DE60207198T2

DE60207198T2 - Transplantate für die wiederherstellung von osteochondralen schäden

Info

Publication number: DE60207198T2
Application number: DE60207198T
Authority: DE
Inventors: Alessandra Pavesio; Lanfranco Callegaro
Original assignee: Fidia Advanced Biopolymers SRL
Current assignee: Anika Therapeutics SRL
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2002-02-06
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2022-02-07
Also published as: ATE309007T1; CA2437440A1; CA2437440C; AU2002256617B2; EP1357953B1; DK1357953T3; AU2002256617B8; WO2002070030A1; DE60207198D1; JP2004524904A; US20040076656A1; EP1357953A1; US7968111B2; ES2250642T3; ITPD20010032A1; WO2002070030A8

Description

GEGENSTAND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und die Verwendung eines biokompatiblen Zweikomponentenmaterials, aufgebaut durch:

a. eine dreidimensionale Matrix von Hyaluronsäurederivaten mit einer Struktur, die Leerräume umfasst, gebildet durch kommunizierende Poren und/oder ein Gewirr von feinen Fasern oder Mikrofasern, mit oder ohne Zellen, und
b) eine poröse, dreidimensionale Matrix, aufgebaut aus einem keramischen Material oder einem Verbundmaterial, das mindestens ein keramisches Material enthält, mit oder ohne Zellen;
c) und wobei wahlweise pharmakologisch oder biologisch aktive Substanzen enthalten sind;

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Verlust von Osteochondralgewebe aus den Gelenken als Folge einer extensiven Arthritis, Nekrose oder als Ergebnis eines Traumas oder der Entfernung eines Tumors erfordert eine wiederaufbauende Chirurgie, um den Defekt zu reparieren.
Die Behandlung von solchen Defekten mittels eines Gelenkersatzes wird dadurch beschränkt, dass die nicht-biologischen Materialien, die verwendet werden, dazu neigen, sich abzunutzen und zu zerreißen, und dass der Ersatz selbst schwierig zu bewegen sein kann.
Alternativ ist es möglich, sich auf autologe, allogene oder xenogene Knochentransplantate zu verlegen. Der ideale Weg zum Ersatz von Knochen besteht in der Transplantation von autologem Gewebe, das eine bessere osteogene Kapazität als allogene Transplantate und Hetero-Transplantate aufweist, wie während der Resorption durch die Gegenwart von Mesenchymal- Zellen gezeigt, die in ostreogene und chondrogene Zelllinien differenzieren (K. L. B. Brown et al., Surg. 1982, 64A, 270–279). Weiterhin tragen allogene Transplantate und Hetero-Transplantate Antigene der Histokompatibilität, was es erforderlich macht, die Patienten immunosuppressiven Behandlungen zu unterwerfen, während autogene Transplantate keine immunologischen Antworten verursachen. Daneben besteht die Möglichkeit, dass allogene Transplantate und Hetero-Transplantate Viren an den Empfänger übertragen können, wie HIV, Hepatitis oder BSE.
Da autogene Knochen-Transplantate ein Zweittrauma beim Patienten verursachen, wenn das Transplantat von der Donorstelle entnommen wird und aufgrund des Mangels von verfügbarem Gewebe, ist die Verwendung dieses Verfahrens jedoch sehr eingeschränkt.
Orthopädische Forschungen haben sich lange Zeit auf neue künstliche Materialien konzentriert, die geeignet für osteochondrale Transplantate sind, die den Bedarf, sich auf Gewebstransplantate zu verlegen, reduzieren oder eliminieren würden.
Um diese Erfordernisse zu erfüllen, muss das Material biokompatibel sein, mit einer Geschwindigkeit biologisch absorbierbar sein, die vergleichbar dem Knochenwachstum ist, fähig sein, Belastung auszuhalten, leicht zu sterilisieren und zu verarbeiten sein, osteoaktiv sein, d.h. es muss ein Osteoinduktor, um die Mesenchymal-Zell-Differentation in Knochen-Vorläuferzellen zu induzieren, und ein Osteokonduktor sein, der das Wachstum der Knochen innerhalb des Transplantates erlaubt.
Die Techniken, die in der Literatur für die Knochen-Regeneration berichtet wurden, beziehen sich auf die Verwendung von keramischen Materialien, Polymeren, zusammengesetzten Materialien und bioaktiven Molekülen.
Die Tatsache, dass von einem chemischen und strukturellen Standpunkt Calciumphosphate dem mineralischen Teil von Knochen ähnlich sind, die hauptsächlich von biologischen Hydroxyapatiten gebildet werden, hat die Verwendung von keramischen Materialien als Biomaterial zur Induzierung der Osteogenese gefördert.
Die keramischen Materialien, die am meisten verwendet sind, sind β-Tricalciumphosphate (TCP) und synthetischer Hydroxyapatit. Man hat nachgewiesen, dass sie aufgrund ihrer Porosität Osteokonduktoren sind, was die Zellkolonisation und das Knochenwachstum fördert.
Studien, die mit subkutanen Implantaten in genidentischen Ratten durchgeführt wurden, zeigen, dass die Kombination von Knochenmarkszellen und porösen keramischen Materialien, die Osteogenese mit der Bildung von neuen Knochen innerhalb der Poren fördern. Außerdem wurden kleine isolierte Bereiche von Knorpel ohne nennenswerte Endochondral-Verknöcherung beobachtet (H. Ohgushi et al., J. Orthop. Res., 1989, 4, 568–578).
Die weit verbreitete Verwendung von Polymeren erklärt sich durch die Möglichkeit verschiedene Zusammensetzung und Strukturen zu erhalten, die fähig sind, die Erfordernisse der spezifischen Anwendungen ebenso wie der Eigenschaften des biologischen Abbaus zu erfüllen. Es ist bekannt, dass Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Copolymere oder Derivate davon in verschiedenen Formen als biologische Materialien für das Wachstum von Osteocyten verwendet werden können. Die Hauptnachteile der Verwendung von solchen Gerüsten bestehen in der Immunantwort, die sich gegen das implantierte Material richtet.
Um ein Biomaterial zu erzeugen, das sowohl unter einem mechanischen als auch unter einem biologischen Gesichtspunkt zufriedenstellend ist, wurden verschiedene zusammengesetzte Materialien, die durch Mischungen von Polymeren und Calciumphosphaten gebildet werden, untersucht.
Es ist auch bekannt, dass Gerüste, die mindestens ein Hyaluronsäure-Derivat enthalten, als biologisches Material für das Gewebswachstum verwendet werden können.
Hyaluronsäure ist ein Polysaccharidether, der sich zusammensetzt aus alternierenden Resten von D-Glucuronsäure und N-Acetyl-Glucosamin. Sie besitzt eine lineare Polymerkette mit einem Molekulargewicht, das zwischen 50000 und 13000000 Da variiert, abhängig von der Quelle und den Methoden der Herstellung und der Bestimmung, die verwendet werden. Es ist in der Natur im perizellulären Gel der Fundamental-Substanz von Bindegeweben von Wirbeltieren, dessen Hauptkomponente es bildet, in der Synovial-Flüssigkeit von Gelenken, in Glaskörpern, in der Nabelschnur und in Hahnenkämmen vorhanden.
Hyaluronsäure spielt eine vitale Rolle in vielen biologischen Verfahren wie der Hydratation, der Proteoglykanorganisation, der Zelldifferenzierung, der Proliferation und der Angiogenese (J. Aiger et al., L. Biomed. Mater. Res. 1998, 42, 172–181).
Es ist auch bekannt, dass Hyaluronsäure-Fraktionen verwendet werden können, um die Gewebereparatur zu verbessern, die Intraokular-Flüssigkeit zu ersetzen oder dass man sie über die intraartikuläre Route verabreichen kann, um Gelenkserkrankungen zu behandeln, wie in den europäischen Patenten Nrn. 0 138 572 und 0 535 200 beschrieben.
Hyaluronsäure spielt eine fundamentale Rolle beim Gewebsreparatur-Verfahren, insbesondere im frühen Granulationsstadium, bei der die Koagulationsmatrix stabilisiert wird und ihr Abbau kontrolliert wird, wobei die Rekrutierung von Zellen bevorzugt wird, die entzündliche Prozesse beinhalten, wie Fibroblasten und Endothelial-Zellen und schließlich bei der Orientierung der nachfolgenden Migration der Epithelial-Zellen.
Es ist bekannt, dass die Anwendung von Hyaluronsäure-Lösungen die Gewebereparaturprozesse in Patienten mit Wunden und Verbrennungen beschleunigen. Die Rolle der Hyaluronsäure in den verschiedenen Phasen der Gewebereparaturprozesse wurde beschrieben durch den Erstellung eines theoretischen Modells durch P. H. Weigel et al., J. Theor. Biol., 119–219, 1986.
Die Verwendung von niedermolekulargewichtigen Fraktionen von Hyaluronsäure und autovernetzter Derivate davon ist auch bekannt bei der Herstellung von pharmazeutischen Verbindungen, die Osteoinduktoren sind (WO93/20827).
Die Total- oder Partial-Ester von Hyaluronsäure (HYAFF^®) und deren autovernetzte Derivate (ACP^®) sind bekannt, ebenso ihre Verwendung auf pharmazeutischen und kosmetischen Gebieten und als biologisch abbaubare Materialien (US-Patente 4 851 521; 4 965 353 und 5 676 964).
Insbesondere die Patentanmeldung Nr. WO93/20858 beschreibt Bindungslösungen und Pasten, die Hyaluronsäure und/oder die Esterderivate davon als Knochenfüller in der Chirurgie verwenden.
Schließlich wurden Ester der Hyaluronsäure vorgeschlagen in der Form von Vliesstrukturen gemäß den im US-Patent 5 520 916 beschriebenen Verfahren.
Hyaluronsäure-Derivate in dreidimensionaler Form und insbesondere Partial- und Total-Ester von Hyaluronsäure (HYAFF^®), verarbeitet in die Form von Vliesgeweben, wurden als Gerüste in der Herstellung von biologischen Materialien verwendet, die Zellen und/oder Produkte die aus solchen Zellen gebildet wurden, enthalten.
Zum Beispiel wurde kürzlich die Möglichkeit der Verwendung von Benzylestern von Hyaluronsäure (HYAFF^®-11) als Gerüst in der Form einer Vliesfaser-Struktur für die Kultivierung für menschlichen Chondrocyten in Gewebe-Konstruktionsverfahren der Knorpelrekonstruktion untersucht. In diesen 3D-Kulturen waren die Chondrocyten fähig, Hyalinknorpel-spezifische Matrixmoleküle wie Kollagen Typ II oder Proteoglykane zu produzieren (J. Aiger et al., L. Biomed. Mater. Res. 1998, 42, 172–181).
Weiterhin kann die Patentanmeldung Nr. WO97/18842 erwähnt werden, die ein Material beschreibt, das enthält:

a. eine effiziente Kultur von autologen oder homologen Stammzellen aus dem Knochenmark, partiell oder vollständig differenziert in Zellen von spezifischem Bindegewebe, die außerdem die Matrix enthält, die sich aus den genannten Zellen abscheidet oder alternativ,
a'. die extracelluläre Matrix, die sich aus vollständig oder partiell differenzierten Knochenmarksstammzellen oder alternativ durch reife Zellen des Gewebes abscheidet;
b. eine dreidimensionale Matrix, die aus Hyaluronsäure-Derivaten und insbesondere Partial- oder Total-Ester (HYAFF^®) besteht.

Hyaluronsäure-Derivate in der Form von Schwämmen (HYAFF^®-11-Schwamm, hergestellt aus Benzylestern von Hyaluronsäure, und ACP^®-Schwamm, hergestellt aus vernetzter Hyaluronsäure), verwendet in Kombination mit Mesenchymal-Zellen, subkutan implantiert in Nacktmäuse, zeigten eine bessere osteogene und chondrogene Kapazität hinsichtlich der Menge der gebildeten Gewebes, als poröse keramische Materialien (L. A. Solchaga et al., J. Orthop. Res., 17, 1999, 205–213).
In einem weiteren Experiment wurden die oben genannten beiden Hyaluronan-Derivat-basierenden Biomaterialien auf ihre Fähigkeit untersucht, die natürliche Heilungsantwort von Gelenkknorpel für die Selbstreparatur zu verbessern. Die Einführung dieser Polymere in Osteochondral-Defekte (erstellt durch Femurkondylen von Kaninchen) stellt ein geeignetes Gerüst für den Reparaturprozess bereit: In der Tat zeigten die Defekte behandelt mit HYAFF^®-11 und ACP^®-Schwämmen eine gute Knochenfüllung und die Oberfläche der Kondylen war hauptsächlich gebildet durch Hyalin-Knorpel (L. A. Solchaga et al., J. Orthop. Res., 18, 2000, 773–780).
Tissue Engineering, Band 7, Nr. 4, 2001, pp. 263–371 offenbart ein zusammengesetztes Transplantat das besteht aus:

– einer Knorpel-Komponente, hergestellt aus Mesenchymal-Stammzellen (MSCs), behandelt mit TGF-beta1, geladen in einen Schwamm, hergestellt aus HYAFF^®11; und
– eine Knochen-Komponente, hergestellt aus MSCs, behandelt mit einem osteogenen Supplement, geladen in eine poröse Calciumphosphat-Keramik-Komponente,

Es hat sich als außerordentlich wichtig erwiesen, die Entwicklung von stabilen Grenzflächen zwischen den Knochenknorpel und den darunter liegenden Knochen-Strukturen zu gewährleisten, bei der Reparatur von Osteochondral-Defekten.
Zusammengesetzte Materialien, gebildet durch künstlichen Knorpel, zusammengeheftet über ein Osteokonduktor-Biomaterial-Gerüst für die Regeneration von Osteochondral-Geweben wurden in Defekte implantiert, die an Kaninchengelenken erzeugt wurden. Sechs Monate später war es möglich, den Wiederaufbau des zusammengesetzten Materials in einem Osteochondral-Gewebe zu beobachten, das dem natürlichen Vorkommen strukturell ähnlich war, mit einem klaren Rand zwischen dem Knorpel und dem Subchondral-Knochen (D. Schaefer et al., 4th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society, 2000).
Obwohl die Verwendung von Hyaluronsäure-Derivaten und keramischen Materialien daher sowohl für die Regeneration/Reparatur von Knochen und Knorpel und als Gerüst für die Kultur von differenzierten und nicht differenzierten Zellen bekannt war und obwohl ein Experte auf diesem Gebiet daher folglich erwarten konnte, dass es möglich war, eines dieser Materialien zur Herstellung von Osteochondral-Transplantaten zu verwenden, konnte nicht vorhergesehen werden, wie durch die vorliegende Erfindung demonstriert, dass wenn die beiden Materialien einmal miteinander gekoppelt sind, es möglich sein würde, separate Bildungen von Knorpel und Knochen zu erhalten, die strukturell integriert sind aber ohne Penetration zwischen den Geweben, wie in natürlichem Osteochondral-Gewebe.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und die Verwendung von biokompatiblen Zwei-Komponenten-Materialien, aufgebaut durch:

a) eine dreidimensionale Matrix von Hyaluronsäurederivaten mit einer Struktur, die Leerräume umfasst, gebildet durch kommunizierende Poren und/oder ein Gewirr von feinen Fasern oder Mikrofasern,
b) eine poröse, dreidimensionale Matrix aufgebaut aus einem keramischen Material oder einem Verbundmaterial, das mindestens ein keramisches Material enthält,

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung des zusammengesetzten biologischen Materials das oben beschrieben ist, für die Reparatur/Regeneration von Osteochondral-Defekten, erhalten durch die Kupplung von Hyaluronsäure-Derivaten und einem weiteren Material, bei dem es sich um ein keramisches Material oder ein Derivat davon oder eine weitere Komponente mit osteoaktiven Eigenschaften handeln kann. Es ist möglich, diese zusammengesetzten Materialien in Assoziation mit osteogenen Zellen für die Herstellung von künstlichen Osteochondral-Geweben zu verwenden.
Die Hyaluronsäure-Derivate, die in den dreidimensionalen Gerüsten (A) verwendet werden, werden aus der folgenden Gruppe ausgewählt:

– Hyaluronsäure-Ester, worin ein Teil oder die gesamten Carboxyfunktionen mit Alkoholen der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, cycloaliphatischen oder heterocyclischen Reihe verestert sind ( EP 0 216 453 B1 );
– autovernetzte Ester von Hyaluronsäure, worin ein Teil oder alle Carboxygruppen verestert sind mit alkoholischen Funktionen der gleichen Polysaccharid-Kette oder anderen Ketten ( EP 0 341 745 B1 );
– autovernetzte zusammengesetzte Materialien von Hyaluronsäure, worin ein Teil oder alle Carboxygruppen verestert sind mit Polyalkoholen der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen oder heterocyclischen Reihe, die eine Vernetzung mittels Spacer-Ketten erzeugen ( EP 0 265 116 B1 );
– Hemiester von Bernsteinsäure oder Schwermetallsalze von Hemiestern von Bernsteinsäure mit Hyaluronsäure oder mit Partial- oder Gesamt-Estern von Hyaluronsäure (WO96/357207);
– O-sulfatierte Derivate (WO95/25751) oder N-sulfatierte Derivate (WO98/45335);
– Amide von Hyaluronsäure oder deren Derivate (WO00/01733).

Die Hyaluronsäure-Derivate können in der Form von Vliesgeweben, Membranen, Schwämmen vorliegen. Die genannten Hyaluronsäure-Derivate können umgekehrt pharmakologisch oder biologisch aktive Substanzen beinhalten.
Die poröse dreidimensionale Matrix gemäß Punkt B kann aufgebaut sein durch:

– Hydroxyapatit oder andere Calciumphosphaten, einschließlich Tricalciumphosphat;
– Calciumsulfat;
– ein zusammengesetztes Material, das sich aus Hydroxyapatit und Tricalciumphosphat aufbaut,
– ein zusammengesetztes Material, aufgebaut durch:
a) Hydroxyapatit oder andere Calciumphosphate oder Calciumsulfate;
b) andere biokompatible keramische Materialien, Metallpartikel oder Polymere;
– ein keramisches Material beschichtet mit Hydroxyapatit oder anderen Calciumphosphaten, einschließlich Tricalciumphosphat;
– biologisch aktives Glas.

Die genannten Materialien können umgekehrt pharmakologische oder biologische aktive Substanzen enthalten.
Die pharmakologisch aktiven Substanzen der Wahl sind Antibiotika, Desinfektionsmittel und Antiseptika, antivirale, antimikrobielle und antifungale Mittel, nicht-steroidale und steroidale antiinflammatorische Arzneimittel, cytostatische, cytotoxische, anästhetische und Antikrebs-Mittel.
Unter den biologisch aktiven Substanzen sollten diejenigen erwähnt werden, die die Adhäsion von Zellen an das biologische Material begünstigen, wie Fibronektin, „RGD" oder Integrin-Sequenzen, Wachstumsfaktoren, wie „transformierender Wachstumsfaktor beta" (TGF-beta), insulinartiger Wachstumsfaktor (IGF), Epidermal-Wachstumsfaktor (EGF), saure oder basische Fibroblast-Wachstumsfaktoren (aFBF oder bFBF), Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF), Keratinocyten-Wachstumsfaktor, knochenmorphogene Proteine (BMPs), wie BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, osteogene Proteine (OPs), wie OP-1, OP-2, OP-3, Wachstumsproteine, Vitamine C, D, E und andere natürliche Substanzen wie Glukosaminsulfat.
Die verschiedenen dreidimensionalen Matrices, die die Komponenten des zusammengesetzten biologischen Materials für Osteochondral-Transplantate bilden, werden zusammengesetzt mit Hilfe natürlicher, synthetischer oder halbsynthetischer, biologisch verträglicher, bevorzugt absorbierbarer Leime, die ausreichende Hafteigenschaften besitzen. Z.B. ist es möglich, einen Fibrinleim biologischen Ursprungs zu verwenden, der weithin in der klinischen Praxis verwendet wird, und der sich als geeignet und wirksam für diesen Zweck erwiesen hat.
Alternativ sollten die Materialien der verschiedenen dreidimensionalen Matrices, die die Komponenten des zusammengesetzten biologischen Materials bilden, es erlauben, dass es möglich ist, sie durch chirurgische Nähte oder mit Gegenständen wie Schrauben oder Nägel, die in der Gesundheitsfürsorge und der Chirurgie verwendet werden, zu verbinden.
Wenn das zusammengesetzte Zwei-Komponenten-Material einmal fertig ist, kann es an den Ort des Defektes wie es ist transplantiert werden ohne irgend welche zellulären Komponenten oder Produkte davon, um als Stützstruktur in der Regeneration/Reparatur des Osteochondral-Gewebes in vivo zu wirken.
Alternativ kann das genannte zusammengesetzte Material geeignet inokuliert werden mit differenzierten oder nicht-differenzierten Zellen und kann als Gerüst verwendet werden, in welches die genannten Zellen vor der Transplantation wachsen.
Außerdem ist es möglich, die zuvor genannten zwei Komponenten nachdem osteochondrogene Zellen darin inokuliert wurden, zu verbinden. Insbesondere das dreidimensionale Gerüst, gebildet durch ein Hyaluronsäure-Derivat kann mit Vorläuferzellen oder mit reifen Chondrocyten beladen werden, um das Knorpelgewebe zu reparieren bzw. zu regenerieren. Die dreidimensionale poröse Matrix kann als Gerüst für die Kultur von Mesenchymal-Zellen oder reifen Knochenzellen verwendet werden, um den Knochen zu reparieren bzw. zu regenerieren.
Beispiel der Herstellung eines Osteochondral-Transplantates
Zellkultur
Es ist bekannt aus der Literatur, dass Osteochondral-Vorläufer-Zellen bekannt als Mesenchymal-Stammzellen (MSCs) auch in Chondrocyten und Osteocyten differenzieren.
Im Falle der vorliegenden Erfindung wurden Mesenchymal-Stammzellen aus Rattenknochenmark isoliert, gezüchtet und expandiert gemäß dem Protokoll, das in der Literatur erscheint (Lennon et al., In vitro Cell Devel. Biolo., 1996, 32, 602–611).
Wenn die Primärzellen Konfluenz erreichten, wurden sie von der Schale abgelöst durch enzymatische Behandlung und expandiert, um unterschiedliche Präparate für die Anwendung unter unterschiedlichen Bedingungen zu erhalten.
Um die Differenzierung von Mesenchymal-Zellen entlang der Chondrocytenlinie zu begünstigen, wurden sie in Gegenwart von TGF-beta1 bei 10 ng/ml gezüchtet. Um die Differenzierung von Mesenchymal-Zellen in Osteocyten zu favorisieren, wurden sie ergänzt mit z.B. 100 nM Dexamethason, 10 mM beta-Glycerophosphat und 0,05 mM Ascorbinsärue-2-phosphat (osteogene Ergänzung).
Das Kulturmedium wurde alle drei bis vier Tage gewechselt.
Konstruktion des zusammengesetzten Transplantats in vitro
Bevor sie Konfluenz erreichten, wurden die Zellen aus der Schale durch enzymatische Behandlung entfernt, gezählt, suspendiert in einem serumfreien Medium bei einer Konzentration von 5 × 10⁶/ml und in die Materialien, z.B. durch die sanfte Vakuumtechnik geladen.
MSCs behandelt mit TGF-beta1 wurden in einen Schwamm geladen, hergestellt aus Hyaluronsäure-Derivat (HYAFF^®-11) für den Aufbau einer Knorpel-Komponente eines zusammengesetzten Transplantates, und die MSCs, die den Zusatz der osteogenen Ergänzung erhielten, wurden in eine poröse Calciumphosphat-keramische Komponente für die Knochenbildung geladen. Der zellbeladene HYAFF^®-11-Schwamm und das keramische Material wurden verbunden und mit Fibrinleim verklebt, um ein zusammengesetztes Osteochondral-Transplantat zu erhalten. Das genannte Transplantat wird bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und anschließend subkutan in die Rücken von syngenen Ratten in speziellen Taschen erstellt mit einem Aufschlaginstrument transplantiert.
Die Tiere wurden drei bis sechs Wochen später getötet und das Material histologisch verarbeitet.
Ergebnisse
Das zusammengesetzte Material blieb an einem Stück nach der in vivo-Transplantation und ist eingekapselt in eine dünne Schicht von faserförmigem Gewebe, das leicht entfernt werden kann. Es gibt keine Anzeichen, dass sich der Knorpel und der Knochenteil in irgend einer Weise getrennt hätten.
Drei Wochen später kann faserförmiges Knorpelgewebe gesehen werden in den leeren Räumen der Matrix basierend auf den Hyaluronsäure-Derivaten, insbesondere im peripheren Teil des Materials. Nach sechs Wochen (Abbildung 1) verteilte sich gut organisierter faserförmiger Knorpel durch das Material, das partiell absorbiert ist. Die Chondrocyten waren in den Hohlräumen, umgeben von extrazellulärer Matrix, angeordnet. In der extrazellulären Matrix des Knorpelgewebes konnte lediglich Typ II-Knorpel gesehen werden.
Drei Wochen nach der Transplantation konnte Knochengewebe in den Poren des keramischen Materials gesehen werden und die Menge des Gewebes stieg mit der Zeit an.
Der Fibrinleim war nach sechs Wochen vollständig absorbiert.
Die separate Bildung von Knorpel und Knochen kann in den zwei Materialien gesehen werden: Weder das Knochengewebe noch der Knorpel kreuzt den Rand zwischen den beiden Materialien. Zur selben Zeit bilden die beiden Materialien ein strukturell integriertes zusammengesetztes Material infolge des Vorhandenseins des fibrösen Gewebes und der Kollagenfasern, die den Rand kreuzen.
Dies suggeriert, dass es möglich ist, ein zusammengesetztes Transplantat aus künstlichem Osteochondral-Gewebe zu konstruieren, das verschiedene Materialien verwendet, die als Gerüst für die chondrogene und osteogene Differenzierung von Mesenchymal-Zellen dienen, infolge ihrer spezifischen chondro-induktiven und osteo-induktiven Potentiale.
Nachdem die Erfindung so beschrieben ist, ist klar, dass dieses Experiment auf verschiedene Weisen im Hinblick auf die Arbeitsbedingungen und Methoden modifiziert werden kann. Solche Modifikationen werden nicht als Abweichung von Geist und Zweck der Erfindung angesehen und jegliche Modifizierung die evident für einen Fachmann auf diesem Gebiet ist, liegt im Umfang der folgenden Patentansprüche.

Claims

Biokompatibles Zweikomponentenmaterial, aufgebaut durch: a) Ein dreidimensionales Gerüst von Hyaluronsäurederivaten mit einer Struktur, die Leerräume umfasst, gebildet durch kommunizierende Poren und/oder ein Gewirr von feinen Fasern oder Mikrofasern, mit oder ohne Zellen, und b) ein poröses, dreidimensionales Gerüst aufgebaut aus einem keramischen Material oder einem Verbundmaterial, das mindestens ein keramisches Material enthält, mit oder ohne Zellen; c) und wobei wahlweise pharmakologisch oder biologisch aktive Substanzen enthalten sind, für die Herstellung eines künstlichen osteochondralen Transplantats, enthaltend einen Knorpelteil und einen Knochenteil, die getrennt voneinander vorliegen aber strukturell integriert sind, durch osteochondrogene Zellen und für die Reparatur/Regeneration von strukturell integriertem Osteochondralgewebe in vivo.
Biokompatibles Zweikomponentenmaterial nach Anspruch 1, worin das dreidimensionale Gerüst (A) aus Hyaluronsäureestern aufgebaut ist, worin ein Teil oder alle Carboxylfunktionen mit Alkoholen aus der Reihe der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, cycloaliphatischen oder heterocyclischen Alkohole verestert sind.
Biokompatibles Zweikomponentenmaterial nach Anspruch 1, worin das dreidimensionale Gerüst (A) aus autovernetzten Estern der Hylauronsäure aufgebaut ist, worin ein Teil oder alle Carboxylgruppen mit den Alkoholfunktionen der selben Polysaccharidkette oder von anderen Ketten verestert sind.
Biokompatibles Zweikomponentenmaterial nach Anspruch 1, worin das dreidimensionale Gerüst (A) aus vernetzten Verbindungen der Hyaluronsaure aufgebaut ist, worin ein Teil oder alle Carboxylgruppen mit Polyalkoholen aus der Reihe der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, heterocyclischen Polyalkohole verestert sind, wobei eine Vernetzung mittels Spacer-Ketten erzeugt wird.
Biokompatibles Zweikomponentenmaterial nach Anspruch 1, worin das dreidimensionale Gerüst (A) aus Hemiestern der Bernsteinsäure oder Schwermetallsalzen der Hemiester der Bernsteinsäure mit Hyaluronsäure oder mit Partial- oder Vollestern der Hyaluronsäure aufgebaut ist.
Biokompatibles Zweikomponentenmaterial nach Anspruch 1, worin das dreidimensionale Gerüst (A) aus sulfatierten Derivaten der Hyaluronsäure aufgebaut ist.
Biokompatibles Zweikomponentenmaterial nach Anspruch 1, worin das dreidimensionale Gerüst (A) aus Amiden der Hyaluronsäure oder Derivaten davon aufgebaut ist.
Biokompatibles Zweikomponentenmaterial nach Anspruch 1, worin das poröse, dreidimensionale Gerüst (B) aufgebaut ist aus: Hydroxyapatit oder anderen Calciumphosphaten, einschließlich Tricalciumphosphat, Calciumsulfaten, einem zusammengesetzten Material aufgebaut aus Hydroxyapatit und Tricalciumphosphat, einem zusammengesetzten Material aufgebaut aus Hydroxyapatit oder anderen Calciumphosphaten oder Calciumsulfaten und anderen keramischen Materialien, biokompatiblen Metallpartikeln oder Polymeren, einem keramischen Material, das mit Hydroxyapatit oder anderen Calciumphosphaten, einschließlich Tricalciumphosphat, beschichtet ist, bioaktivem Glas.
Biokompatibles Zweikomponentenmaterial nach Anspruch 1, worin die pharmakologisch aktiven Bestandteile aus der Gruppe ausgewählt werden, die durch Antibiotika, Desinfektionsmittel und Antiseptika, antivirale Mittel, antimikrobielle Mittel und antimykotische Mittel, nichtsteroidale und steroidale entzündungshemmende Arzneimittel, zytostatische Mittel, zytotoxische Mittel, anästhetische Mittel und Antikrebsmittel, gebildet wird.
Biokompatibles Zweikomponentenmaterial nach Anspruch 1, worin die biologisch wirksamen Bestandteile aus der Gruppe ausgewählt werden, die gebildet wird durch: Substanzen, die die Adhäsion von Zellen an biologische Materialien begünstigen, Wachstumsfaktoren, knochenmorphogene Proteine, osteogene Proteine, Wachstumshormone, Vitamine und andere natürliche Substanzen, wie Glucosaminsulfate.
Biokompatibles Zweikomponentenmaterial nach Anspruch 1, worin die Komponenten (A) und (B) in der Form von Faservliesen, Membranen, Schwämme hergestellt werden,
Biokompatibles Zweikomponentenmaterial nach Anspruch 1, worin die osteochondrogenen Zellen aus eine Gruppe ausgewählt werden, die durch Osteozyten, Chondrozyten, Knochenmark, mesenchymalen Stammzellen gebildet wird.
Biokompatibles Zweikomponentenmaterial nach Anspruch 1, worin die Zellen autologe, allologe, xenologe Zellen sind.
Verfahren zur Herstellung des biokompatiblen Zweikomponentenmaterials nach Anspruch 1, das die folgenden Schritte beinhaltet: – Herstellen des auf Hyaluronsäurederivaten basierenden dreidimensionalen Gerüstes (A); – Herstellen des auf keramischen Materialien basierenden porösen, dreidimensionalen Gerüstes (B); – Koppeln der Gerüste (A) und (B) mit adhäsiven Materialien und/oder Nähen oder durch Befestigung davon mit Artikeln, die in Gesundheitspflege und Chirurgie benutzt werden, – Kultivieren von osteochondrogenen Zellen auf dem biokompatiblen Zweikomponentenmaterial in vitro; worin bei der Herstellung von (A) oder (B) wahlweise ein oder mehrere pharmakologisch oder biologisch aktiven Bestandteile zugesetzt werden.
Verfahren zur Herstellung des biokompatiblen Zweikomponentenmaterials nach Anspruch 1, das die folgenden Schritte beinhaltet: – Herstellen des auf Hyaluronsäurederivaten basierenden dreidimensionalen Gerüstes (A); – Herstellen des auf keramischen Materialien basierenden porösen, dreidimensionalen Gerüstes (B); – Koppeln der Gerüste (A) und (B) mit adhäsiven Materialien und/oder Nähen oder durch Befestigung davon mit Artikeln, die in Gesundheitspflege und Chirurgie benutzt werden, worin bei der Herstellung von (A) oder (B) wahlweise ein oder mehrere pharmakologisch oder biologisch aktiven Bestandteile zugesetzt werden.
Verfahren zur Herstellung des biokompatiblen Zweikomponentenmaterials nach Anspruch 1, das die folgenden Schritte beinhaltet: – Herstellen des auf Hyaluronsäurederivaten basierenden dreidimensionalen Gerüstes (A) und Impfen mit differenzierten oder nichtdifferenzierten Mesenchymalstammzellen oder Knochenmarkzellen; – Herstellen des auf keramischen Materialien basierenden porösen, dreidimensionalen Gerüstes (B) und Impfen mit differenzierten oder nichtdifferenzierten Mesenchymalstammzellen oder Knochenmarkzellen; – Koppeln der Gerüste (A) und (B) mit adhäsiven Materialien und/oder Nähen oder durch Befestigung davon mit Artikeln, die in Gesundheitspflege und Chirurgie benutzt werden, worin bei der Herstellung von (A) und (B) wahlweise ein oder mehrere pharmakologisch oder biologisch aktiven Bestandteile zugesetzt werden.
Verwendung des biokompatiblen Zweikomponentenmaterials nach Anspruch 1 zur Herstellung für die Herstellung von künstlichen osteochondralen Transplantaten.
Verwendung nach Anspruch 17, worin die künstlichen osteochondralen Transplantate in der Form von Faservliesen, Membranen, Schwämmen vorliegen.