JPH09500298A - 埋込型プロステーシス、キットおよびそれを製造するための装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 埋込型プロステーシスは、繊維芽細胞を接種した、生物適合性の合成の実質的に生物同化可能なマトリックス素材からなる。

Description

【発明の詳細な説明】 埋込型プロステーシス、キットおよびそれを製造するための装置 本発明は損傷した靭帯や腱などの結合組織を取り替えたり修復したりするのに 適する方法と、そのような方法において使用するためのプロステーシスに関する 。またそのようなプロステーシス形成するための装置が、プロステーシスを形成 するもとのキットとともに開示されている。 米国特許第５０７８７４４号により、前方十字靭帯（ＡＣＬ）などの損傷した 靭帯の一部を、架橋（cross-linked）し整列した繊維群に形成した精製結合性動 物腱あるいは靭帯組織繊維からなる人工靭帯で置き換えることにより、修復する ことが公知である。 ＡＣＬの修復あるいは再構築のための最も一般的な方法は、自生の組織からな る人工移植片を植え込むことである。従って宿主から、例えば膝蓋腱などの自生 の組織を収集し植え込みのためのプロステーシスを形成することが一般的な外科 処置として行われている。 幾つかの合成の生物同化可能でない素材が人工靭帯の製造に用いられてきてお り、それら素材は、プロステーシスの植え込み後の繊維芽細胞の進界成長を支持 あるいは促進するため、その親和性によって選ばれている。 本発明によれば、宿主に埋め込む前の形態において、繊維芽細胞を接種した生 物適合性で合成の実質的に生物同化可能なマトリックス素材からなる埋込型プロ ステーシスが提供される。 「合成」という用語は単に、哺乳類において結合組織修復に天然では用いられ ない素材あるいはそのような素材の化学的変形物でない素材を意味する。したが ってこの用語からは、コラーゲンや人工的に架橋したコラーゲンマトリックスは 除外される。（ただしもし所望ならばコラーゲンを合成素材に加えて用いること が可能であるが） 「繊維芽細胞」（fibroblast）という用語は、繊維芽細胞、繊維細胞、腱細胞 あるいは滑膜細胞という名称でしばしば呼ばれる細胞を含んでいる。この用語は またこれらの細胞に対する前駆体細胞もカバーしている。 「実質的に生物同化可能なマトリックス素材」は、繊維芽細胞を支持するため の（例えば骨格、メッシュあるいは中実構造の形態の）３次元構造であって、埋 込型（又は植込型）プロステーシス（人工器具又は人工補装器、prostheses）に おいて、体成分の化学的／生物学的機能により、哺乳類の体の中で時間とともに （プロステーシスへの物理的応力による単なる破損ではなく）実質的に分解する ものを意味する。プロステーシスが成人に埋め込まれてから５年後（より望まし くは埋め込み１年後）に、この生物同化可能な素材は、分解してプロステーシス の全体としての構造に実質的に寄与しない程度に分解していることが望ましい。 マトリックスはさらに次の分子を１つ以上含有することが望ましい。それらは 、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチンあるいはその活 性結合領域、あるいは１つ以上の成長因子、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ） 繊維芽細胞成長因子、血管形成因子あるいはその他の刺激因子である。 本発明のさらに別の実施態様によれば、プロステーシスあるいはその１部分（ すなわち植え込み後に骨と接触するプロステーシス領域）は、細胞の浸潤を容易 にするため、骨誘導的(osteoinductive)あるいは骨通導的(osteoconductive)薬 剤を含浸させることが望ましい。浸潤しやすい好適な骨誘導的素材の例としては 、ヒドロキシアパタイト、冷凍乾燥したあるいは脱塩した（demineralised)骨、 成長因子（例えば骨形成タンパク質）などがあげられる。含浸は、プロステーシ スの埋め込みの直前に行うことが好適である。そのような素材はプロステーシス の両端に組み込まれることが好適である。 本発明のさらに別の実施態様によれば、マトリックス上あるいは中において繊 維芽細胞の接種のための適切な条件下で、適切な培地および繊維芽細胞の存在の もとで生物適合性で合成の、実質的に生物同化可能なマトリックス素材を培養す ることと、そののち接種したマトリックスを宿主に埋め込むこととからなる、ヒ トあるいはヒト以外の動物における損傷した結合組織を修復あるいは取り替える 方法が提供される。 適切な実質的に生物同化可能な合成ポリマーの例としては、ポリラクチド（Ｐ ＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリジ オキサノン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリヒドロキシブチレート（ＩＣ ＩＢＩＯＰＯＬ、登録商標）、ポリヒドロキシブチレートコヒドロキシバレレー ト（ＩＣＩＢＩＯＰＯＬ、登録商標）、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル 、ポリオルトカーボネート、ポリアミノカーボネート、ポリトリメチレンカーボ ネートおよび上記のポリマーが形成される単量体を混和したコポリマーがあげら れる。 本発明によるプロステーシスがコポリマーからなるとき、そのコポリマーはヒ ドロキシバレレートおよびヒドロキシブチレート単量体を含有することができる 。そのようなコポリマーにおいて、含まれるヒドロキシバレレートの量は１から ４７モル％である。その他の特に適切なコポリマーはＰＬＡ／ＰＧＡおよびＰＬ Ａ／ＰＣＬコポリマーである。 上記の実質的に生物同化可能な素材を複数含む複合物(composite)もまたマト リックス素材あるいはその一部分として好適である。 マトリックスは、時間とともに機械的性質の２つ以上の相損失を与えるような 異なった分解速度を有する（例えば異なった繊維型の）２つ以上の異なった素材 から作られていてもよい。異なった繊維型は異なった機械的性質をもっていても よい。例えば、高度に伸長可能な繊維を、より伸長性の低い繊維と組合してもよ い。マトリックスは、伸長性の低い繊維が伸長を妨げる前に、ある一定の程度伸 長するように設計できる。この設計は、ある限度の制御された応力を細胞に与え 、かつ形成中の組 織に対する損傷に対して防御するために有利である。例えば、ポリカプロラクト ン繊維は、ポリラクチド繊維よりもヤング率が低い。 さらに１つのポリマー上に別のポリマーをコーティングしてもよい。これは、 機械的性質に基づいて選ばれた良い素材が、（改変しない限り）必ずしも細胞培 地にとって良い素材ではないとき有利である。ここでより生物適合性の良いポリ マーが、より生物適合性の低いベース素材をコーティングするために用いられる 。例えばポリラクチドはポリカプロラクトンよりも繊維芽細胞拡散に対して、よ り良い基質を提供する。繊維芽細胞との共存性を改善するために、ポリカプロラ クトン繊維にポリラクチドをコーティングしてもよい。 上に示したように共重合性素材を用いることができる。これはコポリマーが、 それを構成するホモポリマーの分解速度の中間の値の分解速度を有しているとき 有利になる。従ってコポリマーの組成を制御することにより、分解速度を制御す ることができる。また繊維紡ぎあるいは押し出しによるコポリマー繊維の製造は 、ホモポリマーよりも機械的性質のすぐれた繊維を生み出す。ポリラクチドポリ グリコリドコポリマーはこれら両方の点の良い例である。 マトリックスに接種するために好適な繊維芽細胞は自己原性繊維芽細胞、同種 異系繊維芽細胞、あるいは異種繊維芽細胞である。繊維芽細胞は自己原性のもの であることが望ましい。繊維芽細胞は、例えば真皮、腱あるいは靭帯から由来す るもので ある。マトリックスに接種するための繊維芽細胞は１つ以上の上記の型の繊維芽 細胞の混合物を含有してもよい。繊維芽細胞が自己原性のものである時は、大が かりな侵襲的外科術の必要性を避けるため、それらを真皮から分離培養すること が望ましい。 繊維芽細胞は好適な方法のいずれかによって得ることができる。望ましい方法 は皮膚バイオプシーを行うことである。 マトリックス素材は、繊維芽細胞の存在下で適切な培地（例えばＤＭＥＭ）を 含有する培養容器にマトリックスを入れ、細胞培養条件下で培養することにより 、繊維芽細胞の接種をすることができる。繊維芽細胞を培地に懸濁し、得られる 懸濁液をマトリックスの添加の前あるいは後に培養容器に加える。１ミリリット ルの培地当たりの繊維芽細胞の個数は、どの程度の接種を行いたいかによって変 化させることができる。 本発明のプロステーシスは、損傷した靭帯、腱、角膜、真皮、硬膜（あるいは 結合組織を有する他の部分）の全部あるいは一部と置き換えるため用いることが できる。損傷がかなりのものであるときは損傷した靭帯あるいは腱を全面的に外 科的にプロステーシスで置き換えることができる。損傷がそれほどでもないとき は、既存の損傷靭帯あるいは腱に（例えば縫合によって）結合させるため、マト リックスを設計することができる。 マトリックスの設計はいくつかの可能性のいずれかによることができる。マト リックスは繊維状構造であることが好適である。骨への固着を助けるため両端に ループやその他の構造を有 していてもよい（例えば「２トンネル（two tunnel）」あるいは「オーバーザト ップ（over the top）」技術のどちらかを用いて）。それは例えば編むこと、ニ ッティング、織ること、かぎ針編みなどの適切な技術のいずれかにより形成する ことができる。マトリックスは伸長した形態であることが好ましく、可撓性であ ることが望ましい。 この装置は、靭帯あるいは腱の自然の構造と固定を密接に模倣するのがよい。 例えはＡＣＬ再構築のためには装置は大腿骨から脛骨へ直接通ずるかあるいは装 置の軸のまわりに螺旋を描く繊維束からなる(fasicular)ユニットに分かれて一 緒に束ねた繊維の階層構造(hierarchy)によって構成されていてもよい。固定は 靭帯あるいは腱の自然の固定領域に対してなされる。適切な固定手段のいずれか （例えば、ネジ、くぎ、ステープルあるいはスチン（sutine）など）を用いるこ とができる。固定手段はそれ自身生物同化可能であり、例えばポリヒドロキシブ チレートから形成されている。 本発明は、合成の生物適合マトリックス素材と繊維芽細胞の素材源とからなる 本発明のプロステーシスを形成するためのキットをさらに提供する。 適当な条件下での培養により、繊維芽細胞はマトリックスの上及び／又は中で 成長し、繊維芽細胞により接種したマトリックスを生成する。 キットはさらに繊維芽細胞の増殖用の好適な培地からなることができる。 理想的にはキットは無菌包装により提供される。あるいはまた、キットの部分 (parts)は使用直前に殺菌される。埋め込み前に、繊維芽細胞がプロステーシス 中で種となるように上記のような適切な培養条件下で、キットの成分を一緒に保 存することができる。 繊維芽細胞はすぐ使用できるような適切な形態のいずれかを有する。したがっ て繊維芽細胞が低温保存することが好適である。 マトリックスあるいはその成分／前駆体は、凍結乾燥した形態で提供できる。 好ましい実施態様においては、本発明は、埋め込み前の形態において、密接に 接触するポリマーゲルを有し、ゲルがその中に分散した繊維芽細胞をもつような 、生物適合性で合成の実質的に生物同化可能なマトリックス素材を含有する埋込 型プロステーシスからなる。これは、ゲルが、素材表面の単一層をただ支持する のではなく、細胞を真に３次元の配置で支持することができるという点において 利点を有する。環境は細胞の自然の生理学的環境を密接に模倣する。またゲル中 への細胞の組み込みは、均一な細胞分布を実現し、組み込まないときには重力の 影響により起こるかも知れない細胞の貯り(pooling)を防ぐことができる。 本発明は、繊維芽細胞を分散させたポリマーゲルに接触するマトリックスを含 有するプロステーシスを形成するため、適切な条件下でゲル形成組成物および繊 維芽細胞の存在のもとで生 物適合性のマトリックス素材を培養することと、その後にプロステーシスを宿主 に埋め込むこととからなる、ヒトあるいはヒト以外の動物における結合組織を修 復あるいは取り替える方法が提供される。 好ましいゲル形成組成物には、コラーゲンゲル形成組成物と繊維素ゲル形成組 成物が含まれる。 コラーゲンゲル中の繊維芽細胞はコラーゲンを利用しそれを再編成する能力を 持っている。適切な機械的刺激の下でそれらは、靭帯や腱の自然の超構造に似た 非ランダムに方向付けられた組織化された構造に、原繊維(fibrils)を再編成す る能力を有する。機械的刺激は、もしそれを与えなければ２点でゲルを固定する ことにより時間とともに起きるゲル収縮の防止でもよい。マトリックスはこれを 達成するために設計される。あるいはまたマトリックスの上または中のゲルは、 繊維芽細胞の整列を刺激するために機械的応力装置を用いてかけられる応力にさ らされる。 この方法はゲル中の繊維芽細胞拡散のための適切な条件の下でゲル接触マトリ ックスを培養し、その後そのマトリックスを宿主に埋め込む工程をさらに有して いてもよい。 本発明の望ましい実施態様によれば、適切な培地と、ゲル形成組成物と、種と していれる繊維芽細胞の存在のもとでマトリックスを培養することにより、マト リックスの接種をすることができる。もし必要ならばゲル形成組成物のゲル化を 引き起こす適切な薬剤を用いてもよい。 ゲル形成組成物、繊維芽細胞（および必要ならばゲル化剤）の存在下でのマト リックスの接種により、ゲル中に繊維芽細胞が分散した、ゲルでコーティングあ るいは充填したマトリックスが得られる。ゲルはゲル化剤とゲル形成組成物の相 互作用により形成することができる。望ましいゲルはコラーゲンゲルである。適 切なコラーゲン源を用いて、Ｉ型、ＩＩ型、あるいはＩＩＩ型コラーゲン溶液を 調製することができる。例えばＩ型のコラーゲン溶液は上記のように真皮から調 製することができる（Ｉ型のコラーゲンは皮膚において見られる細胞外タンパク 質の７０％までを形成する）。あるいはまたＩ型コラーゲン溶液は、例えばラッ トあるいはウシの腱のような、ほとんど排他的にＩ型コラーゲンを含む腱から調 製することができる。コラーゲンは当業者に公知の何れかの標準方法によって抽 出することができる。 マトリックスの中あるいは上にゲルを組み込む好適な方法がいくつかある。例 えば、ゲル形成溶液（繊維芽細胞を含有していてもよい）がマトリックスを完全 に取り囲むようのやり方で、マトリックスを懸濁することができる。マトリック スを取り囲む型枠(mould)を用いることができる。ゲルをマトリックスに導くた めに遠心分離や吸引を代替的に用いることができる。 望ましい実施態様のプロステーシスを形成するために用いられるキットは、生 物適合性のマトリックスと、ゲル形成組成物と、繊維芽細胞の源を含むことがで きる。 あるいはまた、キットはポリマーゲルを含むコーティングを 有する及び／又は中に組み込んだポリマーゲルを有する生物適合性マトリックス と、繊維芽細胞の源を含む。適切な条件の下での培養により、繊維芽細胞はゲル に侵入し、中に繊維芽細胞をもつゲルを含むマトリックスを生成することができ る。 本発明のプロステーシスは、埋め込み前に繊維芽細胞を有するので、埋め込み 後に繊維芽細胞の進界成長を高め、繊維芽細胞が生育して新しい靭帯を形成する 骨組となるように設計された、従来の公知のプロステーシスに対し利点を有する 。このように損傷した組織は、自己複製する生育可能な繊維芽細胞を含むプロス テーシスによって置き換えることができる。繊維芽細胞は既に埋め込み時に実質 的に整列しているか、あるいは少なくとも非ランダムに方向付けられている。こ の過程は、埋め込み後の繊維芽細胞によるプロステーシスの浸潤（infiltration ）に依存する従来の公知の方法に比較して速い。繊維芽細胞によるプロステーシ スの接種をするために時間調整した初期の予め決められた培養期間後に、プロス テーシスを埋め込むことができるということが明らかになるであろう。あるいは また、プロステーシスが埋め込まれたとき繊維芽細胞が自己増殖し既にコラーゲ ン原繊維を分泌し始めるように、初期培養期間より長い培養期間にわたってプロ ステーシスを培養することができる。 本発明のプロステーシスと方法は、腱を収集するため大がかりな外科手術を実 行する必要性を避けられるという点において、通常の外科処置あるいは宿主膝蓋 腱を収集することに対して別の利点を有する。単純な皮膚生検（実質的に傷跡を 残さない標 準手順）を用い、繊維芽細胞を得て、培地で拡散させることができる。さらにこ のプロステーシスは、繊維芽細胞方向を最適化するよう設計することもできる。 これらの利点の累積効果により病院滞在の期間を短縮することができる。 コラーゲンゲルがマトリックスに接触する、本発明の望ましい１つの実施態様に よれば、本発明のプロステーシスは、繊維芽細胞によって利用できるなコラーゲ ン源を提供する。ゲル中のコラーゲンは非架橋形態（non-cross-linked）である ことが望ましい。 さらにもう１つ別の本発明の望ましい実施態様によれば、繊維素ゲルが用いら れる。 本発明のさらに別の態様によれば、繊維芽細胞を生育可能な条件に維持するチ ャンバーを備え、チャンバーがマトリックス素材を離脱可能に保持する手段と、 単一の軸だけに沿ってマトリックス素材に応力を印加するようにした手段とを備 える、本発明によるプロステーシスを形成するため用いられる細胞培養用の装置 が提供される。そのような装置は上に述べたようにキットの中に含めることがで きる。 いくつかの応力手段が存在するときは、本発明の装置はある時間において複数 の試料に応力を印加することができる。したがってこの装置は培地を保持するよ うにした１つ以上のチャンバーを有し、複数のマトリックス素材を離脱可能に保 持する手段を備えることができる。これは同時に行うことができる。幾つかのチ ャンバーの各々は、複数のマトリックス素材を離脱可 能に保持する手段を備えることができる。あるいはまた各チャンバーは単一のマ トリックス素材を離脱可能に保持する手段を備えることができる。 チャンバーは装置の中に永久に固定することができる。あるいはまたチャンバ ーは、必要に応じて装置から取り除くこと、例えばマトリックス素材の保持と離 脱を容易にするためチャンバーを取り除くことができるよう、離脱可能に固定さ れていても良い。 チャンバーは、例えばガンマ線照射、蒸気殺菌あるいはエチレンオキシド（Ｅ ＴＯ）殺菌のような適切な殺菌方法によって殺菌された素材の何れかから作るこ とができる。 チャンバーは所望の形状および大きさであってもよい。チャンバーは円柱、立 方体あるいは球体の形状であることが好適である。チャンバーの寸法は、マトリ ックス素材を保持し引き続き応力の印加によって伸長できるような寸法とするべ きである。本発明の装置は（非伸長形態の素材に対して）マトリックス素材の１ ００％までの伸長を引き起こす応力を印加するように形成することができる。し かしながら一般的に言えば、１０％まであるいは５％までの伸長で十分である。 このようにチャンバーの寸法は、マトリックス素材を所望のレベルまで伸長で きるような寸法とすることができる。 チャンバーの寸法は、７５ｃｍ³まで、例えば５０ｃｍ³までの容量を持つよう にすることが望ましい。チャンバーは適切な素材の何れか、例えばステンレスス チールあるいはパース ペックス(Perspex：商標)素材から作ることができる。殺菌を行い易くするため 、素材はオートクレーブ処理可能なものであることが望ましい チャンバーは、培養期間中にマトリックス素材を見ることができるように透明 なあるいは半透明の窓を備えていることが望ましい。好適な素材の例としてはガ ラスおよびポリメチルメタクリレート（ＰＥＲＳＰＥＸ）があげられる。 チャンバーは内部にアクセスできるよう、取り外し可能にあるいは蝶番式に取 り付けられた閉部分を備える。従って例えばチャンバーはその少なくとも１つの 端が取り外しできるようなガラス円筒を備える。チャンバーは折り畳み可能ある いは入れ子式のものであることが好適である。 チャンバーは恒温的に制御することが望ましく、水ジャケットあるいはその他 の加熱手段によって加熱される。それは各種のセンサ、例えばチャンバーの頭部 空間の中のＣＯ₂含有量のセンサを備えることが望ましい。ＣＯ₂源も備えること ができる。 マトリックス素材はチャンバー内の保持手段によって取り外し可能に保持され る。 応力を印加する手段は、エレメント間の間隔が変動しうるようにチャンバー内 で可動である２つのエレメントから構成できる。あるいはまた、１つのエレメン トを可動とし、他の１つを固定することも可能である。 保持手段は、マトリックス試料を取り外し可能に保持する適 切な手段の何れかである。保持手段のデザインはマトリックス素材の両端のデザ インに依存する。したがって例えばマトリックス素材がループ状の両端を有して いるとき、保持手段は１対のクリップあるいはフックを備える。保持手段は例え ば、共にネジ留めするかバネで支持できるチャックあるいはレイズあるいは顎部 を備えることが好適である。保持手段は、マトリックス素材の両端がその上にう まく乗るようにデザインされた、スロットあるいはその他の開口部の形状である ことが好適である。したがって例えばマトリックス素材の両端は、スロットの中 に保持された樹脂の中に埋め込むことができる。マトリックス素材に開口部があ り、保持手段がその中にはまるような、逆配置を用いることも可能である。マト リックス素材を取り外し可能に保持するさらに別の方法は、マトリックス素材を まわりに巻き付けて摩擦で位置を保持することができるように概ね円筒形のスプ ール状の物を設けることである。スプール状の物は、把持装置(gripping device )により支持される。そのようなスプールの物は２つ設け、２つの把持装置にそ れぞれ１つ支持させることができる。 本発明の装置により応力を印加するべきマトリックス素材は、生育可能細胞を 支持する適切な素材の何れかを備える。細胞はマトリックス素材の中にあるいは その全長にわたって存在する。あるいはまた、マトリックス素材の１部分、例え ばその両端に細胞がないようにすることもできる。マトリックス素材が伸長下に 保持される前か後に細胞をマトリックス素材に加えられる。 しかしながらチャンバー内で素材が伸長下に保持される前に、細胞を素材に加え ることが望ましい。 マトリックス素材は、補綴の靭帯あるいは腱の形状でデザインされる。例えば マトリックス素材が補綴の靭帯の形態の場合、応力をかけない時の靭帯の長さは １から３０ｃｍの範囲にあることが望ましい。マトリックス素材は、埋め込みに よって、例えば膝においてかかる応力の大きさに耐えられるように選択する必要 がある。 応力を印加する手段は、マトリックス素材の両端あるいは１端を引っ張ること により作用し、マトリックス素材の伸長をもたらす。これは種々の手段、例えば 機械的、電気化学的、電気的、ピエゾ電気的、空気圧的、油圧的あるいはその他 の手段で行うことができる。マトリックス素材は、チャンバーの一端にある静止 成分に取り外し可能に取り付けられ、マトリックス素材の逆の端は張力印加部材 （例えば巻き上げ装置など）に取り付けられる。チャンバー内に一端があり、他 端はチャンバー外にある隔壁によって、応力をマトリックス素材に印加すること が好適である。枢軸的に取り付けたレバーを用いて応力を印加しても良い。 本発明はまた、マトリックスと細胞をおおうのに適当な量の培地を有するチャ ンバー内において、生存細胞を密接に接触してもっているマトリックス素材を剥 離可能に固定し、単一の軸に沿ってマトリックス素材に応力を印加することとか らなる応力下に細胞を培養する方法を提供する。 本発明のマトリックスにおいて用いるのに適切な素材は、以下に例示するよう に評価することができる。 素材の評価 繊維芽細胞の生育を補助する適切な素材の初期評価を行うために、以下の表１ に示されるように、様々の素材（これは限定的に解釈されるべきではない）を取 得し、次の温度で２．５トンで５分間、膜状に成形した。ポリラクチド１７０℃ 、ポリグリコリド２４５℃、ポリヒドロキシブチレート１８５℃およびポリカプ ロラクトン６５℃。 繊維芽細胞を素材１cm²あたり１×１０⁴個の密度でこれらの素材の表面上に接 種し、培養条件下で３日間培養した。 培養期間後に、細胞を接種をした試料の顕微鏡写真をとった。これらは上の表 １に示される試料について、図１ａから１ｄに示されている。（この出願のため 提供された全ての写真の写真複写は関連する写真の直後に作られる。） 繊維芽細胞が全ての素材の表面に十分付着し、健全な培養繊維芽細胞に特有の 形態を示していることが見て取れる。 繊維芽細胞の１つの試料を、長い（１６日間の）培養期間を用いた以外は上記 と同様にしてポリラクチド上で成長させた。 この期間の後、細胞を生体染料（カルセインＡＭ（２μＭ））で染色し、フル オレセインフィルタを用いて蛍光顕微鏡で視覚化した。生存細胞の融合性単一層 が観察され、ポリラクチドは培養時間の延長に対して生存繊維芽細胞を支持する 能力があることが示された。 図２は、生物同化性合成素材の４例すなわち（いずれも上述の）ポリラクチド （ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ） およびポリカプロラクトン（ＰＣＬ）上の繊維芽細胞の拡散を、組織培養処理し たポリスチレン（ＴＣＰ）コントロール（ＴＣＰは良い繊維芽細胞成長を支持す ることが知られているので）と比較した時の相対割合を示すグラフである。 図２ａ）からｅ）は、（それぞれの参照例について）単一のグラフ上で、これ らの各々の素材を示す。細胞を１×１０⁴cells.cm^-2で三つに分けて接種し、標 準細胞培養技術を用いて培養の後、７日までの時間点において、細胞ＤＮＡへの トリチウム化したチミジンの摂取量を測定することにより、拡散率を定量した。 培地は２日、４日、および６日に変えた。点は３つの測定量の平均を表し、誤差 線は範囲を表す。全てのポリマーは繊維芽細胞の拡散を支持した。 図３は１５日間の培養の後の３次元コラーゲンゲルの中に埋め込まれた繊維芽 細胞の顕微鏡写真である。、マトリックスに接触させるためには用いられなかっ た点以外は（後述の）実施例２に記載されているようにして、細胞を接種したゲ ルを調製した。ゲルは、細胞が埋め込まれ、膜インテグリン受容体を通じてコラ ーゲン分子との反応を形成できる３次元構造を提供する。細胞はランダムに配置 され、長い過程を示し、ゲルの中のコラーゲン原繊維を再編成する能力がある。 図４は、ゲルが、組織培養適合性接着剤で培養皿に貼り付けた２つのステンレ ススチールの釘(peg)により１つの方向に収縮することを抑制された点を除いて 、上の図３に記述されたような３次元コラーゲンゲル内に埋め込まれた繊維芽細 胞の顕微鏡写真である。細胞は高度に方向づけられた態様で、その長い軸が抑制 釘(constraining pegs)の間の軸に平行になるように配置される。コラーゲン原 繊維(fibrils)は同じ軸に沿って整列する。この効果は、培養物中に繊維芽細胞 が存在する時に、起こるであろうゲル収縮を防止する釘のためである。 つぎの実施例は、制限的に解釈すべきではないが、細胞を接種した種々のマト リックスがいかに生成されるかを示す。 実施例１：繊維芽細胞を接種したポリラクチドマトリックスプロステーシスの調 製 ａ）細胞の調製 バイオプシーをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、７０％アルコール ですすいだ。すすいだバイオプシーは次に、 ダルベッコの修正基礎培地（ＤＭＥＭ）に浸し、３７℃で２４時間培養した。培 養の後、バイオプシーをＰＢＳの下で小片に切り分けた。切り分けた小片は、消 化させるための５ミリリットルのコラーゲナーゼ溶液を含む５０ｍｍのペトリ皿に移さ れた。表皮シートをコラーゲナーゼ溶液から取り除いた。得られた溶液を遠心分 離した。繊維芽細胞ペレットをＤＭＥＭに再懸濁し、その後ＤＭＥＭを用いて３ ５ｍｍのペトリ皿に接種した。細胞は２日から４日の間に融合性であってもよい 。その後、マトリックスに接種するため適切な量の繊維芽細胞を提供するため、 細胞を培養してもよい。 分離した繊維芽細胞を培養するための適切な培地は、以下のものすなわち、グ ルタミン、胎児子牛血清、非必須アミノ酸および抗生物質を補ったＤＭＥＭから なる。さらに培地は、重炭酸塩などの緩衝剤を有してもよい。 ｂ）マトリックス素材の調製 靭帯と置き換えるプロステーシスにおいて用いるのに好適なポリラクチドマト リックス素材は、ポリラクチド繊維を得て、靭帯と置き換えるのに適切な寸法の 編みひも(braid)を形成するためにそれらを編む（braiding）ことにより調製で きる。 ポリラクチド繊維は、押し出し成形、繊維紡糸、溶融紡糸、延引成形、熱アニ ーリングなどにより得ることができる。 繊維を編むことは、標準の編み技術によって行うことができ、適切な性質をも つ編みひもを形成するため、編みひもの長さと厚さ、存在する繊維の数および存 在する繊維の直径を選択され る。 装置の両端は、ネジあるいはその他の固定手段によって装置に固定することを 助けるために適切な方法で構成される。これは両端に小穴(eyelets)を形成する ことにより行われる。 ｃ）細胞によるマトリックス素材の接種 編んだ装置は体積比で１０％の血清を含む培地で２４時間培養され、マトリッ クス素材の表面が細胞懸濁液で完全に覆われるまで、細胞懸濁液をマトリックス 素材の表面上にピペットで分取することにより細胞を接種する。（あるいはまた マトリックスを、例えばボトルローラー上で撹拌する条件のもとで約６時間懸濁 液とともに培養してもよい。また別の方法としては、真空下で装置の中を通して 細胞懸濁液を吸引する（もし多孔質である場合）ことによるか、あるいは装置を 通して細胞懸濁液を遠心分離することにより装置に接種することである。 ｄ）細胞を接種したマトリックスに応力をかけること 細胞を接種した装置は、単一の長手方向の軸に沿って装置に応力をかける応力 装置において両端を把持する。これは、細胞の顕微鏡解析により評価されるよう に、長手方向の一般的方向に沿って繊維芽細胞を実質的に整列させることができ るように十分の時間をかけて行われる。応力の印加が数時間にわたってあるいは 数日にわたって起こるが細胞が生育可能のままであるように、装置は培養チャン バーを備える。通常は装置は３７℃で応力を印加する。 応力印加時、好適な条件下で細胞を培養するため培地が用い られる。これは血清と、アスコルビン酸塩あるいはその安定な類似体と、成長因 子を含有する。 アスコルビン酸塩は繊維芽細胞を刺激してコラーゲンを合成させる。血清は細 胞の拡散と細胞の付着を促進する因子を含有し、成長因子は細胞拡散と成長およ び移動を刺激することができる。 ｅ）細胞を接種したマトリックスの埋め込み 繊維芽細胞の整列が所期の程度になるよう十分な期間、細胞を接種した装置に 応力を印加した後、装置を細胞応力装置から剥離し、所期の技術の何れかによっ て患者に埋め込まれる。 侵襲的外科術が最小になることが望まれる。人工器官の前方十字靭帯について は、埋め込みは「２トンネル」あるいは「オーバーザトップ」技術を利用して行 われる。固定は、マトリックスの小穴を通して置かれたネジ（あるいはその他の 固定成分）を用いて達成できる。ネジは、ポリヒドロキシブチレートなどの生物 分解性素材から形成されるのが好適である。 実施例２：繊維芽細胞が組み込まれたコラーゲンゲルを含有する、繊維芽細胞を 接種したポリラクチドマトリックスプロステーシス調製。 これは、ポリラクチドマトリックスに接種するのに用いられるコラーゲンゲル 中に繊維芽細胞が組み込まれるという代替的手順を挿入すること以外は実施例１ に記載した方法と類似の態様で行うことができる。この別段の手順は以下に記載 している。 ａ）コラーゲンの調製 酸に可溶で、かつ架橋していない形態でコラーゲンを形成することが望ましい 。これは次のように行うことができる。 Ｉ型のコラーゲンを腱から調製するが、例えば皮膚のような他の組織からのも のであっても良い。組織を細かく切り刻み、（体積比）７０％のエタノールで少 なくとも３０分消毒し、（体積比１％の）酢酸に分散させ、４℃で撹拌しつつ培 養する。上澄みを取り除き、適当な量の１．０Ｍ水酸化ナトリウムを加えて中性 にする。沈澱したＩ型のコラーゲンを８０００×ｇでの遠心分離によりペレット 化し、適当な量の（体積比１％の）酢酸にペレットを再懸濁する。この溶液のコ ラーゲン濃度は適当な方法（例えば全タンパク検定−ＢＣＡ検定）の何れかで測 定し、コラーゲン溶液の濃度を適切に（例えば３ｍｇ．ｍｌ-1を用いることがで きる）調節する。 もし生成物がキットの場合は、無菌のコラーゲン溶液を冷凍乾燥し、架橋形成 を防ぐため、真空下あるいは不活性ガス（例えばアルゴン）下で保存する。希釈 （酢酸）も準備することができる。あるいは溶液として準備し４℃から−２０℃ で保存してもよい。 ｂ）細胞によるマトリックス素材の接種 マトリックスに接種するため、通常３つの成分、すなわち適当な培地に懸濁し た細胞と、コラーゲン溶液とゲル化剤（例えば１Ｍの水酸化ナトリウム）を用い る。最終のコラーゲン濃度はおよそ１ｍｇ.ml-1であり接種密度は、ゲル１ｍｌ （あるいはマトリックスの中の体積）当たりの細胞数でおおよそ３×１ ０⁴個である。３成分を０℃から４℃に維持し、混合してマトリックスに加える 。マトリックスを十分に含浸させた後、３７℃で培養し、ゲル化を開始させる。 マトリックスの含浸は好適な方法の何れかを用いて行う。マトリックスを型内 で溶液中に単に浸しても良い。あるいは溶液を、真空を利用して骨格の中へ吸引 するか、遠心分離で（例えば５００ｒｐｍで５分間、０から４℃で遠心分離した 型の中で）押し込めてもよい。 温度を変化させることにより、ゲルの固化速度を変化させることができる。 実施例３：繊維芽細胞が組み込まれた繊維素（fibrin）ゲルを含有する、繊維芽 細胞を接種したポリラクチドマトリックスプロステーシスの調製。 これは、コラーゲンゲルのかわりに繊維素ゲルが用いられることを除いて、実 施例２に記載した方法に類似の方法によって行うことができる。 この場合もまた、３つの成分すなわち細胞懸濁液と、フィブリノーゲン溶液と 、塩化カルシウム（ｍＭ）を含有するトロンビン溶液が用いられる。最終の細胞 濃度は、１ｍｌあたり細胞数３×１０⁴個であり、フィブリノーゲン濃度は３ｍ ｇ／ｍｌで、トロンビン活性は２．５ユニット／ｍｌで、塩化カルシウム濃度は ５ｍＭである。試薬を混合しマトリックスと共に培養する。溶液と含浸させた後 、マトリックスを３７℃で培養して高速にゲル化させる。マトリックスの含浸は 、上記の何れかの 技術によって行うことができる。 トロンビン活性及び／又は温度を変化させることにより、ゲル化速度を変化さ せることができる。 装置を形成するため合わせることのできる種々の構成要素を示す、図５ａ）、 ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）のみを参照して、例示により、前に言及した細胞応 力装置を説明する。 装置はパースペックス（Perspex：商標）の容器１０（カッタウェイ部分図で 示す）およびふた２０（図５ａ）および５ｅ）を参照）を備える。容器１０は、 細胞培養条件下で繊維芽細胞を接種した伸長可能な素材を収容するのに用いるこ とができる。参照し易いように、当業者によく知られているであろうような、サ ーモスタットやセンサーや培地の上部除去（topping up）のための入口（inlets ）やその他の成分は図示していない。 装置はさらに第一および第二グリップ３０および４０を備え、そのそれぞれは 釘（pegs）５０を有する２つの平行なアーム４５を持っている。（図５ｃ）およ びｅ）を参照） グリップの１つ（グリップ４０）は、モーター（図示せず）により単一の長手 方向の軸に沿って他方のグリップ３０へ向かってあるいは遠ざかる向きに動かす ことのできるサポート６０を備える。もう一方のグリップ３０は装置の端壁３５ に固定的に取り付けられている。 グリップ３０と４０は、スプール７０および８０を受けとめ保持するように働 く（図５ｃ）および５ｅ）を参照）。これは 溝９０にはまる釘（ペグ、pegs）５０によりなされ、それぞれスプール７０および ８０のグリップ３０および４０に対する回転を防ぐように、スプール７０および ８０をグリップ３０および４０に取り付ける。 スプール７０と８０は、細胞を接種したポリラクチド編みひもプロステーシス １００で示される、繊維芽細胞を接種した伸長可能な素材を保持する働きをする 。 これは開口部１１０および１２０を通してプロステーシス１００の両端を通し 、プロステーシス１００がスプール７０および８０に摩擦によって保持されるよ うに、スプール７０と８０をそれぞれ軸ＡおよびＢのまわりに数回回転させるこ とによりなされる。（図５ｂ）参照） 次にスプール７０と８０は上に述べたようにグリップ３０と４０にはめ込まれ （図５ｃ）参照）、グリップ３０と４０の間隔がより大きくなるように容器の中 でサポート６０を引き込むことにより、プロステーシス１００を伸長させること ができる。一旦所望の伸長がなされた時、取り外し可能なロック装置（図示せず ）によりサポート６０を固定保持し、伸長したプロステーシス００を、必要な時 間だけ培養条件下で培養することができる。 プロステーシス１００を容易に見ることができるように、透明あるいは半透明 の素材でできた窓１３０が設けられる。これは、いつプロステーシス１００が埋 め込みできる状態になったかを決めるため、プロステーシス１００上に生育する 繊維芽細 胞の顕微鏡的解析に用いることができる。 容器１０の底に置くために溝をつけた透明あるいは半透明のブロック１４０も 設けられる（図５ｄ）参照）。スプール７０と８０がグリップ３０と４０により 保持された状態で、スプール７０と８０の上に置かれたとき、プロステーシス１ ００をおおう十分な培地を溝１５０が収容することができるように、ブロックの 大きさが決められる。このことにより用いられる培地の量が経済的になる。 応力装置の要素を形成するのに用いられる素材は、オートクレーブ処理可能で アルコールで消毒可能である。通常、その装置は３７℃の温度で５％のＣＯ₂の 雰囲気で作動させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９３１４４７１．５ (32)優先日 1993年７月７日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３１４５８０．３ (32)優先日 1993年７月14日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３２０３５２．９ (32)優先日 1993年10月２日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９３２０３６８．５ (32)優先日 1993年10月２日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 サール，リチャード，ジョン イギリス国、ヨーク ワイオー２ ６エイ チイー、アッパー・ポップルトン、フェア ウェイ・ドライブ 12 (72)発明者 マシューズ，ジェーン，ブリジェット イギリス国、ヨーク ワイオー２ １ディ ーピー、サウス・バンク・アベニュー 84 (72)発明者 キング，ジョン，ビー. イギリス国、ケント ビーアール１ ２エ ヌダブリュ、ブロムリ、チゼルハースト・ ロード、ウェル・コテージ（番地なし) (72)発明者 パーマー，デブラ イギリス国、ドーセット エスピー７ ８ ピーダブリュ、テン・エーカーズ、シヤフ ツベリ（番地なし) (72)発明者 シェルトン，ジュリア キャロライン イギリス国、ロンドン イー９ ７エヌデ ー、ハックニイ、ビクトリア・パーク・ロ ード 187

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．埋め込む前の形態において、生物適合性で合成の実質的に生物同化可能な、 繊維芽細胞を接種したマトリックス素材からなる埋込型プロステーシス。 ２．生物同化性マトリックス素材が、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリジオ キサノン、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシブ チレートコヒドロキシバレレート、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、ポ リオルトカーボネート、ポリアミノカーボネート、ポリトリメチレンカーボネー トあるいは上記のポリマーが形成される単量体を含有するコポリマーからなる、 請求項１記載のプロステーシス。 ３．生物同化可能でないマトリックス素材をさらに含有する、請求項１あるいは 請求項２記載のプロステーシス。 ４．生物同化可能でないマトリックス素材が、ポリエステル、ポリエチレン、ポ リプロピレン、ＰＴＦＥ、カーボンファイバー、あるいは上記の素材の２つ以上 の複合物である、請求項３記載のプロステーシス。 ５．マトリックスが、以下のもの、すなわちプロテオグリカン、グリコサミノグ リリカン、フィブロネクチンあるいはその活性結合領域、成長因子、骨誘導的あ るいは骨通導的な素材の１つ以上をさらに含有する、前記請求項の何れかに記載 のプロステーシス。 ６．生物同化性マトリックス素材と密接に接触するゲルを有し、 ゲルがその中に分散した繊維芽細胞をもつ、前記請求項の何れかに記載のプロス テーシス。 ７．ゲルがコラーゲンあるいは繊維素ゲルである、請求項６記載のプロステーシ ス。 ８．ゲルがコーティング及び／又は充填の形態である、請求項７記載のプロステ ーシス。 ９．生物同化性マトリックス素材がポリヒドロキシブチレートあるいは複数のヒ ドロキシブチレート単量体を混和したコポリマーである、請求項６から８までの 何れかに記載のプロステーシス。 １０．マトリックスが可撓性である、前記請求項の何れかに記載のプロステーシ ス。 １１．繊維質の部材の形態である、前記請求項の何れかに記載のプロステーシス 。 １２．織った、ニッティングした、かぎ針編みしたあるいは編んだ部材の形態で ある、前記請求項の何れかに記載のプロステーシス。 １３．異なった生物同化速度をもつ複数の生物同化性マトリックス素材からなる 、前記請求項の何れかに記載のプロステーシス。 １４．繊維芽細胞が非ランダムに方向付けられた、前記請求項の何れかに記載の プロステーシス。 １５．繊維芽細胞が実質的に整列している、請求項１４記載のプロステーシス。 １６．繊維芽細胞源あるいは哺乳類の体から繊維芽細胞を取り出すための装置お よび生物同化性なマトリックス素材からなる、請求項１記載のプロステーシスを 生成するキット。 １７．繊維芽細胞源あるいは哺乳類の体から繊維芽細胞を取り出すための装置、 生物同化性マトリックス素材およびポリマーゲルあるいはポリマーゲルを形成す るための組成物からなる、請求項６記載のプロステーシスを生成するキット。 １８．繊維芽細胞を生育可能な条件に維持するチャンバーを備え、チャンバーが マトリックス素材を離脱可能に保持する手段と、単一の軸だけに沿ってマトリッ クス素材に応力を印加するようにした手段とからなる、請求項１４または請求項 １５に記載のプロステーシスを製造するために用いられる装置。 １９．マトリックス上あるいは中において繊維芽細胞を接種するための適切な条 件下で、適切な培養地および繊維芽細胞の存在のもとで生物適合性で合成の、実 質的に生物同化可能なマトリックス素材を培養することと、そののち繊維芽細胞 を接種したマトリックスを宿主に埋め込むこととからなる、ヒトあるいは動物に おける損傷した結合組織を修復あるいは取り替える方法。 ２０．繊維芽細胞を非ランダムに方向付けるために、繊維芽細胞を接種した時に マトリックス素材に応力を印加する手順をさらに含む、請求項１９記載の方法。 ２１．非ランダムな方向付けが繊維芽細胞の実質的整列である、請求項１９記載 の方法。 ２２．繊維芽細胞がゲルに混和されている、請求項２０あるいは請求項２１記載 の方法。 ２３．ゲルがコラーゲンゲルあるいは繊維素ゲルである、請求項２２記載の方法 。