 방사선 라벨링된 히스톤을 사용할 수 있다. 예를 들면, 본원에 입증된 바대로, 송아지 흉선 히스톤과 복합체로 있는 Tc99m 나노입자는 폐 조직에 선택적이고, 피험체에게 투여될 때 감마 섬광조영술에 의해 가시화되는 것처럼 우선적으로 폐를 표적으로 한다. 이러한 방식으로, 폐에서의 히스톤 축적을 억제하는 후보물질 화합물의 능력을 시험하기 위한 스크리닝제로서 히스톤 코팅 나노입자를 사용할 수 있다.

나노입자를 사용하여 히스톤을 방사선 라벨링하기 위한 조건

히스톤을 방사선 라벨링하기 위해 PCT/AU2009/000508에 기재된 방법에서 이렇게 제조된 또는 얻은 나노입자를 사용할 수 있다.

소수성 계면, 예컨대 공기-물 계면, 탄화수소-물 계면 및 추론하자면 수성 나노입자 현탁액 중의 흑연-물 계면은 일반적으로 순수한 물 중의 히드록실 이온의 약간의 우위를 끌어당긴다. 결과는 이 계면이 약간 음으로 하전된 채 거동하지만, 표면 전위가 일반적으로 매우 낮다(수십 밀리볼트)는 것이다. 나노입자는 또한 이의 제조에서 사용되는 음이온성 계면활성제, 통상적으로 데옥시콜레이트의 흡착으로 인해 이의 표면에 증가된 음전하를 보유할 수 있다. 입자 및 마크로분자가 동일한 수성 배지에서 유사하게 음으로 하전된 경우, 이것은 전하의 이의 확산 2중 층이 중첩될 때 수십 나노미터 스케일로 약하게 서로 반발할 수 있다. 그러나, 예컨대 히스톤의 pI에서의 히스톤에 대한 순 전하가 실질적으로 0인 수성 배지의 pH의 선택은 이 전위를 매우 신속히 스크리닝하여 이 시스템에서의 마크로분자에 대한 입자의 흡착 및 응집에 대한 아주 적은 에너지 장벽을 제공한다. 10 ㎚ 미만의 Debye 길이에서의 이러한 스크리닝은 인력 분산, 이온 상관관계 또는 소수성 힘이 일반적으로 이 표면의 전체 상호작용 에너지를 지배하는 상황을 만들 것이다. 결과는 히스톤과 일단 결합된 입자가 실질적으로 비가역적인 방식으로 마크로분자에 집요하게 부착된다는 것이다. 이에 의해 이 조건은 히스톤 및 나노입자 복합체의 아비드 결합을 촉진한다. 바람직한 실시양태에서, 접촉이 일어나는 배지는 장거리 정전기 척력에 비해 이의 정도 및 양을 감소시킴으로써 나노입자와 히스톤 사이의 단거리 인력의 영향을 촉진하는 pH 및 전해질 농도를 포함할 수 있다. 성공적인 접촉의 결과로서, 마크로분자는 나노입자 복합체와 회합되거나 복합체화될 수 있는 것으로 기재될 수 있다. 생성된 집합체(entity)는 또한 복합체라 칭할 수 있다. 본 문맥에서의 용어 "복합체" 및 "복합체화된"은 단단히 결합되는 성공적인 접촉의 결과로서 일어날 수 있는 것 이외의 히스톤과 나노입자 복합체의 임의의 특정한 구조 배치를 포함하도록 의도되지 않는다는 것에 유의한다.

적합한 pH 및 바람직하게는 또한 적합한 전해질 농도의 조건 하에 나노입자 및 마크로분자를 접촉시킴으로써 히스톤을 라벨링하기 위해 나노입자를 사용할 수 있다. 상기 기재된 스크리닝 공정을 수월하게 하고 따라서 반발 정전력에 비해 우세한 단거리 인력이 가능하게 하는 적합한 용액 조건을 선택할 수 있어서, 나노입자는 마크로분자에 실질적으로 비가역적으로 결합하게 된다. 본원의 개시내용의 견지에서, 적절한, 그리고, 원하는 경우, 최적의, 결합 조건, 예컨대 pH 및 전해질 농도를 나노입자와 히스톤 사이의 원하는 접촉에 경험상 결정할 수 있는 것으로 이해된다.

접촉이 임의의 적합한 배지에서 일어날 수 있지만, 수성 배지가 일반적으로 바람직할 수 있다. 접촉 전에, 나노입자를 일반적으로 분산액의 안정성을 허용하도록 선택되는 적합한 저장 배지 중에 제조하거나 저장할 수 있다. 따라서, 나노입자의 분산액은 매우 낮은(예를 들면, 약 10 마이크로몰) 농도의 음이온성 계면활성제, 예컨대 나트륨 데옥시콜레이트를 포함할 수 있다. 본 발명의 접촉 단계의 방법 전에, 나노입자를 나노입자 및 히스톤의 결합을 선호하는 분산액의 조건을 조정하도록 전처리할 수 있다. 예를 들면, 완충제 유형, pH, 전해질 농도 및 유형, 계면활성제의 존재 또는 부재 및 나노입자를 비롯한 임의의 성분의 농도와 같은 조건을 조정할 수 있다. 배지의 pH 및 이온성 강도의 조정은 히스톤의 존재 또는 부재 하에 일어날 수 있다. 통상적으로, 배지의 pH 및 이온성 강도의 조정은, 나노입자의 존재 하에, 응집 및 덩어리 형성(clumping)을 야기하는 나노입자 사이만의 결합보다는 나노입자와 마크로분자 사이의 결합을 촉진하도록 마크로분자의 또한 존재에서 일어날 수 있다.

마크로분자의 pI 근처의 pH 및 단순한 전해질 NaCl의 적합한 농도의 이용을 통해 히스톤으로의 나노입자의 결합을 성취할 수 있고, 이는 약 1 mM NaCl 초과의 농도에서의 마크로분자로의 나노입자의 아비드 결합을 유도하는 데 효과적이다. 히스톤으로의 나노입자의 아비드 결합을 유도하기에 적절한 조건을 매우 다양한 전해질 중 임의의 1종 이상을 사용함으로써 성취할 수 있는 것으로 이해된다. 약 1 밀리몰 초과의 단순한 전해질 농도를 이용하여 히스톤으로의 나노입자의 아비드 결합을 유도하고, 따라서 나노입자가 방사성 미립자 코어를 갖는 경우, 방사선 라벨링된 히스톤의 제제를 제공할 수 있다. 일반적으로, 접촉을 위한 용액 또는 배지의 단순한 전해질 농도는 약 1 밀리몰 내지 약 200 밀리몰; 통상적으로, 약 10 밀리몰 내지 약 175 밀리몰; 약 20 밀리몰 내지 약 150 밀리몰; 약 50 밀리몰 내지 약 150 밀리몰 범위인 것으로 예상된다. 더 통상적으로, 용액의 전해질 농도는 약 1 밀리몰 내지 약 200 밀리몰; 통상적으로 약 10 밀리몰 내지 약 175 밀리몰; 약 20 밀리몰 내지 약 150 밀리몰; 약 40 밀리몰 내지 약 150 밀리몰; 약 50 밀리몰 내지 약 150 밀리몰; 약 75 밀리몰 내지 약 150 밀리몰; 약 90 밀리몰 내지 약 150 밀리몰; 약 100 밀리몰 내지 약 150 밀리몰; 약 150 밀리몰 범위인 것으로 예상된다. 당업자는 본 발명의 접촉 단계에 대한 전해질 용액 또는 배지의 이온 농도를 예를 들면 NaCl을 사용하여 성취할 수 있고, 적합한 이온 농도를 약 150 mM의 NaCl 농도 또는 예를 들면, 약 75 mM 미만의 MgS0₄ 농도로 성취할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 또한 전해질 용액의 적합한 이온성 강도를 NaCl과 MgS0₄의 혼합물과 같은 여러 상이한 이온성 종의 사용에 의해 성취할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 당업자는 이온성 강도를 1종 이상의 이온성 종 및 1종 이상의 비이온성 종 예컨대 삼투질 또는 고분자량 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜의 사용에 의해 성취할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 물의 유효 농도가 감소하는 경우, 전해질의 농도를 예를 들면 약 250 mM에서 증가시킬 필요가 있을 수 있다.

임의의 적합한 이온성 종을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이온성 종은 Na, Ni, Al, Ru, Pt, Os, Ir, Fe, Se, Sn, K, Te, Mn, Mo, V, Mg, Zn, Ca, Cu, Co의 염을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이온성 종은 통상적으로 Na, K, Ca와 같은 유효 농도에서 비독성인 것으로 제한될 것이다.

접촉 단계에서 사용되는 완충제는 반발 정전력을 억제함으로써 나노입자와 히스톤 사이의 단거리 인력을 촉진하기에 적합하도록 선택되는 임의의 적합한 pH를 가질 수 있다. 바람직하게는, 완충제는 약 pH 3 내지 약 pH 10 또는 초과, 약 pH 3 내지 약 pH 8, 약 pH 3.5 내지 약 pH 8.5, 약 pH 4 내지 약 pH 8, 약 pH 4.5 내지 약 pH 7.5, 약 pH 5 내지 약 pH 7의 범위일 수 있다. 더 바람직하게는, 접촉 단계의 pH, 예컨대 수성 배지의 pH는 폴리펩타이드와 같은 접촉에 사용되는 마크로분자의 pI에 근접할 것이다. 훨씬 더 바람직하게는, 접촉 단계의 pH는 실질적으로 접촉에서 사용되는 마크로분자의 pI에 있을 것있다. 본원에 기재된 바대로, 원하는 최적의 pH를 전해질(들) 유형 및 농도 및 마크로분자(들)과 같은 다른 반응 조건을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다.

접촉은 접촉 동안의 조건의 변경, 예컨대 접촉 동안의 항온처리의 온도의 증가 또는 감소, 또는 접촉 동안의 배지의 교반 또는 혼합의 증가 또는 감소를 포함할 수 있다.

방사선 라벨링된 히스톤을 접촉에 후속하는 1 이상의 정제 단계로 처리할 수 있다. 이는 라벨링되지 않은 마크로분자 및/또는 자유 나노입자 복합체로부터 방사선 라벨링된 마크로분자를 분리하는 것을 포함할 수 있다. 통상적인 반응에서, 접촉은, 접촉 단계의 수성 매질에서 미반응 성분, 통상적으로 히스톤에 부착되지 않은 나노입자 복합체의 비를 보유하면서, 방사선 라벨링된 히스톤을 제공하도록 히스톤에 대한 나노입자의 충분한 결합을 발생시킬 수 있다. 예를 들면, 비표적 기관으로의 혈류 수송과 같은 자유 나노입자 복합체가 해로울 수 있는 상황에서 미반응 성분의 제거가 바람직할 수 있다. 비결합 마크로분자의 제거가 달리 특정한 결합 부위, 예컨대 세포 수용체 또는 항원 부위에 대한 라벨링된 마크로분자와 경쟁하는 경우에 바람직하고, 이에 의해 영상화 능력 또는 스크리닝 감도를 감소시킨다. 미반응 성분의 제거는 부분, 실질적으로 완전 또는 완전할 수 있다. 이 문맥에서, "부분" 제거는 1종 이상의 미반응 또는 바람직하지 않은 성분의 임의의 양의 제거를 포함하는 것으로 이해되고, 더 통상적으로, 1종 이상의 미반응 또는 바람직하지 않은 성분의 약 80%, 90% 또는 95%까지의 제거 및 "완전한" 제거는 1종 이상의 미반응 또는 바람직하지 않은 성분의 약 95% 초과의 제거로 이해된다. 통상적으로, 미반응 또는 바람직하지 않은 성분의 95% 이상의 제거가 바람직하고, 미반응 또는 바람직하지 않은 성분의 약 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과의 제거가 더 바람직하다.

그러므로, 이 문맥에서의 "정제"에 대한 언급은 임의의 정도의 정제를 의미하는 것으로 의도되는 것으로 이해되고, 이에 의해 "정제" 단계 후의 방사선 라벨링된 마크로분자(또는 방사성 동위원소의 불활성 전구세포로 '라벨링된' 마크로분자)는 정제 단계 전과 비교하여 더 적은 불순물, 예컨대 접촉의 미반응 또는 바람직하지 않은 성분을 포함한다.

비결합 방사성 나노입자 또는 히스톤과 같은 미반응 또는 바람직하지 않은 성분으로부터 방사선 라벨링된 히스톤을 분리할 수 있는 임의의 방법을 정제 단계에서 이용할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 방사선 라벨링된 히스톤으로부터 1종 이상의 바람직하지 않은 성분을 세척하는 것을 포함할 수 있거나, 1종 이상의 바람직하지 않은 성분으로부터 방사선 라벨링된 히스톤을 추출하는 것을 포함할 수 있거나, 고속에서의 원심분리를 포함할 수 있거나, 이러한 단계의 조합을 포함할 수 있다.

히스톤과의 나노입자 복합체의 코팅 방법

탄소 캡슐화 방사성 핵종의 나노입자 복합체를 PCT/AU2006/000554에 따라 제조할 수 있다. 탄소 캡슐화 방사성 핵종(예를 들면, Tc-99m)을 포함하는 나노입자의 중성 또는 약간의 산성 pH의 안정한 수성 분산액을 제조할 수 있다. 나노입자의 분산액은 또한 살아 있는 피험체의 혈류와 상용성이고 이로 주사될 수 있는 매우 낮은(예를 들면, 10 마이크로몰) 농도의 음이온성 계면활성제, 나트륨 데옥시콜레이트를 포함할 수 있다(본원의 도 5 및 도 6 참조). 이 입자는 각각 라벨링 공급원으로서 수 만개 이상의 동위원소 원자를 운반할 수 있어서, 전통적인 라벨링 방법에 의해 얻을 수 있는 것을 초과한 매우 높은 수준의 비활성을 용이하게 얻을 수 있다. 모델 캡슐화된 방사성 동위원소로서의 Tc-99m과의 나노입자 복합체의 경우, 나노입자의 통상적인 제제를 원하는 경우, 수성 현탁액 2 ㎖ 중의 1 내지 30 mCi를 포함하도록 용이하게 제조할 수 있다. 주사 이동도 입자 크기(SMPS) 기술을 이용한 입자의 기상 특성으로부터, 이 현탁액이 약 50 ㎍의 나노입자 물질을 포함하여서, 600 mCi ㎎만큼 높거나, 22 GBq/㎎ 초과인 비활성이 얻어질 수 있다는 것을 볼 수 있다.

탄소 캡슐화 공정은 탄소 케이지에서 금속 동위원소를 랩핑하여서, 이것이 생체내 사용되게 될 때 특히 입자에 중요한 특성인 이의 외부 환경과의 접촉으로부터 이것이 물리적으로 분리된다. 생체내 방사성 금속 이온의 침출 및 생체 흡수에 대한 잠재력은 실질적으로 실재하지 않는다. 나노입자 복합체의 탄소 내부만이 생체내 생물학적 환경에 노출된다. 탄소가 흑연화 형태이므로, 이것은 자연 흡수 특성을 갖고, 이는 선택되는 폴리펩타이드에 대한 물리 흡착(physico-adsorption)에 대한 기초로서 사용할 수 있다. 그러나, 우선 폴리펩타이드의 부착을 선호하는 적절한 조건을 결정하는 것이 필요하고, 하기 연구 및 실시예는 이러한 조건이 어떻게 결정될 수 있는지를 예시한다.

나노입자 복합체는 이의 흑연화 표면을 비롯하여 소수성 또는 분산액 상호작용을 통해 높은 아비디티 결합을 할 수 있다. 흑연화 표면이 폴리펩타이드와 같은 마크로분자와의 소수성 상호작용을 형성하도록, 폴리펩타이드는 매우 가까운 범위로 흑연 표면에 접근하여, 결국 반발 정전력이 억제되는 것이 필요하게 만들어야 한다. 본 발명자들은 폴리펩타이드의 등전점 근처로 pH를 조정함으로써, 또는 적절한 농도의 전해질 반대이온에 의해 폴리펩타이드의 전하를 차폐함으로써 폴리펩타이드가 최소 표면 순 전하를 갖는 나노입자 제제에 제시될 때 이 조건이 만족될 수 있다는 것을 보여준다. 경험적인 결합 실험을 이용하여 적절한 결합 조건을 확립할 수 있다.

스크리닝 방법

본 발명은 1종 이상의 히스톤의 활성을 조절하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 후보물질 화합물과 히스톤의 상호작용이 가능하도록 적합한 조건 하에 히스톤과 후보물질 화합물의 접촉 및 히스톤의 활성 또는 활성 손실의 평가를 포함한다.

히스톤은 HI, H2A, H2B, H3, H4 또는 H5로부터 선택될 수 있다. 히스톤은 또한 송아지 흉선 히스톤과 같은 상이한 히스톤의 혼합물을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 히스톤의 변이체, 단편 및 유사체를 사용할 수 있다.

일 실시양태에서, 히스톤 결합 화합물을 스크리닝하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 시험 피험체에의 1종 이상의 방사선 라벨링된 히스톤의 투여에 이어 시험 피험체에의 1종 이상의 후보물질 화합물의 투여를 이용한다. 이후, 방사선 라벨링된 히스톤을 영상화하고 방사선 라벨링된 히스톤의 위치는 폐와 같은 기관에서의 히스톤 축적을 억제하는 후보물질 화합물의 능력의 평가가 가능하게 한다.

다른 실시양태에서, 후보물질 화합물을 방사선 라벨링된 히스톤 전에 또는 동시에 시험 피험체에게 투여할 수 있다. 대안적으로, 후보물질 혼합물을 시험 피험체에게 투여하기 전에 후보물질 화합물을 방사선 라벨링된 히스톤과 혼합할 수 있다.

단일 광자 단층 촬영(SPECT), 양전자 방출 단층 촬영(PET) 또는 감마 섬광조영술과 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의한 내부 영상화를 이용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 히스톤을 형광 염료 예컨대 FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트) 또는 양자 점으로 라벨링할 수 있다. 다른 실시양태에서, 히스톤을 생물발광 모이어티에 의해 라벨링할 수 있다. 따라서, 라벨링된 히스톤의 위치 및 농도를 생체내 결정할 수 있다.

이후, 당해 분야에 공지된 임의의 양상에 의한 영상화는 히스톤 축적을 억제하는 후보물질 화합물의 실패일 수 있는 조직 또는 기관 부위에서의 라벨링된 히스톤의 존재 또는 과풍부를 나타낼 수 있다. 유사하게, 시험 화합물의 부재 하의 대조 라벨링된 히스톤과 비교하여 조직 또는 기관에서의 라벨링된 히스톤의 풍부 하의 감소는 후보물질 화합물이 히스톤을 억제하고 조직 또는 기관에서의 축적을 방지한다는 것을 나타낸다.

정맥내 주사될 때, 라벨링되지 않은 나노입자 복합체가 세망내피계, 즉 간의 쿠퍼 세포와 같은 식세포에 의해 20 분 내의 순환으로부터 거의 완전히 제거할 수 있는 것에 유의해야 한다. 따라서, 간, 비장 및 골수에서의 라벨링된 히스톤의 존재 또는 과풍부는 예를 들면 폐에 대한 히스톤 결합을 억제하는 후보물질 화합물로 인할 수 있는 세망내피계에 의한 순환하는 나노입자의 신속한 청소율(clearance)을 나타낼 수 있다.

히스톤, 이의 변이체, 단편 및 유사체는 이 분자와 상호작용하는 화합물 및 물질의 스크리닝 및 확인에 유용하다. 특히, 바람직한 화합물은 이 분자의 활성을 조절하는 것이다. 히스톤, 이의 변이체, 단편 및 유사체의 기능을 억제함으로써 이러한 화합물은 조절 효과를 발휘할 수 있다. 추가로, 히스톤, 이의 변이체, 단편 및 유사체는 히스톤의 분해를 촉진하는 화합물 및 물질의 스크리닝 및 확인에 유용하다. 적합한 화합물은 간접(예를 들면, 결합) 또는 직접 상호작용에 의해 이의 효과를 발휘할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로 적합한 화합물은 히스톤, 이의 변이체, 단편 및 유사체와 다른 단백질 또는 펩타이드의 상호작용을 조절함으로써 이의 효과를 발휘할 수 있다.

결합하거나, 그렇지 않으면 히스톤과 상호작용하는 화합물 및 특별히 이의 활성을 조절하거나 이의 분해를 촉진하는 화합물을 다양한 적합한 방법에 의해 확인할 수 있다. 비제한적인 방법으로 공면역침강법, 면역학 기반 검출 방법, 예컨대 웨스턴 블로팅, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 이동도 검정, 질량 분석법, 탠덤(tandem) 친화도 정제, 파지 디스플레이, 라벨 전달, 단백질 마이크로어레이를 들 수 있다.

추가로, 결합하거나, 그렇지 않으면 히스톤과 상호작용하고 활성을 조절하거나 히스톤의 분해를 촉진하는 후보물질 화합물의 능력을 히스톤의 기능에 대한 이 후보물질 화합물의 효과에 의해 평가할 수 있다. 그 기능을 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 측정할 수 있다.

친화성 크로마토그래피

후보물질 또는 복수의 후보물질들이 히스톤 또는 이의 변이체 또는 단편과 상호작용하거나 결합하는지를 결정하기 위해 친화성 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 예를 들면, 히스톤, 이의 변이체, 단편 또는 유사체를 칼럼 위를 통과한 혼합물로 또는 단독으로 지지체(예컨대, 세파로스) 및 후보물질 화합물에 고정화할 수 있다. 이후, 고정화된 히스톤 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 단편에 대한 화합물 결합을 칼럼으로부터 용리시키고 예를 들면 질량 분석법에 의해 확인할 수 있다.

이런 방식으로, 히스톤, 이의 변이체, 단편 또는 유사체와 직접 상호작용하지 않는 단백질 또는 다른 화합물을 확인할 수 있다. 예를 들면, 히스톤과 직접 상호작용하는 화합물은 결국 히스톤과의 직접 상호작용 없이 히스톤 활성을 조절할 수 있는 물질과 회합될 수 있다. 화합물 및 회합제의 복합체와 고정화된 히스톤 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 단편과의 상호작용은 히스톤과의 직접 상호작용 없이 히스톤 활성을 조절할 수 있는 화합물의 확인을 수월하게 할 것이다.

히스톤 활성의 잠재적 조절제를 당업자에게 공지된 다수의 기술에 의해 상기 방법에 의해 스크리닝을 위해 생성할 수 있다. 예를 들면, X선 결정학 및 핵 자기 공명 분광법과 같은 방법을 이용하여 히스톤, 변이체 단편 또는 이의 유사체의 구조를 모델링하여, 컴퓨터 기반 모델링을 이용하여 잠재적 조절제의 설계를 수월하게 할 수 있다. 잠재적 조절제를 생성하기 위해 다양한 형태의 결합 화학(combinatorial chemistry)을 또한 사용할 수 있다.

히스톤, 이의 변이체, 단편 또는 유사체를 결합하거나, 그렇지 않으면 상호작용하는 능력에 대해 후보물질 화합물을 검정하기 위해 고속(high-throughput) 스크린으로 사용할 수 있다. 효소 활성에 대한 화합물의 효과를 결정하기 위해 이 후보물질 화합물을 기능성 히스톤, 변이체 단편 또는 이의 유사체에 대해 추가로 스크리닝할 수 있다.

면역학적 방법

후보물질 또는 복수의 후보물질들이 히스톤 또는 이의 변이체 또는 단편과 상호작용하거나 결합하는지를 결정하기 위해 면역학적 방법을 이용할 수 있다. 일 실시양태에서, 히스톤 또는 이의 변이체 또는 단편과 상호작용하거나 결합하는지를 결정하기 위해 면역침강법을 이용하기 전에 히스톤 또는 이의 변이체 또는 단편을 1종 이상의 후보물질 화합물과 접촉시킬 수 있다. 이러한 기술을 이용하여, 통상적으로 각각의 용액을 혼합함으로써 1종 이상의 후보물질 화합물을 히스톤 또는 변이체 또는 단편과 접촉시킬 수 있다. 이후, 이 혼합물(샘플)을 예를 들면 고체 지지체에 부착된 항체-결합 단백질에 의한 포획에 의해 용액으로부터 면역침강될 수 있는 히스톤 또는 후보물질 화합물 중 어느 1종에 특정한 항체와 항온처리할 수 있다. 이 방법에 의한 단백질의 면역침강법은 이 단백질과 회합된 물질의 공면역침강법이다. SDS-PAGE, 웨스턴 블로팅 및 질량 분석법(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 당해 분야에 공지된 다수의 방법을 이용하여 회합된 물질의 확인을 확립할 수 있다.

후보물질 화합물 또는 히스톤에 특정한 항체를 지지체에 고정화할 수 있다. 히스톤과 회합된 후보물질 화합물을 검출하는 것은 통상적으로 고정화된 항체와 히스톤 또는 후보물질 화합물 사이의 결합에 적합한 조건 하에 히스톤과 회합된 후보물질 화합물을 추정상 포함하는 샘플과 고정화된 항체를 접촉시키는 것 및 지지체를 적합한 시약으로 세정하여 비결합 샘플을 제거하는 것을 포함한다. 후속하여, 히스톤과 회합된 후보물질 화합물을 추정상 포함하는 결합 샘플을 예를 들면 변성제로 세정함으로써 용리시킬 수 있고, SDS-PAGE, 웨스턴 블로팅 및 질량 분석법(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 당해 분야에 공지된 다수의 방법을 이용하여 결합 샘플의 성분의 동일성을 확립할 수 있다.

항체는 직접 결합에 의해 지지체에 고정화되거나 1종 이상의 추가의 화합물을 통해 지지체에 간접적으로 결합될 수 있다. 적합한 지지체의 비제한적인 예로는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 또는 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 막(예를 들면, 니트로셀룰로스 막), 비즈/디스크(자기 비드 및 디스크 포함) 및 미립자 물질, 예컨대 여과지, 니트로셀룰로스 막, 세파로스, 아가로스, 가교결합 덱스트란 및 다른 폴리사카라이드로부터 제조된 시험관 또는 검정 플레이트(예를 들면, 미량적정 플레이트)를 들 수 있다.

특정한 실시양태에서, 히스톤 또는 이의 변이체 또는 단편과 상호작용하거나 결합하는 후보물질 또는 복수의 후보물질의 검출을 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA)으로서 수행한다. 일반적으로, 검정은 고체 지지체, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등과 같은 물질로부터 제조된 미량적정 플레이트 또는 칼럼의 웰에의 적합한 포획 시약의 코팅을 포함한다. 일 실시양태에서, 항히스톤 항체를 포획 시약으로서 사용한다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 후보물질 화합물을 고체 지지체에 코팅하여 포획 시약을 제조한다. 추가의 실시양태에서, 포획 시약은 헤파린, 헤파란 설페이트, 소 혈청 알부민 공액 헤파란 설페이트, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(예를 들면, 퍼레칸), 포유동물 세포 등일 수 있다. 다른 실시양태에서, 히스톤을 포획 시약으로서 사용할 수 있다.

포획 시약은 예를 들면 비공유 또는 공유 상호작용 또는 물리적 결합에 의해 지지체의 표면에 연결될 수 있다. 공유 결합을 사용하는 경우, 가교결합제를 사용하여 포획 시약을 지지체(예를 들면, 글루타르알데하이드, N-히드록시-숙신이미드 에스테르, 2작용성 말레이미드)에 부착시킬 수 있다.

지지체를 차단제(예를 들면, 탈지 우유, 소 혈청 알부민, 카제인, 에그 알부민)로 처리하여 지지체의 표면 위의 초과 부위로의 물질의 원치않는 결합을 방지할 수 있다.

샘플을 코팅 및 차단 이후 지지체의 표면에 투여할 수 있다. 일반적으로, 샘플을 적합한 완충제를 사용하여 적절한 수준으로 희석시킨다. 샘플 희석 정도 및 적절한 완충제의 선택은 분석 중인 샘플 및 검정에서 사용되는 포획 시약 및 지지체의 유형과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 이를 당업자가 본 발명의 노력 없이 결정할 수 있다.

포획 시약으로 코팅된 지지체에 도포되면, 샘플을 일반적으로 검정의 감도를 최대화하고 해리를 최소화하기에 적합한 조건 하에 항온처리한다. 항온처리를 약 0℃ 내지 약 40℃ 범위, 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 30℃ 범위의 일반적으로 일정한 온도에서 수행할 수 있다. 항온처리 혼합물의 pH는 약 4 내지 약 10 범위, 바람직하게는 약 6 내지 약 9 범위, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 8 범위일 수 있다. 일 실시양태에서, 항온처리 혼합물은 pH 7.4에 있다. 다양한 완충제를 사용하여 항온처리 동안 표적 pH를 성취하고 이를 유지시킬 수 있고, 이의 비제한적인 예로는 트리스-포스페이트, 트리스-HCl, 보레이트, 포스페이트, 아세테이트 및 카보네이트를 들 수 있다. 항온처리 시간은 일반적으로 온도와 관련되고, 비특이적 결합을 피하기 위해 약 12 시간 미만일 수 있다. 바람직하게는, 항온처리 시간은 실온에서 약 0.5 시간 내지 약 3 시간, 더 바람직하게는 약 0.5 시간 내지 약 1.5 시간이다.

항온처리 후, 생물학적 샘플을 고정화된 포획 시약으로부터 제거하여, 예를 들면 지지체를 세척/세정함으로써 비결합 샘플을 제거할 수 있다. 적합한 세척 완충제의 pH는 약 6 내지 약 9 범위, 바람직하게는 약 7 내지 약 8 범위일 수 있다. 세척/세정을 3 시간 이상 수행할 수 있다. 세척/세정을 일반적으로 약 0℃ 내지 약 40℃의 온도, 바람직하게는 약 4℃ 내지 약 30℃의 온도에서 세척 완충제를 사용하여 수행할 수 있다.

후속 단계에서, 포획 시약에 결합된 샘플의 고정화된 성분을 검출 시약과 접촉시킬 수 있다. 검출 가능한 시약의 선택은 사용되는 포획 시약 및 분석 중인 샘플 유형을 포함하는 인자에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 포획 시약에 결합된 샘플의 고정화된 분자를 약 20℃ 내지 약 40℃의 온도에서, 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 25℃의 온도에서 검출 시약과 접촉시킨다. 일 실시양태에서, 포획 시약에 결합된 샘플의 고정화된 분자를 실온(RT)에서 약 1 시간 동안 검출 시약과 접촉시킨다. 검출 시약은 항체일 수 있다. 검출 가능한 시약이 항체인 적용에서, 지지체에 고정화된 샘플의 분자의 최대 농도와 관련하여 항체의 몰 초과량이 바람직하다. 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능할 수 있다. 항체는 비색 라벨 또는 형광광도 라벨을 가질 수 있다. 검출 시약에 결합하는 추가의 항체를 사용할 수 있다. 추가의 항체는 비색 라벨 또는 형광광도 라벨을 가질 수 있다.

포획 시약에 결합된 샘플의 존재 및 수준의 결정을 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 성취할 수 있고, 사용된 검출 시약에 따라 결정할 수 있다. 예를 들면, 검출은 비색법, 화학발광 또는 형광광도법을 포함할 수 있다. 검출 및 정량 측정을 대조 샘플로부터 유도된 배경 신호와 비교하여 검출 시약(들)으로부터 유도된 신호에 기초하여 수행할 수 있다.

패혈증의 치료

패혈증의 치료는 통상적으로 예를 들면 항생제 치료에 의한 병증의 기본적인 원인의 치료를 포함한다. 활성화 단백질 C(APC)와 같은 대안적인 치료가 개발되었지만, 이는 치료제의 항응고 특성 또는 패혈증의 신속한 진행에 비해 느린 작용 방식으로 인해 임상적인 영향을 거의 미치지 않는다.

히스톤 독성은 최근에 패혈증에서의 내피 세포 기능장애, 기관 부전 및 사망의 매개자로서 확인되었다. 본 발명자들은 무시할만한 항응고 특성을 가질 수 있는 올리고사카라이드 다음이온이 살아 있는 동물의 순환시 히스톤과 복합체를 형성할 수 있고 기관에서의 히스톤 축적을 방지할 수 있다는 것을 발견하였다. 이는 통상적으로 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 1종 이상의 다음이온의 투여를 포함하는 패혈증의 치료에 대한 기본을 제공한다.

조성물, 투약량 및 투여 경로

본 발명에서 사용되는 다음이온(들)을 치료학적으로 또는 예방학적으로 조성물로서 투여할 수 있다. 치료 용도에서, 조성물을 질환 및/또는 이의 합병증을 해결하거나 부분적으로 정지시키거나, 환자의 생존을 개선하기에 충분한 양으로 이미 질환(예를 들면, 패혈증)을 앓고 있는 피험체에게 투여한다.

일반적으로, 적합한 조성물을 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조할 수 있고 따라서 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다.

투여 가능한 조성물을 제조하는 방법은 당업자에게 명확하고, 예를 들면 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (본원에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)]에 더 자세히 기재되어 있다.

다음이온은 약학적으로 허용되는 염으로서 존재할 수 있다. "약학적으로 허용되는 염"이란, 합당한 의학적 판단의 범위 내에, 부적합한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합당한 이익/위험 비에 알맞은 염을 의미한다. 약학적으로 허용되는 염은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

임의의 특정한 피험체에 대한 본원에 개시된 치료학적 유효량의 다음이온은 패혈증의 중증도; 사용되는 조성물의 활성; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 성별 및 식이; 투여 시간; 투여 경로; 조성물의 제거 속도; 치료 기간; 배합물로 사용되거나 의학에서 널리 공지된 다른 관련 인자와 함께 치료와 일치하는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.

당업자는, 일상적인 실험에 의해, 본 발명의 방법의 원하는 결과를 성취하는 데 필요한 제제의 성분의 비독성 유효량을 결정할 수 있을 것이다.

일반적으로, 다음이온의 유효 투약량은 약 0.0001 ㎎ 내지 약 1000 ㎎/체중(㎏)/24 시간; 통상적으로, 약 0.001 ㎎ 내지 약 750 ㎎/체중(㎏)/24 시간; 약 0.01 ㎎ 내지 약 500 ㎎/체중(㎏)/24 시간; 약 0.1 ㎎ 내지 약 500 ㎎/체중(㎏)/24 시간; 약 0.1 ㎎ 내지 약 250 ㎎/체중(㎏)/24 시간; 약 1.0 ㎎ 내지 약 250 ㎎/체중(㎏)/24 시간 범위인 것으로 예상된다. 더 통상적으로, 유효 용량 범위는 약 1.0 ㎎ 내지 약 200 ㎎/체중(㎏)/24 시간; 약 1.0 ㎎ 내지 약 100 ㎎/체중(㎏)/24 시간; 약 1.0 ㎎ 내지 약 50 ㎎/체중(㎏)/24 시간; 약 1.0 ㎎ 내지 약 25 ㎎/체중(㎏)/24 시간; 약 5.0 ㎎ 내지 약 50 ㎎/체중(㎏)/24 시간; 약 5.0 ㎎ 내지 약 20 ㎎/체중(㎏)/24 시간; 약 5.0 ㎎ 내지 약 15 ㎎/체중(㎏)/24 시간 범위인 것으로 예상된다.

대안적으로, 다음이온의 유효 투약량은 약 500 ㎎/㎡까지일 수 있다. 일반적으로, 유효 투약량은 약 25 내지 약 500 ㎎/㎡, 바람직하게는 약 25 내지 약 350 ㎎/㎡, 더 바람직하게는 약 25 내지 약 300 ㎎/㎡, 추가로 더 바람직하게는 약 25 내지 약 250 ㎎/㎡, 훨씬 더 바람직하게는 약 50 내지 약 250 ㎎/㎡, 추가로 훨씬 더 바람직하게는 약 75 내지 약 150 ㎎/㎡ 범위인 것으로 예상된다.

추가로, 개별 투약량의 최적 분량 및 간격이 치료되는 패혈증의 성질 및 정도, 투여의 형태, 경로 및 부위 및 치료되는 특정한 개인의 성질에 의해 결정될 것이라는 것이 당업자에게 명확할 것이다. 또한, 이러한 최적 조건을 종래의 기법에 의해 결정할 수 있다. 몇몇 치료 용도에서, 치료는 패혈증의 기간에 대한 것일 것이다.

치료의 최적 과정, 예컨대 시간 또는 일의 한정된 수 동안 시간 또는 일마다 주어지는 다음이온의 용량의 수를 치료 결정 시험의 종래의 과정을 이용하여 당업자가 알아낼 수 있다는 것이 당업자에게 또한 명확할 것이다.

일반적으로, 적합한 조성물을 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조할 수 있고 따라서 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다.

편리한 투여 방식은 주사(피하, 정맥내, 동맥내 등), 경구 투여, 비강내 또는 흡입을 포함한다. 투여 경로에 따라, 제제 및/또는 다음이온을 화합물의 치료 활성을 불활성화할 수 있는 효소, 산 및 다른 자연 조건의 작용으로부터 다음이온을 보호하기 위한 물질로 코팅할 수 있다. 다음이온을 또한 비경구로 또는 복강내로 투여할 수 있다.

다음이온(들)의 분산액을 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 및 오일 중에서 제조할 수 있다. 저장 및 사용의 일상적인 조건 하에, 약학 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 포함할 수 있다.

주사에 적합한 약학 조성물은 무균 주사용수 또는 분산액의 즉각적 제조를 위한 무균 수성 용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 무균 분말을 포함한다. 이상적으로는, 조성물은 제조 및 저장의 조건 하에 안정하고 박테리아 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 조성물을 안정화하기 위한 보존제를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에서, 다음이온(들)을 예를 들면 불활성 희석제 또는 동화 가능한 섭취 가능한 담체와 경구로 투여할 수 있다. 다음이온(들) 및 다른 성분을 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉합하거나, 정제로 압축하거나, 개인의 식사에 직접 혼입할 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 다음이온(들)을 부형제와 혼입할 수 있고, 섭취용 정제, 협측 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭시르제, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용할 수 있다. 적합하게는, 이러한 조성물 및 제제는 적어도 1 중량%의 활성 다음이온을 포함할 수 있다. 약학 조성물 및 제제 중의 다음이온의 백분율은, 물론, 변할 수 있고, 예를 들면 편리하게는 투약량 단위의 중량의 약 2% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 75%, 약 15% 내지 약 65%; 약 20% 내지 약 60%, 약 25% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 45%, 또는 약 35% 내지 약 45%, 범위일 수 있다. 치료학적으로 유용한 조성물 중의 다음이온의 양은 적합한 투약량이 얻어질 수 있는 것이다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 다음이온을 리포솜 형태로 투여할 수 있다. 리포솜은 일반적으로 인지질 또는 다른 지질 물질로부터 유래하고, 수성 배지 중에 분산된 1층형 또는 다층형 수화된 액체 결정에 의해 형성된다. 리포솜을 형성할 수 있는 임의의 비독성이고, 생리학적으로 허용되고, 대사 가능한 지질을 사용할 수 있다. 리포솜 형태의 조성물은 안정화제, 보존제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 바람직한 지질은 인지질 및 포스파티딜 콜린(레시틴)(둘 다 천연 및 합성)이다. 리포솜을 형성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 이 특정 참조문헌과 관련하여 문헌[Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq. (이의 내용이 본원에 참조문헌으로 포함됨)]에 기재되어 있다.

"약학적으로 허용되는 담체"라는 말은 용매, 분산 배지, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함하도록 의도된다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 예로는 탈염수 또는 증류수; 식염수; 땅콩유, 홍화유, 올리브유, 면실유, 옥수수유, 참깨유, 아라키스유 또는 코코넛 오일과 같은 식물성 오일; 메틸 폴리실록산, 페닐 폴리실록산 및 메틸페닐 폴리실록산과 같은 폴리실록산을 포함하는 실리콘 오일; 휘발성 실리콘; 광유, 예컨대 액체 파라핀, 연질 파라핀 또는 스쿠알란; 셀룰로스 유도체 예컨대 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 또는 히드록시프로필메틸셀룰로스; 저급 알칸올, 예를 들면 에탄올 또는 이소-프로판올; 저급 아르알칸올; 저급 폴리알킬렌 글리콜 또는 저급 알킬렌 글리콜, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 글리세린; 지방산 에스테르 예컨대 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 미리스테이트 또는 에틸 올레이트; 폴리비닐피리돈; 한천; 트라가칸스 검 또는 아카시아 검 및 바셀린을 들 수 있다. 통상적으로, 담체 또는 담체들은 조성물의 10 내지 99.9 중량%를 형성할 것이다.

약학적으로 활성 물질에 대한 이러한 약제 및 제제의 사용은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 종래의 약제 및 제제가 다음이온과 불상용인 경우를 제외하고, 치료 조성물 및 치료 방법 및 예방책에서의 이의 사용이 고려된다. 보충적 활성 화합물을 또한 본 발명에 따른 조성물에 도입할 수 있다. 투여 용이성 및 투약량의 균일성을 위해 투약량 제형으로 비경구 조성물을 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 "투약량 제형"은 치료되는 개인에 대한 단일의 투약량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하고; 소정 분량의 다음이온(들)을 포함하는 각각의 단위는 원하는 약학 담체와 관련하여 원하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산한다. 다음이온(들)을 허용되는 투약량 단위로 적합한 약학적으로 허용되는 담체와 유효량으로 편리하고 효과적인 투여를 위해 제제화할 수 있다. 보충적 활성 성분을 포함하는 조성물의 경우, 투약량을 상기 성분의 투여 방식 및 일반 용량을 참조하여 결정한다.

일 실시양태에서, 담체는 경구로 투여 가능한 담체일 수 있다.

약학 조성물의 다른 형태는 경구 투여에 적합한 장내 코팅 과립, 정제 또는 캡슐로서 제제화되는 투약량 형태이다.

본 발명의 범위 내에 또한 지연 방출 제제가 포함된다.

다음이온을 또한 "프로드럭" 형태로 투여할 수 있다. 프로드럭은 활성 형태로 생체내 변형되는 화합물의 비활성 형태이다. 적합한 프로드럭은 다음이온의 활성 형태의 에스테르, 포스포네이트 에스테르 등을 포함한다.

경구 사용에 적합한 담체, 희석제, 부형제 및 부형제의 몇몇 예로는 땅콩유, 액체 파라핀, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 아카시아 검, 트라가칸스 검, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 젤라틴 및 레시틴을 들 수 있다. 또한, 이 경구 제제는 적합한 착향제 및 착색제를 포함할 수 있다. 캡슐 형태로 사용될 때, 캡슐을 붕괴를 지연시키는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 화합물로 코팅할 수 있다.

일 실시양태에서, 화합물을 주사에 의해 투여할 수 있다. 주사용수의 경우, 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 미생물 작용의 예방을 다양한 항박테리아제 및 또는 항진균제를 포함함으로써 성취할 수 있다. 적합한 제제는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 벤질 알콜, 아스코르브산, 티오메로살 등을 들 수 있다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들면 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 내에 포함시킴으로써 주사용 조성물의 흡수 연장이 발생할 수 있다.

상기 열거된 성분 중 하나 또는 이의 조합으로 적절한 용매 중에 필요한 양으로 다음이온을 도입하고, 필요한 바대로, 이후 무균 여과시켜 무균 주사용수를 제조할 수 있다. 일반적으로, 유사체를 염기성 분산 배지 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 포함하는 무균 비히클로 도입함으로써 분산액을 제조한다.

정제, 트로키제, 환제, 캡슐 등은 또한 결합제, 예컨대 트라가칸스 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 인산이칼슘; 붕괴제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 활택제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트; 및 감미료, 예컨대 수크로스, 락토스 또는 사카린 또는 착향제, 예컨대 페퍼민트, 윈터그린 오일 또는 체리 착향제를 포함할 수 있다. 투약량 제형이 캡슐일 때, 이것은, 상기 유형의 물질 이외에, 액체 담체를 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질은 코팅으로서 존재하거나, 그렇지 않으면 투약량 단위의 물리적 형태를 변경하기 위해 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제, 또는 캡슐을 쉘락, 당 또는 둘 다로 코팅할 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르제는 유사체, 감미료로서의 수크로스, 보존제로서의 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 착향제, 예컨대 체리 또는 오렌지 향을 포함할 수 있다. 물론, 임의의 투약량 제형을 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 이용되는 양에서 약학적으로 순수하고 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 유사체를 서방 제제 및 제조물로 혼입할 수 있다.

약학 조성물은 산 가수분해를 최소화하기 위한 적합한 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 완충제는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 인산염, 시트르산염, 탄산염 및 이의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 단일 또는 다중 투여를 수행할 수 있다. 당업자는, 일상적인 실험에 의해, 다음이온의 효과적인 비독성 투약량 수준 및/또는 및 패혈증을 치료하는 데 적합한 투여 패턴을 결정할 수 있을 것이다.

조합 섭생

조합 섭생을 통해 치료 이점을 실현할 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 다음이온을 패혈증의 치료에 대한 조합 치료 접근법의 일부로서 투여할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 조합 치료에서, 각각의 제제를 동시에 또는 임의의 순서로 연속하여 투여할 수 있다. 연속하여 투여할 때, 성분을 동일한 경로로 투여하는 것이 바람직할 수 있다.

대안적으로, 성분을 조합 생성물로서의 단일 투약량 단위로 함께 제제화할 수 있다. 본 발명의 조성물과 조합하여 사용할 수 있는 적합한 제제가 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명에 따른 치료 방법을 종래의 치료와 함께 적용할 수 있다. 종래의 치료는 또한 소염제, 항생제, 항바이러스제, 항진균제 또는 APC의 사용과 같은 의학적 중재의 다른 형태의 투여를 포함할 수 있다.

소염제의 예로는 스테로이드, 코티코스테로이드, COX-2 억제제, 비스테로이드성 소염제(NSAID), 아스피린 또는 이들의 임의의 조합을 들 수 있다.

항생제의 예로는 아미노글리코시드, 안사마이신, 카바세펨, 카바페넴, 세팔로스포린, 글리코펩타이드, 린코사미드, 마크롤라이드, 모노박탐, 페니실린, 폴리펩타이드, 퀴놀론 설폰아미드 및 테트라사이클린을 들 수 있다.

항바이러스제의 예로는 비뉴클레오사이드 역전사효소 억제제, 뉴클레오사이드 역전사효소 억제제(예를 들면, 뉴클레오사이드 유사체), 프로테아제 억제제 및 뉴클레오티드 유사체 역전사효소 억제제를 들 수 있다.

항진균제의 예로는 이미다졸, 트리아졸, 티아졸, 알릴아민 및 에키노칸딘을 들 수 있다.

본원에 개시된 다음이온을 치료학적으로 또는 예방학적으로 투여할 수 있다. 치료 용도에서, 화합물 및 조성물을 패혈증 및 이의 증상 및/또는 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 패혈증을 이미 앓고 있는 환자에게 투여할 수 있다. 화합물 또는 조성물은 환자를 효과적으로 치료하기에 충분한 활성 화합물의 분량을 제공해야 한다.

예를 들면, 패혈증을 진행시킬 위험에 있는 환자에서 패혈증이 임상적으로 뚜렷해 지기 전에 본원에 개시된 다음이온을 환자에게 투여할 수 있다.

담체 , 희석제, 부형제 및 부형제

담체, 희석제, 부형제 및 부형제는 조성물의 다른 성분과 상용성이고, 이의 수여자에게 해롭지 않다는 점에서 "허용되어야" 한다. 이러한 담체, 희석제, 부형제 및 부형제를 본 발명의 조성물의 통합성 및 반감기를 증대시키기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 생물학적 활성을 증대시키거나 보호하기 위해 이를 또한 사용할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 예로는 탈염수 또는 증류수; 식염수; 땅콩유, 홍화유, 올리브유, 면실유, 옥수수유, 참깨유, 아라키스유 또는 코코넛 오일과 같은 식물성 오일; 메틸 폴리실록산, 페닐 폴리실록산 및 메틸페닐 폴리실록산과 같은 폴리실록산을 포함하는 실리콘 오일; 휘발성 실리콘; 광유, 예컨대 액체 파라핀, 연질 파라핀 또는 스쿠알란; 셀룰로스 유도체 예컨대 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 또는 히드록시프로필메틸셀룰로스; 저급 알칸올, 예를 들면 에탄올 또는 이소-프로판올; 저급 아르알칸올; 저급 폴리알킬렌 글리콜 또는 저급 알킬렌 글리콜, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 글리세린; 지방산 에스테르 예컨대 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 미리스테이트 또는 에틸 올레이트; 폴리비닐피롤리돈; 한천; 트라가칸스 검 또는 아카시아 검 및 바셀린을 들 수 있다. 통상적으로, 담체 또는 담체들은 조성물의 10 내지 99.9 중량%를 형성할 것이다.

담체는 또한 본 발명의 화합물에 공유 결합된 화학 화합물 또는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 생물학적 및 화학적 담체를 표적으로의 화합물의 전달을 증대시키거나 화합물의 치료 활성을 증대시키기 위해 사용할 수 있다. 융합 단백질의 제조를 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 Ausubel 등의 문헌(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987) 및 Sambrook 등의 문헌(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 제3 Edition 2001)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물은 주사에 의한 투여에 적합한 형태, 경구 섭취에 적합한 제제 형태(예컨대 캡슐, 정제, 캐플릿, 엘릭시르제, 예를 들면), 국소 투여에 적합한 연고, 크림 또는 로션 형태, 점안액으로서의 전달에 적합한 형태, 비강내 흡입 또는 경구 흡입과 같은 흡입에 의한 투여에 적합한 에어로졸 형태, 비경구 투여에 적합한 형태, 즉 피하, 근육내 또는 정맥내 주사일 수 있다.

주사용수 또는 현탁액으로서의 투여를 위해, 비독성 비경구로 허용되는 희석제 또는 담체는 링거액, 등장 식염수, 인산염 완충 식염수, 에탄올 및 1,2 프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다.

경구 사용에 적합한 담체, 희석제, 부형제 및/또는 부형제의 몇몇 예는 땅콩유, 액체 파라핀, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 아카시아 검, 트라가칸스 검, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 젤라틴 및 레시틴을 포함한다. 또한, 이 경구 제제는 적합한 착향제 및 착색제를 포함할 수 있다. 캡슐 형태로 사용될 때, 붕괴를 지연시키는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 화합물로 캡슐을 코팅할 수 있다.

경구 투여를 위한 고체 형태는 인간 및 수의 약학 실행에서 허용되는 결합제, 감미료, 붕괴제, 희석제, 착향제, 코팅제, 보존제, 활택제 및/또는 시간 지연제를 포함할 수 있다. 적합한 결합제는 아카시아 검, 젤라틴, 옥수수 전분, 트라가칸스 검, 나트륨 알기네이트, 카복시메틸셀룰로스 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적합한 감미료는 수크로스, 락토스, 글루코스, 아스파탐 또는 사카린을 포함한다. 적합한 붕괴제는 옥수수 전분, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 구아 검, 크산탄 검, 벤토나이트, 알긴산 또는 한천을 포함한다. 적합한 희석제는 락토스, 소르비톨, 만니톨, 덱스트로스, 카올린, 셀룰로스, 탄산칼슘, 규산칼슘 또는 인산이칼슘을 포함한다. 적합한 착향제는 페퍼민트 오일, 윈터그린, 체리, 오렌지의 오일 또는 라즈베리 착향제를 포함한다. 적합한 코팅제는 아크릴산 및/또는 메타크릴산 및/또는 이의 에스테르의 중합체 또는 공중합체, 왁스, 지방 알콜, 제인, 쉘락 또는 글루텐을 포함한다. 적합한 보존제는 나트륨 벤조에이트, 비타민 E, 알파-토코페롤, 아스코르브산, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤 또는 아황산나트륨을 포함한다. 적합한 활택제는 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 나트륨 올레이트, 염화나트륨 또는 탈크를 포함한다. 적합한 시간 지연제는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 포함한다.

경구 투여를 위한 액체 형태는, 상기 물질 이외에, 액체 담체를 포함할 수 있다. 적합한 액체 담체는 물, 오일 예컨대 올리브유, 땅콩유, 참깨유, 해바라기유, 홍화유, 아카리스유, 코코넛유, 액체 파라핀, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 글리세롤, 지방 알콜, 트리글리세라이드 또는 이의 혼합물을 포함한다.

경구 투여를 위한 현탁액은 분산제 및/또는 현탁제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 현탁제는 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 폴리-비닐-피롤리돈, 나트륨 알기네이트 또는 아세틸 알콜을 포함한다. 적합한 분산제는 레시틴, 스테아르산과 같은 지방산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노- 또는 디-올레이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노- 또는 디-올레이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트 등을 포함한다. 경구 투여를 위한 유화제는 1종 이상의 유화제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 유화제는 상기 예시된 분산제 또는 천연 검, 예컨대 구아 검, 아카시아 검 또는 트라가칸스 검을 포함한다.

치료 시기

당업자는 다음이온을 단일 물질로서 또는 진단시 패혈증의 치료에 대한 조합 치료 접근법의 일부로서 또는 이후 후속하여, 예를 들면, 패혈증에 현재 이용 가능한 치료에 대한 보안으로서 추적 치료 또는 공고 치료로서 투여할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 패혈증의 높은 위험에 있는 것으로 알려진 환자를 또한 패혈증의 진행에 대해 예를 들면 항생제와 함께 예방의 일부로서 적합하게는 비독성 다음이온으로 치료할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예와 관련하여 오직 예의 방식으로 더 자세히 기재되어 있다. 실시예는 본 발명을 예시하도록 제공되는 것으로 의도되고 본 명세서를 통해 설명에서의 개시내용의 일반성을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예

실시예 1: 인간 내피 세포에 대한 히스톤의 세포독성 작용의 상이한 다음 이온에 의한 억제

상이한 농도의 송아지 흉선 히스톤을 초기에 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC) 및 인간 미세혈관 내피 세포(HMEC)에 대한 이의 독성을 평가하였다. 배지 199/20% 소 태아 혈청(FCS) 중의 HUVEC/HMEC의 현탁액을 96웰 플레이트의 각각의 웰(50 ㎕ 배지 중의 1×10⁵개의 세포/웰)에 분배하였다. 이후, 송아지 흉선 히스톤(M199/20% FCS 중의 50 ㎕/웰)을 첨가하여 100∼800 ㎍/㎖의 최종 농도를 생성시키고, 이어서 PBS 중의 Calcein-AM의 25 ㎕/웰(0.04 μM의 최종 농도) 및 PBS 중의 프로피듐 요오다이드(PI)의 25 ㎕/웰(최종 농도 2.5 g/㎖)을 첨가하였다. 각각의 96웰 플레이트를 5% C0₂ 항온처리기 내에서 37℃에서 60 분 동안 항온처리하고, 얼음에 위치시키고, 각각의 웰의 함량을 생존 세포 및 사멸 세포에 대해 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 생존 세포를 Calcein-AM-bright 및 Pi-dim으로 검출하고, 사멸 세포를 Calcein-AM-dim 및 PI-bright로 검출하였다. 도 1은 단독 항온처리된 HUVEC(9.15% 사멸, 78.6% 생존)를 200 ㎍/㎖의 송아지 흉선 히스톤과 60 분 동안 항온처리된 HUVEC(50.4% 사멸, 35.6% 생존)와 비교하는 통상적인 생존율 검정을 도시한 것이다. HUVEC 및 HMEC에 대한 송아지 흉선 히스톤의 독성이 도 2에 자세히 도시되어 있고, HUVEC(도 2a) 및 HMEC(도 2B)에 대한 히스톤 독성은 매우 농도 의존적이지만, HMEC는 HUVEC보다 히스톤 독성에 더 저항적이다. 따라서, 100 ㎍/㎖에서 히스톤은 15∼20%의 HUVEC를 사멸시키지만 HMEC 생존율에 영향을 갖지 않고, 반면 800 ㎍/㎖에서 히스톤은 85% 초과의 HUVEC 및 약 55%의 HMEC를 사멸시켰다(도 1). 후속 억제 실험에서, 송아지 흉선 히스톤을 HUVEC에 대해 200 ㎍/㎖에서 사용하고 HMEC에 대해 400 ㎍/㎖에서 사용하였고, 이 농도는 내피 세포의 집단 둘 다의 약 50% 사멸을 발생시켰다.

억제 실험에서, 각각의 웰에의 HUVEC/HMEC, Calcein-AM 및 PI의 첨가 전에 억제제(1.6∼100 ㎍/㎖ 범위의 최종 농도)를 송아지 흉선 히스톤(최종 농도 200 또는 400 ㎍/㎖)과 혼합하였다. 말토트리오스 설페이트 및 말토펜타오스 설페이트가 HUVEC에 대한 히스톤 세포독성의 강력한 억제제이어서, 100 ㎍/㎖에서 히스톤 독성을 완전히 억제하고 여전히 25 ㎍/㎖에서 매우 효과적인 것을 발견하였다(도 3 및 4). 말토트리오스 설페이트에 대한 1차 유세포 분석법 데이터의 몇몇은 이 황산화 트리사카라이드의 강력한 억제 활성을 추가로 강조하도록 도 5에 제시되어 있다. 반대로, 디사카라이드 말토스 설페이트는 히스톤 세포독성의 약한 억제제이어서(도 3 및 4), 다음이온 올리고사카라이드 쇄 길이의 말토스 시리즈가 억제 활성에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 그러나, 이소말토트리오스 설페이트(α1-6 연결 글루코스)는 말토트리오스 설페이트(α1-4 연결 글루코스)보다 덜한 활성 억제제이어서, 당 결합이 또한 억제 활성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 제안한다(도 3). 그러나, 사이클릭 β-시클로덱스트린 설페이트(사이클릭 α1-4 연결 헵타글루코스)는 선형 말토트리오스 설페이트 및 말토펜타오스 설페이트 분자와 같이 거의 활성이다(도 3).

내피 세포 표적으로서 HMEC를 사용하여 히스톤 독성에 대한 말토트리오스 설페이트(도 6) 및 다른 황산화 올리고사카라이드(표 1)의 유사한 억제 효과가 관찰되었다. 사실, 표적 내피 세포로서 HMEC를 사용하는 히스톤 독성에 대한 일련의 다음이온의 억제 활성의 더 자세한 분석은 표 1에 기재되어 있다.

상이한 황산화 디사카라이드는 이의 억제 활성이 다르고, 셀로비오스 설페이트(β1-4 연결 글루코스)는 히스톤 독성의 강력한 억제제인 반면, 말토스 설페이트(α1-4 연결 글루코스) 및 수크로스 옥타설페이트(글루코스 β1-4 연결 프럭토스)는 더 약한 억제제이다(표 1). 그러나, 말토스의 개환 형태인 말티톨의 억제 활성은 말토스보다 크다. 황산화 트리사카라이드는 또한 이의 억제 활성이 변하였고, 황산화 말토트리오스, 라피노스 및 파노스는 황산화 이소말토트리오스보다 활성이다. 분석으로 또한 황산화 연결 글루코스 분자가 약간의 억제 활성(예를 들면, 프로파닐 비스-글루콘아미드 SO₄)을 나타내고, 황산화 β-시클로덱스트린이 활성이지만 카복실화 β-시클로덱스트린은 활성이 아니고, 헤파린, 저분자량 헤파린 및 약간의 화학 변이체(예를 들면, N-탈아세틸화, 글리콜 스플릿)가 활성인 것으로 밝혀졌다(표 1).

추가의 연구로 히스톤 세포독성이 세포 표면 헤파란 설페이트에 따라 달라지지 않는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 플라보박테리아 헤파리늄(0.25 단위/㎖, 37℃, 1 시간)으로부터의 인간 혈소판 헤파라나제(4 ㎍/㎖, 37℃, 1 시간) 또는 헤파리티나아제 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ에 의한 HMEC의 치료, 세포 표면 헤파란 설페이트를 제거하는 효소 절차는 히스톤 세포독성에 대한 HMEC의 감수성에 효과를 갖지 않았다(도 7). 유사하게, 야생형 중국 햄스터 난소(CHO-K1) 세포 및 이 세포주의 헤파란 설페이트 결핍 변이체(pgsA-745)의 비교로 세포주 둘 다 히스톤 세포독성에 동등하게 감수성인 것으로 밝혀졌다(도 8).

실시예 2: 정맥내로 주사된 히스톤은 래빗의 폐에서 축적한다.

송아지 흉선 히스톤을 Tc99m-나노입자의 표면으로의 흡착에 의해 방사선 라벨링한다. Tc99m-나노입자(대략 50 ㎍; 4 mCi)의 수성 콜로이드 현탁액(3 mL)을 실온에서 1 시간 동안 히스톤(10 ㎍/㎖)으로 처리하였다. 방사성라벨링된 히스톤을 감마 카메라 하에 위치한 마취된 래빗의 귀 정맥에 주사하고, 동적 영상을 주사 시작으로부터 개시하여 일련의 30 초 획득으로 얻었다. 도 9a에서의 영상은 히스톤 유도 조직 손상의 폐 국부화화 일치하는 폐에서의 히스톤의 신속하고 선택적인 축적을 보여준다. 히스톤이 결합되지 않은 방사선 라벨링된 나노입자는 세망내피계에 의해 순환하는 외래 입자의 신속한 청소율에 예상된 바대로 간, 비장 및 골수에서 국부화된다(도 9b 참조).

실시예 3: 폐에서의 히스톤 축적의 경쟁적 억제

송아지 흉선 히스톤을 Tc99m-나노입자의 표면에의 흡착에 의해 방사선 라벨링한다. 이후, 이 방사선 라벨링된 제제를 반으로 분할하였다. 처음 반분을 감마 카메라 하에 위치한 마취된 대조군 래빗의 귀 정맥에 주사하고, 동적 영상을 주사 시작으로부터 개시하여 일련의 30 초 획득으로 얻었다. 상기 실시예 2에서처럼, 도 10a에서의 영상은 대조군 래빗의 폐에서의 방사선 라벨링된 히스톤의 신속하고 선택적인 축적을 보여준다. 방사선 라벨링된 히스톤 제제의 제2 반분을 초기 15 ㎎/㎏의 나트륨 말토헥사오스 설페이트와 함께 정맥내로 15 분 주사된 마취된 래빗의 귀 정맥으로 주사하였다. 방사성 라벨의 주사의 시작으로부터 이 전처리된 래빗의 감마 영상화는 폐에서의 방사선 라벨링된 히스톤의 축적이 차단된다는 것을 보여준다(도 10b). 방사선 라벨링된 히스톤은 폐를 통과하고 간 및 비장에서 국부화되었다.

실시예 4: 말토테트라오스 설페이트에 의한 래빗 폐에서의 히스톤 축적의 봉쇄

방사선 라벨링된 히스톤 제제를 초기 15 ㎎/㎏의 나트륨 말토테트라오스 설페이트와 함께 15 분 정맥내 주사된 마취된 래빗의 귀 정맥으로 주사하였다. 방사성 라벨의 주사의 시작으로부터 이 전처리된 래빗의 감마 영상화는 폐에서의 방사선 라벨링된 히스톤의 축적이 차단된다는 것을 보여준다(도 11). 방사선 라벨링된 히스톤은 결합 없이 폐를 통과하고 간 및 비장에서 국부화되었다. 도 11의 1∼4 프레임은 30 초 획득이고, 5∼8 프레임은 60 초 획득이었다.

실시예 5: 셀로비오스 설페이트에 의한 래빗 폐에서의 히스톤 축적의 봉쇄

방사선 라벨링된 히스톤 제제를 초기 15 ㎎/㎏의 나트륨 셀로비오스 설페이트와 함께 15 분 정맥내 주사된 마취된 래빗의 귀 정맥으로 주사하였다. 방사성 라벨의 주사의 시작으로부터 이 전처리된 래빗의 감마 영상화는 폐에서의 방사선 라벨링된 히스톤의 축적이 차단된다는 것을 보여준다(도 12). 방사선 라벨링된 히스톤은 결합 없이 폐를 통과하고 간 및 비장에서 국부화되었다. 도 12의 1∼4 프레임은 30 초 감마 카메라 획득이었다.

실시예 6: 마우스에서의 LPS 유도 패혈증 연구

패혈증의 리포폴리사카라이드(LPS) 유도 마우스 모델에서의 시험 물품 1(말토트리오스 설페이트; TAl), 시험 물품 2(셀로비오스 설페이트; TA2) 및 시험 물품 3(헤파린; TA3)의 생체내 효율을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 내독소혈증은 1일째에 LPS에 의한 복강내(i.p.) 주사에 의해 유도되었다. 시험 물품을 1일째에 i.p. 공동 투여하고, 이후 추가 2 일 동안 매일 i.p. 투약하였다. 시험 물품 1 및 시험 물품 2를 2 용량 농도에서 평가하고, 시험 물품 3을 하기 표 2에 기재된 바대로 1 농도에서 평가하였다.

결과 : 동물이 사멸하거나, 안락사되어야 하는 것으로 발견될 때까지의 시간을 도 13에서 Kaplan-Meier 도면으로 도시되어 있다. 이 연구에서 사용된 고용량(100 ㎎/㎏)의 말토트리오스 설페이트(TA1)는 제3 용량 후 약간의 독성(사멸의 클러스터)을 생성시키지만, 저용량(15 ㎎/㎏)은 더 내약성인 것으로 보인다. 용량 둘 다에서 셀로비오스 설페이트(TA2)는 더 내약성이고, 헤파린(TA3; 1.1 ㎎/㎏)에 낮은 용량이 선택되었다. 도 13에서의 Kaplan-Meier 도면은 연장된 생존이 말토트리오스 설페이트(TA1)의 저용량 및 셀로비오스 설페이트(TA2)의 용량 둘 다에 얻어진다는 것을 보여준다. 헤파린(TA3)의 경우, 대조군과 비교하여 생존 도면의 명확한 변화가 없었다(도 13).

Claims (19)

1. 피험체에서 세포외 히스톤의 세포독성 활성을 억제함으로써 패혈증을 치료하기 위한, 유효량의 다음이온을 포함하는 약학적 조성물로서,
   다음이온은 실질적인 항응고 활성을 갖지 않고,
   다음이온은 하기 일반 구조 (Ⅰ)을 갖는 다음이온성 올리고사카라이드이며,
   다음이온이 프로트롬빈 시간(PT), 부분 트롬보플라스틴 시간(PTT), 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT), 트롬빈 응고 시간(TCT), 또는 활성화 응고 시간(ACT)을 정상 범위의 0 내지 10%만큼 증가시키는 경우, 상기 다음이온은 실질적인 항응고 활성을 갖지 않는 것인 약학적 조성물:
   A-(B)_n-D (Ⅰ)
   [식 중,
   A 및 B는 각각 독립적으로 사이클릭 모노사카라이드이고,
   D는 사이클릭 모노사카라이드이고,
   n은 0, 1 및 2로부터 선택되는 정수이고,
   각각의 사이클릭 모노사카라이드는 독립적으로 OSO₃ ^-로 임의로 치환되고,
   다음이온성 올리고사카라이드는 2개 이상의 OSO₃ ^-를 포함한다].
2. 제1항에 있어서, 사이클릭 모노사카라이드는 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 리보스, 아라비노스, 크실로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 만노스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 리불로스, 크실룰로스, 푸시코스, 소르보스, 타가토스 및 세도헵툴로스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 사이클릭 모노사카라이드는 글루코스, 갈락토스 및 프럭토스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 다음이온성 올리고사카라이드는 하기 일반 구조 (I-a)를 갖는 것인 약학적 조성물:
   

   

   
   [식 중,
   각각의 R¹은 독립적으로 OSO₃ ^-, OH 또는 H로부터 선택되고,
   n은 0, 1 및 2 사이의 정수이고,
   R¹ 중 2개 이상은 OSO₃ ^-이다].
5. 제1항에 있어서, 다음이온성 올리고사카라이드는 하기 일반 구조 (I-b)를 갖는 것인 약학적 조성물:
   

   

   
   [식 중,
   각각의 R¹은 독립적으로 OSO₃ ^-, OH 또는 H로부터 선택되고,
   n은 0, 1 및 2 사이의 정수이고,
   R¹ 중 2개 이상은 OSO₃ ^-이다].
6. 제1항에 있어서, 다음이온성 올리고사카라이드는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물:
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   

   

   및
   

   

   
   [식 중,
   각각의 R²는 독립적으로 OSO₃ ^-, OH 또는 H로부터 선택되고,
   R² 중 2개 이상은 OSO₃ ^-이다].
7. 제1항에 있어서, 다음이온성 올리고사카라이드는 말토스 설페이트, 말토트리오스 설페이트, 말토테트라오스 설페이트, 파노스 설페이트, 이소말토트리오스 설페이트, 에를로스 설페이트, 셀로비오스 설페이트 및 라피노스 설페이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
8. 제1항에 있어서, 다음이온성 올리고사카라이드는 셀로비오스 설페이트인 약학적 조성물.
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