JP2005521379A

JP2005521379A - ヘパラナーゼ活性を阻害するための方法及び組成物

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Publication number: JP2005521379A
Application number: JP2003512403A
Authority: JP
Inventors: ボーレン，ペーター; ヒックリン，ダニエル; クッシー，ポール; リ，イウェン
Original assignee: イムクローンシステムズインコーポレイティド
Priority date: 2001-07-13
Filing date: 2002-07-10
Publication date: 2005-07-21
Also published as: WO2003006645A3; EP1417304A2; EP1417304A4; WO2003006645A2; CA2453566A1

Abstract

本発明は、ヘパラナーゼに対する免疫応答を導出する有効量のイムノゲンを動物に投与することにより、ヘパラナーゼ活性を阻害し、種々の状態を治療する方法に関する。本発明によれば、イムノゲンはヘパラナーゼ又はそのフラグメントであり、好ましくは、イムノゲンは、表面上にヘパラナーゼ又はそのフラグメントを表示する抗原提示細胞(APC)、例えば樹状細胞(DC)である。本発明はまた、イムノゲンを含有する組成物に関する。

Description

本発明の分野
本発明は、ヘパラナーゼ活性を阻害するための方法及び組成物に関する。より特に、本発明は、ヘパラナーゼ活性に関連する症状の治療方法に関する。

本発明の背景
ヘパラン・スルフェート・プロテオブリカン（ＨＳＰＧｓ）は、哺乳動物組織中に広く分布し、そして悪性に関連する多数のプロセスに関わる。一般に、Blackhall et al., Br. J. Cancer, 85 (8) : 1094-8 (Oct. 2001) を参照のこと。ヘパラナーゼの上昇レベルは、転移性腫瘍担持動物及び悪性メラノーマ患者からの血清中に検出されており、そしてヘパラナーゼ活性と腫瘍転移の程度との間には相関がある。ヘパラナーゼによるＨＳＰＧｓの開裂は、ＥＣＭの分解、及び生理活性剤、例えば、血管形成促進因子の放出を導く。内皮基底膜の首尾よい貫通は、造血性腫瘍転移の形成における重要なプロセスである。ヘパリンのヘパラナーゼ阻害性の、非血液凝固性種、並びに硫酸ラミナリン及びマンノペンタロース・ホスフェート・スルフェート（ＰＩ−８８）は、実験動物において肺転移の発生を顕著に低下させ、Vlodavsky et al., 1994, 前掲；Miao et al., Int. J. Cancer, 83 : 424-31 (1999) ; Nakajima, 1988, 前掲；Parish et al., Int. J. Cancer, 40 : 511-7 (1987)、さらに腫瘍増殖及び血管形成を顕著に低下させ、Parish et al., Cancer Res., 59 : 3433-41 (1999)、これは、ヘパラナーゼが、潜在的に、腫瘍発達のための有用なマーカーであることを示唆している。したがって、ヘパラナーゼ活性を標的とする免疫療法は、腫瘍増殖と血管形成の両者のための潜在的に有用な治療法である。

上記のヘパリンの非血液凝固種は、Ｔリンパ球の移動を有意に弱め、そして細胞免疫反応性及び実験的自己免疫疾患を抑制した。Vlodavsky et al., 1992, 前掲。さらに、ヘパラナーゼによる処置は、実験的自己免疫脳脊髄炎、アジュバント関節炎、及び移植片拒絶の発生を顕著に低下させた。Vlodavsky et al., 1992, 前掲；Lider et al., J. Clin. Invest., 83 : 752-6(1989)；Willenborg & Parish, J. Immunol., 140:3401-5(1988)を参照のこと。このことは、ヘパラナーゼ活性を標的にした免疫療法的処置が、これらの状態に対して潜在的に有用であることを示している。

HSPGは、グリコサミノグリカン、ヘパラン硫酸(HS) の鎖が付着するコア蛋白質から成っている。多糖HS鎖は典型的には、反復するヘキスロン酸単位及びD-グロコサミン二糖単位から成っている。これらの単位は、硫酸化、エピマー化及びN-アセチル化により種々の位置で変更を加えられており、これにより多糖類HS鎖は、低硫酸化領域又は非硫酸化領域によって分離された硫酸化二糖クラスターをもたらす。高多形HS鎖に加えて、種々のクラスのコア蛋白質の存在は、かなり多様な構造及び機能を有するマクロ分子スーパーファミリーを形成する。

HSPGは、細胞外マトリックス(ECM)の成長因子、ケモカイン及び構造蛋白質を含む多くの蛋白質と相互作用し、これにより、細胞増殖、分化、及び環境に対する細胞応答に影響を与える。具体的には、T及びBリンパ球、血小板、顆粒球、マクロファージ及び肥満細胞と、内皮下層ECMとの相互作用は、特異的なエンド-β-D-グルクロニダーゼ(ヘパラナーゼ)活性によるHSの分解と関連する。Nakajima他、Science, 220:611-613(1983)参照。HSPGがECM成分の自己組織化及び不溶性、並びに、細胞の付着及び移動運動に重要な役割を果たすことも、研究により判っている。Bernfield他Annu. Rev. Biochem., 68:729-77(1999);Iozzo, Annu. Rev. Biochem., 67:609-52(1998); Vlodavsky他、Invasion & Metastasis, 14:290-302(1994); Wight他、Curr. Opin, Cell Biol., 4:793-801 (1992)参照。

HSを分解させるヘパラナーゼ酵素は、種々の活性化シグナル、例えばトロンビン、カルシウム・イオノフォア、免疫複合体、抗原及びマイトジェンに応答して、細胞内区画から、例えばリソソーム及び特異的顆粒から放出される。このことは、炎症及び細胞免疫性にこの酵素が制御された状態で関与していることを示唆している。無傷の細胞、血小板、肥満細胞、好中球及びリンパ腫細胞によって発現させられたヘパラナーゼは、ECM及び基底膜から、活性HSに結合された活性塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を放出することが判った。このようにヘパラナーゼは、(負傷から生じる)創傷修復及び炎症のようなプロセス中に間接的な新生血管応答を導出することができる。概略に関してはVlodavsky他、Invasion Metastasis, 12(2):112-27(1992); Nakajima他、J.Cell Biochem., 36(2): 157-67(1988)を参照されたい。

ヒト・ヘパラナーゼ(Vlodavsky他、Nat. Med., 5:795-802(1999); Hulett他、Nat. Med., 5:803-809(1999); Kussie他、Biochem. Biophy. Res. Commun., 261:183-187(1999)参照)及びニワトリ・ヘパラナーゼ(Toyoshima & Nakajima, J. Biol. Chem., 261:183-187(1999)参照)に対応する遺伝子はクローニングされ、機能的に発現させられている。ウシ・ヘパラナーゼ(遺伝子バンク:AF 281160)、ラット・ヘパラナーゼ(遺伝子バンクNM 022605) の完全配列及びマウス・ヘパラナーゼ(遺伝子バンク:AX 034647)(Hulett他、前出)の部分配列（残基150〜535)が知られている。さらに、GenBank寄託番号AX 034647(欧州特許出願公開第1032656号明細書参照)は、マウス・ヘパラナーゼの別の部分配列（残基156〜535)を、対応ポリヌクレオチド配列とともに開示している。

発明の概要
本発明は、ヘパラナーゼに対する免疫応答を導出する有効量のイムノゲンを動物に投与することにより、ヘパラナーゼ活性を阻害し、種々の状態を治療する方法に関する。本発明は、該イムノゲンがヘパラナーゼ又はそのフラグメントである方法、及び、好ましい実施態様の場合、該イムノゲンが、表面上にヘパラナーゼ又はそのフラグメントを表示する抗原提示細胞(APC)、例えば樹状細胞(DC)である方法を提供する。さらに、本発明により提供されるのはイムノゲンの組成物である。

さらに本発明は、分離されたヘパラナーゼ・マウス・ポリペプチド、例えばSEQ ID NO:1又はそのフラグメントに関する。さらに本発明は、マウス・ヘパラナーゼ・ポリペプチド、例えばSEQ ID NO:2又はそのフラグメントをコード化する、分離されたヘパラナーゼ・ポリヌクレオチド、及びこのようなポリヌクレオチドを有するクローニング(又は発現)ベクター及び宿主細胞に関する。

発明の詳細な説明
本発明の関連において、ヘパラナーゼ、ヘパラナーゼ活性又はヘパラナーゼ触媒活性は、ヘパラン又は(HSPGを含む)HS基質に対して特異的な動物エンドグリコシダーゼ加水分解活性を意味する。この活性は、β-排除によってヘパラン又はHSを分解させる細菌酵素(ヘパリナーゼI, II及びIII)の活性とは大きく異なる。本発明の関連において阻害されるヘパラナーゼ活性は、好ましくは天然型である。すなわちヘパラナーゼ活性は、基礎レベルに変更されることはあるものの、動物において自然発生している。

1実施態様の場合、本発明は、ヘパラナーゼに対する免疫応答を導出することにより、ヘパラナーゼ活性を阻害することに関する。ヘパラナーゼ活性の阻害の1つの結果は、HSPGの分解を予防することである。云うまでもなく、このことは1つの結果に過ぎず、ヘパラナーゼ活性の阻害の唯一の結果では決してない。他の結果は、腫瘍転移を予防する、基底膜の分解の阻害、及び血管形成に関与する、内皮細胞による侵入の予防を含む。さらに、ヘパラナーゼ活性の阻害は、免疫系の活性化細胞が循環系に入るのを防止し、ひいては、炎症関連状態及び自己免疫状態の導出を阻害することができる。

ヘパラナーゼ活性は、1又は2種以上のイムノゲンの有効量を投与するのに続いて、ヘパラナーゼに対する免疫応答を導出することにより阻害される。本発明の関連において、イムノゲンが天然ヘパラナーゼに対する体液性又は細胞性免疫応答を導出するのに有効である。免疫応答は好ましくは、ヘパラナーゼ活性を阻害する、すなわち予防、減速又は停止する活性免疫性である。従って、本発明の方法に関連して、ヘパラナーゼ活性は、完全に排除される必要はない。云うまでもなく、ヘパラナーゼに対する免疫応答は、直接的又は間接的に導出することができる。従って、イムノゲンがヘパラナーゼ活性を直接的に阻害することは本発明においては必要とされない。むしろイムノゲンは、ヘパラナーゼ活性を最終的に阻害するカスケードを開始させることにより、間接的に免疫応答を導出することができる。このような間接阻害の一例としては、ヘパラナーゼ活性に関連する1又は2以上のRNA種の転写又は分解、ヘパラナーゼ・ポリペプチドの翻訳又は翻訳後プロセッシング、及び/又はヘパラナーゼ蛋白質の分解の速度又は範囲を変化させることが挙げられる。

本発明のイムノゲンは、ペプチド、DNA、RNA、小分子、又はヘパラナーゼ活性を阻害するその他の任意の好適な免疫原性分子であってよい。イムノゲンはその動物にとって天然であってよいが、しかしこのようなイムノゲンには、免疫応答を引き起こすように変更を加えなければならない。本明細書中に使用された「天然」という用語は、動物に対してオートロガス又はホモローグであることを意味する。この場合天然抗原は「自己」ポリペプチドであり、変更されていない場合には、これらの起源である動物において非免疫原性であるのが典型的である。或いは、イムノゲンはその動物にとって非天然であってよい。このことは、イムノゲンが外来であり且つ「自己」ポリペプチドでないことを意味する。このように、これらのイムノゲンは、付加的な変更を加えずに免疫応答を誘発することができる。

本発明の1実施態様の場合、イムノゲンはペプチド又はポリペプチドである。ヘパラナーゼ活性を阻害する任意の好適なペプチド又はポリペプチドを使用することができる。これらの例は、ヘパラナーゼ又はそのフラグメントである。米国特許第5,968,822号明細書を参照されたい。好適なヘパラナーゼは、合成誘導されたヘパラナーゼ又はそのフラグメント、組換え誘導されたヘパラナーゼ又はそのフラグメント、天然誘導されたヘパラナーゼ又はそのフラグメントであってよい。さらに、好適なヘパラナーゼは、その動物にとって天然型又は外来型であってよい。

例えば、好適なポリペプチド・イムノゲンはヒト・ヘパラナーゼである。ヒト・ヘパラナーゼは、543個のアミノ酸から成る61.2kDaポリペプチドである。細胞及び組織から分離された成熟50kDa酵素は、開始コドンからアミノ酸157個分だけ下流側にN末端を有し、ヘパラナーゼ・ペプチドの翻訳後プロセッシングを示唆する。例えばKussie他、Biochem. Biophys. Res. Commun. 261:183-7(1999);Toyoshima & Nakajima, J. Biol. Chem. 274:24153-60(1999)を参照されたい。ヘパラナーゼのアミノ酸配列は、推定上のN末端シグナル・ペプチド配列(Met¹〜Ala³⁵)と、候補膜貫通領域(Pro⁵¹⁵〜Ile⁵³⁴)とを含有する。例えばVlodavsky他、Nat. Med. 5:793-802(1999); Hulett他、Nat. Med. 5:183-7(1999)を参照されたい。他のTIM-バレル・グリコシル加水分解と類似して、ヘパラナーゼが共通の触媒メカニズムを有することが、部位特定突然変異誘発により明らかになった。この触媒メカニズムは2つの保存酸性残基、Glu²²⁵における推定上のプロトン・ドナー、及びGlu³⁴³における求核原子を伴う。Hulett他、Biochem. 39:15659-67(2000)を参照されたい。50kDaヒト成熟酵素(Lys¹⁵⁸〜Ile⁵⁴³)に対応する、ヒト、マウス及びラットの部分アミノ酸配列のアラインメントは、80%〜93%の同一性であることが明らかになった。Hullet他,1999前出を参照されたい。

本発明との関連における好適な外来ヘパラナーゼは、その動物にとって非天然型であり、しかも付加的な変更を加えずに免疫応答を誘発することができる任意のヘパラナーゼであってよい。例えば動物がヒトの場合、ヘパラナーゼは哺乳動物、例えばウサギ、ラット又はマウスから誘導することができる。好ましくは、動物がヒトの場合、ヘパラナーゼ又はそのフラグメントは、マウス・ヘパラナーゼ又はそのフラグメントであるか、或いはマウス・ヘパラナーゼ又はそのフラグメントから誘導されたヘパラナーゼである。

マウス・ヘパラナーゼに対応する好適なポリペプチド配列が分離されており、SEQ ID NO:1において示されている。マウス・ヘパラナーゼの精製及びポリペプチド特徴付けにより、43-kDaポリペプチドと7-kDaペプチドとから成る非共有ヘテロ二量体が明らかになった。43-kDaポリペプチド及び7-kDaペプチドの双方は単一前駆体ポリペプチドから誘導される。マウス・ヘパラナーゼの酵素活性は、HSPGを分解するその能力と、周知のヘパラナーゼ・インヒビターによる阻害とによって確認された。このフルレングス・マウス・ヘパラナーゼ・アミノ酸配列を分析することにより、ヒト・ヘパラナーゼと比較して同一性が約76%であることも明らかになった。

本発明のマウス・ヘパラナーゼ・ポリペプチドは分離且つ/又は精製されている。本明細書中に使用する「分離された」又は「精製された」という用語は、分子、例えばポリペプチドが細胞物質又はこれを自然の状態で伴うその他の成分から分離されることを意味する。典型的には、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関しては、蛋白質、又は自然の状態で付随するその他の自然発生型有機分子から60%以上が遊離している場合に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドは実質的に純粋である。好ましくは調製物の純度は、75%以上、より好ましくは90%以上、そして最も好ましくは99%以上(重量)の遊離である。例えば、天然資源、ポリペプチドをコード化する組換え核酸の発現、又は化学合成によって、実質的に純粋なポリヌクレオチド又はポリペプチドを得ることができる。純度は任意の適正な方法、例えばカラム・クロマトグラフィ、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法、又はHPLC分析により測定することができる。化学合成されたポリヌクレオチド又はポリペプチド、或いは、自然発生する細胞タイプ以外の細胞タイプで生成された組換えポリヌクレオチド又はポリペプチドは、定義によれば、これを自然の状態で伴う成分から実質的に遊離している。従って、実質的に純粋なポリヌクレオチド又はポリペプチドは、E.coli又はその他の原核動物において生成される、真核生物から誘導された配列を有するものを含む。さらに云うまでもなく、「分離された」又は「精製された」という用語が、無数のその他の配列フラグメントを含有するライブラリ型調製物を意味することはない。

外来ヘパラナーゼ又はそのフラグメントを含むヘパラナーゼ又はそのフラグメントの等価物を本発明に使用することもできる。このような等価物は、機能等価物又は誘導体、相同体、類似体（又はこれらのフラグメント）、又は、ヘパラナーゼ・ポリペプチドに匹敵する免疫応答を誘発するポリヌクレオチド配列の突然変異形を含む。機能等価物という用語は、付加、抹消及び置換を含むアミノ酸配列の変更形であって、ポリペプチド特性、例えば電荷、IEF、親和性、アビディティ、コンフォメーション、可溶性を実質的に変化させず、そしてそのポリペプチドの特異的機能又は免疫交差反応性を維持するものを意味する。機能等価物という用語は、同類アミノ酸置換を含む。同類アミノ酸置換は、ポリペプチドのアミノ酸を、概ね類似の特性、例えば酸性、塩基性、芳香族性、サイズ、正又は負の電荷、極性、非極性を有するアミノ酸と置換することにより、アミノ酸配列を変化させることを伴う。相同体という用語は、等価の特性及び/又は機能を有する異なる種に由来するポリペプチド配列を意味する。突然変異形は、スプライシング、多形又はその他の事象により生じるポリペプチド配列の変更形、及び自然の状態で選択されていてよい変更形を意味する。

さらに、このような等価物は、対応するポリペプチドとの免疫交差反応性を有する。但し、ヘパラナーゼ活性を阻害し、天然型ヘパラナーゼと類似する生体活性を有さない、本発明の関連におけるイムノゲンとして機能するペプチドがあり得る。等価物はまた、ペプチドのフラグメント、或いは、例えばポリペプチドの置換、付加又は抹消突然変異体であってもよい。等価ポリペプチドは、等価アミノ酸配列を有する。別の配列と実質的に同じであるが、しかし1又は2以上の置換、付加又は抹消によって前記別の配列とは異なるアミノ酸配列は、等価配列であると考えられる。好ましくは、アミノ酸残基の数の25%未満、より好ましくは10%未満及び最も好ましくは5%未満が、本発明のポリペプチドの代わりに置換されるか、本発明のポリペプチドに付加されるか、又は本発明のポリペプチドから抹消される。

本発明のヘパラナーゼ・フラグメントは好ましくは、抗原のエピトープを定義するのに十分なアミノ酸残基を含有する。フラグメントは例えば、そのエピトープだけをコード化するミニ遺伝子であってよい。既知の免疫原性ポリペプチドから免疫原性フラグメントを分離して同定する方法が、Salfeld他によってVirol., 63: 798-808(1989)において、またIsola他、J. Virol., 63:2325-34(1989)において記載されている。フラグメントが好適なエピトープを定義するが、しかし免疫原性であるには余りにも短い場合、このフラグメントはキャリヤ分子に接合することができる。いくつかの好適なキャリヤ分子は、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、Ig配列、TrpE及びヒト又はウシの血清アルブミンを含む。接合は、当業者に知られた方法によって行うことができる（下記により詳しく説明する）。

好ましくは、本発明のイムノゲンは、APC含有ヘパラナーゼ又はそのフラグメントである。このヘパラナーゼ又はフラグメントはAPCの表面上に表示される。APCは概ね、真核細胞であって、主要組織適合複合体(MHC)のクラスI又はクラスII遺伝子生成物をそれらの細胞表面に有するものである。本発明において使用することができるAPCの幾つかの例は、DC並びにマクロファージ、好ましくはMHCクラスIIポジティブ・マクロファージ、単球、好ましくはMHCクラスIIポジティブ単球、及びリンパ球を含む。概要については米国特許第5,597,563号明細書を参照されたい。

好ましくは、本発明のAPCはDCである。DCは、最も強力なAPC及びin vivoでの免疫応答の効率的なイニシエータであると幅広く考えられている。免疫応答はCD4⁺Tヘルパー、CD8⁺CTL及び抗体の応答を含む。また、DCは高レベルのMHCクラスII分子、及び、抗原提示に重要なコスティミュラトリー分子、例えばCD80、CD86、CD40リガンド及びICAM-1を発現させる。ペプチド又はポリペプチド、全蛋白質でパルス化された、又は、DNA又はRNAがトランスフェクトされた少数のDCをマウスに接種すると、このことは強力なT細胞性in vivo応答を誘発し、強力な免疫応答を導出して、自己抗原耐性を克服することが判った。

ヘパラナーゼ又はそのフラグメントをAPC中に導入するために、任意の好適な方法を用いることができる。1つの好適な方法は、ヘパラナーゼ又はそのフラグメントでAPCをパルス化することである。別の好適な方法は、ヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化するDNA又はRNAをAPC中に導入し、次いでこれをAPC内のヘパラナーゼ又はそのフラグメント中に転写且つ/又は翻訳する。このDNA又はRNAは、任意の好適な方法、例えばリン酸カルシウム・トランスフェクションを介して、又は、ヘパラナーゼ又はフラグメントをコード化するDNA又はRNAを含有するクローニング・ベクター又は発現ベクターを介して挿入することにより、APC中に導入することができる。このことについては以下にさらに詳しく説明する。

本発明の関連において、フルレングス・ヘパラナーゼ又はそのフラグメントをAPC中に導入することができるが、フルレングス・ヘパラナーゼを使用するといくつかの利点が得られる。第1に、APCによる抗原の細胞内プロセッシングにより、複数のCTLエピトープを発現させることができる。さらに、ヘパラナーゼ・ポリペプチド全体内に複数のTヘルパー・エピトープが存在してもよく、このようなMHCクラスII決定因子は、抗原に対する持続的な細胞応答を確立する上で有用である場合がある。最後に、B細胞エピトープが存在し、ヘパラナーゼ特異的抗体応答を誘発させることもできる。

本発明の別の実施態様の場合、APCは細菌細胞又は真核細胞、例えば末梢血細胞であってよい。この細胞は、ヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化する外生的DNA又はRNAを発現させる。好適な細菌細胞の例は、Mycobacterium bovisの無毒性菌株、例えばカルメット・ゲラン杆菌(BCG)、又はサルモネラの無毒性菌株、例えばS. typhimuriumである。細菌細胞は、当業者に知られているように、無毒性菌株中で抗原(例えばヘパラナーゼ)の活性部分を有するDNAをクローニングすることにより、調製することができる。例えば、組換えSalmonellaの調製に関しては、Curtiss他、Vaccine, 6: 155-60(1988)及びGalan他、Gene, 94:29-35(1990)を、また、組換えBCGの調製に関しては、Stover他、Vaccines, 91:393-8(1991)を参照されたい。

本発明はまた、ヘパラナーゼ分子を模倣する抗イディオタイプ抗体又はこれらのフラグメントを提供する。抗イディオタイプ抗体は、抗体又はT細胞受容体の配列の抗原特異的部分に向けられており、ひいてはその他の抗体の結合部位を認識する。原則的には、抗イディオタイプ抗体は特異的免疫応答を阻害するようになっており、抗イディオタイプ抗体は免疫系の制御に重要である。抗イディオタイプ・ヘパラナーゼ特異的抗体は、当業者に知られた方法によって得ることができる。概要に関してはJerne他、EMBO 1:234(1982); Jerne, Ann. Immunol. (Paris) 125C:373(1974)を参照されたい。

或いは、ペプチド模倣体(ペプチド・ミメティクス)は、本発明の関連においてイムノゲンとして機能することができる。ペプチド模倣体は、ペプチドの生体活性を模倣しているが、しかし化学的な性質においてもはやペプチド性ではない分子である。厳格な定義によれば、ペプチド模倣体は、もはやいかなるペプチド結合をも、すなわちアミノ酸間のいかなるアミド結合をも含有しない分子である。しかし本発明の関連においては、「ペプチド模倣体」という用語は、その性質においてもはや完全にはペプチド性でない分子、例えば擬似ペプチド、半ペプチド及びペプトイドを含むものとする。本発明によるペプチド模倣体は、これが完全に非ペプチドであろうと部分的に非ペプチドであろうと、ペプチド模倣体の基準となるペプチドにおける活性基の三次元配置に極めて近似している反応性化学成分の空間的配置を提供する。ペプチド模倣体を発生させる技術はコンベンショナルである。このように、ペプチド模倣体が起源ペプチドと類似の構造を採用するのを可能にする非ペプチド結合で、ペプチド結合を置換することができる。アミノ酸の化学基を類似構造の他の化学基で置換することにより、ペプチド模倣体を発生させることもできる。

別の実施態様の場合、イムノゲンは、ヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化するDNA又はRNAであってよい。ヘパラナーゼに対する免疫応答を導出するヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化し、これにより、ヘパラナーゼ活性を阻害するいかなるDNA又はRNAも、本発明の関連において使用するのに好適である。例えば、好適なDNAはヒト・ヘパラナーゼをコード化する。このヒト・ヘパラナーゼは1629bpのオープン・リーディング・フレームを含有する。例えばKussie他、1999, 前出；Toyoshima & Nakajima, 1999, 前出を参照されたい。さらに、好適なDNAは、ヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化するDNAを有するプラスミドであってよい。例えば米国特許第5,589,466号明細書及び同第5,630,796号明細書を参照されたい。

さらに、好適なDNA又はRNAは、動物にとって天然型又は外来型であるヘパラナーゼをコード化することができる。外来型ヘパラナーゼをコード化する好適なDNA又はRNAは、その動物にとって非天然型であって付加的な変更を加えずに免疫応答を誘発することができるヘパラナーゼをコード化する任意のDNA又はRNAであってよい。例えば動物がヒトである場合、DNA又はRNAは哺乳動物、例えばウサギ、ラット又はマウスに由来するヘパラナーゼをコード化することができる。好ましくは、動物がヒトの場合、ヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化するDNA又はRNAは、マウス・ヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化するDNA又はRNAである。マウス胚cDNAライブラリからクローニングされた、好適なマウス・ヘパラナーゼ・ポリヌクレオチド(DNA)が同定されている。これをコーディングする分離されたcDNA配列は、SEQ ID NO:2で示されている。

外来ヘパラナーゼをコード化するDNA又はRNAを含む、ヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化するDNA又はRNAの等価物を本発明において使用することもできる。このような等価物は、ヘパラナーゼ・ポリペプチドと匹敵する免疫応答を誘発する機能誘導体又は類似体（又はこれらのフラグメント）をコード化するDNA、RNA、DNA/RNAデュプレックス、ポリペプチド-核酸(PNA)、又はこれらの誘導体を含む。この等価物は例えば、DNA又はRNAのフラグメント、或いは、DNA又はRNAの置換、付加又は抹消突然変異体であってよい。等価DNA又はRNAは、実質的に等価の核酸配列を有する。実質的に別の配列と同じではあるが、しかし、1又は2以上の置換、付加及び/又は末梢によって前記別の配列とは異なる核酸配列は、等価配列であると考えられる。好ましくは、アミノ酸残基の数の25%未満、より好ましくは10%未満及び最も好ましくは5%未満が、本発明のDNA又はRNAの代わりに置換されるか、本発明のDNA又はRNAに付加されるか、又は本発明のDNA又はRNAから抹消される。

ヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化するDNA又はRNAにさらに含まれるのは、ポリヌクレオチド配列の縮重変異形、相同体又は突然変異形である。「縮重変異形」という用語は、ポリヌクレオチド配列、特にコドンの第3塩基における変化を意味する。これらの変化が、ヌクレオチド配列によってコード化されたアミノ酸配列に影響を及ぼすことはない。「相同体」という用語は、等価の構造及び/又は機能を有する異なる種に由来するポリヌクレオチド配列を意味する。突然変異形は、ポリヌクレオチドの変更形、例えば当業者に良く知られている組換えDNA技術を用いて1又は2以上のヌクレオチドの付加、抹消又は置換のような変更形、又は自然の状態で選択されている変更形を意味する。Kunkel他(1987) Meth Enzymol. 154:367-382。

本発明のヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化するDNA又はRNAポリヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、又は同定に関して当業者によく知られている種々のハイブリッド形成技術、mRNA又はDNA分子の全部又は一部のクローニング及び増幅において使用するのに十分に長いフラグメント又はセグメントを含む。例えば、高緊縮条件下でのハイブリッド形成は、下記の核酸ハイブリッド形成条件及び洗浄条件を意味する：50%ホルムアミドの存在における42℃でのハイブリッド形成；1%SDSを含有する2X SSCによる65℃での第1回洗浄；続く0.1X SSCによる65℃での第2回洗浄。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド又は上記ペプチドのうちの任意のものの補体、例えばcDNA及びmRNAを含む。

さらに、本発明のヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化するDNA又はRNAは、当業者に知られた方法によって、哺乳動物細胞、特に内皮細胞中に導入することができる。このような方法は、例えば米国特許第5,674,222号明細書に記載されている。好適な方法は、リン酸カルシウム・トランスフェクション、又は、ヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化するDNA又はRNAを含有するクローニング・ベクター又は発現ベクターを介して行う挿入を含む。本発明の関連において有用な（真核及び原核の双方の）細胞は、in vivo又はin vitroで調製することができる。これらの細胞の精製方法は当業者によく知られている。真核細胞中にDNA又はRNAを挿入するための好適なクローニング・ベクター又は発現ベクターは、SV-40、アデノウィルス、サイトメガロウィルス(CMV)のよく知られた誘導体、レトロウィルス誘導型DNA又はRNA配列を含む。このようなベクターはいずれも、プラスミドとファージDNA(シャトル・ベクター)との組み合わせに由来するベクターとカップリングされると、原核細胞及び真核細胞双方における蛋白質コード配列のクローニング及び/又は発現を可能にする。その他の真核細胞発現ベクターが当業者に知られている。例えばSouthern & Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1:327-41(1982); Subramani他、Mol. Cell. Biol., 11: 854-64(1981); Kaufmann & Sharp J. Mol. Biol., 159: 601-21 (1982); Scahill他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4654-9(1983); Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-20(1980)参照。

幾つかの好適な原核クローニング・ベクターは、E.coliに由来するプラスミド、例えばcolE1, pCR1,pBR322, pMB9, pUC, pKSM及びRP4を含む。原核ベクターはまた、ファージDNA、例えばM13, fd及びその他の線維状一本鎖DNAファージを含む。例えば、細菌、特にE.coli中にポリペプチドを発現させるためのベクターもよく知られている。このようなベクターはpK233(又はプラスミドのtac群のうちの任意のもの)、T7及びラムダP_Lを含む。融合ポリペプチドを発現させるベクターの例は、Dieckmann及びTzagoloffによってJ. Biol. Chem., 260:1513-1520(1985)に記載されているPATHベクターである。これらのベクターは、カルボキシ末端のポリリンカーが後に続くアントラニル酸シンテターゼ(TrpE)をコード化するDNA配列を含有する。その他の発現ベクター系は、ベータ-ガラクトシダーゼ(pEX)；ラムダP_L；マルトース結合蛋白質(pMAL)；グラタチオンS-トランスフェラーゼ(pGST)に基づいている。例えばSmith & Johnson, Gene, 67:31-40(1988); Abath & Simpson, Peptide Research, 3:167-68(1990)を参照されたい。

クローニング・ベクターは、染色体又は非染色体及び合成のDNA配列のセグメントを有することができる。本発明において有用なベクターは、発現されるべきDNA又はRNA配列又はフラグメント、すなわちヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化するDNA又はRNAに作用連関された1以上の発現制御配列を含有する。クローニングされたDNA又はRNA配列の発現を制御し且つ調節するために、制御配列はベクター中に挿入される。有用な発現制御配列の例はlac系、trp系、tac系、trc系、ファージ・ラムダの主要なオペレータ領域及びプロモータ領域、fdコート蛋白質の制御領域、及びポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルス及びシミアンウィルスに由来するプロモータ、例えばSV40の初期及び後期プロモータ、及び、原核細胞又は真核細胞及びこれらのウィルス又はこれらの組み合わせにおいて遺伝子発現を制御することが知られているその他の配列である。

或いは、本発明のイムノゲンは小分子であってもよい。本発明の小分子は、炭素原子及び水素原子、並びに、例えば窒素、硫黄、酸素及びリンを含むヘテロ原子を有する存在物である。小分子中の原子は共有結合及びイオン結合を介して、一緒にリンクされる。共有結合は小型有機化合物、例えば小分子チロシン・キナーゼ・インヒビターに関して典型的であり、イオン結合は、小型無機化合物に関して典型的である。小型有機分子における原子の配列は、鎖、例えば炭素-炭素鎖又は炭素-ヘテロ原子鎖、又は炭素原子を含有する環、例えばベンゼン、炭素とヘテロ原子との組み合わせ、すなわち複素環、例えばピリミジン又はキナゾリンを表すことができる。環系に結合された小型有機分子中で1又は2以上の鎖を組み合わせることにより、置換型環系が形成され、2つの環を縮合することにより、縮合多環系が形成される。この縮合多環系は、単に多環系と呼ぶことができる。小分子は、天然に見出された化合物、例えばホルモン、神経伝達物質、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂質及びこれらの誘導体、並びに、伝統的な有機合成、生体媒介性合成、又はこれらの組み合わせにより、合成によって形成された化合物の両方を含む。例えばGanesan, Drug Discov. Today, 7(1):47-55(2002); Lou, Drug Discov. Today 6(24):1288-1294(2001)を参照されたい。ヘパラナーゼを阻害する任意の好適な小分子を本発明の関連において使用することができる。これらの小分子は、脂質、及び多糖類のポリマー、並びにこれらの誘導体、例えばリポ多糖類を含む。

別の実施態様の場合、本発明のイムノゲンを、当業者に知られた種々の方法で、例えば免疫原性試薬と一緒に同時投与するか、又は免疫原性試薬に接合又は遺伝子融合することにより、このイムノゲンに変更を加えることができる。免疫原性試薬に接合又は融合することにより、免疫応答を刺激するか、又は、イムノゲンにより導出された既存の免疫応答を増大させることができる。これらの接合体及び融合分子は、抗原をキャリヤ又は融合分子にカップリング又は融合するための周知の方法のうちの任意のものにより、調製することができる。接合体は、当業者によく知られた方法により、融合ポリペプチドとして組換え調製することもできる。好ましい接合方法は共有結合である。これにより抗原は免疫原性試薬に直接的に結合される。さらに、免疫原性試薬がイムノゲンの前に、イムノゲンと同時に、又はイムノゲンに続いて投与されるように、同時投与を行うことができる。

好ましい免疫原性試薬は多糖類(概要については米国特許第5,623,057号明細書参照)、及び、ペプチドグリカン(概要については米国特許第5,153,173号明細書参照)を含む。その他の免疫原性試薬は、例えばサイトカイン、リンホカイン、ホルモン又は成長因子を含む。このような分子の例としては、ケモカイン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子(GM-CSF)、血管内皮成長因子(VEGF)、幹細胞刺激因子(SCF)、bFGF及びインターロイキン(IL)、例えばIL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6及びIL-7が挙げられる。概要については米国特許第5,334,379号明細書を参照されたい。さらに、免疫原性試薬は、本明細書中に記載した種々の状態のうちの任意のものを予防及び/又は治療するのにコンベンショナルに使用される任意の好適な薬剤又は療法であってよい。例えば、本発明の方法で腫瘍を治療する場合、免疫原性試薬は化学療法薬、放射線又は受容体アンタゴニストであってよい。イムノゲンをMHC抗原、例えばクラスI及びクラスII制限抗原と同時投与するか、又はこのMHC抗原に結合することにより、このイムノゲンに変更を加え、これによりMHCとの複合体を形成することもできる。このようなMHC抗原の源、及びMHC抗原にイムノゲンを結合する方法は、概ね米国特許第4,478,823号明細書に記載されている。

本発明の関連においてイムノゲンに変更を加えるために、その他の好適な方法を用いることができる。例えば、イムノゲンをハプテン化することにより、このイムノゲンに変更を加えることができる。概要に関しては米国特許第4,778,752号及び同第5,290,551号明細書を参照されたい。ハプテンは、ポリペプチドとカップリングされると免疫応答を導出することができる物質である。本発明のイムノゲンはそれ自体でハプテン化することができ、或いは、ハプテン化処理された蛋白質に結合することもできる。概要については米国特許第4,778,752号明細書及び同第5,290,551号明細書を参照されたい。本発明のイムノゲンに変更を加える付加的な方法は、ヘパラナーゼ又はそのフラグメントのグリコシル化又はペジル化、又は、イムノゲンのキャリヤ分子のグリコシル化又はペジル化である。この方法の概要は米国特許第5,484,735号明細書及び同第4,629,692号明細書に記載されている。

イムノゲンは、アジュバントに結合することもでき、或いは、このアジュバントをイムノゲンと一緒に投与することができる。イムノゲンによって導出される抗ヘパラナーゼ免疫応答を高めるために本発明の関連において有用な製薬上許容可能なアジュバントは、例えばムラミール・ペプチド、リンホカイン、例えばインターフェロン、インターロイキン-1及びインターロイキン-6、サポニン及びCpGオリゴヌクレオチドを含む。アジュバントは、イムノゲンが吸収される好適な粒子、例えば酸化アルミニウム粒子であってもよい。抗ヘパラナーゼ免疫応答を高めるために本発明の関連において有用な製薬上許容可能なアジュバントの他の例は、細菌性アジュバントである。細菌性アジュバントの例はBCGである。(上述の)APCとして機能する場合、組換えBCGは、それ自体のアジュバントとして付加的に作用することができる。この場合、付加的なアジュバントは必要とされないが、1又は2種以上のアジュバントが任意に存在していてもよい。自然の状態で使用される場合、BCGはイムノゲンと組み合わされることによりアジュバントとしてだけ作用する。その結果、効果的な免疫応答を導出する形が得られる。

動物内のヘパラナーゼに対する免疫応答を導出する上述の方法の実施態様のうちの任意のものにおいて、ヘパラナーゼに対して誘発された免疫応答は、その動物内で、ヘパラナーゼに特異的に結合する抗体、CD4+Tヘルパー細胞、又はヘパラナーゼに対する細胞傷害性リンパ球の生成を誘発することができる。Tヘルパー細胞は、侵入生物を探して攻撃するために抗体によってトリガーされる。マクロファージと呼ばれる細胞は、感染部位にTヘルパー細胞を召集し、Tヘルパー細胞がその上に係止する突出抗原を提示し、こうして侵入物質を認識する。次いで、T4ヘルパー細胞は強力なリンホカイン・ホルモンを再生して分泌する。このリンホカイン・ホルモンは、抗体のB細胞生成を刺激し；ナチュラル・キラー細胞又は細胞傷害性(細胞を殺す)T細胞をシグナリングし；そして感染部位により多くのマクロファージを召集する。CD4 + Th1 Tヘルパー細胞によってTh1が促進される。Th1は、後天性免疫応答であり、この応答の最も顕著な特徴は、抗体産出量に対して細胞傷害性Tリンパ球活性が高いことである。CD4 + Th2 Tヘルパー細胞によってTh2が促進される。Th2は、後天性免疫応答であり、この応答の最も顕著な特徴は、細胞傷害性Tリンパ球活性量に対して抗体産出量が高いことである。CD4は55kD糖蛋白質である。この糖蛋白質は本来Tリンパ球上の分化抗原として定義されているが、しかし、単球/マクロファージを含むその他の細胞上にも見出される。CD4抗原は、免疫グロブリン超遺伝子群の員であり、MHSクラスII制限免疫応答における同類認識要素として関与する。Tリンパ球上でこれらのCD4抗原は、ヘルパー/誘発物質のサブセットを定義する。CD4受容体は中でも、CD4細胞（ヘルパーT細胞)、マクロファージ及びDC上に存在する。通常、CD4は、アクセサリー分子として作用し、T細胞及びその他の細胞がそれを通して互いにシグナリングする大型構造(例えばT細胞受容体)の部分を形成する。細胞傷害性リンパ球は、適正な標的細胞を直接的に破壊することができる免疫化Tリンパ球である。これらの細胞傷害性リンパ球は、in vitroでは混合リンパ球培養中で、in vivoではグラフト対宿主反応中に、又は同種移植、腫瘍細胞、又はウィルス形質転換又は化学的変更を施された標的細胞による免疫化後で発生させることができる。溶菌現象は、細胞性リンパ球溶解と呼ばれることがある。これらの細胞は、ナチュラル・キラー、及び抗体依存性細胞傷害を媒介するキラー細胞とは区別可能である。

本発明のイムノゲンは、種々の状態の予防及び/又は治療のために投与することができる。本発明の関連において、治療とは、根本的な状態の進行の阻害、減速又は逆転、或る状態の臨床的症状の改善、又はその状態の臨床的症状の出現の予防を包含するものとする。云うまでもなく、本発明の方法及び組成物を用いることにより、動物内のヘパラナーゼ活性と関連する任意の状態を治療することができ、本発明の方法及び組成物は、過剰ヘパラナーゼ活性と概ね関連する状態を治療するのに有用である場合がある。例えば本発明の方法を用いることにより、負傷、炎症、糖尿病又は自己免疫に関連する状態を治療することができる。さらに、本発明の方法を用いることにより、血管由来の状態、例えばアテローム性動脈硬化、関節炎、黄斑変性及び乾癬を治療することができる。ヘパラナーゼに対する免疫応答を導出するイムノゲンで治療するのが相応しい状態を有する好適な動物、例えばウサギ、ラット、マウス、又は好ましくはヒトのような哺乳動物の同定が、当業者の能力及び知識の範囲内で十分に行われる。例えばヘパラナーゼ活性を決定するための上述の方法のうちの任意のものが、本発明の方法による治療が相応しい状態を有する動物を決定するのに有用である。

予防用途の場合、本発明のイムノゲンを含有する組成物が、今のところはその状態を積極的には患ってはおらず、むしろ症状をまだ示していないか、或いはその状態の無症状期間にある患者に、状態の将来の影響を少なくとも部分的に低減するのに十分な量で投与される。このような量は「有効量」としても定義される。この用途において、正確な量はまた、患者の健康状態及び全身的な免疫レベル、並びに、下記に説明する投与スケジュールに依存する。

治療用途の場合、組成物は、すでにその状態を患っている患者に、この状態を治癒するか又は少なくとも部分的に制止するのに十分な量で投与される。このことを達成するのに十分な量が「有効量」として定義される。この用途に効果的な量は、その状態の重篤性及び患者自身の免疫系の全身状態に依存することになる。投与スケジュールも、疾患状況及び患者の体質に応じて変化することになり、単回のボーラス投与又は連続的な輸液から、1日当たり複数回の投与、例えば4〜6時間毎の投与、或いは医師の指示及び患者の状態に応じた投与になるのが典型的である。

別の実施態様の場合、本発明の方法を用いることにより、腫瘍の成長を阻害するか、又は、一次腫瘍とは異なる部位における二次腫瘍の成長である腫瘍転移を予防することができる。本発明の方法によって治療することができる好適な腫瘍の例は下記のものを含む：脳腫瘍、例えば星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫及びPNET(Primitive Neural Ectodermal Tumor)；膵臓腫瘍、例えば膵管腺癌；肺腫瘍、例えば小型及び大型細胞腺癌、扁平上皮癌、気管支肺胞癌；大腸癌、例えば上皮腺癌及びこれらの腫瘍の肝臓転移；肝臓腫瘍、例えば肝臓癌及び胆管腫；乳癌、例えば管腺癌及び小葉癌；婦人科系腫瘍、例えば扁平上皮乳頭腫及び子宮頚部の腺癌、及び子宮及び卵巣の上皮腺癌；前立腺腫瘍、例えば前立腺癌；膀胱腫瘍、例えば移行扁平上皮癌；RES系の腫瘍、例えばB及びT細胞リンパ腫(結節性及びびまん性)、形質細胞腫、及び、急性及び慢性白血病；皮膚腫瘍、例えば悪性黒色腫；及び軟部組織腫瘍、例えば軟部組織肉腫及び平滑筋肉腫、を含む。

云うまでもなく、本発明のイムノゲンは、予防又は治療の目的で動物に使用される場合には、付加的にキャリヤを有する組成物の形で投与することができる。従って本発明は、動物におけるヘパラナーゼ活性を阻害するための、イムノゲン及びキャリヤの組成物を含む。上記で例示した任意の好適なイムノゲンを本発明の組成物の関連において使用することができる。例えばカプセル、サシェ、紙又はその他の容器の形態であってよい好適なキャリヤは、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びにこれらの組み合わせのうちの1又は2種以上を含む。キャリヤはさらに少量の補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、保存剤又は緩衝液を有することができる。これらは、結合ポリペプチドの保存期間又は効用を向上させる。キャリヤはこれが希釈剤として作用する場合、固形、半固形、又は液状材料であってよい。この材料はビヒクル、賦形剤、又は活性成分のための媒質として作用する。本発明のこのような組成物は、製薬業界に良く知られた形式で調製される。

本発明の組成物は、種々の形態であってよい。これらの組成物は例えば、固形、半固形及び液状の投与形、例えば錠剤、トローチ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、（固形物として又は液状媒質中の）エアロゾル、例えば最大10重量%の活性化合物を含有する軟膏、軟及び硬ゼラチン・カプセル剤、座剤、懸濁液、丸薬、散剤、溶液、分散体、疎液化形、リポソーム、注射可能・輸液可能な溶液、及び滅菌パッケージ散剤及び局所用パッチを含む。好ましい形態は、所期の治療用途及び投与様式に依存する。本発明の目的では、イムノゲンは、種々のルートによって、例えば経口又は直腸ルートによって、局所又は非経口で、例えば注射又は輸液(静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内)によって投与することもできる。本発明の組成物は、哺乳動物への投与後、活性成分の急速放出、徐放、又は遅延放出を可能にするように、当業者に良く知られているように調製することができる。

従って本発明は、当業者に良く知られている調査法、診断法、予防法又は治療法のために、in vivo及びin vitroで使用することができる。例えば、フルレングス・マウス・ヘパラナーゼのcDNA及びポリペプチド配列は、そのポリペプチドの大量産出を可能にすることができ、ヘパラナーゼ蛋白質構造研究に役立ち、また、新規の抗癌薬及び抗炎症薬の開発に関与するヘパラナーゼ・インヒビターのスクリーニング及び検証に役立つ。

もちろん、本明細書に開示された本発明の原理内で当業者が変更を加え得ることは明らかであって且つ予期されることであり、このような変更形は、本発明の範囲内に含まれるものとする。

本明細書中に挙げた全ての参考文献の全体を引用する。

実施例
本発明を実施例に基づきさらに説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとは決して解釈すべきではない。コンベンショナルな方法、例えばベクター及びプラスミドの構成、このようなベクター及びプラスミド中へのポリペプチド・コード化DNA又はRNAの挿入、宿主細胞中へのプラスミドの導入、並びに、DNA、RNA及び蛋白質の発現及びその決定において採用される方法は、Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を含む多数の刊行物から得られる。

ヘパラナーゼ
当業者に良く知られた方法により、細菌発現系においてフルレングス・マウス・ヘパラナーゼ・ポリペプチドを発現させた。手短に云えば、マウス胚cDNAライブラリからマウス・ヘパラナーゼ遺伝子をクローニングし、フルレングス遺伝子を、アミノ末端にポリヒスチジン・コード化配列を有するプラスミドpET28a中にクローニングした。ポリペプチドをE.coli中に発現させ、調製電気泳動法により封入体から精製し、PBS中に緩衝液交換し、そして内毒素に関して試験した。動物試験における全てのポリペプチド調製物は1.25＜EU/mlの内毒素を含有した。

樹状細胞(DC)
下記のプロトコルを用いて、C57BL/6同系マウスの骨髄からDCを分離した。骨髄細胞を脛骨及び大腿骨から収穫し、続いてこれらの細胞を、抗体カクテル(抗CD4(クローンGK1.5)、抗CD8(2.43)、抗Ia(B21-2)、抗B220(RA3-3A1/6.1)及び抗Gr-1(RB6-8C5/1))と一緒に30分間にわたって4℃でインキュベートし、次いでウサギ補体と一緒にさらに30分間にわたって37℃でインキュベートすることにより、これらの細胞から既存のT細胞、B細胞、マクロファージ及び顆粒球を消耗させた。残りの細胞をGM-CSF(20ng/ml)及びIL-4(50ng/ml)の存在において、37℃、5%CO₂で3日間にわたって、10%ウシ胎仔血清(FCS)Dulbecco's Modified Eagles Medium(DMEM)中に培養した。非粘着細胞を廃棄し、残りの細胞をさらに3日間にわたって培養した。その結果として得られた非粘着細胞を、新鮮な培地を有する新しいプレートに移し、さらに3日間にわたって培養した。これらの成熟DCを収穫し、免疫化試験の際にAPCとして後で使用するために、低温保存した。DCに関する形態及び表現型の分析を、フローサイトメトリによって評価した。典型的にはDCは広範囲な樹状突起を有し、細胞群を形成し、高レベルのMHCクラスII、コスティミュラトリー分子、例えばB7.1/CD80及びB7.2/CD86を発現させるが、その他の細胞系統マーカー、例えば単球/マクロファージ・マーカーCD14に対してはネガティブである。

ヘパラナーゼ抗原でパルス化するために、DCを血清非含有AIMV培地中で2回洗浄し、AIMV中で6〜10時間にわたってヘパラナーゼ蛋白質(100μg/ml)と一緒にインキュベートした。これらの細胞を使用前にAIMV中で2回洗浄した。

実施例1
この実施例は、ヘパラナーゼに対する免疫応答を導出する有効量のイムノゲンを動物に投与することを示す。APCの一例であるDCを、ヘパラナーゼでパルス化した(DC-ヘパラナーゼ)。C57BL/6マウスにDC-ヘパラナーゼを、マウス1匹あたり5 x 10⁴個の細胞の濃度で静脈内(i.v.)投与した。対照群においては、アルカリ・フォスファターゼ(AP)でパルス化されたDC(DC-AP又はDC-対照)、又はPBSをマウスにi.v.投与した。10日間のインターバルで、全部で3回の投与を行った。最後の免疫化から7日後に、3つのマウス群全てから採取した血清を、ELISAによって抗ヘパラナーゼ抗体に関して試験した。

結果を図1〜3に示す。これらの図は、PBS(図1)、DC-対照(図2)及びDC-ヘパラナーゼ(図3)の投与後に、種々の希釈率で生成された抗体濃度を示すグラフである。これらの結果は、強力な抗ヘパラナーゼ抗体応答が、ヘパラナーゼでパルス化されたDCの投与後に誘発されたが、しかし対照群においては誘発されなかったことを示す。抗ヘパラナーゼ抗体は、免疫化前の血清中でも検出できなかった。

実施例2
この実施例は、ヘパラナーゼに対する免疫応答を導出する有効量のイムノゲンを動物に投与することを示す。APCの一例であるDCを、ヘパラナーゼでパルス化した(DC-ヘパラナーゼ)。C57BL/6マウスにDC-ヘパラナーゼを、マウス1匹あたり5 x 10⁴個の細胞の濃度でi.v.投与した。対照群においては、ヒヨコ・オボアルブミン(OVA)でパルス化されたDC(DC-OVA又はDC-対照)、又はPBSをマウスにi.v.投与した。10日間のインターバルで、全部で2回の投与を行った。第2回免疫化から7日後に、脾臓細胞を調製し、Elispotアッセイを用いて検定した。手短に云えば、3つのマウス試験群から採取した脾臓細胞を、96ウェル平底プレート内に1ウェル当たり2 x 10⁵個添加した。刺激を受けた細胞は、2 x 10⁴のDC-ヘパラナーゼ、DC-対照又はPBSを受容した。細胞を10%ウシ胎仔血清(FCS)を有するRPMI中で培養した。in vitro培養から4日後に、青で染色されたスポット(単一抗原で活性化されたT細胞により放出されたIFN-γの抗体染色による)をカウントし、非免疫化マウス又は対照免疫化マウスから採取した脾臓細胞を備えたプレートと比較した。

結果を図4〜6に示す。これらの図は、PBS(図4)、DC-対照(図5)及びDC-ヘパラナーゼ(図6)の投与後に、種々の希釈率でIFN-γを生成するスポットの数を示すグラフである。これらの結果は、ヘパラナーゼでパルス化されたDCで免疫化されたマウス中には高頻度のヘパラナーゼ特異的T細胞があったが、しかし対照マウス群においてはなかったことを示す。DC-ヘパラナーゼが投与されたマウスから採取された脾臓中、IFN-γを生成するスポットの数は、対照群におけるその数のほぼ10倍であった。

実施例3
この実施例は、有効量のイムノゲンを動物に投与した後の、動物内の腫瘍成長(腫瘍転移成長を含む）の阻害を示す。APCの一例であるDCを、ヘパラナーゼでパルス化した(DC-ヘパラナーゼ)。C57BL/6マウスにDC-ヘパラナーゼを、マウス1匹あたり5 x 10⁴個の細胞の濃度でi.v.投与した。対照群においては、APでパルス化されたDC(DC-AP又はDC-対照)、又はPBSをマウスにi.v.投与した。10日間のインターバルで、全部で3回の投与を行った。最後の免疫化から7日後に、1 x 10⁶個のルイス肺癌細胞(同系腫瘍ライン)をフットパッド内に注射することにより、マウスを攻撃した。腫瘍の直径がほぼ5mmに成長したときに、腫瘍を担持する脚を外科的に除去した。マウスの生存を毎日モニターした。

その結果を図7に示した。図7は、PBS、DC-AP(DC-対照)及びDC-ヘパラナーゼの投与後の時間の関数として生存率(%)を示すグラフである。これらの結果は、マウス生存率がDC-ヘパラナーゼ群において有意に高められ、これに対して、対照群の全てのマウスが、一次腫瘍除去後20日以内に肺転移のために死亡したことを示す。DC-ヘパラナーゼで免疫化されたマウスの30%は治癒したと考えられた。なぜならば、これらのマウスは腫瘍攻撃後120日よりも長く生存したからである。これらの結果は、DC-ヘパラナーゼによる免疫化が転移モデルにおける腫瘍担持マウスの生存率を高くすることを示す。

実施例4
この実施例は、有効量のイムノゲンを動物に投与した後の、動物内の腫瘍成長(腫瘍転移成長を含む）の阻害を示す。APCの一例であるDCを、ヘパラナーゼでパルス化した(DC-ヘパラナーゼ)。C57BL/6マウスにDC-ヘパラナーゼを、マウス1匹あたり5 x 10⁴個の細胞の濃度でi.v.投与した。対照群においては、OVAでパルス化されたDC(DC-OVA又はDC-対照)、又はPBSをマウスにi.v.投与した。10日間のインターバルで、全部で3回の投与を行った。10日後に1 x 10⁶個のB16黒色腫細胞を注射することによりマウスを攻撃した。60日目にマウスを犠牲にして、肺を除去し、肺上の腫瘍瘤塊の数をカウントすることにより測定した。

その結果を図8に示した。図8は、PBS、DC-OVA(DC-対照)及びDC-ヘパラナーゼの投与後の肺転移平均数を示すグラフである。これらの結果は、肺転移平均数がDC-ヘパラナーゼ群において有意に低減されることを示す。DC-ヘパラナーゼで処理されたマウス群にはほぼ80%の強力な阻害率が見出された。これに対してDC-APで処理されたマウス群においてはほぼ10%のわずかな阻害率しか見出されなかった。

実施例5
この実施例は、SEQ ID NO:1で示されるマウス・ヘパラナーゼのポリペプチド配列、及び、SEQ ID NO:2で示されるマウス・ヘパラナーゼのcDNA配列の同定、発現、精製及び特徴付けを示す。

アレイ型cDNAライブラリ・スクリーン
フルレングス・ヘパラナーゼ遺伝子を得るために、マウス(菌株FVB)胚(12.5日)cDNAライブラリをスクリーニングした。pCMV6-XL3(Origene Technologies, Inc., Rockville, MD)中にクローニングされたオリゴ-dTプライム型ライブラリの96ウェル・マスター・プレートを、PCRによってスクリーニングした。ヒト遺伝子配列から誘導された2つのプライマー(順5'-CAAGAACAGC ACCTACTCAA GAAGC-3'、逆5'-GCCACATAAA GCCAGCTGCA AAGG-3')をPCRスクリーニングのために使用した。陽性サブプレート10Aを順序付けしてPCRによってスクリーニングし、これにより、陽性サブウェルを同定した。陽性サブウェルのストックをLB-アンピシリン・プレート上に平板培養し、コロニーをスクリーニングすることにより、ヘパラナーゼcDNAクローンを同定した。ほぼ1800bpのインサートを有する単一クローンを分離し、配列決定した。

発現
マウス遺伝子のオープン・リーディング・フレームを、Ventポリメラーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)を使用したPCRによって、プラスミドpEEl3.1(Lonza Biologics, Inc., Fair Lawn, NJ)中にクローニングした。安定的な細胞株を確立するために、エレクトロポレーションによってNS0細胞(Lonza Biologics)に、線形化プラスミドDNAをトランスフェクトし、そして透析されたウシ胎仔血清及びグルタミン・シンテターゼ補足物質(JRH Biosciences, Lenexa, KA)を有するグルタミン非含有DMEM中で培養した。ポリクローナル抗ヘパラナーゼ抗体を使用したウェスタン・ブロットによって、ポリペプチド発現に関していくつかのクローンをスクリーニングし、ローラ・ボトル内での培養のために最高産出体を選択した。

ポリペプチド精製
マウス・ヘパラナーゼを発現させるNS0細胞(8x10⁹)を収穫し、1%Triton X-100, 500mM NaCl, 15mM ジメチルグルタル酸ナトリウム, pH6.0を含有する緩衝液で、これらを処理した(30分、4℃)。遠心分離後、抽出物を20 ml Con-Aビード(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)と一緒に、4℃で一晩にわたって、静かに揺り動かしながらインキュベートした。結合された物質を200mlの20%α-メチルマンノシド、500mM NaCl、15mM ジメチルグルタル酸ナトリウム、pH6.0で溶離した。Con-A溶出液を1800mlの15mMジメチルグルタル酸ナトリウム、pH6.0で希釈し、Hi-Trapヘパリン・セファロース・カラム(Amersham Pharmacia)に装填した。カラムを15mMジメチルグルタル酸ナトリウム、pH6.0中のNaCl(0.025〜1.5M)の勾配で溶離した。そして、画分全てをヘパラナーゼ活性に関して試験した。活性画分をプールし、Ultrafree 濃縮器(NMWL 30K, Millipore, Bedford, MA)で濃縮し、そしてSuperdex 75カラム(Amersham Pharmacia)を使用して、これらにゲル濾過クロマトグラフィを施した。画分全てを280nmのUV吸光率によってモニタリングし、ヘパラナーゼ活性に関して試験した。酵素活性画分を、更なる特徴付けのためにプールした。

SDS-PAGE及びウェスタン・ブロット
4〜20%勾配ポリアクリルアミド・ゲルを使用して、還元条件下でSDS-PAGEによってポリペプチドを分解した。電気泳動の後、ゲルをクーマシー・ブルーで染色するか、又はポリビニリデンジフルオリド膜(Millipore)に移した。ヒト・ヘパラナーゼに対して生じたポリクローナル抗体でプローブした。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに接合されたヤギ抗ウサギ抗体と一緒にインキュベートした後、化学発光基質(Amersham Pharmacia)を使用してブロットを発生させた。

ポリペプチド配列分析及び質量分析
ポリビニリデンジフルオリド膜上に移されたポリペプチドをクーマシー・ブルーで染色した。個々のバンドを切り取って、Applied Biosystems Procise Model 492蛋白質シーケンサー(Applied Biosystems, Norwalk, CT)において自動化エドマン分解法を行うことによって、ポリペプチド配列を得た。Poros Reverse Phase R1/10カラム(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)を有するAgilent 1100 HPLCを使用して、液体クロマトグラフィ-質量分析(LC-MS)によって、精製されたポリペプチドを直接的に分析した。カラムをThermo-Finnigan LCQ Deca XPイオントラップ質量分析計にカップリングした。

ヘパラナーゼ活性
0.1M 酢酸ナトリウム, pH 5.0, 0.01% Triton X-100を含有する緩衝液中で25μlの³⁵S-ECM-HSPG(Israel Vlodavsky博士(The Hadassah-Hebrew University Hospital, Jerusalem Israel)から提供)と、ポリペプチド試料を混合した。37℃で一晩インキュベーションした後、試料をSuperose 12カラム(0.7 x 25cm, 0.5ml/分)に装填し、画分(0.25ml/画分)の放射能をβ-シンチレーション・カウンターにおいて測定した。酵素活性をHS分解能力に関しても検査した。これを目的として、³H-HS-セファロース(6.25nM)をヘパラナーゼ反応における基質として置換した。一晩のインキュベーションの後に反応緩衝液中に放出された放射能を測定した。

フルレングス・マウス・ヘパラナーゼ遺伝子のクローニング
フルレングス・マウス・ヘパラナーゼ遺伝子を分離するために、アレイ型マウス胚cDNAライブラリを、ヘパラナーゼ・コーティング配列の中央に配置されたプライマーを使用してスクリーニングした。スクリーニングされた5 x 10⁵個のクローンから、ほぼ1800塩基対のインサートを含有する単一陽性クローンを分離して配列決定した。このクローンは、理論上の分子質量60064Daのアミノ酸535個から成るポリペプチドをコード化する1605bpのオープン・リーディング・フレームを含有した。クローンは、開始コドンの上流側の81塩基対を含んだ。コンセンサス・ポリアデニル化シグナルAATAAAを、ストップ・コドンの下流側で、ポリ(A)尾部の22bpだけ上流側に配置した。

ポリペプチド発現、精製及び特徴付け
マウス遺伝子をマウス骨髄腫細胞株(NS0)中にトランスフェクトし、グルタミン・シンテターゼ選択マーカーを使用して、安定的なクローンを分離した。細胞培養上澄中及び洗剤処理された細胞抽出物中でヘパラナーゼ活性を検出し、そしてウェスタン・ブロット分析によって発現を確認した。組換えポリペプチドを精製するために、NS0細胞を洗剤で処理し、抽出物をCon-Aセファロース・ビードと一緒にバッチモードで一晩インキュベートした。ビードを洗浄し、ポリペプチドをα-メチルマンノシドで溶離した。

酵素活性フラグメントをヘパリン-セファロース・アフィニティ・カラムに酵素活性フラグメントを装填し、ポリペプチドを塩勾配を用いて溶離した。このステップから得られた活性画分を濃縮し、ゲル濾過クロマトグラフィによってポリペプチドを分解した。活性画分をSDS-PAGEゲル上で走行させたとき、検出された主要なバンドは50及び8kDaである。これはヒト・ポリペプチドに類似している。

精製された組換えマウス・ポリペプチドのウェスタン・ブロット分析はまた、少量のより高い分子量65-70kDaの種を検出した。これはフルレングスのプロセッシングされていないポリペプチドを表し、既知のヒト・ヘパラナーゼと一致する。50kDaバンドのN末端配列はKEF XST YSR SSV DML YSF AKC SGL DLI FGであり、8kDaペプチドに関しては、エドマン分解法によって測定して、DDV VDL EFY TKR PLR SVS PSF LIS TID ASLである。50kDaポリペプチドの第4残基は配列決定中には検出されなかった。このことはこの部位がグリコシル化されていることを示唆する。8kDaペプチドのLC-MS分析は、8051.0の分子質量を明らかにした。このことは、このペプチドが、8050Daの質量を有する71アミノ酸ペプチドAsp²⁹〜Lys¹⁰⁰に対応することを強く示唆する。

成熟ヒト・ヘパラナーゼ・ポリペプチドは、50kDa及び8kDaペプチドのヘテロ二量体として存在することができる。マウス酵素に関して本明細書中で報告したデータは、この構想と一致する。先ず535アミノ酸・マウス・プレプロヘパラナーゼを、シグナル・ペプチドの開裂により、60-kDaプロヘパラナーゼ・ポリペプチド中にプロセッシングする。続いて、内部49残基ペプチド(Glu¹⁰¹〜Gln¹⁴⁹)を蛋白質分解除去し、その結果、50kDaポリペプチド(Lys¹⁵⁰〜Ile⁵³⁵)と、8kDaペプチド(Asp²⁸〜Lys¹⁰⁰)とから成る非共有結合へテロ二量体として存在する成熟酵素が生じる。

マウス及びヒト・ヘパラナーゼの比較
マウス・ヘパラナーゼとヒト・ヘパラナーゼとは、アミノ酸レベルで77%の同一性を有することが見極められた。マウス・ポリペプチドは、ヒト・ポリペプチドよりも8残基だけ短く(535対543)、この差異は、マウス・シグナル配列がより小さいことに起因する。マウス・ヘパラナーゼのより小さな8kDaフラグメントは、ヒト・ポリペプチドよりも2アミノ酸だけ短く、これに対してより大きいポリペプチドは同じ長さ、つまり385アミノ酸である。マウス・ヘパラナーゼの潜在的なN-リンクされたグリコシル化部位は、ヒトよりも2つだけ少ないが、しかし、マウス中に存在するその4つの部位はヒト・ヘパラナーゼ中で保存される。精製マウス・ポリペプチドのより大きなサブユニットは、たとえこれらのポリペプチドが同数のアミノ酸残基を含有していても、ヒト酵素よりもSDS-PAGEゲル上で高速に移動する。このことは、マウス・ヘパラナーゼ中に存在するグリコシル化部位がより少ないという観察と一致する。

マウス・ヘパラナーゼ活性
組換えマウス・ヘパラナーゼが酵素活性であるか否かを試験するために、代謝的に放射性同位元素で標識付けされたHSPGと一緒に、精製ポリペプチドをインキュベートした。Superose 12 カラム上でゲル濾過することにより、反応生成物を分析した。初期画分(5-15)において、ECM中の未消化³⁵S-HSPGを溶離し、これに対して、マウス・ヘパラナーゼと一緒にインキュベートされた基質を、後期フラクション(16〜35)における低MWフラグメントとして溶離した。対照として使用された精製ヒト血小板ヘパラナーゼは同様の活性プロフィールを生じさせた。

ヒト・ヘパラナーゼ酵素活性はpH依存性であることが実証されている。マウス・ヘパラナーゼを種々のpH条件で³H-HSと一緒にインキュベートしたときに同様の活性プロフィールが観察された。酵素はpH5.0で最も活性であり、この場合、50ngのヘパラナーゼは³H-HS最大分解量6.25nmoleをもたらした。pH7.5のヘパラナーゼはまだHSを分解することができたが、しかし、匹敵する活性を達成するためには10倍近く多くの酵素が必要となった。マウス・ヘパラナーゼをpH4.0又は8.0でインキュベートすると酵素活性はほとんど又は全く検出されなかった。

in vitroでヒト・ヘパラナーゼ活性を阻害し、in vivoで腫瘍転移を阻害することが判っているラミナリン硫酸は、50nMのIC₅₀で、1μMでマウス・ヘパラナーゼ活性を完全に阻害した(図6)。酵素活性はまた、ヘパリン及びその他のヘパラナーゼ・インヒビターによって阻害される。

図1は、対照ポリペプチドの動物へのin vivo投与の結果、動物内に誘発されたヘパラナーゼ特異的抗体の濃度を種々の希釈率で示すグラフである。図2は、対照ポリペプチドでパルス化されたDSの動物へのin vivo投与の結果、動物内に誘発されたヘパラナーゼ特異的抗体の濃度を種々の希釈率で示すグラフである。図3は、ヘパラナーゼでパルス化されたDSの動物へのin vivo投与の結果、動物内に誘発されたヘパラナーゼ特異的抗体の濃度を種々の希釈率で示すグラフである。図4は、対照ポリペプチドの動物へのin vivo投与の結果、動物内にIFN-γを生成するElispotの数を種々の希釈率で示すグラフである。図5は、対照ポリペプチドでパルス化されたDCの動物へのin vivo投与の結果、動物内にIFN-γを生成するElispotの数を種々の希釈率で示すグラフである。図6は、ヘパラナーゼでパルス化されたDCの動物へのin vivo投与の結果、動物内にIFN-γを生成するElispotの数を種々の希釈率で示すグラフである。図7は、PBS、対照ポリペプチドでパルス化されたDC、又はヘパラナーゼでパルス化されたDCの動物へのin vivo投与に続く動物の生存率(%)を、経時的に示すグラフである。図8は、PBS、対照ポリペプチドでパルス化されたDC、又はヘパラナーゼでパルス化されたDCの動物へのin vivo投与に続く動物内の肺転移の平均数を示すグラフである。

Claims

動物におけるヘパラナーゼ活性を阻害する方法であって、ヘパラナーゼに対する免疫応答を誘導するために有効な量のイムノゲンを該動物に投与することを含む、前記方法。
該イムノゲンがヘパラナーゼ又はそのフラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
該ヘパラナーゼ又はそのフラグメントが、マウス・ヘパラナーゼ又はそのフラグメントである、請求項２に記載の方法。
該イムノゲンが、抗原提示細胞(APC)を含み、該抗原提示細胞の表面上に、ヘパラナーゼ又はそのフラグメントが提示される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
該APCが樹状細胞である、請求項４に記載の方法。
該イムノゲンが、ヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化するDNA又はRNAを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
該DNA又はRNAが、クローニング・ベクター又は発現ベクターを介して該動物にデリバリーされる、請求項６に記載の方法。
該DNA又はRNAが、マウス・ヘパラナーゼ又はそのフラグメントをコード化する、請求項６又は７に記載の方法。
該方法が、ヘパラナーゼに特異結合する抗体の生成を誘発する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
該方法が、CD4+Tヘルパー細胞の生成を誘発する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
該方法が、ヘパラナーゼに対して特異的な細胞傷害性リンパ球の生成を誘発する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
該方法が、該動物中のヘパラナーゼ活性と関連する状態を治療するのに用いられる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
該状態が炎症又は負傷に関連する、請求項１２に記載の方法。
該状態が糖尿病又は自己免疫に関連する、請求項１２に記載の方法。
該状態が、アテローム性動脈硬化、関節炎、黄斑変性及び乾癬から成る群から選択された血管由来の状態である、請求項１２に記載の方法。
該方法が腫瘍成長を阻害する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
該方法が、腫瘍の転移を予防する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
該動物が哺乳動物である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
該動物がヒトである、請求項１８に記載の方法。
SEQ ID NO:1又はそのフラグメントを含む分離されたヘパラナーゼ・ポリペプチド。
SEQ ID NO:2又はそのフラグメントを含むヘパラナーゼ・ポリペプチドをコード化していることを特徴とする分離されたヘパラナーゼ・ポリヌクレオチド。
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含むクローニング・ベクター又は発現ベクター。
請求項２２に記載のクローニング・ベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞。
イムノゲン及びキャリアを含む動物内のヘパラナーゼ活性を阻害するための組成物。
SEQ ID NO:1及びキャリヤを含む動物内のヘパラナーゼ活性を阻害するための組成物。
SEQ ID NO:2及びキャリヤを含む動物内のヘパラナーゼ活性を阻害するための組成物。