DE69432865T2

DE69432865T2 - Implantierbare prothese, kit und vorrichtung zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69432865T2
Application number: DE69432865T
Authority: DE
Inventors: Sorrel Elizabeth Wolowacz; Andrew James Carter; Richard John Searle; Bridget Jane MATTHEWS; John B. Bromley KING; Debra Palmer; Caroline Julia Hackney SHELTON
Original assignee: Smith and Nephew PLC
Current assignee: Smith and Nephew PLC
Priority date: 1993-07-07
Filing date: 1994-07-05
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2014-07-06
Also published as: EP0707498A1; DE69432865D1; CA2166697A1; ATE243535T1; AU7078994A; DK0707498T3; JPH09500298A; WO1995001810A1; JP3493199B2; EP0707498B1; AU692779B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren, die geeignet sind, um gebrochenes oder beschädigtes Bindegewebe, wie Ligamente oder Sehnen, zu ersetzen oder zu reparieren, sowie auf Prothesen zur Verwendung in derartigen Verfahren. Es wird auch eine Vorrichtung zur Verwendung bei der Bildung derartiger Prothesen, sowie Kits, aus denen die Prothesen gebildet werden können, offenbart.
Aus dem Vereinigte Staaten Patent Nr. US5078744 ist das Reparieren beschädigter Ligamente, wie etwa des anterioren Kreuzbands (ACL), durch das Ersetzen eines Teils des beschädigten Ligaments mit einem prothetischen Ligament, das gereinigte tierische Sehnen- oder Ligamentbindegewebsfasern beinhaltet, die quervernetzt und in Gruppen ausgerichteter Fasern gebildet sind, bekannt. Das üblichste Verfahren zur Reparatur oder Wiederherstellung des ACL ist das Implantieren eines prothetischen Transplantats, das autogenes Gewebe beinhaltet.
Deshalb ist es übliches chirurgisches Vorgehen, autogenes Gewebe, z. B. Kniescheibenband, vom Wirt zu entnehmen und eine Prothese zur Implantation zu bilden.
Eine Anzahl synthetischer, nicht bioresorbierbarer Substanzen sind bei der Herstellung von prothetischen Ligamenten verwendet worden, wobei die Substanzenentsprechend ihrer Neigung zum Unterstützen oder Fördern des Einwachsens von Fibroblasten, nach der Implantation der Prothese, ausgewählt wurden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine implantierbare Prothese bereitgestellt, die in einer vor der Implantation gegebenen Form eine Matrix aus biokompatibler, synthetischer, bioresorbierbarer Polymersubstanz, die mit Fibroblasten angeimpft ist, beinhaltet, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix ein Polymergel aufweist, mit dem sie in sehr gutem Kontakt steht und das die Matrix ausfüllt, und wobei die Fibroblasten in dem Gel angeordnet sind.
Mit „synthetisch" ist lediglich eine Substanz gemeint, die vom Körper eines Säugetiers bei Bindegewebereparaturen nicht natürlich verwendet wird oder die keine chemisch veränderte Form einer derartigen Substanz darstellt. Deshalb schließt der Begriff Kollagen und künstlich quervernetzte Kollagenmatrizen aus (auch wenn Kollagen, falls erwünscht, zusätzlich zur synthetischen Substanz verwendet werden kann).
Der Begriff „Fibroblast" umfasst Zellen, die manchmal als Fibroblasten, Fibrozyt-, Tenocyt- oder Synoviocyt-Zellen bezeichnet werden. Dieser Begriff bezeichnet auch Vorläuferzellen jeder dieser Zellen.
Mit „im Wesentlichen bioresorbierbarer Matrixsubstanz" ist eine dreidimensionale Struktur zum Stützen von Fibroblasten (die zum Beispiel in Form einer Gerüst-, Maschen- oder Feststruktur auftreten kann) gemeint und die, in der implantierten Prothese im Wesentlichen über die Zeit in einem Körper eines Säugetiers, aufgrund der chemischen/biologischen Aktivität von Körperkomponenten, abgebaut wird (im Gegensatz zu einfachem Brechen aufgrund physikalischer Überbeanspruchung der Prothese). Die bioresorbierbare Substanz wird, wünschenswerteiweise fünf Jahre nach dessen Implantation in einen erwachsenen Menschen (besser bereits ein Jahr nach der Implantation), so weit abgebaut sein, dass es keinen wesentlichen Beitrag zur strukturellen Integrität der Prothese mehr leistet.
Vorzugsweise kann die Matrix zusätzlich ein oder mehrere der folgenden Moleküle beinhalten: Proteoglykane, Glycosaminoglykane, Fibronektin oder seinen Aktivbindungsbereich oder einen oder mehrere Wachstumsfaktoren, z. B. Knochenmorphogeneseprotein-Fibroblastenwachstumsfaktor (BMP-Fibroblastenwachstumsfaktor), Angiogensisfaktor oder andere Stimulationsfaktoren.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann die Prothese oder ein Teil davon (z. B. (ein) Bereiche) der Prothese, der/die nach der Implantation mit dem Knochen in Kontakt kommen wird/werden) mit osteoinduktiven oder osteokonduktiven Mitteln imprägniert werden, um eine leichtere Infiltration durch Knochenzellen zu ermöglichen. Beispiele für geeignete osteoinduktive Substanzen, die auf Infiltration ansprechen, umfassen Hydroxyapatit, gefriergetrockneten oder entmineralisierten Knochen, Wachstumsfaktoren (z. B. Knochenmorphogeneseprotein) etc. Imprägnierung kann geeigneterweise kurz vor der Implantation der Prothese erfolgen. Passenderweise werden derartige Substanzen in den Enden der Prothese eingelagert.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellen wir ein Verfahren zum Reparieren oder Ersetzen von beschädigtem Bindegewebe bei einem Menschen oder einem Tier zur Verfügung, das folgende Schritte beinhaltet: Inkubieren einer biokompatiblen, synthetischen, im Wesentlichen bioresorbierbaren Matrixsubstanz unter Anwesenheit eines geeigneten Kulturmediums und von Fibroblasten unter geeigneten Bedingungen zum Ansetzen einer Kultur von Fibroblasten auf oder in der Matrix und danach Implantieren der angeimpften Matrix in einen Wirt.
Beispiele von geeigneten im Wesentlichen bioresorbierbaren, synthetischen Polymeren umfassen Polylactid (PLA), Polyglycolid (PGA), Polydioxanon, Polycaprolacton (PCL), Polyhydroxybutyrat (ICI BIOPOL^TM), Polyhydroxybutyrate-co-hydroxyvalerat (ICI BIOPOL^TM), Polyanhydride, Polyorthoester, Polyorthocarbonate, Polyaminocarbonate, Polytrimethylencarbonat und Copolymere, die Monomere, aus denen die bereits genannten Polymere gebildet werden können, einlagern.
Beinhaltet die erfindungsgemäße Prothese ein Copolymer, so kann das Copolymer Hydroxyvalerat- und Hydroxybutyratmonomere einlagern. Bei derartigen Copolymeren kann die vorliegende Menge an Hydroxyvalerat von 1 bis 47 Mol% reichen. Andere besonders geeignete Copolymere sind PLA/PGA- und PLA/PCL-Copolymere.
Mischungen aus einer Vielzahl der oben genannten im Wesentlichen bioresorbierbaren Substanzen können ebenfalls als Matrixsubstanz oder als Teil dieser geeignet sein.
Die Matrix kann aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Substanzen (z. B. unterschiedliche Faserarten) mit verschiedenen Abbauraten gefertigt werden, wobei ein Zwei- oder Mehrphasenverlust an mechanischen Eigenschaften mit der Zeit bereitgestellt wird. Die verschiedenen Faserarten können auch verschiedene mechanische Eigenschaften besitzen. Zum Beispiel können die stark ausdehnbaren Fasern mit weniger ausdehnbaren Fasern kombiniert werden. Die Matrix kann entworfen werden, um sich bis zu einem bestimmten Ausmaß zu verlängern, bevor die weniger ausdehnbaren Fasern eine weitere Ausdehnung verhindern. Dieser Entwurf kann vorteilhaft sein, wenn die Zellen begrenzter und gesteuerter Belastung ausgesetzt werden, während vor Schäden an dem sich bildenden Gewebe geschützt wird. Zum Beispiel weisen Polycaprolacton-Fasern einen niedrigeren Young-Modulus als Polyactid-Fasern auf.
Zudem kann ein Polymer mit einem anderen Polymer beschichtet werden. Dies ist vorteilhaft, wenn die Wahlsubstanz auf der Basis der mechanischen Eigenschaften nicht notwendigerweise die Wahlsubstanz für die Zellkultur ist (sofern sie nicht modifiziert wird). Hier kann ein biokompatibleres Polymer verwendet werden, um eine weniger biokompatible Basissubstanz zu beschichten. Zum Beispiel stellt Polyactid ein besseres Substrat zur Proliferation von Fibroblasten bereit als Polycaprolacton. Polycaprolacton-Fasern könnten mit Polyactid beschichtet werden, um die Kompatbilität mit Fibroblasten zu verbessern.
Wie oben angeführt, können Copolymer-Substanzen verwendet werden. Dies kann vorteilhaft sein, wenn die Copolymere Abbauraten besitzen, die zwischen den Raten der Homopolymere liegen, aus denen sie zusammengesetzt sind. Daher kann die Abbaurate durch Steuern der Zusammensetzung des Copolymers gesteuert werden. Die Produktion von Copolymer-Fasern durch Faserspinnen oder Extrudieren kann Fasern mit mechanischen Eigenschaften ergeben, die denen der Homopolymere überlegen sind. Polyactid-Polyglycolid-Copolymere sind gute Beispiele dieser beiden Punkte.
Geeignete Fibroblasten zur Verwendung beim Animpfen der Matrix können autogene Fibroblasten, allogene Fibroblasten oder xenogene Fibroblasten sein. Vorzugsweise sind die Fibroblasten autogen. Die Fibroblasten können zum Beispiel der Dermis, den Sehnen oder Ligamenten entstammen. Die Fibroblasten zur Verwendung beim Animpfen der Matrix können ein Gemisch aus einer oder mehreren der obigen Arten von Fibroblasten beinhalten. Wenn die Fibroblasten autogen sind, wird es bevorzugt, diese aus der Dermis zu isolieren, da dies den Bedarf an einem extensiven invasiven Eingriff vermeidet.
Die Fibroblasten können gemäß jedem geeigneten Verfahren erhalten werden. Ein bevorzugtes Verfahren dafür ist das Durchführen einer Hautbiopsie.
Die Matrixsubstanz kann mit Fibroblasten angeimpft werden, indem die Matrix in ein Kulturgefäß, das ein angemessenes Kulturmedium (z. B. DMEM) enthält, unter Anwesenheit von Fibroblasten platziert wird und unter Zellkulturbedingungen inkubiert wird. Die Fibroblasten können in dem Kulturmedium suspendiert werden, und die daraus resultierende Suspension kann entweder vor oder nach der Zugabe der Matrix dem Kulturgefäß zugegeben werden. Die Anzahl an Fibroblasten/ml des Mediums kann gemäß dem Animpfgrad, der wünschenswerterweise erreicht werden soll, variiert werden.
Die Prothese der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um beschädigtes Ligament, beschädigte Sehne, Cornea, Dermis, Dura (oder andere Bindegewebe beinhaltende Körperteile) entweder teilweise oder ganz zu ersetzen. Ist der Schaden wesentlich, können das beschädigte Ligament oder die beschädigte Sehne durch die Prothese ganzheitlich operativ ersetzt werden. Ist der Schaden unwesentlicher, kann die Matrix so entworfen werden, dass sie mit dem bestehenden beschädigten Ligament oder der bestehenden beschädigten Sehne verbunden werden kann (z. B. durch Vernähen).
Die Matrix kann gemäß jeder beliebigen der Anzahl von Möglichkeiten entworfen werden. Passenderweise ist die Matrix eine faserförmige Struktur. Sie kann Schleifen und andere Strukturen an jedem Ende zum Unterstützen der Befestigung am Knochen aufweisen (zum Beispiel unter Verwendung entweder der „Zwei-Tunnel"- oder der „Over-The-Top"-Technik). Sie kann durch jede angemessene Technik gebildet werden – z. B. Flechten, Wirken, Weben, Häkeln, etc. Die Matrix weist wünschenswerterweise eine längliche Form auf und ist vorzugsweise elastisch.
Die Vorrichtung kann die natürliche Struktur und die Befestigung des Ligaments oder der Sehne genau imitieren. Zum Beispiel könnte sich die Vorrichtung, zur ACL-Rekonstruktion, aus einer Hierarchie von in faszikulären Einheiten zusammengebündelten Fasern zusammensetzen, die direkt vom Femur zur Tibia führen oder einen Spiralweg um die Achse der Vorrichtung nehmen. Die Befestigung kann an den natürlichen Befestigungsbereichen des Ligaments oder der Sehne erfolgen. Jedes angemessene Befestigungsmittel kann verwendet werden (z. B. Schrauben, Nägel, Klammern oder Nähte). Das Befestigungsmitel selbst kann bioresorbierbar sein, zum Beispiel kann es aus Plyhydroxybutyrat gebildet sein.
Bei Inkubation unter geeigneten Bedingungen werden die Fibroblasten auf und/oder in der Matrix wachsen, wodurch eine mit Fibroblasten angeimpfte Matrix produziert wird.
Das Kit kann zusätzlich ein geeignetes Medium zur Proliferation von Fibroblasten beinhalten.
Idealerweise wird das Kit steril verpackt vorgelegt. Alternativ dazu können die Teile des Kits direkt vor Gebrauch sterilisiert werden. Vor der Implantation können die Komponenten des Kits unter angemessenen Kulturbedingungen wie oben beschrieben zusammen inkubiert werden, damit die Fibroblasten die Prothese animpfen können.
Die Fibroblasten können jede beliebige zum sofortigen Gebrauch geeignete Form aufweisen. Daher können die Fibroblasten passenderweise kältekonserviert sein.
Die Matrix, oder deren Komponenten/Vorläufer, kann/können in gefriergetrockneter Form bereitgestellt werden.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet eine implantierbare Prothese, die in einer der Implantation vorhergehenden Form eine biokompatible, synthetische, im Wesentlichen bioresorbierbare Matrixsubstanz beinhaltet, die ein damit in direktem Kontakt stehendes Polymergel aufweist, wobei das Gel darin verteilte Fibroblasten aufweist. Das ist dahingehend vorteilhaft, dass das Gel die Zellen in einer wirklichen dreidimensionalen Anordnung stützen kann, als lediglich eine monomolekulare Schicht auf der Oberfläche der Substanz zu stützen. Die Umgebung bildet genau die natürliche physiologische Umgebung der Zellen nach. Das Einlagern von Zellen in einem Gel kann auch eine gleichmäßige Zellverteilung bereitstellen, die die Zellen davon abhält, sich anzusammeln, was sonst aufgrund von Gravitätseinfluss auftreten kann.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Reparieren oder Ersetzen von Bindegewebe bei einem Menschen oder Tier zur Verfügung und beinhaltet folgende Schritte: Inkubieren einer biokompatiblen Matrixsubstanz unter Anwesenheit einer Gel bildenden Zusammensetzung und von Fibroblasten unter geeigneten Bedingungen zur Bildung einer Prothese, die eine ein Polymergel berührende Matrix enthält, wobei das Gel darin verteilte Fibroblasten aufweist, und danach Implantieren der Prothese in einen Wirt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung der Prothese wie hierin bereits beschrieben bereit, das den Schritt des Inkubierens der Matrix unter Anwesenheit eines geeigneten Kulturmediums; einer Gel bildenden Zusammensetzung, von Fibroblasten und, falls notwendig, eines Geliermittels beinhaltet.
Geeignete Gel bildende Zusammensetzungen umfassen Kollagengel bildende Zusammensetzungen und Fibringel bildende Zusammensetzungen.
Fibroblasten in einem Kollagengel sind in der Lage, das Kollagen zu verwenden und es neu zu organisieren. Bei einem angemessenen mechanischen Reiz sind sie in der Lage, die dünnen Fasern in nicht zufällig orientierte, organisierte Strukturen, die der natürlichen Ultrastruktur von Ligament und Sehnen gleichen, neu zu organisieren. Ein mechanischer Reiz kann Gelkontraktion verhindern, die sonst nach einiger Zeit durch das Befestigen des Gels an zwei Punkten auftreten würde. Die Matrix kann entworfen werden, um dies zu erreichen. Alternativ dazu, kann das Gel auf oder in der Matrix angewandter Belastung unter Verwendung einer mechanisierten Belastungsvorrichtung ausgesetzt werden, um die Ausrichtung der Fibroblasten zu stimulieren.
Das Verfahren kann einen zusätzlichen Schritt des Inkubierens einer Gel berührenden Matrix unter geeigneten Bedingungen zur Fibroblastenproliferation in dem Gel und danach des Implantierens der Matrix in einen Wirt, beinhalten.
Bei der bevorzugten Auführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Matrix mittels Inkubierens der Matrix unter Anwesenheit eines geeigneten Kulturmediums, einer Gel bildenden Zusammensetzung und der zum Animpfen bereiten Fibroblasten angeimpft. Ein angemessenes Mittel zur Auslösung der Gelierung der Gel bildenden Zusammensetzung kann, falls notwendig, auch verwendet werden.
Das Animpfen der Matrix unter Anwesenheit einer Gel bildenden Zusammensetzung, von Fibroblasten (und, falls erforderlich, eines Geliermittels) resultiert in einer gefüllten Matrix, wobei das Gel darin verteilte Fibroblasten aufweist. Das Gel kann durch das Zusammenwirken des Geliermittels und der Gel bildenden Zusammensetzung gebildet werden. Ein bevorzugtes Gel ist ein Kollagengel. Eine Typ-I-, -II- oder -III-Kollagenlösung kann unter Verwendung einer angemessenen Kollagenquelle präpariert werden. Somit kann zum Beispiel eine Typ-I-Kollagenlösung aus Dermis präpariert werden (Typ-I-Kollagen bildet bis zu 70% von in der Haut enthaltenem extrazellulären Protein) wie oben beschrieben. Alternativ dazu kann eine Typ-I-Kollagenlösung präparierte Sehnen sein, z. B. Ratten- oder Rindersehnen, die fast ausschließlich Typ-I-Kollagen beinhalten. Das Kollagen kann gemäß jedem beliebigen, dem Fachmann bekannten Standardverfahren extrahiert werden.
Es gibt eine Anzahl geeigneter Wege, das Gel in oder auf der Matrix einzulagern. Zum Beispiel kann die Matrix derart suspendiert werden, dass die Gel bildende Lösung (die wahlweise Fibroblasten beinhaltet) die Matrix vollständig umgibt. Eine die Matrix umgebende Form kann verwendet werden. Zentrifugierung oder Unterdruck können alternativ dazu verwendet werden, um das Gel zur Matrix hinzuführen.
Eine wie hierin beschriebene Prothese in Kitform, die eine biokompatible Matrix, eine Gel bildende Zusammensetzung und eine Fibroblastenquelle beinhaltet.
Alternativ dazu kann das Kit eine biokompatible Matrix mit einer Beschichtung, die ein Polymergel beinhaltet und/oder ein darin eingelagertes Polymergel und eine Fibroblastenquelle aufweist, beinhalten. Bei Inkubation unter geeigneten Bedingungen können die Fibroblasten in das Gel eindringen, wodurch eine Matrix, die ein Fibroblasten darin aufweisendes Gel trägt, produziert wird.
Die Prothese der vorliegenden Erfindung bietet einen Vorteil gegenüber bereits bekannten Prothesen, die entworfen wurden, um das Einwachsen von Fibroblasten nach der Implantation zu fördern und als Gerüst zu fungieren, durch das Fibroblasten wachsen und ein neues Ligament bilden können, da sie Fibroblasten vor der Implantation beinhaltet. Somit kann das beschädigte Gewebe durch eine Prothese, die lebensfähige Fibroblasten beinhaltet, die sich replizieren können, ersetzt werden. Die Fibroblasten können schon im Wesentlichen bei der Implantation ausgerichtet oder zumindest in nicht zufälliger Weise orientiert sein. Dieser Prozess ist schneller als die bereits bekannten Verfahren, die auf Infiltration der Prothesen durch Fibroblasten nach der Implantation basieren. Es ist ersichtlich, dass die Prothese nach einem anfänglichen vorbestimmten Inkubationszeitraum, der zeitlich so gewählt ist, um in der Animpfung der Prothese mit Fibroblasten zu resultieren, implantiert werden kann. Alternativ dazu kann die Prothese über einen längeren Inkubationszeitraum als den anfänglichen Inkubationszeitraum inkubiert werden, so dass die Fibroblasten sich replizieren und schon begonnen haben, kleine Kollagenfasern abzusondern, wenn die Prothese implantiert wird.
Die Prothese und das Verfahren der vorliegenden Erfindung bieten andere Vorteile gegenüber der herkömmlichen chirurgischen Praxis oder dem Ernten von Wirtskniescheibenbändern, dadurch dass sie den Bedarf des Durchführens eines extensiven operativen Eingriffs zum Ernten der Sehne vermeiden. Eine einfache Hautbiopsie (eine Standardprozedur, die keine wesentliche Narbenbildung zur Folge hat) kann verwendet werden, um Fibroblasten zu erhalten, die dann in einer Kultur proliferiert werden können. Zusätzlich kann die Prothese entworfen werden, um die Orientierung der Fibroblasten zu optimieren. Die Gesamtwirkung dieser Vorteile kann in der Verkürzung eines Krankenhausaufenthalts resultieren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der ein Kollagengel die Matrix berührt, stellt die Prothese der vorliegenden Erfindung eine Kollagenquelle bereit, die von den Fibroblasten verwendet werden kann. Das Kollagen im Gel weist vorzugsweise eine nicht quervernetzte Form auf.
Substanzen, die sich zur Verwendung in einer Matrix der vorliegenden Erfindung eignen, können, wie unten veranschaulicht, beurteilt werden:
Beurteilung der Substanzen
Um eine erste Beurteilung angemessener Substanzen zum Stützen von Fibroblastenwachstum vornehmen zu können, wurden verschiedenartige Substanzen erhalten (die nicht als einschränkend erachtet werden sollen), wie in Tabelle 1 unten angegeben, und über 5 min bei 2,5 Tonnen bei den folgenden Temperaturen in Filme geformt: Polylactid 170°C; Polyglycolid, 245°C; Polyhydroxybutyrat, 185°C und Polycaprolacton, 65°C.
Tabelle 1
Fibroblasten wurden auf die Oberflächen dieser Substanzen bei einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen/cm² an Substanz geimpft und 3 Tage lang unter Kulturbedingungen inkubiert.
Nach dem Inkubationszeitraum wurden von den mit Zellen angeimpften Proben Mikrophotographien angefertigt. Diese werden in 1a bis 1d für die in Tabelle 1 oben angegebenen Proben gezeigt (Kopien aller für diese Anwendung bereitgestellten Photographien werden umgehend nach den relevanten Photographien bereitgestellt).
Es ist zu erkennen, dass die Fibroblasten an den Oberflächen aller Substanzen gut anhaften und dass sie die für gesunde Kulturfibroblasten typische Morphologie aufzeigen.
Eine Probe von Fibroblasten wurde auf Polylactid gezüchtet, wie oben beschrieben, mit Ausnahme dessen, dass ein längerer (16 Tage langer) Kulturzeitraum verwendet wurde.
Nach diesem Zeitraum wurden die Zellen mit einem lebensfähigen Farbstoff (Calcein AM (2 μM)) gefärbt und durch eine Fluoreszensmikroskopie unter Verwendung eines Fluoreszeinfilters sichtbar gemacht. Eine konfluente monomolekulare Schicht von lebensfähigen Zellen wurde beobachtet und zeigte, dass Polyactid in der Lage ist, lebensfähige Fibroblasten über ausgedehnte Kulturzeiträume zu stützen.
2 ist eine graphische Darstellung, die die relative Geschwindigkeit der Proliferation von Fibroblasten an vier Beispielen von bioresorbierbaren synthetischen Substanzen zeigt: Polylactid (PLA); Polyglycolid (PGA) Polyhydroxybutyrat (PHB) und Polycaprolacton (PCL) (alle wie oben beschrieben) im Vergleich zu einer Gewebekultur, die mit Polystyren (TCP)-Kontrolle behandelt wurde (da bekannt ist, dass TCP ein gutes Fibroblastenwachstum unterstützt).
2a) bis e) zeigen jede dieser Substanzen in einer einzelnen graphischen Darstellung (für jede von Bezug). Zellen wurden bei 1 × 10⁴ Zellen.cm^–2 in dreifacher Ausführung geimpft und die Proliferationsgeschwindigkeit wurde durch Messen der Aufnahme von tritiiertem Thymidin in zelluläre DNS bei Zeitpunkten von bis zu 7 Tagen nach der Inkubation unter Verwendung von Standardzellkulturtechniken bestimmt. Das Medium wurde bei 2, 4 und 6 Tagen gewechselt. Die Punkte stellen das Mittel von drei Bestimmungen dar und die Fehlerbalken stellen die Reichweite dar. Alle Polymere unterstützten Fibroblastproliferation.
3 ist eine Mikrophotographie von Fibroblasten, die in ein dreidimensionales Kollagengel nach 15 Tagen der Kultur eingebettet werden. Das mit Zellen angeimpfte Gel wurde wie in Beispiel 2 (das später beschrieben werden soll) beschrieben, präpariert, mit Ausnahme dessen, dass es nicht verwendet wurde, um eine Matrix zu berühren. Das Gel stellt eine dreidimensionale Struktur bereit, in der die Zellen eingebettet sind, und kann Wechselwirkungen mit Kollagenmolekülen über Membranintegrin-Rezeptoren bilden. Die Zellen sind zufällig angeordnet, weisen lange Prozesse auf und sind in der Lage, kleine Kollagenfasern innerhalb des Gels neu zu organisieren.
4 ist eine Mikrophotographie von Fibroblasten, die innerhalb eines dreidimensionalen Kollagengels eingebettet sind, wie für 3 oben beschrieben, mit Ausnahme dessen, dass das Gel nun durch zwei mit einem mit Gewebekulur kompatiblen Kleber an eine Kulturschale geklebte Edelstahlstifte daran gehindert wurde, sich in eine Richtung zusammenzuziehen. Die Zellen sind auf eine gut orientierte Weise angeordnet, wobei ihre langen Achsen parallel zur Achse zwischen den Begrenzungsstiften liegen. Die kleinen Kollagenfasern richten sich entlang derselben Achse aus. Diese Auswirkung ergibt sich aufgrund der Tatsache, dass die Stifte das Gel daran hindern sich zusammenzuziehen, was sonst unter Anwesenheit von Fibroblasten in einer Kultur auftreten würde.
Die folgenden Beispiele, die nicht als einschränkend erachtet werden sollen, veranschaulichen, wie verschiedenartige, mit Zellen angeimpfte Matrizen produziert werden können.
a) Präparieren der Zellen
Eine Biopsie wird dreimal in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in 70% Alkohol gespült. Die gespülte Biopsie wird dann in Dulbeccos modifiziertes Kulturmedium (DMEM) getaucht und bei 37°C 24 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wird die Biopsie unter PBS in kleine Stücke geschnitten. Die geschnittenen Stücke werden in eine 50 mm Petrischale transferiert, die ungefähr 5 ml Kollagenaselösung enthält, um Aufschluss zu ermöglichen. Die epidermalen Schichten werden aus der Kollagenaselösung entfernt. Die daraus resultierende Lösung wird zentrifugiert. Das Fibroblastenzellpellet wird in DMEM resuspendiert und danach in einer 35 mm Petrischale unter Verwendung von DMEM als Kultur angesetzt. Die Zellen können aus 2–4 Tagen zusammenfließen. Danach können die Zellen kultiviert werden, um eine angemessene Menge an Fibroblasten zum Animpfen der Matrix bereitzustellen.
Ein geeignetes Medium zum Kultivieren der isolierten Fibroblasten kann DMEM beinhalten, das mit Folgendem ergänzt werden kann: Glutamin, fetalem Kalbsserum, nicht essentiellen Aminosäuren und Antibiotika. Zusätzlich kann das Medium ein Puffermittel wie Hydrogencarbonat aufweisen.
b) Präparieren der Matrixsubstanz
Eine zur Verwendung in einer Prothese zum Ersetzen eines Ligaments geeignete Polylactid-Matrixsubstanz kann dadurch präpariert werden, dass Polylactid-Fasern erhalten und diese dann geflochten werden, um ein Geflecht von angemessenen Ausmaßen zum Ersetzten des Ligaments zu bilden.
Polylactid-Fasern können durch Extrudieren, Faserspinnen, Schmelzspinnen, Ziehen, Wärmeaushärtung, etc. erhalten werden.
Das Flechten der Fasern kann durch Standardflechttechniken erreicht werden, wobei die Länge und die Dicke des Geflechts, die Anzahl der vorliegenden Fasern und der Durchmesser der vorliegenden Fasern ausgewählt werden, um ein Geflecht mit angemessenen Eigenschaften zu bilden.
Die Enden der Vorrichtung sind auf geeignete Weise konstruiert, um die Befestigung der Vorrichtung durch eine Schraube oder andere Befestigungsmittel zu unterstützen. Dies wird durch Bilden von Ösen an den Enden erreicht.
c) Belasten der mit Zellen angeimpften Matrixsubstanz
Die mit Zellen angeimpfte Vorrichtung wird in einem Belastungsapparat an beiden Enden ergriffen, was bewirkt, dass die Vorrichtung entlang einer einzigen Längsachse belastet wird. Dies wird über einen ausreichenden Zeitraum durchgeführt, so dass bewirkt wird, dass sich die Fibroblasten im Wesentlichen entlang der allgemeinen Richtung der Längsachse ausrichten, wie durch Mikroskopanalyse der Zellen beurteilt werden kann. Der Apparat beinhaltet eine Kulturkammer, so dass das Belasten über einige Stunden oder sogar einige Tage stattfinden kann und die Zellen dennoch lebensfähig bleiben. Typischerweise wird die Vorrichtung bei 37°C belastet.
Während des Belastens wird ein Kulturmedium verwendet, um die Zellen unter geeigneten Bedingungen zu kultivieren. Dies umfasst ein Serum, Ascorbat oder dessen stabile Entsprechungen, zusammen mit Wachstumsfaktoren.
Das Ascorbat stimuliert die Fibroblasten zur Synthese von Kollagen; das Serum enthält Faktoren, die Zellproliferation und Zellhaftung fördern und die Wachstumsfaktoren können Zellproliferation, Zellentwicklung und Zellmigration stimulieren.
d) Implantation der mit Zellen angeimpften Matrix
Wenn die mit Zellen angeimpfte Vorrichtung über einen ausreichenden Zeitraum belastet worden ist, um einen erwünschten Grad an Ausrichtung der Fibroblasten zu erhalten, wird sie aus der die Zellen belastenden Vorrichtung entfernt und durch eine beliebige erwünschte Technik in den Patienten implantiert.
Bevorzugt wird ein minimaler invasiver Eingriff. Für eine prosthetische anteriore Kreuzbandimplantation sollte das „Zwei-Tunnel"- oder das „Over-The-Top"-Verfahren verwendet werden. Eine Befestigung kann durch die Verwendung von Schrauben (oder anderen Befestigungsteilen), die durch die Ösen der Matrix platziert werden, erzielt werden. Die Schrauben sind geeigneterweise aus einer biologisch abbaubaren Substanz gebildet, wie zum Beispiel Polyhydroxybutyrat.
Beispiel 1: Präparieren einer mit Fibroblasten angeimpften Polyactid-Matrixprothese, die ein Kollagengel beinhaltet, in dem die Fibroblasten eingelagert sind
Dies kann auf eine dem oben beschriebenen Verfahren analoge Weise durchgeführt werden, mit der Ausnahme des Einschließens einer alternativen Prozedur, wodurch die Fibroblasten in ein Kollagengel eingelagert werden, das zum Animpfen der Polyactid-Matrix verwendet wird. Diese zusätzliche Prozedur wird untenbeschrieben:
a) Präparieren des Kollagens
Es ist erwünscht, ein Kollagen in säurelöslicher und nicht querverbundener Form zu bilden. Dies kann wie folgt durchgeführt werden:
Das Typ-I-Kollagen wird aus Sehne präpariert, könnte aber aus anderem Gewebe, z. B. Haut, sein. Das Gewebe wird fein zerschnitten, in 70%igem (Vol/Vol) Ethanol für mindestens 30 min desinfiziert, in Essigsäure (1% Vol/Vol) verteilt und unter Umrühren bei 4°C inkubiert. Der Überstand wird entfernt und durch Zugabe eines angemessenen Volumens von 1,0 M Natriumhydroxid neutralisiert. Das ausgefällte Typ-I-Kollagen wird durch Zentrifugieren bei 8000 × g pelletiert und das Pellet in einem angemessenen Volumen Essigsäure (1% Vol/Vol) resuspendiert. Die Kollagenkonzentration dieser Lösung wird durch ein beliebiges angemessenes Verfahren (z. B. eine Gesamtproteinanalyse – die BCA-Analyse) bestimmt und die Konzentration der Kollagenlösung wird angemessen geregelt (z. B. können 3 mg.ml^–1 verwendet werden).
Ist das Produkt ein Kit, kann die sterile Kollagenlösung gefriergetrocknet und unter Vakuum oder einem inerten Gas (z. B. Argon) gelagert werden, um ein Quervernetzen zu vermeiden. Ein Verdünnungsmittel (Essigsäure) könnte ebenfalls bereitgestellt werden. Alternativ dazu könnte es als eine Lösung bereitgestellt und bei 4°C bis –20°C gelagert werden.
b) Animpfen der Matrixsubstanz mit Zellen
Zum Animpfen der Matrix werden typischerweise drei Komponenten verwendet: – in einem angemessenen Medium suspendierte Zellen, Kollagenlösung und ein Geliermittel – (z. B. 1 M Natriumhydroxid). Die endgültige Kollagenkonzentration kann annähernd 1 mg.ml^–1 und die Animpfdichte annähernd 3 × 10⁴ Zellen pro ml Gel (oder Volumen innerhalb der Matrix) betragen. Die drei Komponenten werden bei 0°C bis 4°C gehalten, gemischt und der Matrix zugegeben. Ist die Matrix vollständig imprägniert, wird sie bei 37°C inkubiert und das Gelieren wird eingeleitet.
Das Imprägnieren der Matrix kann durch jedes geeignete Verfahren erzielt werden. Die Matrix kann in einer Gussform lediglich in die Lösung getaucht werden. Alternativ dazu kann die Lösung unter Verwendung eines Vakuums in das Gerüst gesaugt oder durch Zentrifugieren (zum Beispiel innerhalb einer Gussform bei 500 U/min für 5 min bei 0–4°C zentrifugiert) gezwungen werden.
Die Geschwindigkeit des Setzens des Gels kann durch Variieren der Temperatur variiert werden.
Beispiel 2: Präparieren einer mit Fibroblasten angeimpften Polyactid-Matrixprothese, die ein Fibringel beinhaltet, in dem die Fibroblasten eingelagert sind
Dies kann durch ein dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren analoges Verfahren durchgeführt werden, mit Ausnahme dessen, dass eher ein Fibringel als ein Kollagengel verwendet wird.
Wieder werden drei Komponenten verwendet: Zellsuspension, Fibrinogenlösung und Calciumchlorid (mM) enthaltende Thrombinlösung. Die endgültige Zellkonzentration kann 3 × 10⁴ Zellen pro ml betragen, die Fibrinogenkonzentration kann 3 mg/ml, die Thrombinaktivität 2,5 Einheiten/ml und die Calciumchloridkonzentration 5 mM betragen. Die Reagenzien werden gemischt und dann mit der Matrix inkubiert. Ist die Lösung imprägniert, wird die Matrix bei 37°C inkubiert, um ein schnelles Gelieren zu ermöglichen. Das Imprägnieren der Matrix kann durch jede der oben beschriebenen Techniken ausgeführt werden.
Die Geschwindigkeit des Gelierens kann variiert werden, indem die Thrombinaktivität und/oder die Temperatur variiert werden.

Claims

Eine implantierbare Prothese, die in einer vor der Implantation gegebenen Form eine Matrix aus biokompatibler, synthetischer, im Wesentlichen bioresorbierbarer Polymermatrixsubstanz, die mit Fibroblasten angeimpft ist, beinhaltet, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix ein Polymergel aufweist, mit dem sie in sehr gutem Kontakt steht und das die Matrix ausfüllt, und wobei das Gel die darin dispergierten Fibroblasten aufweist.
Prothese gemäß Anspruch 1, wobei das Gel ein Kollagengel ist.
Prothese gemäß Anspruch 1, wobei das Gel ein Fibringel ist.
Prothese gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Gel aus Typ-I-Kollagen besteht.
Prothese gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fibroblasten nicht zufällig orientiert sind.
Prothese gemäß Anspruch 5, wobei die Fibroblasten im Wesentlichen ausgerichtet sind.
Prothese gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die bioresorbierbare Matrixsubstanz eine oder mehrere der folgenden Substanzen beinhaltet; ein Polylactid, ein Polyglycolid, ein Polydioxanon, ein Polycaprolacton, ein Polyhydroxybutyrat, ein Polyhydroxybutyrat-co-hydroxyvalerat, ein Polyanhydrid, ein Polyorthoester, ein Polyorthocarbonat, ein Polyaminocarbonat, ein Polytrimethylencarbonat oder ein Copolymer, das Monomere, aus denen die oben genannten Polymere gebildet sind, einlagert.
Prothese gemäß Anspruch 7, ferner bestehend aus einer nicht bioresorbierbaren Matrixsubstanz.
Prothese gemäß Anspruch 8, wobei die nicht bioresorbierbare Matrixsubstanz ein Polyester, ein Polyethylen, ein Polypropylen, PTFE, Carbonfaser oder ein Verbundstoff aus zwei oder mehreren der bereits genannten Substanzen ist.
Prothese gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, die ferner eins oder mehrere des Folgenden beinhaltet: Proteoglycane, Glycosaminoglycane, Fibronectin oder seinen Aktivbindungsbereich, Wachstumsfaktoren, osteoinduktive und osteokonduktive Substanzen.
Prothese gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Matrixsubstanz flexibel ist.
Prothese gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, die eine Vielzahl von bioresorbierbaren Matrixsubstanzen, die unterschiedliche Bioresorptionsraten aufweisen, beinhaltet.
Prothese gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Prothese die Form eines faserförmigen Elements aufweist.
Prothese gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, die die Form eines gewebten, gewirkten, gehäkelten oder geflochtenen Elements aufweist.
Prothese gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche in Form eines Kits, die die Matrixsubstanz, eine Quelle von Fibroblasten und eine Zusammensetzung zur Bildung des Gels beinhaltet.
Ein Kit gemäß Anspruch 15, das ferner ein Medium, das zur Proliferation von Fibroblasten geeignet ist, beinhaltet.
Ein Verfahren zur Herstellung der Prothese gemäß Anspruch 1, das den Schritt des Inkubierens der Matrix unter Anwesenheit eines geeigneten Kulturmediums, einer Gel bildenden Zusammensetzung, von Fibroblasten und, falls notwendig, eines Geliermittels beinhaltet.
Verfahren zur Herstellung der Prothese gemäß Anspruch 17, das ferner den Schritt des Befestigens des Gels an zwei Punkten beinhaltet.