DE60129850T2

DE60129850T2 - Ersatz für verbindungsgeweben, verfahren zu dessen herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE60129850T2
Application number: DE60129850T
Authority: DE
Inventors: Albert Normand; Francine Sainte-Foy GOULET; Denis Levis RANCOURT; Rejean Sillery COUTIER; Julie Beauport TREMBLAY; Francois Sillery A. AUGER; Lucie Saint-Augustin GERMAIN; Jean St-Augustin LAMONTAGNE; Marc Sainte-Foy BOUCHARD; Eve St.-Etienne-de-Lauzon LANGELIER; Daniel Sainte-Foy DUPUIS; Stephane Hull BOUCHARD; Nazrul Sainte-Foy ISLAM; Louis-Mathieu Montreal STEVENS; Sheila St.-Charles-sur-Richelieu LAVERTY; Bertrand St. Hyacinthe LUSSIER; Anne-Marie Outremont BELZIL; Pierrot Chicoutimi TREMBLAY
Original assignee: Universite Laval
Current assignee: Universite Laval
Priority date: 2000-11-24
Filing date: 2001-11-21
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2021-11-22
Also published as: WO2002041930A2; US7347872B2; EP1363685B1; US20040067249A1; WO2002041930A8; DE60129850D1; US20030100948A1; WO2002041930A3; CA2429666A1; US7335230B2; ATE369154T1; EP1363685A2; US20070005138A9; AU2002218093A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(a) Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gewebetechnik, die Herstellung von Bindegewebe, das mit natürlichen Knochen oder synthetischem Knochenersatz verbunden ist (Sehnen, Bänder, Knorpel etc.), kann von dem erfindungsgemäßen Verfahren profitieren. Das erfindungsgemäße Verfahren wird zur Herstellung von biotechnologisch hergestelltem Bindegewebsersatz durchgeführt. Erfindungsgemäßer Bindegewebsersatz (connective tissue substitutes, CTS) kann zum Ersatz von Bändern hergestellt werden, und insbesondere von Kreuzbändern oder Sehnen.
(b) Beschreibung des Standes der Technik
Forscher auf den Gebiet der Chirurgie arbeiten seit vielen Jahren an der Entwicklung neuer Techniken und Materialien zur Verwendung als Transplantate zum Ersetzen oder zum Reparieren geschädigter oder gerissener Gewebestrukturen, insbesondere Knochen und Bindegewebe, wie Bänder und Sehnen, und zum Beschleunigen der Reparatur von Weichteilen. Beispielsweise ist es heute üblich, dass ein Orthopäde bzw. Unfallchirurg einen Mittelteil einer Patellarsehne autogenen oder allogenen Ursprungs zur Verwendung als Ersatz für ein gerissenes Kreuzband erntet. Die chirurgischen Methoden für einen solchen Ansatz sind gut bekannt. Ferner ist es üblich geworden, dass Chirurgen implantierbare Prothesen, die aus Kunststoff, Metall und/oder keramischem Material gemacht sind, zur Rekonstruktion oder als Ersatz für physiologische Strukturen verwenden. Trotz ihrer häufigen Verwendung bringen chirurgisch implantierte Prothesen jedoch viele begleitende Risken für den Patienten mit sich. Es reicht zu sagen, dass Chirurgen Bedarf an einem nicht immunogenen Transplantatmaterial mit hoher Zugfestigkeit haben, das für die chirurgische Reparatur von Knochen, Sehnen, Bändern und anderer funktioneller Gewebestrukturen verwendet werden kann.
Zu den am häufigsten verwendeten Substituten für das vordere Kreuzband (anterior cruciate ligament, ACL) gehört das Knochen-Patellarsehne-Knochen-Transplantat. Das mittlere Drittel der Patellarsehne des Patienten oder eines Spenders wird zusammen mit Abschnitten der knöchernen Einsätze der Patellarsehne als Ersatz für ein beschädigtes ACL verwendet. Die knöchernen Einsätze werden als Knochenfragmente geerntet, um die Implantation und Fixation des Ersatztransplantats in Knochentunneln, die im Schienbein und im Oberschenkelkno chen im Kniegelenk des Patienten durchgeführt wird, zu erleichtern. Das Knochen-Patellarsehne-Knochen-Transplantat ist wegen seiner hohen Belastbarkeit nach sechs Wochen und seiner funktionellen Knochenfixation eine häufige Wahl für ACL-Wiederherstellungschirurgie.
Manche Fixationseinrichtungen verwenden verschiedene Strukturen für die Kupplung mit einem Band oder einer Naht und für die Anbindung an den Knochen. Beispielsweise offenbart US 5 356 435 eine Element zum Fixieren eines Bandes in einem Knochentunnel. Das Element umfasst einen inneren Kanal zur Aufnahme eines Endes eines Bandes und eine Klemmstruktur zum Befestigen des Band-Endes in dem Kanal. US 5 356 413 (Martins et al.) offenbart eine chirurgische Verankerung mit einem Körperabschnitt und einem Nahtmaterial aufnehmenden Knochen. Ein anderer häufig verwendeter ACL-Ersatz ist das Iliotibialband-Transplantat. Das Iliotibialband ist ein Bandabschnitt, der von einem Abschnitt eines Iliotibialbandes eines Patienten oder Spenders geerntet wird, der sich in den anterolateralen Bandstrukturen des Kniegelenks befindet. Das Hauptproblem bei diesen Methoden besteht darin, dass ein anderer Teil des Körpers oder das Gelenk des Spenders oft signifikant geschwächt ist, nachdem biopsiert wurde, um Transplantate zu bekommen. Langfristige Nachteile dieses Ansatzes sind chronische Schmerzen, Patellafrakturen, Knieinstabilität und Knorpeldegeneration.
Forscher haben versucht, zufriedenstellende Polymere oder Kunststoffmaterialien zu entwickeln, die als Band oder Sehne für anderen Bindegewebsersatz dienen können. Es wurde festgestellt, dass es schwierig ist, eine langfristige Lösung unter Verwendung dieser Materialien für den dauerhaften Ersatz von Bindegeweben anzugeben.
Künstliche Materialien auf der Basis von Netzwerkfasern aus Polyester oder Polytetrafluorethylen wurden in größerem Umfang als Ersatz für Band und Sehne verwendet, und zwar mit einigem Erfolg. Es kommt jedoch nach dem Abrieb von Teilchen in der Zeit nach der Implantation zu persistenten Entzündungsreaktionen. Ferner lösen sie sich nicht leicht auf und werden nicht leicht über Remodellierung durch Gewebezellen im Körper integriert.
Biotechnologisch hergestellte Gewebe können als Transplantate, Implantate oder Prothesen für den Ersatz von beschädigtem Gewebe verwendet werden.
WO 00/69355 (Altmann et al., veröffentlicht am 23. November 2000) betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines vorderen Kreuzbandes ex vivo, welches Verfahren das Aussäen pluripo tenter Stammzellen in eine Matrix zur Bildung einer besiedelten Matrix, Befestigen der besiedelten Matrix an geeigneten Ankern und Kultivieren der Zellen in der Matrix unter für das Zellwachstum und die Zellregenerierung geeigneten Bedingungen, während die Matrix über Ankerbewegungen mechanischen Kräften ausgesetzt wird, umfasst.
US 5 855 619 (Caplan) offenbart die Verwendung eines Filaments als Lasttrageelement einer kontrahierten Gelmatrix, die Mesenchymzellen enthält. Das in dem Patent beschriebene Implantat ermöglich eine teilweise Reparatur von Bindegeweben durch Befestigen des Implantats am zu reparierenden Gewebe. Da das Implantat jedoch ohne Verankerungsenden konstruiert wird, ist das Verankerungsvermögen begrenzt.
Fibroblast-besiedelte Kollagengele (FPCG) stellen ein interessantes in-vitro-Modell von Weichteilen dar, um die Gewebeantwort auf verschiedene biologische, chemische, elektrische und mechanische Stimuli zu untersuchen. Im vergangenen Jahr wurde das Potential der Verwendung bandförmiger FPCG zur Herstellung von biotechnologisch hergestelltem vorderem Kreuzband (ACL) untersucht. Es ist jedoch bekannt, dass die mechanischen Eigenschaften von FPCG signifikant niedriger sind als jene, die für ein funktionelles ACL erforderlich sind. Es wäre äußerst nützlich, Wege zur Verbesserung ihrer mechanischen Eigenschaften zu finden, nicht nur, um ein ACL zu verbessern, sondern auch für das Gebiet des Gewebetechnik im Allgemeinen.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Implantat und ein Verfahren zu seiner Herstellung anzugeben, welche die Nachteile der Lösungsvorschläge des Standes der Technik vermeiden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Implantat für Bindegewebsersatz bei einem Menschen oder bei einem Tier anzugeben, wobei das Implantat ein Paar Knochenverankerungen aufweist, die an ihren proximalen Enden durch zumindest ein Trägerfilament verbunden sind, wobei das Trägerfilament mit zumindest einer Matrixschicht beschichtet ist, deren Dicke ausreichend ist, um die Besiedelung durch Zellen zu ermöglichen, und wobei zumindest eines von Trägerfilament oder Matrixschicht dehydratisiert oder lyophilisiert wurde.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Im plantats für Bindegewebsersatz bei einem Tier anzugeben, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Bereitstellen eines Satzes Knochenverankerungen durch Verbinden eines Paares Knochenzapfen an ihren proximalen Enden durch zumindest ein Trägerfilament; und zumindest einmaliges Inkubieren des Satzes Knochenverankerungen in einer matrixbildende Moleküle enthaltenden Lösung für eine Zeit, die für die Bildung zumindest einer Matrixschicht um das Trägerfilament ausreichend ist, wobei die Matrixschicht eine Dicke hat, die ausreichend ist, um die Besiedelung durch Zellen zu ermöglichen, wobei die Inkubation unter Bedingungen durchgeführt wird, unter denen Wellen, Vibrationen, zyklische Traktionen und/oder statische Traktionen des Implantats induziert werden.
Gemäß einem anderen Ziel der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Implantats für Bindegewebsersatz bei einem Tier angegeben, wobei dieses Verfahren die Schritte umfasst:

a) Bereitstellen eines Satzes Knochenverankerungen durch Verbinden eines Paares Knochenzapfen an ihren proximalen Enden durch zumindest ein Trägerfilament; und zumindest einmaliges Inkubieren des Satzes Knochenverankerungen aus Schritt a) in einer matrixbildende Moleküle enthaltenden Lösung für eine Zeit, die für die Bildung zumindest einer Matrixschicht ausreichend ist, und diese eine Dicke hat, die für die Besiedelung durch Zellen ausreichend ist, und wobei die Inkubation unter Bedingungen durchgeführt wird, unter denen Wellen, Vibrationen, zyklische Traktionen und/oder statische Traktionen des Implantats induziert werden, und wobei das Implantat dehydratisiert oder lyophilisiert wurde.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Matrix bereitgestellt, die ferner durch Zellen besiedelt wird. Die Zellen können autolog, heterolog oder aus der Gruppe Fibroblast, Myoblast, Osteoblast, Mesenchymzelle, Endothelzelle, Immunzelle, Chondrozyt-Zelle und deren Kombinationen ausgewählte Zellen sein.
Es ist ein anderes Ziel der Erfindung, Bindegewebsersatz bereitzustellen, der ein teilweiser oder vollständiger Ersatz eines Bindegewebes ist. Das Bindegewebe kann aus der aus Sehne, Knorpel, Diskus, Meniskus, Muskel, Zahn, Haar, Gelenk, Band und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt sein.
Ferner kann das Filament und/oder die Matrixschicht dehydratisiert oder lyophilisiert werden.
Erfindungsgemäß kann die Knochenverankerung aus der Gruppe bestehend aus einem Kno chenabschnitt und einem Stück, das aus einem natürlichen und/oder synthetischen biokompatiblen, porösen Material besteht, ausgewählt sein.
Die erfindungsgemäße Matrixschicht kann aus Produkten bestehen, die aus der aus Chitosan, Glycosaminoglycan, Chitin, Ubiquitin, Elastin, Polyethylenglykol, Polyethylenoxid, Vimentin, Fibronectin, Derivaten und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Das Filament der vorliegenden Erfindung kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus einem resorbierbaren Faden, Naturfasern und einem Filament bestehend aus Proteinen, Lipiden, biokompatiblen Molekülen und/oder synthetischen Komponenten.
Das erfindungsgemäße Implantat kann ferner eine pharmazeutisch wirksame Menge eines biologisch aktiven Moleküls aufweisen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Medikamenten, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Antibiotika, Hormonen oder einer Kombination davon.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, eine Matrixschicht anzugeben, die ferner zumindest eine Innenschicht aus Gel und/oder Filament umfasst, das mit zumindest einer ergänzenden Matrixbeschichtungsschicht beschichtet ist, oder ein Implantat, das eine Innenschicht aus Matrix und/oder Filament umfasst, die vor der Beschichtung mit der ergänzenden Matrixbeschichtungsschicht dehydratisiert oder lyophilisiert werden kann. Die Matrixbeschichtungsschicht kann zusätzlich Zellen aufweisen.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind folgende Ausdrücke nachstehend definiert.
Der Ausdruck „Matrix", wie er hier verwendet wird, meint ein Netzwerk biologischer extrazellulärer Komponenten, wie beispielsweise, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Kollagen, Elastin, Fibronectin, Laminin, Proteoglycane, Glycosaminoglycane, Chitosan, Ubiquitin und Derivate davon, in hydratisierter oder dehydratisierter Form. Diese Matrix kann aus Naturfasern in Kombination oder nicht mit synthetischen oder halbsynthetischen Fasern hergestellt werden.
Der Ausdruck „Transplantat", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein natürliches und/oder synthetisches implantierbares Substitut für verschiedene Gewebetypen.
Der Ausdruck „Lyophylisierung", wie er hier verwendet wird, meint passive oder aktive Dehydratisierung des hydratisierten Matrixnetzwerks, wie es oben definiert ist. Einfaches Lufttrocknen, Trocknung, vakuumunterstützte Dehydratisierung, Erwärmen, Wassersublimation oder andere Verfahren können die Lyophilisierung ausführen.
Der Ausdruck „chemisch fixiert", wie er hier verwendet wird, meint die Fixation der Behandlung der Matrix mit einer Chemikalie, wie beispielsweise, aber nicht darauf eingeschränkt, Paraformaldehyd, Ethanol, Formaldehyd, Methanol, um eine Verbindung zwischen den Matrixfasern und den Verankerungen, Knochen oder Knochensubstituten herzustellen.
Diese Zusammenfassung der Erfindung beschreibt nicht notwendigerweise alle erforderlichen Merkmale der Erfindung, sondern die Erfindung kann auch in einer Subkombination der beschriebenen Merkmale bestehen. Die hier eingefügte Zusammenfassung der Erfindung stellt also nur ein Beispiel, nicht aber eine Einschränkung des Gegenstandes auf genau diese Kombination von Merkmalen dar.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 illustriert Ligamentfibroblasten (LF), die aus einer humanen ACL-Biopsie isoliert wurden;
2 illustriert ein Querloch, das in einer humanen Knochenverankerung gemacht wurde;
3 illustriert zwei Knochenverankerungen, die mit einem chirurgischen Faden verbunden sind, der durch ihre Querlöcher geführt und verdrillt ist;
4 illustriert zwei sterile Knochenverankerungen, die durch einen chirurgischen Faden verbunden, in ein steriles Kunststoffröhrchen transferiert und in Position gehalten sind, indem ein heißer Metallstift durch ihre Querlöcher und durch das Röhrchen geführt ist;
5 illustriert einen ACL-Ersatz nach 24 Stunden in Kultur;
6 illustriert einen azellulären ACL-Ersatz nach 24 Stunden in Kultur;
7 illustriert einen lyophilisierten ACL-Ersatz;
8 illustriert einen histologischen Schnitt eines ACL-Ersatzes einer Ziege vor der Implantation. Die mit lebenden LF besiedelte hydratisierte Kollagenschicht umgibt den zentralen kreisförmigen lyophilisierten Kern;
9A bis 9C illustrieren die Kollagenschicht eines azellulären ACL-Ersatzes, der aus einem Netzwerk von Kollagenfasern (A) besteht; die Haftung und Wanderung von enthaltenden LF in die äußere azelluläre hydratisierte Kollagenschicht nach 24 Stunden in Kultur (B); und wie in b), aber nach 48 Stunden Kultur (C);
10 illustriert das mehrstufige Verfahren zur Herstellung eines Ersatzbandes; und
11 illustriert ein altenatives mehrstufiges Verfahren zur Herstellung eines Ersatzbandes.
12 illustriert eine makroskopische Erscheinung eines biotechnologisch hergestellten ACL, das für die Implantation bereit ist (geöffnetes Kniegelenk einer Ziege);
13 illustriert eine makroskopische Erscheinung eines biotechnologisch hergestellten ACL unmittelbar nach der Implantation in situ (geöffnetes Kniegelenk einer Ziege);
14 illustriert die makroskopische Erscheinung eines dehydratisierten Bandersatzes;
15 illustriert einen histologischen Schnitt eines dehydratisierten Bandersatzes, der eine Ausrichtung der Kollagenfasern im Gerüst zeigt (longitudinale Sicht);
16 illustriert einen histologischen Schnitt eines azellulären Bandersatzes, der 5 Monate in ein Kniegelenk einer Ziege transplantiert ist; und
17 illustriert die makroskopische Erscheinung eines biotechnologisch hergestellten Periodontalligaments, das für die Implantation bereit ist.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die folgende Beschreibung ist die einer bevorzugten Ausführungsform als Beispiel und ohne Einschränkung auf die Kombination von Merkmalen, die zur Durchführung der Erfindung erforderlich ist.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Implantat angegeben, das dauerhafte Implantation eines Bindegewebsersatzes erlaubt.
Es ist auf dem Gebiet bekannt, dass synthetische Prothesen wie Dacron^TM oder Lad indirekt in wenigen Jahren im Kniegelenk für den Abrieb von Partikeln anfällig sind, was zu Entzündungsreaktionen, Knorpeldegeneration und funktioneller Instabilität des Knies führt.
In einer Ausführungsform zeigt das Implantat der Erfindung kein Risiko der Transplantatabstoßung, da es angestrebt ist, autologe Zellen aus den Bindegeweben des Wirts, ihre eigenen Knochenfragmente und Kollagen zu verwenden oder zu integrieren.
Eine andere wichtige Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass es die Verwendung des gegenständlichen Implantats vermeidet, einen Teil gesunden autologen Gewebes, wie einen Teil vom Patellar-, semitendinösen oder TFL-Iliotibialband, oder semimembranöse Sehnen für Bindegewebsersatz zu verwenden, was oft zu chronischen Schmerzen, Muskelschwäche oder Instabilität der Gelenke führt. Es werden dem Wirt nur einige Zellen entnommen, entfettet, falls das erforderlich ist, und nach einem von mehreren bekannten Verfahren verarbeitet, die zur Herstellung von Gewebe zur Implantation bei einem Menschen oder Tier verwendet werden, wie beispielsweise, aber nicht darauf eingeschränkt, Pferde, Hunde und andere Haustiere. Die Erfindung ist auch allgemein auf dem Gebiet der Veterinärmedizin, Zahnmedizin und Kieferorthopädie anwendbar.
Die Zellen, die zum Kontrahieren der Kollagenfibrillen während der Bildung eines organisierten Gewebsersatzimplantats nützlich sind, können aus verschiedenen Säugertierquellen (z.B. Rind, Schwein, Mensch, Hund) erhalten werden. Die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Bindegewebezellen waren Fibroblasten, aber andere mesenchymale Zelltypen wie Fibroblasten aus anderen Quellen und Geweben können ebenfalls verwendet werden. Die Humanfibroblasten können durch enzymatische Disaggregation, Explantate oder Perfusion der Ursprungsgewebe erhalten werden.
Natürlich vorkommende Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung können Epithelzellen, Myoblasten, Chondroblasten, Osteoblasten, Fibroblasten und andere faserige Bindegewebezellen, die von Sehne, Band, Knorpel und dergleichen stammen, einschließen, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Die autologen Bindegewebezellen können in einem Zelldepot konserviert werden, um ein anderes biotechnologisch hergestelltes Bindegewebeimplantat für die Patienten herzustellen, die das Transplantat unter folgenden traumatischen Umständen brechen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Methode der Implantation durch Arthroskopie ausgeführt werden, wobei Arthrotomien und damit verbundene Risken (Infektion, Knieschmerzen und Verlust der Mobilität des Gelenks, starke Schwellung und bleibende Narben) vermieden werden. Diese Vorteile tragen dazu bei, die Kosten der medizinischen Versorgung langfristig zu senken und die Lebensqualität der Patienten nach dem chirurgischen Eingriff zu verbessern.
In einer anderen Ausführungsform widersteht ein voll funktionelles Ersatzgewebe zumindest den Belastungen und Spannungen, die durch die normale körperliche Aktivität auf den Ge webetyp aufgebracht werden, den das Konstrukt ersetzen soll.
Ferner ist das Implantat gemäß einer Ausführungsform der Erfindung vollkommen biokompatibel und in vivo integrierbar, i.e. das Implantat gleicht einem natürlichen Gewebe was die Besiedelung mit Zellen und die Interaktion mit den spezifischen Zellen, die bereits im Körper vorhanden sind, betrifft. Die besiedelnden Zellen organisieren ferner das Implantat und sezernieren spezifische Produkte, wie Bestandteile der extrazellulären Matrix, Proteine und/oder Wachstumsfaktoren, in dem Bindegewebsersatz der vorliegenden Erfindung, wodurch der Abbau, die Remodellierung und Regeneration der histologischen Strukturen als funktioneller Gewebsersatz möglich ist. Eine solche Integration kann das Implantat stärken und konditioniert es, damit es als Ersatzgewebe bessere Leistung zeigt.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die Gelschicht des Implantats mit Proteinen, Peptiden oder Hormonen supplementiert werden, die bei der Gewebeintegration und Gewebereparatur eine Rolle spielen. Verschiedene bekannte Faktoren können von dem Implantat vor der Implantation freigesetzt werden, wie beispielweise, aber nicht darauf eingeschränkt, Wachstumsfaktoren, Wachstumshormone, Fibroblastwachstumsfaktoren, epithelialer Wachstumsfaktor, TGF-β, Insulin und IGF-1. Cytokine können von Zellen exprimiert werden, die genetisch modifiziert, transfiziert oder transformiert sind, um lokale Entzündungsprozesse, Knorpelregeneration, Vaskularisation etc. zu modulieren.
Das Kollagen kann aus verschiedenen Kollagen enthaltenden tierischen Geweben extrahiert werden. Beispiele für mögliche Kollagen enthaltende Gewebe sind Sehne, Haut, Kornea, Knochen, Knorpel, in Bandscheiben, Herz-Kreislauf-System und Plazenta. Das hier verwendete Kollagen ist Kollagen vom Typ I. Andere Typen von Kollagen (z.B. Typ II, III und andere) können auch verwendet werden.
Gemäß der bevorzugtesten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht die Matrixschicht des Implantats aus Kollagen vom Typ I, aber sie kann auch aus rekombinanten Kollagenproteinen wie Chitosan, Chitin, Ubiquitin, Elastin, Polyethylenoxid, Vimentin, Fibronectin und Kombinationen davon gebildet sein, ohne darauf eingeschränkt zu sein.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Implantat angegeben, das ein Paar im Allgemeinen zylindrische Knochenzapfenteile aufweist, die an ihren proximalen Enden durch ein Kernfilament verbunden sind, wobei der Knochenzapfen vorzugsweise beide Knochen regionen einschließt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein solches Implantat angegeben, worin eine der Knochenverankerungen so adaptiert ist, dass sie durch einen Tunnel, beispielsweise im Oberschenkelknochen, gezogen wird, um die Fusion damit zu erlauben, und der andere Knochenverankerungsabschnitt ist so adaptiert, dass er durch einen Tunnel im Schienbein gezogen werden kann, um die Fusion damit zu erlauben, sodass ein Ersatz für ein natürliches Kreuzband bereitgestellt wird, wobei das Segment so adaptiert ist, dass es unter Spannung zwischen die Tunnel gebracht wird, um für eine Bandfunktion zu sorgen. Ähnliche Methoden können angewendet werden, um anderen Knochenverbindungen Bindegewebsfunktion zu geben.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung bietet ein Implantat zur Förderung der Heilung und/oder des erneuten Wachstums von erkrankten oder geschädigten Gewebestrukturen durch chirurgische Reparatur solcher Strukturen mit dem erfindungsgemäßen Implantat. Das implantierte Transplantat ist trophisch gegenüber Vaskularisation und Gewebe und kann im Wesentlichen remodelliert werden, um die strukturellen und funktionellen Merkmale der reparierten Struktur anzunehmen.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Implantat nach seiner Herstellung lyophilisiert werden. Dieser Vorgang vermeidet die Verwendung von Chemikalien zur Stärkung der Matrixschicht des Implantats, um die Verstärkung der Verbindungen zwischen den Knochenzapfen und der Kollagenschicht, die in ihre trabekuläre Struktur polymerisiert ist, zu ermöglichen. Die Lyophilisierung erlaubt auch die Herstellung von Implantaten, indem übereinander liegende Matrixschichten hinzugefügt werden, um die Struktur eines biotechnologisch hergestellten Bindegewebes zu verstärken, oder eine höhere Reißfestigkeit vor und während der chirurgischen Implantation verliehen wird.
Eine andere wichtige Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass die Lyophilisierung die Bildung von Matrixschichten auf dem Implantat mit anderen Biomaterialien wie beispielsweise, aber nicht darauf beschränkt, Elastin, in Kombination mit Kollagen oder nicht, und das Ersetzen der Knochenverankerungen des Implantats durch andere poröse Verankerungen wie beispielsweise, aber nicht darauf eingeschränkt, Zement oder Keramik, erlaubt.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Transplantatsimplantat bereitzustel len, das verbessertes Transplantatfixationsvermögen aufweist und das Einwachsen von Bindegewebe und Knochen zwischen dem Transplantat und dem Knochentunnel erlaubt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung und ein Verfahren zum zyklischen Strecken der Matrix und zur mechanischen Prüfung angegeben. Eine Vorrichtung für zyklische Traktion wird offenbart. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Matrix in der Cycling-Kammer in Position gehalten, indem die zwei Knochenverankerungen in Metallstifte eingesetzt werden, wobei einer an einer Lastzelle fixiert und der andere mit einem bewegungsgesteuerten Zeiger verbunden ist. Durch Steuerung der Position des Zeigers wird die Matrix zyklischer Traktion mit Streckungsamplituden von 0 bis 30 mm bei einer Frequenz von bis zu 1 Hz für niedrigere Amplituden über eine längere Zeitdauer ausgesetzt. Das gesamte System wird über eine LABview VI Software gesteuert. Der Betreiber kann die Traktionsbedingungen leicht ändern und die Testverläufe überwachen um sicherzustellen, dass alles glatt abläuft. Ein Matrixsatz kann unter statischer Spannung gehalten werden oder zyklischer Spannung unterworfen werden. Die Zellen in einer Matrix, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, können induziert werden, eine strukturelle Organisation zu nehmen, wenn sie einem Spannungsstimulus ausgesetzt werden. Der Stimulus kann auch aus einfachen Wellen in einem Kulturmedium durch Bewegen der Petrischalen, in welchen eine Matrix gehalten wird, oder einem elektrischen Stimulus bestehen.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verstanden, die zur Illustration der Erfindung, nicht aber zur Einschränkung ihres Umfangs angegeben werden.
BEISPIEL I
Herstellung von vorderem Kreuzband
Material und Methoden
LF-Isolierung und -Kultur
Biopsien gerissener ACL werden vom Wirt genommen. Die Biopsien werden vor der Isolierung der Zellen nicht länger als 24 bis 48 Stunden bei 4°C gehalten. Die ACL-Biopsie wird gewogen und in kleine Stücke geschnitten, nachdem das periligamentäre Gewebe entfernt wurde. Die Fragmente werden mit 0,125%iger Kollagenase, die 2 mM CaCl₂ (1 ml enzymatische Lösung/mg Gewebe) 20 h unter leichtem Bewegen bei 37°C verdaut. Eine 0,1%ige Trypsinlösung (1 ml/mg hydratisiertes Gewebe) wird dann für 1 Stunde zu der Zellsuspension zugegeben. Die Enzyme werden in Dulbecco's modifiziertem Eagles^TM-Medium (Gibco), pH 7,4, das Antibiotika enthält, gelöst.
Die aus ACL-Biopsien isolierten Ligamentfibroblasten (LF) werden in DME kultiviert, das mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), 100 IU/ml Penicillin G und 25 μg/ml Gentamicin ergänzt ist (1).
Wenn LF-Primärkulturen etwa 85% Konfluenz erreichen, werden die Zellen von ihren Kulturflaschen unter Verwendung von 0,05% Trypsin-0,01% EDTA-Lösung (pH 7,8) für etwa 10 min bei 37°C abgelöst. Die LF-Suspensionen werden zweimal 10 min bei 200 × g zentrifugiert. Die Zellpellets werden in komplettem Kulturmedium resuspendiert, und die Zellen werden gezählt. Die Zellviabilität wird unter Anwendung der Trypanblau-Exklusionsmethode bestimmt.
Bisher wurden LF aus ACL-Biopsien von mehr als 20 Patienten und 10 Tieren (Ziegen, Hunde und Kaninchen) mit 100% Erfolg isoliert und kultiviert. Die Zellen behielten ihre Morphologie für mehr als 7 Passagen in Kultur. Für die Herstellung von ACL-Ersatz werden LF-Kulturen aus den Passagen 2 bis 5 verwendet. Immunfluoreszenzmarkierungsanalyse zeigte, dass verschiedene Populationen humaner LF, die aus ACL-Biopsien extrahiert wurden, Vimentin, Fibronectin, Kollagene vom Typ I und III und Elastin exprimieren.
Herstellung der Knochenverankerungen der ACL-Substitute
Knochenstücke werden mit 100%igem Ethanol gewaschen und entsprechend den an die Bedürfnisse des Wirtes angepassten Abmessungen (durchschnittliche Größe 1 cm Durchmesser und 2 cm lang) in Zylinderform geschnitten.
In jede Knochenverankerung wird ein Querloch (1/8 Inch Durchmesser) gemacht (2). Die Knochenzapfen werden zum Sterilisieren über Nacht in 100% Ethanol gehalten. Ein innerhalb eines Monats nach dem chirurgischen Eingriff resorbierbarer chirurgischer Faden wird durch die Querlöcher von 2 Knochenverankerungen geführt und durch einfaches Heften zwischen den Knochen fixiert. Dann wird der Faden zwischen den Knochen verdrillt, um die Ver bindung dicker zu machen (3).
In jede Knochenverankerung werden ein oder mehrere Längslöcher (1 mm Durchmesser oder breiter) gemacht. Solche Löcher werden gebohrt, um die Haftung von hydratisiertem Kollagen an den Knochen zu erhöhen. Dieser Schritt ist optional. Die zwei sterilen durch den verdrillten chirurgischen Faden verbundenen Knochenzapfen werden in ein steriles Kunststoffröhrchen transferiert und in Position gehalten, indem ein heißer Metallstift durch ihre Querlöcher und durch das Röhrchen geführt wird (4).
Einer der zwei Knochen wird am Boden, der andere im oberen Abschnitt des Röhrchens fixiert. Dann wird das die Knochenzapfen enthaltende Röhrchen mit sterilem Kulturmedium gefüllt, das 10% FCS enthält, und über Nacht auf 37°C gehalten, um zu verifizieren, dass keine bakterielle Kontamination herauskommt. Bisher hatten wir bei Einhaltung dieser Methode nie irgendeine Kontamination. Eine Alternative könnte sein, dass die Knochen und der Faden mit 100% Ethanol gespült, unter sterilen Bedingungen getrocknet und ein zweites Mal mit Ethylenoxid sterilisiert werden. Sie können bis zur Verwendung in sterilem Kulturmedium, das 5-10% FCS enthält, bei 4°C gehalten werden.
Herstellung der biotechnologisch hergestellten ACL-Substitute in vitro
Es wurden zwei Protokolle entwickelt, um ähnliche Produkte zu erhalten; transplantierbare biotechnologisch hergestellte ACL-Substitute. Das Protokoll beinhaltet die Zugabe von lebenden LF erst am Ende der Herstellungsschritte unter Vermeidung der Verwendung mit Zellen besiedelter Kollagengele während der.

A) Eine Lösung von DME 2,7X, die Antibiotika enthält, wird mit einer zweiten Lösung gemischt, die durch Wärme inaktiviertes (30 min bei 56°C) FCS, solublisiertes bovines Kollagen vom Typ I und lebende LF (vorzugsweise aus den Passagen 2 bis 5; 10, Schritt 3) enthält. Die Zellen werden bei einer Endkonzentration von 2,5 × 10⁵ Zellen pro ml zugesetzt, aber niedrigere oder höhere Zellkonzentrationen könnten verwendet werden. Die Endkonzentration von bovinem Kollagen Typ I variiert in den ACL-Substituten zwischen 1,0-2,0 mg/ml, aber andere Konzentrationen könnten verwendet werden (z.B. vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 5 mg/ml). Der nächste Schritt wird auf der 10, Schritt 5, beschrieben.
B) Eine Antibiotika enthaltende Lösung von DME 2,7X wird mit einer zweiten Lösung ge mischt, die durch Wärme inaktiviertes (30 min bei 56°C) FCS, solubilisiertes bovines Kollagen vom Typ I enthält. Die Endkonzentration des bovinen Kollagens Typ I variiert in den ACL-Substituten zwischen 1,0-2,0 mg/ml, aber andere Konzentrationen könnten verwendet werden (z.B. vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 5 mg/ml). In diesem Stadium ist der Mischung noch keine Zelle zugesetzt.

Die Mischung wird schnell in das sterile Kunststoffröhrchen gegossen, das die zwei durch den verdrillten chirurgischen Faden verbundenen Knochenverankerungen enthält.
Der ACL-Ersatz wird in DME kultiviert, das mit 10% FCS, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 IU/ml Penicillin G und 25 μg/ml Gentamicin ergänzt ist. Es wird während der ersten 24 Stunden der Kultur in einer statischen vertikalen Position gehalten, hauptsächlich um entsprechende Kollagenpolymerisation zu erlauben. Der ACL-Ersatz wird dann nach der Kollagenpolymerisation (bei pH 7.4) aus dem Röhrchen entnommen. Die Kollagenmatrix wird auch kontrahiert, wenn der ACL-Ersatz lebende LF gemäß der Vorgehensweise A enthielt (5), aber sie wird nicht kontrahiert, falls azelluläre Substitute erzeugt werden wie bei der Methode B beschrieben (6).
Dann wird der ACL-Ersatz aus dem Röhrchen genommen und bei –80°C in einer sterilen Schale eingefroren (10 und 11, Schritt 5).
Wenn er gefroren ist, wird der ACL-Ersatz lyophilisiert (7 und 10 und 11, Schritt 6).
Der lyophilisierte ACL-Ersatz wird dann in ein neues steriles Kunststoffröhrchen transferiert und wie zuvor beschrieben fixiert, um als fester zentraler Kern verwendet zu werden (10 und 11, Schritt 7). Es können weitere lyophilisierte Schichten hinzugefügt werden, um größere und stärkere ACL-Substitute herzustellen.
Es wird noch eine Schicht hydratisiertes Kollagen gemischt mit lebenden LF gemacht und um den lyophilisierten Kollagenkern hinzugefügt, gemäß den im Abschnitt A beschriebenen Methoden. Der zweischichtige ACL-Ersatz kann in Kultur gehalten werden, bis er dem Wirt transplantiert wird. 8 zeigt einen histologischen Schnitt des ACL-Ersatzes vor der Implantation (transversale Sicht). Der lyophilisierte zentrale Kern ist von einer hydratisierten Kollagenschicht umgeben, die mit LF des Wirts besiedelt ist, in diesem Fall einer Ziege.
Eine zweite Schicht hydratisiertes Kollagen wird wie im Abschnitt B beschrieben gemacht (keine Zelle ist in der Matrix inkludiert). Der azelluläre ACL-Ersatz ist ein Netzwerk von Kollagenfasern (9A). Nach Polymerisation über Nacht wird der azelluläre ACL-Ersatz in ein Kulturmedium gebracht, das LF in dem Medium suspendiert enthält (DME, ergänzt mit 10% FCS, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 IU/ml Penicillin G und 25 μg/ml Gentamicin; 11, Schritt 8). Innerhalb von 24 h heften sich die Zellen an und wandern in die äußere hydratisierte Kollagenschicht (nicht lyophilisiert; 9B). Die Zellen kontrahieren die Kollagenmatrix, während sie sie besiedeln, innerhalb von 48 h (9C). Der zweischichtige, mit Zellen besiedelte ACL-Ersatz kann in Kultur gehalten werden, bis er transplantiert wird (11, Schritt 9). Es können weitere hydratisierte Matrixschichten um den bACL hinzugefügt werden.
Organisation der matriziellen Struktur, die in dem ACL-Ersatz durch zyklische Traktion induziert wird
Mindestens 10 Wiederholungen wurden unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt, um die Wirkungen zyklischer Traktion auf die Entwicklung unseres ACL zu evaluieren. Die Zyklen wurden bei einer Frequenz von 1 Zyklus/min fixiert. Während der ersten 5 Tage wurden die ACL auf 1 mm Dehnung pro Zyklus gedehnt, wobei immer zu ihrer Anfangslänge zurückgekehrt wurde (etwa 4 cm), um jeden Zyklus zu beenden. Vom Tag 5 bis 10 wurde die Amplitude auf 2 mm erhöht. Histologische Studien wurden nach 10 Tagen an ACL durchgeführt, die unter statischen horizontalen Bedingungen kultiviert wurden, im Vergleich zu ACL, die zyklischer Traktion unterworfen wurden. Zum ersten Mal wird ein dichtes Netzwerk von Kollagenfasern, die in welligen Bündeln organisiert sind, in vitro in einem humanen, biotechnologisch hergestellten lebenden Gewebe beobachtet. Unsere Daten zeigen deutlich, dass lebende ACL-Zellen, die in ACL ausgesät sind, auf mechanische Stimuli in vitro reagieren können. Die Kräuselungen folgten einem welligen Muster, wie man es bei nativem ACL sieht. Die Ergebnisse waren von einem Versuch zum anderen wiederholt ähnlich.
Chirurgische Methode für die Implantation der biotechnologisch hergestellten ACL-Substitute bei Mensch und Tieren
Chirurgische Eingriffe erfolgen durch Arthroskopie beim Menschen und unter Vollnarkose bei Tieren (intramuskuläre Injektion von Ketamin und Xylasin; 0,6 ml/kg Körpergewicht), die durch Inhalation einer 2:1-Mischung von Sauerstoff und Lachgas mit 0,1% Halothan auf rechterhalten wird.
Unter Verwendung von Kirschnerdrähten und einem Mini-Driver wird ein Tunnel (etwa 1 cm Durchmesser, angepasst an das Knie des Wirts) durch den metaphysealen Knochen des Oberschenkelknochens erzeugt, distal zur Epiphysennarbe und perpendikulär zur langen Achse des Oberschenkelknochens.
Das bACL (etwa 1 cm Länge, angepasst an das Knie des Wirts) wird sehr vorsichtig in den Knochentunnel gebracht um sicherzustellen, dass das bACL die gesamte Länge des Loches ausfüllt.
Das Ende der Prothese, das am lateralen Ende des Tunnels austritt, wird in einen zweiten Tunnel eingesetzt, der im lateralen femoralen Periost ist. Es wird eine minimale statische Spannung auf das bACL angewendet.
Die Knochenverankerungen des Transplantats können mit Schrauben und/oder Zement (einschließlich biomedizinisches Epoxy) fixiert werden.
Die Einschnittstelle wird mit einem topischen antibakteriellen Mittel besprüht. Im Falle von Menschen wird normale Ernährung und Bewegungseinschränkung während des ersten Monats nach dem Eingriff vorgesehen. Sie beginnen gemäß der Toleranz Gewicht auf das operierte Bein zu bringen und bekommen ein Trainingsprogramm, um die Muskelkraft zu erhalten oder zu vergrößern. Die Knie werden während einer Woche täglich überwacht, um anormale Entzündungszeichen festzustellen. Im Falle von Tieren sind Wasser und Nahrung ad libitum vorgesehen. Prophylaktisch wird 10 Tage lang Tetracyclin in Wasser zugesetzt. Ein Gipsverband oder eine leichte Orthese, wie sie derzeit zur Einschränkung der Bewegung von Gelenken beim Menschen nach chirurgischen Eingriffen verwendet wird, wird verwendet, um über 4-7 Tage nach der bACL-Implantation die Kniebewegung des Tieres zu verhindern. Die körperliche Beurteilung des Tieres erfolgt täglich durch Tierärzte und ihr Personal.
Ein solcher Bandersatz kann weiter modifiziert oder für Gentherapie adaptiert werden, indem Gene in die Zellen eingeführt werden. Die Methode kann auch leicht für andere Anwendungen adaptiert werden, z.B. zum Ersetzen eines Bandes an einer anderen anatomischen Stelle des Körpers (Wirbelsäule, Hals etc).
BEISPIEL II
Herstellung von Bindegeweben
Material und Methoden
Isolierung und Kultur von dermalen Fibroblasten
Die dermalen Fibroblasten (DF), die aus der Dermis von Hautbiopsien isoliert wurden, enzymatisch (gleiche Methode wie im Beispiel I beschrieben) oder durch Explantate, werden in DME kultiviert, das mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), 100 IU/ml Penicillin G und 25 μg/ml Gentamicin ergänzt ist.
Wenn DF-Primärkulturen etwa 85% Konfluenz erreichen, werden die Zellen von ihren Kulturflaschen unter Verwendung von 0,05% Trypsin-0,01% EDTA-Lösung (pH 7,8) für etwa 10 min bei 37°C abgelöst. Die DF-Suspensionen werden zweimal 10 min bei 200 × g zentrifugiert. Die Zellpellets werden in komplettem Kulturmedium resuspendiert, und die Zellen werden gezählt. Die Zellviabilität wird unter Anwendung der Trypanblau-Exklusionsmethode bestimmt.
Bisher wurden DF aus Hautbiopsien von mehr als 100 Patienten und 10 Tieren (Ziegen, Hunde und Kaninchen) mit 100% Erfolg isoliert und kultiviert. Die Zellen behielten ihre Morphologie für mehr als 7 Passagen in Kultur. Für die Herstellung von Bindegewebsersatz (z.B. Bänder) werden DF-Kulturen aus den Passagen 2 bis 5 verwendet.
Herstellung der Knochenverankerungen der Bandsubstitute
Knochenstücke werden gewaschen, geschnitten und sterilisiert gemäß der im Beispiel I beschriebenen Methode.
In jede Knochenverankerung werden wie zuvor beschrieben Löcher gemacht. Die zwei sterilen durch den verdrillten chirurgischen Faden verbundenen Knochenzapfen werden in ein steriles Kunststoffröhrchen transferiert und in Position gehalten, indem ein heißer Metallstift durch die Querlöcher und durch das Röhrchen geführt wird (4).
Herstellung biotechnologisch hergestellter Bandsubstitute in vitro
Eine erste Alternative: Eine Lösung von DME 2,7X, die Antibiotika enthält, wird mit einer zweiten Lösung gemischt, die durch Wärme inaktiviertes (30 min bei 56°C) FCS, solublisiertes bovines Kollagen vom Typ I und lebende DF (vorzugsweise aus den Passagen 2 bis 5) enthält. Die DF werden bei einer Endkonzentration von 2,5 × 10⁵ Zellen pro ml zugesetzt, aber niedrigere oder höhere Zellkonzentrationen könnten verwendet werden. Die Endkonzentration von bovinem Kollagen Typ I variiert in den Bandsubstituten zwischen 1,0-2,0 mg/ml, aber andere Konzentrationen könnten verwendet werden (z.B. vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 5 mg/ml). Der nächste Schritt wird in 11, Schritt 5, beschrieben.
Eine zweite Alternative: Eine Antibiotika enthaltende Lösung von DME 2,7X wird mit einer zweiten Lösung gemischt, die durch Wärme inaktiviertes (30 min bei 56°C) FCS, solubilisiertes bovines Kollagen vom Typ I enthält. Die Endkonzentration des bovinen Kollagens vom Typ I variiert zwischen 1,0-2,0 mg/ml in den ACL-Substituten, aber andere Konzentrationen könnten verwendet werden (z.B. vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 5 mg/ml). In diesem Stadium ist der Mischung noch keine Zelle zugesetzt.
Die Mischung wird schnell in das sterile Kunststoffröhrchen gegossen, das die zwei durch den verdrillten chirurgischen Faden verbundenen Knochenverankerungen enthält. Kollagengerüste werden zwischen die zwei Knochenverankerungen gegossen, im Beispiel I beschrieben. Die Gewebekonstrukte werden in minimaler horizontaler Spannung unter normalem Atmosphärendruck oder darunter (im Bereich von etwa 25 bis 0 mm Hg) in einen Exsikkator gebracht. Das Aussehen der makroskopischen Erscheinung eines biotechnologisch hergestellten ACL, das für Implantation bereit ist, ist in 12 zu sehen, sowie unmittelbar nach der Implantation in situ (geöffnetes Kniegelenk einer Ziege) (13). Die Gerüste wurden innerhalb von etwa 2-3 Stunden vollständig dehydratisiert (14). 15 zeigt einen histologischen Schnitt einer Kollagenmatrix, die unter diesen Bedingungen dehydratisiert wurde.
Die biotechnologisch hergestellten Gerüste wurden in frischem DMEM rehydratisiert, aus dem Röhrchen entnommen und dann in ein neues steriles Kunststoffröhrchen transferiert. Weitere dehydratisierte Schichten können hinzugefügt werden und eine weitere Schicht hydratisiertes Kollagen kann hinzugefügt werden, die lebende DF oder LF aufweist, um größere und stärkere Bandsubstitute herzustellen.
Ein azelluläres biotechnologisch hergestelltes Band wurde in das Kniegelenk einer Ziege transplantiert. Nach 5 Monaten, wie in 16 gezeigt, ist das transplantierte Band von den Zellen des Wirts deutlich besiedelt und innerviert. Man beachte das Vorhandensein der Wirtszellen, welche das Transplantat nach der Implantation besiedelten, und die hohe Dichte der Kollagenfasern, die in er langen Achse des regenerierenden vorderen Kreuzbandes in situ ausgerichtet sind (longitudinale Sicht).
BEISPIEL III
Herstellung von Periodontalligamentsubstitut
Material und Methoden
Isolierung und Kultur von Fibroblasten
Dermale Fibroblasten (DF), Ligamentfibroblasten (LF) oder Fibroblasten aus anderen Quellen (z.B. Mundschleimhaut) können isoliert und in DME kultiviert werden, das mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), 100 IU/ml Penicillin G und 25 μg/ml Gentamicin ergänzt ist.
Wenn Primärkulturen der Zellen etwa 85% Konfluenz erreichen, werden sie von ihren Kulturflaschen unter Verwendung von 0,05% Trypsin-0,01% EDTA-Lösung (pH 7,8) für etwa 10 min bei 37°C abgelöst. Die Zellsuspensionen werden zweimal 10 min bei 200 × g zentrifugiert. Die Zellpellets werden in komplettem Kulturmedium resuspendiert, und die Zellen werden gezählt. Die Zellviabilität wird unter Anwendung der Trypanblau-Exklusionsmethode bestimmt.
Herstellung der Zahnverankerungen der Periodontalligamentsubstitute
Zahnstücke werden gewaschen und sterilisiert gemäß der im Beispiel I beschriebenen Methode.
In jeden Zahn werden wie zuvor beschrieben Löcher gemacht. Ein steriler Zahn wird durch einen verdrillten chirurgischen Faden mit einer Knochenverankerung verbundenen und beide werden in ein steriles Kunststoffröhrchen transferiert und in Position gehalten, indem ein hei ßer Metallstift durch ihre Querlöcher und durch das Röhrchen geführt wird.
Herstellung biotechnologisch hergestellter Periodontalligamentsubstitute in vitro
Eine Lösung von DME 2,7X, die Antibiotika enthält, wird mit einer zweiten Lösung gemischt, die durch Wärme inaktiviertes (30 min bei 56°C) FCS, solublisiertes bovines Kollagen vom Typ I und lebende Fibroblasten (vorzugsweise aus den Passagen 2 bis 5) enthält. Die Fibroblasten werden bei einer Endkonzentration von 2,5 × 10⁵ Zellen pro ml zugesetzt, aber niedrigere oder höhere Zellkonzentrationen könnten verwendet werden. Die Endkonzentration von bovinem Kollagen Typ I variiert in den Bandsubstituten zwischen 1,0-2,0 mg/ml, aber andere Konzentrationen könnten verwendet werden (z.B. vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 5 mg/ml).
Gemäß einer zweiten Möglichkeit wird eine Antibiotika enthaltende Lösung von DME 2,7X mit einer zweiten Lösung gemischt, die durch Wärme inaktiviertes (30 min bei 56°C) FCS, solubilisiertes bovines Kollagen vom Typ I enthält. Die Endkonzentration des bovinen Kollagens vom Typ I variiert zwischen 1,0-2,0 mg/ml in den ACL-Substituten, aber andere Konzentrationen könnten verwendet werden (z.B. vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 5 mg/ml). In diesem Stadium ist der Mischung noch keine Zelle zugesetzt.
Die Mischung wird schnell in ein steriles Kunststoffröhrchen gegossen, das den Knochen und die Zahnverankerungen enthält, die durch den verdrillten chirurgischen Faden verbunden sind. Kollagengerüste werden zwischen die zwei Verankerungen gegossen. Die Gewebekonstrukte werden lyophilisiert oder unter minimaler horizontaler Spannung unter normalem Atmosphärendruck oder darunter (im Bereich von etwa 25 bis 0 mm Hg) in einen Exsikkator gebracht. Wenn sie vollständig dehydratisiert sind, werden die Gerüste in frischem DMEM rehydratisiert, aus dem Röhrchen genommen und dann in ein neues steriles Kunststoffröhrchen transferiert. Es kann eine weitere Schicht hydratisiertes Kollagen hinzugefügt werden, die lebende Fibroblasten enthält, um größere und stärkere Bandsubstitute herzustellen. Der Periodontalligamentersatz kann im Zahnfleisch implantiert werden (17).
Obwohl die Erfindung in Verbindung mit speziellen Ausführungsformen beschrieben wurde, versteht sich, das Modifizierungen möglich sind und diese Anmeldung soll jedwede Variation, Verwendung oder Adaptationen der Erfindung umfassen, die allgemein den Prinzipien der Erfindung folgen und solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung beinhalten, wie sie zur bekannten und üblichen Praxis auf dem Gebiet gehören, dem die Erfindung angehört, und wie sie auf die hier dargelegten wesentlichen Merkmale angewendet werden können und wie es im Umfang der beigefügten Ansprüche folgt.

Claims

Implantat für Bindegewebsersatz bei einem Tier, wobei das Implantat ein Paar Knochenverankerungen aufweist, die an ihren proximalen Enden durch zumindest ein Trägerfilament verbunden sind, wobei das Trägerfilament mit zumindest einer Matrixschicht beschichtet ist, deren Dicke ausreichend ist, um die Besiedelung durch eine Zelle zu ermöglichen, und wobei zumindest ein Trägerfilament oder eine Matrixschicht dehydratisiert oder lyophilisiert wurde.
Implantat nach Anspruch 1, wobei die Matrixschicht von einer Zelle besiedelt ist.
Implantat nach Anspruch 1, wobei der Bindegewebsersatz ein teilweiser oder vollständiger Ersatz eines Bindegewebes ist.
Implantat nach Anspruch 1, wobei das Bindegewebe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Sehne, einem Knorpel, einem Diskus, einem Meniskus, einem Muskel, einem Zahn, einem Haar, einem Gelenk und einem Band oder einer Kombination davon.
Implantat nach Anspruch 1, wobei das Tier ein Mensch ist.
Implantat nach Anspruch 1, wobei das Tier ein Säugetier ist, das nicht der Mensch ist.
Implantat nach Anspruch 1, wobei die Knochenverankerung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Knochenabschnitt und einem Stück, das aus zumindest einem Element aus natürlichem oder synthetischem biokompatiblen, porösen Material besteht.
Implantat nach Anspruch 1, wobei die Matrixschicht eine Kollagengelschicht ist.
Implantat nach Anspruch 1, wobei die Matrixschicht ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chitosan, Glycosaminoglycan, Chitin, Ubiquitin, Elastin, Polyethylenglykol, Polyethylenoxid, Vimentin, Fibronectin und einem Protein, das die Ausrichtung oder Assemblierung von Kollagen fördert, oder Derivaten oder einer Kombination davon.
Implantat nach Anspruch 1, wobei das Trägerfilament ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus zumindest einem Element aus einem resorbierbaren Faden, einer Naturfaser und einem Filament bestehend aus einem Protein, einem Lipid, einem biokompatiblen Molekül und einer synthetischen Komponente.
Implantat nach Anspruch 1, wobei die Matrixschicht ferner eine Zelle aufweist.
Implantat nach Anspruch 11, wobei die Zelle eine autologe Zelle ist.
Implantat nach Anspruch 11, wobei die Zelle eine heterologe Zelle ist.
Implantat nach Anspruch 1, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fibroblasten, einem Myoblasten, einem Osteoblasten, einer Mesenchymzelle, einer Endothelzelle, einer Epithelzelle, einer Immunzelle und einer Chondrozyt-Zelle oder einer Kombination davon.
Implantat nach Anspruch 1, wobei die Matrixschicht ferner eine pharmazeutisch wirksame Menge eines biologisch aktiven Moleküls aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Medikament, einem Wachstumsfaktor, einem Cytokin, einem Antibiotikum und einem Hormon oder einer Kombination davon.
Implantat nach Anspruch 1, wobei die Matrixschicht ferner zumindest eine Innenschicht aus Gel und/oder Filament, das mit zumindest einer ergänzenden Matrixbeschichtungsschicht beschichtet ist, umfasst.
Implantat nach Anspruch 16, wobei die Innenschicht dehydratisiert und das Filament hydratisiert und lyophilisiert wird, bevor in die Matrixschicht eingebracht wird.
Implantat nach Anspruch 16, wobei das Implantat dehydratisiert oder lyophilisiert wird, bevor mit der ergänzenden Matrixbeschichtungsschicht beschichtet wird.
Implantat nach Anspruch 18, wobei die ergänzende Matrixbeschichtungsschicht ferner dehydratisiert oder lyophilisiert wird, bevor sie mit einer weiteren ergänzenden Matrix beschichtungsschicht beschichtet wird.
Implantat nach Anspruch 16, wobei die Matrixbeschichtungsschicht ferner eine Zelle aufweist.
Implantat nach Anspruch 20, wobei die Zelle eine autologe Zelle ist.
Implantat nach Anspruch 20, wobei die Zelle eine heterologe Zelle ist.
Implantat nach Anspruch 20, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fibroblasten, einem Myoblasten, einem Osteoblasten, einer Mesenchymzelle, einer Endothelzelle, einer Epithelzelle, einer Immunzelle und einem Chondrozyten oder einer Kombination davon.
Verfahren zur Herstellung eines Implantats für Bindegewebsersatz bei einem Tier, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Bereitstellen eines Satzes Knochenverankerungen durch Verbinden eines Paares Knochenzapfen an ihren proximalen Enden durch zumindest ein Trägerfilament; b) zumindest einmaliges Inkubieren des Satzes Knochenverankerungen aus Schritt a) in einer matrixbildende Moleküle enthaltenden Lösung für eine Zeit, die für die Bildung zumindest einer Matrixschicht um das Trägerfilament ausreichend ist, wobei die Matrixschicht eine Dicke hat, die ausreichend ist, um die Besiedelung durch Zellen zu ermöglichen, und wobei diese Inkubation unter Bedingungen durchgeführt wird, unter denen Wellen, Vibrationen, zyklische Traktionen und/oder statische Traktionen des Implantats induziert werden, und wobei das Implantat dehydratisiert oder lyophilisiert wurde.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Matrix ferner von einer Zelle besiedelt ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Implantat vor dem Implantieren chemisch behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Bindegewebe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Sehne, einem Knorpel, einem Diskus, einem Meniskus, einem Muskel, einem Zahn, einem Haar, einem Gelenk und einem Band oder einer Kombination davon.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Tier ein Mensch ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Tier ein Säugetier ist, das nicht der Mensch ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Knochenverankerung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Knochenabschnitt und einem Stück, das aus einem natürlichen und/oder synthetischen biokompatiblen, porösen Material besteht.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Matrixschicht eine Kollagengelschicht ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Matrixschicht aus einer Verbindung besteht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chitosan, Glycosaminoglycan, Chitin, Ubiquitin, Elastin, Polyethylenglykol, Polyethylenoxid, Vimentin und Fibronectin oder Derivaten oder Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Filament ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem resorbierbaren Faden, einer Naturfaser und einem Filament bestehend aus zumindest einem Element aus Protein, Lipid, biokompatiblem Molekül oder synthetischer Komponente.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Matrixschicht ferner eine Zelle aufweist.
Verfahren nach Anspruch 25 oder 34, wobei die Zelle eine heterologe Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 25 oder 34, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fibroblasten, einem Myoblasten, einem Osteoblasten, einer Mesenchymzelle, einer Endothelzelle, einer Epithelzelle, einer Immunzelle, einem Chondrozyten und einer Kombination davon.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Matrix ferner eine pharmazeutisch wirksame Menge eines biologisch aktiven Moleküls enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Medikament, einem Wachstumsfaktor, einem Cytokin, einem Antibiotikum, einem Hormon und einer Kombination davon.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die innere Matrixschicht mit zumindest einer ergänzenden Matrixbeschichtungsschicht beschichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei zumindest eines der Elemente innere Matrixschicht oder Filament dehydratisiert oder lyophilisiert wird, bevor mit der ergänzenden Matrixbeschichtungsschicht beschichtet wird.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die ergänzende Matrixbeschichtungsschicht dehydratisiert oder lyophilisiert wird, bevor sie mit einer weiteren ergänzenden Matrixbeschichtungsschicht beschichtet wird.
Verfahren nach Anspruch 38 oder 40, wobei die ergänzende Matrixbeschichtungsschicht oder eine andere Zelle eine autologe Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Zelle eine heterologe Zelle ist.
Implantat nach Anspruch 8, wobei das Kollagen ein rekombinantes Kollagenprotein ist.
Implantat nach Anspruch 8, wobei das Kollagen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kollagen der Typen I, II und III.
Implantat nach Anspruch 8, wobei das Kollagen von einer tierischen Gewebequelle kommt.
Implantat nach Anspruch 45, wobei das tierische Gewebe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sehne, Haut, Kornea, Knochenknorpel, Bandscheibe, kardiovaskulärem Gewebe und Plazenta.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Kollagen ein rekombinantes Kollagenprotein ist.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Kollagen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kollagen der Typen I, II und III.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Kollagen von einer tierischen Gewebequelle kommt.
Verfahren nach Anspruch 49, wobei das tierische Gewebe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sehne, Haut, Kornea, Knochen, Knorpel, Bandscheibe, kardiovaskulärem Gewebe und Plazenta.