CN101332315A - 组织工程肌腱及其体外构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种组织工程化肌腱移植物，它包括(a)药学上可接受的生物可降解材料；和(b)种子细胞，所述的种子细胞接种于所述的生物可降解材料，且种子细胞选自下组：(i)成纤维细胞，(ii)脂肪来源细胞，或(iii)1∶10000－10000∶1的真皮成纤维细胞和脂肪来源细胞的混合物。所述的移植物是将种子细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合，得到种子细胞－生物材料复合物后，将复合物在生物反应器中培养而得到。本发明的移植物可用于修复肌腱缺损。

Description

组织工程肌腱及其体外构建方法
技术领域
本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及应用真皮成纤维细胞和(或)脂肪来源细胞在体外构建组织工程肌腱的制备方法和用途。
背景技术
肌腱是连接骨骼肌肌腹与骨之间的致密胶原纤维结缔组织束，是骨骼肌的组成部分。肌腱的结构可以看成是肌肉的延续、退化部分。新鲜标本的肌腱呈银白色、索带状，质地坚韧。在松弛状态下表面有波纹，如果牵拉超过松弛状态的4％时，这波纹便消失，张力取消后波纹再现。在肌-腱联接处，胶原纤维进入肌内膜，附着在肌纤维的肌膜上在腱-骨连接处，腱束直接连续到骨和骨膜上，其中绝大部分胶原纤维进入骨，形成Sharpey穿纤维。肌腱传导肌腹收缩所产生的力，牵引骨骼，使之产生运动。肌腱本身不具有收缩能力，但能抵抗很大的张力。
肌腱缺损是目前临床工作中经常遇到的问题，对于肌腱缺损的治疗方法主要是：1、自体肌腱移植。2、同种异体肌腱移植。3、肌腱移植替代物。但以上方法均存在着某些弊端，自体肌腱移植存在肌腱供区缺乏的问题。新鲜的异体肌腱移植会引起严重的免疫排斥反应，经过冻干处理后的同种异体肌腱保存的仅仅是胶原纤维，将来仍需要自体肌腱细胞进行替代。人工肌腱替代物虽然近期生物力学强度较好，但远期终会发生降解，而且还会引起炎症、纤维化和肌腱粘连等反应甚至替代物排出体外。
上世纪80年代末期，组织工程学的兴起和蓬勃发展为解决这一难题提供了可能。曹谊林等于1994年首次报道了用聚羟基乙酸(PGA)短纤维在裸鼠皮下构建出了组织工程肌腱样组织。刘永涛等则在有完善免疫功能的鸡趾指屈肌腱原位，应用自体肌腱细胞构建组织工程肌腱成功，但是，应用自体肌腱细胞作为组织工程肌腱的种子细胞仍需切取较大的肌腱组织，造成新的损伤。因此，寻找新的种子细胞来源成为组织工程肌腱发展的首要问题。
此外，目前国内外组织工程肌腱的研究主要集中在动物体内的修复实验，即在体外扩增出足够数量的种子细胞，与生物材料复合后立即或仅在体外培养一至两周即植入体内缺损部位，尽管获得了一些初步的成功，但这种将接种细胞后的支架材料直接回植入体内形成肌腱的方式仍然存在一些重大缺陷：包括：(1)植入的是细胞材料复合物而非肌腱移植物，导致种子细胞存活不佳，从而引起移植失败，无法获取恒定的高成功率。(2)植入的支架为尚未降解的材料，其分解产物多为酸性，可以直接导致炎性反应，瘢痕形成和肌腱粘连，从而直接影响了肌腱的修复效果。(3)由于植入的是非肌腱移植物，随着材料的降解，细胞-材料复合物的力学性能大大降低，无法修复高张力部位的肌腱缺损。因此，虽然有较多的肌腱构建和修复的动物体内实验，但由于上述问题的存在，离临床应用仍有相当的距离。
由此可见，采用组织工程技术构建肌腱组织、修复肌腱组织缺损，并达到产业化生产的目的，关键之一是获取大量有正常功能的肌腱细胞。但是肌腱细胞经多次传代后丧失分泌基质的能力，难以获得大量有功能活性的肌腱细胞来修复大块缺损组织。关键之二是要构建出具有一定力学性能、大部分材料已发生降解的相对成熟的肌腱组织。因此，探索更广泛的种子细胞来源、更优化的体外构建技术已成为组织工程肌腱研究的焦点。
针对关键问题一，许多学者作了大量研究工作，试图拓展肌腱组织工程种子细胞来源，并促进其增殖。
第一，寻找可替代细胞例如骨髓基质干细胞(Mesenchymal stem cell MSC)、真皮成纤维细胞(Dermal Fibroblast DF)。MSC是一群具有多相分化潜能的细胞，在特定的诱导条件下可分化为多种间充质组织细胞，Awad等分离、培养MSC后与胶原复合形成细胞胶原复合物植入人工缺损髌韧带处，与对照组(单纯应用胶原)进行比较，发现实验组组织的弹性模量、最大张力、硬度等较对照组大，而在组织学和形态学方面两者并没有很大差别。然而，骨髓基质干细胞的来源有限，分离较为复杂。陈兵等人用猪的自体成纤维细胞成功构建组织工程肌腱并修复趾浅屈肌腱缺损，证明了真皮成纤维细胞作为组织工程肌腱或韧带构建的种子细胞的可行性。
第二，促进种子细胞增殖与基质合成。生长因子是通过细胞间信号传递影响细胞活动的一类多肽因子，在体内或体外可促进或抑制细胞增殖。许多学者直接使用生长因子研究并证实其在体内体外对肌腱损伤修复的促进作用。此外，还有人利用转基因技术，将基因信息传递给细胞以此来改变细胞功能。利用此种技术使靶细胞增加或抑制合成和分泌蛋白质(如生长因子)，调控细胞的生长，参与组织修复过程。成功应用这一方法可使细胞、组织按要求合成分泌细胞因子以调控其生长。已有学者成功地用不同方法将基因转入肌腱中，LacZ标记基因被应用于髌韧带后持续表达了6周，在鸡趾屈肌腱的实验中，Lou等运用转基因技术将LacZ标记基因转入肌腱中，75天后还可以检测到该基因，并提出了减少和阻止肌腱损伤后的粘连形成的一些方法。
虽然经过上述各种研究，仍没有彻底解决肌腱种子细胞来源缺乏的难题。
针对关键问题二，有学者尝试在体外应用多种生物材料进行肌腱组织的构建。曹德君等人利用可吸收生物材料聚羟基乙酸(polyglycolic acids，PGA)和肌腱细胞在体外构建组织工程肌腱，用U形弹簧给予细胞-PGA复合物持续张力后体外培养，6周后形成与正常肌腱结构相似、具有一定力学性能的肌腱样组织，但此种方法无法精确计量所施加的张力大小及频率等参数，所构建的组织的力学性能极为薄弱。体外模拟体内微环境仍需要进一步的改进和优化。
因此，本领域迫切需要一种用新的种子细胞并在体外构建的组织工程化人肌腱，而且所述的组织工程化肌腱具有良好的力学性能。
发明内容
本发明旨在提供一种组织工程化人肌腱移植物。
本发明的另一个目的是提供所述的组织工程化肌腱移植物的体外制备方法。
本发明的再一个目的是提供上述组织工程化肌腱移植物的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种组织工程化肌腱移植物，它包括：
(a)药学上可接受的生物可降解材料；和
(b)种子细胞，所述的种子细胞接种于所述的生物可降解材料，且种子细胞选自下组：(i)成纤维细胞，(ii)脂肪来源细胞，或(iii)1∶10000-10000∶1的成纤维细胞和脂肪来源细胞的混合物。
在另一优选例中，所述组织工程化肌腱移植物的最大张力为10-80N。
在另一优选例中，所述的种子细胞是成纤维细胞或成纤维细胞和脂肪来源细胞的混合物。
在另一优选例中，所述的种子细胞的含量为1×105个细胞/ml-5×108个细胞/ml。
在另一优选例中，所述的生物可降解材料为条索状。
在另一优选例中，所述的成纤维细胞和脂肪来源细胞来源于自体或同种异体。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其各种类型和比列的混合物。
在本发明的第二方面，提供了一种制备上述的组织工程化肌腱移植物的方法，包括步骤：
将种子细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合，得到种子细胞-生物材料复合物，其中所述的种子细胞接种于所述的生物可降解材料，且种子细胞选自下组：(i)成纤维细胞，(ii)脂肪来源细胞，或(iii)1∶10000～10000∶1的成纤维细胞和脂肪来源细胞的混合物；
在另一优选例中，它还包括步骤：
将种子细胞-生物材料复合物在生物反应器中培养得到如上所述的组织工程化肌腱移植物。
在另一优选例中，所述的生物反应器是申请号为200510110037.0中所公开的一种牵拉式肌腱生物反应器。
在另一优选例中，移植物中种子细胞的含量为1×105个细胞/ml-5×108个细胞/ml。
在另一优选例中，生物反应器中加载在种子细胞-生物材料复合物上的牵引力为2-20N。
在另一优选例中，所述的生物可降解材料为条索状。
在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的组织工程化肌腱移植物的用途，它可用于制备修复肌腱缺损的移植物。
据此，本发明提供了一种用新的种子细胞并在体外构建的组织工程化人肌腱，而且所述的组织工程化肌腱具有良好的力学性能。
附图说明
图1显示了第二代人皮肤成纤维细胞。
图2显示了第二代人肌腱细胞。
图3显示了原代脂肪来源细胞。
图4显示了对脂肪来源细胞各种表型的鉴定结果；其中
A表示Vimentin+的鉴定结果，B表示CD106+的鉴定结果，C表示CD34-的鉴定结果，D表示CD29+/CD49D+的鉴定结果，E表示CD44+/CD49D+的鉴定结果。
图5显示了脂肪来源细胞成软骨诱导后，II型胶原的表达情况。
图6显示了脂肪来源细胞成脂肪诱导后，由红染色，观察细胞浆内脂滴形成的情况。
图7显示了脂肪来源细胞成骨诱导后，钙结节形成的情况。
图8显示了脂肪来源细胞的免疫抑制调控功能检测结果。
图9显示了预塑形后的束状PGA纤维支架。
图10显示了预塑形的束状纤维固定在“U”形弹簧上的PGA支架。
图11显示了生物反应器外观。
图12显示了人真皮成纤维细胞和/或脂肪来源干细胞在反应器内构建肌腱方法。
图13显示了应用人真皮成纤维细胞为种子细胞，静态牵拉2周+动态牵拉10周后的组织工程化肌腱组织学检测结果；其中
A表示皮肤成纤维细胞+PGA；B表示肌腱细胞+PGA
图14显示了不同张力下体外构建组织工程肌腱的生物力学检测结果。
图15显示了应用人脂肪来源干细胞为种子细胞，静态牵拉2周+动态牵拉5周后的组织工程化肌腱组织学检测结果。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现可以将人的真皮成纤维细胞、脂肪来源细胞或其混合物作为构建组织工程化肌腱移植物的种子细胞，并将种子细胞和生物可降解材料的混合物放置在生物反应器中进行体外培养，能获得具有良好生理力学性能的组织工程化人肌腱。
术语
术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽。
术语“异种移植”指将所需生物材料(如肌腱)从某一物种中取出并再施用于另一物种对象的方法。
术语“自体移植”指将所需生物材料(如肌腱)从某病人中取出并再施用于同一病人的方法。
术语“异体移植”指将所需生物材料(如肌腱)从同一物种的某个体中取出并再施用于另一不同病人的方法。
如本文所用“药学上可接受的生物可降解材料”、“医学上可接受的生物可降解材料”、“生物可降解材料”、“生物材料”和“材料”是同样的含义，都表示可给细胞及生长因子提供一个载体，与细胞或机体组织具有良好的生物相容性，而且具有与组织生长相匹配的降解速率的材料。
如本文所用，“组织工程化肌腱移植物”、“组织工程化肌腱”和“组织工程肌腱”可互换使用，只要它们都表示一种含有种子细胞-生物材料复合物并能修补体内肌腱缺损的移植物即可。
种子细胞
可用于本发明肌腱移植物的种子细胞是成纤维细胞和(或)脂肪来源细胞，这两种细胞可以来自自体，也可以来自异体，成纤维细胞取自自体更佳。若为两者的混合物，则成纤维细胞和脂肪来源细胞的数量之比为1∶10000-10000∶1，较佳地为1∶5-100∶1，更佳地为1∶2-10∶1。
本发明的成纤维细胞的来源没有特别限制，可以是任何来源的成纤维细胞，通常，本发明的成纤维细胞是自体的(如真皮、皮下组织以及其他组织中的成纤维细胞)、或同种异体的成纤维细胞(如人胎儿来源的成纤维细胞)。成纤维细胞还可以是衍生自脂肪干细胞、骨髓基质干细胞、或其他干细胞的成纤维细胞。
可用于本发明的成纤维细胞来自人体。
尽管自体的成纤维细胞是优选的，但异体的成纤维细胞的来源也可使用。
在本发明的一个优选例中，所述的种子细胞是人自体真皮成纤维细胞。
分离和获得真皮成纤维细胞的方法是本领域中熟知的。常用的分离方案包括：
(a)胶原酶消化、分离法：在无菌条件下取皮肤组织，切成2×2×2mm3大小组织块，磷酸缓冲液(PBS，含青、链霉素各100U/ml)冲洗2遍，加入二倍体积的1mg/ml II型胶原酶(Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37℃恒温摇床消化4h后用150目尼龙网筛过滤离心，沉淀细胞用PBS洗2次计数，台盼蓝染色检查真皮成纤维细胞活力，以1×106/盘密度(培养皿直径100mm)培养细胞。
(b)组织块培养法：在麻醉无菌条件下取皮肤组织，切成2×2×2mm3大小组织块，磷酸缓冲液(PBS，含青、链霉素各100U/ml)冲洗2遍。将组织块在培养皿表面均匀摆置，将培养皿放置于培养箱中放置2-4小时，轻轻加入培养液让液体缓慢覆盖组织小块，等待细胞游出。
真皮成纤维细胞的培养方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将真皮成纤维细胞在饱和湿度、5％CO2培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)：1)DMEM培养基((Gibco公司)+10％胎牛血清；2)DMEM培养基+20％小牛血清；3)DMEM培养基+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进成纤维细胞生长的细胞因子等)、各种转基因成分、各种细胞成分。
适用于本发明的真皮成纤维细胞应能在体内或体外增殖。一种优选的真皮成纤维细胞是体外培养的原代至第五十代细胞，且免疫组织化学染色证明I型胶原表达，原位杂交检测证明I型胶原mRNA表达。
本发明人研究发现，脂肪组织中获得的脂肪来源细胞(adipose derivedcells，ADCs)也属于一种间充质干细胞，与BMSC一样具有多向分化潜能，能够在诱导条件下向骨，软骨，肌腱等方向分化。与BMSC相比ADC还具有其它优点。1、来源丰富，易于获取，且获取量要远高于BMSC，而且ADC细胞增殖能力也远大于BMSC，能够为组织工程化构建提供充足的细胞量。2、胶原分泌能力较强，而肌腱组织中需要大量的I型胶原维持其良好的抗拉强度，更适合作为肌腱种子细胞，更容易形成功能性肌腱组织。3、具有低免疫原性和免疫调节功能，更适合应用于同种异体间的移植，具有更广泛的临床应用前景。
因此，脂肪来源细胞(ADC)不仅能够作为组织工程肌腱的种子细胞，而且具有相当大的实用价值，开展相关的研究将有可能形成被不同个体接受的组织工程肌腱产品，突破组织工程肌腱产品个体化治疗的瓶颈问题。
分离和获得脂肪来源细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是：
在无菌条件下取吸脂术后废弃的人脂肪组织，转移到培养瓶中，用生理盐水反复冲洗，加入等体积的0.075％的I型胶原酶(Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37℃恒温摇床消化，分别于1小时后，300g离心10分钟，获得高密度的细胞沉淀物，弃上清和漂浮的脂肪组织，细胞振匀，计数后以1×106/盘密度(培养皿直径100mm)培养细胞。
脂肪来源细胞的培养方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将脂肪来源细胞在饱和湿度、5％CO2培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)：1)DMEM培养基((Gibco公司)+10％胎牛血清；2)DMEM培养基+20％小牛血清；3)DMEM培养基+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进脂肪来源细胞生长的细胞因子等)、各种转基因成分、各种细胞成分。
适用于本发明的脂肪来源细胞应能在体内或体外增殖。一种优选的脂肪来源细胞是体外培养的原代至第三十代细胞。
如果必要，可以在种子细胞中加入一些肌腱细胞和/或骨髓基质干细胞。分离和获得肌腱细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是通过胰酶、胶原酶消化进行分离，即用无血清DMEM培养基(GIBCO公司)将胰酶或胶原酶浓度调整至0.1-5mg/ml(较佳地约为1mg/ml)，37℃±2℃恒温振荡器内消化约4-20h。
肌腱细胞的培养方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将肌腱细胞在饱和湿度、5％CO2培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)：1)DMEM培养基((Gibco公司)+10％胎牛血清；2)DMEM培养基+20％小牛血清；3)DMEM培养基+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进肌腱细胞生长的细胞因子等)、各种转基因成分、各种细胞成分。
本发明中骨髓基质干细胞(BMSCs)的来源没有特别限制，一种优选的来源是来自自体的骨髓。分离获得骨髓基质干细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是麻醉下骨髓穿刺抽取自体骨髓，以密度梯度离心法分离出其中的有核细胞，加入适合的培养液(如含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C50ug/ml，青、链霉素各100U/ml，地塞米松5nM(Sigma)的DMEM(Gibco，Gland Island，NY，USA)条件培养液)，制成细胞悬液，以约1×105/cm2的密度接种于培养皿，于37℃、5％CO2、100％饱和湿度的条件下培养。48小时后首次换液，加入条件培养液继续培养隔日换液。待细胞生长近汇合后，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，以1×104/cm2的密度接种进行细胞传代。
生物可降解材料
可用于本发明的组织工程化肌腱的材料是药学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)：
(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；
(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；
(c)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料。
其中优选聚羟基乙酸PGA、聚乳酸PLA，或两者共纺物PGLA等。
生物反应器
适用于本发明的生物反应器没有特别限制，可以使用本发明常用的各种生物反应器。优选的生物反应器具有以下特征：1、大小、容量合适，利于细胞或组织的培养和代谢产物的排出，且不易污染。2、能够模拟生物体内肌腱的生物力学等微环境，提供适于组织工程肌腱的生长环境。3、拉力、频率等参数可控，且便于操作。
组织工程肌腱
本发明提供了一种新的组织工程化肌腱移植物，它包括：(a)药学上可接受的生物可降解材料；和(b)真皮成纤维细胞和(或)脂肪来源细胞，所述的两种种子细胞分别或混合接种于所述的生物可降解材料。本发明提供的组织工程化肌腱移植物具有良好的力学性能，可以使用本领域常规的方法进行测试，例如但不限于应用Intron生物力学测定仪，BOSE生物力学测试仪等对肌腱移植物的抗拉性能进行测定。
测试时本发明提供的组织工程化肌腱移植物的最大张力较佳的为10-80N，更佳的为40-80N。
本发明的组织工程肌腱相对成熟，在体外培养一定时期后，生物材料大部分降解，避免了早期回植入体内时，因生物材料的大量降解产物引发的肌腱粘连、断裂等现象，能够更有效的修复肌腱缺损。
本发明的组织工程肌腱相对成熟，在体外培养一定时期后，种子细胞分泌了充分的胶原等细胞外基质，使新生组织工程肌腱植入时已经具备一定的生物力学性能，避免了修复早期因受力导致肌腱断裂等。
本发明的组织工程肌腱移植物的形状没有特别限制，可以按照组织缺损的形状任意塑形，通常移植物为长条形。
体外培养扩增的种子细胞接种到生物相容性良好并可被机体吸收的可降解生物材料上形成种子细胞-生物材料复合物，将这一种子细胞-生物材料复合物置于生物反应器中，培养一定时期后，随着生物材料的逐渐降解吸收，种子细胞继续增殖并分泌基质，替代大部分生物材料而形成相对成熟的组织工程肌腱，植入到缺损部位时，可达到修复肌腱缺损的目的。
可以使用本领域常用的生物反应器，只要可以为细胞-材料复合物的体外构建提供必要的动态牵引力，优选牵拉式肌腱生物反应器。将肌腱移植物的长度、直径依照肌腱缺损长度与直径确定，然后在应力条件(2-20牛顿)下体外培养一周，每一至二天换液一次，以保证细胞营养，从而形成供移植的肌腱。
本发明组织工程肌腱中的种子细胞浓度通常约为1×105/ml至5×108/ml或更高，较佳地为1×106/ml至1×108/ml，更佳地为5×106/ml至5×107/ml。通常以培养液调整种子细胞浓度，然后与可降解材料混合。混合时培养液与可降解材料的比例没有特别限制，但是以该材料能够吸附的培养液最大量为宜。
此外，在本发明的组织工程肌腱移植物中，还可添加或复合其他各种细胞、生长因子、各种转基因成分，从而保持肌腱细胞表型、促进肌腱细胞生长，以及促进组织工程肌腱在体内的血管神经化。
用本发明方法形成的组织工程肌腱移植物或肌腱，可直接植入体内肌腱缺损处并修复肌腱缺损。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
(1)真皮成纤维细胞和(或)脂肪来源细胞分布广泛，取材容易，解决了组织工程化肌腱构建种子细胞来源不足的问题。
(2)脂肪来源细胞具有低免疫原性和免疫调节功能，有望解决同种异体移植修复的免疫排斥问题。
(3)可以按照组织缺损的形状任意塑形形成的组织可以在生物体内终生存活。
(4)利用新型的生物反应器提供精确可调控的单向牵引力，进行肌腱构建，并利用excluded volume effect(EVE)效应来加速肌腱的成熟。
(5)体外形成肌腱后，细胞处于自然细胞外基质的包绕中，再回植体内可以避免细胞死亡，从而获得相对恒定的高成功移植率。
(6)在体外构建的肌腱再植入体内时，由于支架材料已经大部降解，避免了酸性降解产物的产生，从而可以防止肌腱纤维化和粘连。
(7)在体外构建出具有一定生物力学性能的组织工程肌腱，回植后可以像正常肌腱移植一样开展早期的功能锻炼，有助于防止肌腱粘连和促进功能康复。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
皮肤成纤维细胞的分离与培养
在无菌条件下取术中废弃的包皮组织，切成2×2×2mm3大小组织块，磷酸缓冲液(PBS，含青、链霉素各100U/ml)冲洗2遍，加入二倍体积的1mg/ml的II型胶原酶(购自Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37℃恒温摇床消化4h后用150目尼龙网筛过滤离心，沉淀细胞用PBS洗2次计数，台盼蓝染色检查成纤维细胞活力，以1×106/盘密度(培养皿直径100mm)培养细胞，培养液为DMEM(购自Gibco，Gland，Island，NY，USA)含10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C50ug/ml，青、链霉素各100U/ml，成纤维细胞传至第二代，经0.25％胰酶消化收集细胞用于实验(图1)。
实施例2
肌腱细胞的分离与培养
在无菌条件下取新鲜截肢术后废弃的人肌腱组织，切成2×2×2mm3大小组织块，磷酸缓冲液(PBS，含青、链霉素各100U/ml)冲洗2遍，加入二倍体积的0.25mg/ml的II型胶原酶(购自Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37℃恒温摇床消化，分别于4、5、7小时后，用150目尼龙网筛过滤离心，沉淀细胞用PBS洗2次计数，台盼蓝染色检查肌腱细胞活力，以1×106/盘密度(培养皿直径100mm)培养细胞，培养液为DMEM(购自Gibco，Gland，Island，NY，USA)含10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C50ug/ml，青、链霉素各100U/ml，肌腱细胞传至第二代，经0.25％胰酶消化收集细胞用于实验(图2)。
实施例3
脂肪来源细胞的分离与培养
在无菌条件下取吸脂术后废弃的人肌腱组织，转移到培养瓶中，用生理盐水反复冲洗，加入等体积的0.075％的I型胶原酶(购自Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37℃恒温摇床消化，分别于1小时后，300g离心10分钟，获得高密度的细胞沉淀物，弃上清和漂浮的脂肪组织，细胞振匀，计数后以1×106/盘密度(培养皿直径100mm)培养细胞，培养液为DMEM(购自Gibco，Gland，Island，NY，USA)含10％胎牛血清，置于37℃、5％CO2、100％饱和湿度的条件下培养，24小时后首次换液，用PBS反复冲洗去除漂浮的细胞，加入培养液，待细胞基本长满培养皿底时进行传代(图3)。细胞传至所需代次，经0.25％胰酶消化收集细胞用于实验。
脂肪来源细胞的鉴定
将原代脂肪来源细胞培养于细胞爬片上，至70％汇合时，4％多聚甲醛固定15分钟，加入各类待测表面抗原的抗体，37℃孵育1小时，PBS冲洗，加入FITC连接的二抗(DAKO，Carpinteria，U.S.A)，37℃孵育30分钟，PBS再次冲洗，应用Heochest33258(购自Sigma公司(美国))或Propidium Iodide(购自Sigma公司(美国))进行核衬染，激光共聚焦显微镜下观察细胞表面抗原的表达。
脂肪来源细胞的多向分化潜能
成软骨诱导
第三代细胞采用微团块培养法进行成软骨诱导，诱导因子终浓度为TGF-β1(购自R&D公司(美国))10ng/mL，IGF(购自R&D公司(美国))100ng/mL，Dex(购自Sigma公司(美国))0.1μmol/L，转铁蛋白(购自Sigma公司(美国))6.25μg/mL。
成脂肪诱导
第三代细胞培养7天时进行脂肪诱导，诱导液成分为基础培养液和0.5mmol/L IBMX(购自Sigma公司(美国))、1μmol/L Dex、10μmol/L insulin(购自Sigma公司(美国))、200μmol/L indomethacin(购自Sigma公司(美国))，倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化，诱导14天进行相应的检测。
成骨诱导
第三代细胞培养7天时进行成骨诱导，诱导液成分为基础培养液加入2.16g/L β-磷酸甘油、10nmol/L维生素D3。诱导20天，对矿化结节进行成骨的相关特殊染色。
实施例4
生物材料支架的制备
将材料纤维预塑形成束状(图9)，并固定在“U”形弹簧上给予支架持续的静态张力(图10)，再在75％乙醇中浸泡消毒1小时后用PBS冲洗3-5遍，紫外灯消毒、风干后待用。
实施例5
组织工程肌腱的体外构建
皮肤成纤维细胞和/或脂肪来源细胞传至第2～4代，经0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，制成2.0×107/ml的细胞悬液。将细胞悬液接种到预制好的PGA纤维支架上，先将细胞-材料复合物在二氧化碳培养箱内放置4小时，然后加入含10％胎牛血清的DMEM培养液约30ml，继续置于培养箱内培养。以后每二天更换培养液一次，以保证细胞营养。大约2周后，细胞分泌足够的细胞外基质，再转移到牵拉式肌腱生物反应器的细胞培养室内进行动态牵拉培养，培养一定时期(较佳的为3～10周)后形成能够用于肌腱缺损修复的组织工程肌腱移植物。生物反应器中加载在种子细胞-生物材料复合物上的牵引力为2-20N，牵拉频率为每日牵拉1～12小时，每次牵拉持续2～30秒，间隔5～60秒，位移为移植物长度的5～30％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种组织工程化肌腱移植物，其特征在于，它包括：
(a)药学上可接受的生物可降解材料；和
(b)种子细胞，所述的种子细胞接种于所述的生物可降解材料，且种子细胞选自下组：(i)成纤维细胞，(ii)脂肪来源细胞，或(iii)1∶10000-10000∶1的成纤维细胞和脂肪来源细胞的混合物。
2.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，最大张力为10-80N。
3.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的种子细胞是成纤维细胞或成纤维细胞和脂肪来源细胞的混合物。
4.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的种子细胞的含量为1×105个细胞/ml-5×108个细胞/ml。
5.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的生物可降解材料为条索状。
6.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的成纤维细胞和脂肪来源细胞来源于自体或同种异体。
7.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其各种类型和比列的混合物。
8.一种制备如权利要求1所述的组织工程化肌腱移植物的方法，其特征在于，包括步骤：
将种子细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合，得到种子细胞-生物材料复合物，其中所述的种子细胞接种于所述的生物可降解材料，且种子细胞选自下组：(i)成纤维细胞，(ii)脂肪来源细胞，或(iii)1∶10000～10000∶1的成纤维细胞和脂肪来源细胞的混合物；
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，它还包括步骤：
将种子细胞-生物材料复合物在生物反应器中培养得到如权利要求1所述的组织工程化肌腱移植物。
10.一种如权利要求1所述的组织工程化肌腱移植物的用途，其特征在于，它可用于制备修复肌腱缺损的移植物。
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