BR9814036B1 - esqueleto polimÉrico macroporoso, processo para fabricar um esqueleto polimÉrico macroporoso, e, processo para cultivar tecido com distribuiÇço penetrante no esqueleto polimÉrico macroporoso. - Google Patents

Description

"ESQUELETO POLIMÉRICO MACROPOROSO, PROCESSO PARAFABRICAR UM ESQUELETO POLIMÉRICO MACROPOROSO, E,PROCESSO PARA CULTIVAR TECIDO COM DISTRIBUIÇÃOPENETRANTE NO ESQUELETO POLIMÉRICO MACROPOROSO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito ao uso de um esqueleto depolímero biodegradável para aplicações no engendramento de tecido. Maisparticularmente, a presente invenção diz respeito a um novo esqueleto depolímero macroporoso tendo um alto nível de interconectividade entre osmacroporos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os tratamentos ósseos por ferimentos, deformações genéticase doenças freqüentemente requerem o implante de enxertos. E bem conhecidoque os autoenxertos e os aloenxertos são os implantes mais seguros;entretanto, devido ao fornecimento limitado e os riscos de transmissão dedoença e rejeição encontrados com estes enxertos, os biomateriais sintéticostêm sido também amplamente usados como implantes. As complicações invivo foram observadas com alguns destes biomateriais, como má combinaçãomecânica (tensão de cobertura) e aparecimento de escombros de desgasteleva à atrofia óssea, osteoporose ou osteólise em torno dos implantes (Woo etai., 1976; Terjesen et al., 1988).

Um novo processo, definido como Engendramento de Tecido(TE), recentemente suscitou muito interesse. O engendramento de tecidoenvolve o desenvolvimento de uma nova geração de biomateriais capazes deinterações específicas com os tecidos biológicos para produzir tecidosfuncionais equivalentes. O conceito básico é que as células podem serisoladas de um paciente, expandidas em cultura de célula e semeadas em umesqueleto preparado a partir de um biomaterial específico para formar umesqueleto/compósito biológico chamado de uma "construção TE". Aconstrução pode depois ser enxertada no mesmo paciente para funcionarcomo um tecido de substituição. Alguns de tais sistemas são utilizáveis parasubstituição de tecido de órgão onde existe uma disponibilidade limitada dedoadores de órgãos ou onde, em alguns casos (por exemplo, pacientesjovens) substituições naturais inadequadas são disponíveis. O esqueleto por sisó pode atuar como um veículo de transferência para porções biologicamenteativas de fatores de crescimento, genes e medicamentos. Este processorevolucionário para cirurgia tem aplicações extensivas com benefícios tantopara o bem estar do paciente quanto para o avanço dos sistemas de cuidadossanitários.

A aplicação do engendramento de tecido para o cultivo detecidos ósseos envolve colher as células tronco osteogênicas, semea-las edeixa-las desenvolver para produzir um novo tecido in vitro. O tecidorecentemente obtido pode então ser usado como um autoenxerto. Ospoliésteres biodegradáveis, em particular os poli(lactide-co-glicolídeo)s,foram usados como esqueletos para o engendramento de tecidos de váriaspopulações celulares diferentes, por exemplo condrócitos (como descrito porFreed et al., no J. of Biomed. Mater. Res. 27: 11 a 13, 1993), hepatócitos(como descrito por Mooney et al., no Journal of Biomedical Mat. Res. 29,959 a 965, 1995) e mais recentemente, células derivadas da medula óssea(como descrito por Ishaug et al., no J. Biomed. Mat. Res. 36: 17 a 28, 1997 eHoly et al., no Cells and Materials, 7, 223 a 234, 1997). Especificamente, asestruturas porosas destes poliésteres foram preparadas e semeadas comcélulas; entretanto quando as células derivadas da medula óssea foramcultivadas nestas estruturas porosas, o crescimento ósseo interno apenasocorreu dentro da borda externa do esqueleto polimérico 3-D (Ishaug et ai,acima; Holy et al., acima). Assim, o esqueleto polimérico preparado nestesexemplos foram inadequados para permitir o crescimento celular requeridopara dar o tecido adequado para o implante ou para o uso como umautoenxerto.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Foi agora descoberto que os esqueletos poliméricoscaracterizados por macroporos na faixa de tamanho milimétrica cominterconexões como visto no osso trabecular são particularmente utilizáveispara o engendramento de tecido por permitirem o crescimento celular internoque é crucial para o desenvolvimento de tecidos tridimensionais, taisesqueletos poliméricos podem ser preparados usando-se um novo processoque combina as técnicas de inversão de fase e de lixivia de particulado.

Consequentemente, em um aspecto da presente invenção,forneceu-se um esqueleto polimérico que compreende macroporos, quevariam no tamanho entre 0,5 mm e 3,5 mm e tendo uma porosidade deinterconexão semelhante àquela encontrada no osso trabecular humano.

Mais particularmente, forneceu-se um esqueleto polimérico macroporoso com uma morfologia trabecular tendo uma porosidade de pelomenos 50% , o dito esqueleto polimérico macroporoso incluindo macroporosque tenham um diâmetro médio com tamanho na faixa de cerca de 0,5 mm ecerca de 3,5 mm, os macroporos tendo paredes porosas definidas por suportespoliméricos e incluindo passagens macroporosas interconectando os macroporos.

Em um outro aspecto da presente invenção, forneceu-se umprocesso para fabricar um esqueleto polimérico compreendendo as etapas de:combinar um polímero em um meio líquido com partículaspara formar uma mistura particulado-polímero;

estabilizar a mistura particulado-polímero;

submergir a mistura particulado-polímero em um solvente emque o polímero é insolúvel para precipitar o polímero para produzir umamistura particulado-polímero solidificada; e

submergir a mistura particulado-polímero solidificada em umsolvente particulado por um tempo suficiente para a dissolução das partículas.

Em um outro aspecto da invenção, forneceu-se um processopara cultivar tecido, com distribuição penetrante, em um esqueletopolimérico macroporoso tridimensional com uma morfologia trabecular auma profundidade de pelo menos 2,5 vezes a média do tamanho domacroporo no esqueleto, compreendendo as etapas de:

semear o esqueleto polimérico com células de tecido, o ditoesqueleto polimérico macroporoso tendo uma porosidade de pelo menos 50%,o dito esqueleto polimérico macroporoso incluindo macroporos que tenhamum diâmetro médio com tamanho na faixa de cerca de 0,5 mm e cerca de 3,5mm, os macroporos tendo paredes porosas definidas por suportes poliméricos,e incluindo passagens macroporosas interconectando os ditos macroporos, epassagens microporosas interconectando os ditos macroporos; ecultivar as células.

A presente invenção também fornece um processo paracultivar tecido, com distribuição penetrante, em esqueleto poliméricomacroporoso tridimensional com uma morfologia trabecular a umaprofundidade de pelo menos 2,5 vezes a média de tamanho do macroporo noesqueleto, que compreende as etapas de:

sintetizar um esqueleto polimérico macroporoso com umamorfologia trabecular tendo uma porosidade de pelo menos 50%, o ditoesqueleto polimérico macroporoso incluindo macroporos que tenham umdiâmetro médio na faixa de cerca de 0,5 . mm a cerca de 3,5 mm , osmacroporos tendo parede porosas definidas por suportes poliméricos, eincluindo passagens macroporosas e passagens microporosas interconectandoos ditos macroporos;

semear o esqueleto polimérico com células de tecido; e

"segue-se a página 4a"cultivar as células de tecido.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

As modalidades da presente invenção estão descritas emmaiores detalhes com referência aos desenhos e micrografias digitalizadaspor computador que as acompanham, em que:A Figura 1 é uma representação em diagrama -de.uma porçãode um sistema de poro polimérico que ilustra componentes diferentes cómõanteriormente definido;

A Figura 2 é um micro diagrama luminoso das trabéculasósseas no colo de fêmur mostrando as áreas isotrópicas e anisotrópicas(micrografia modificada por luz de Tobin W. J., em J. Bone Jt Surg 37A(1)57 a 72, 1955);

A Figura 3A é uma micrografia luminosa de um polímero deacordo com a presente invenção (amplitude de campo = 1,8 cm);

A Figura 3B é uma micrografia luminosa de um corte de 20μm do esqueleto polimérico da Figura 3A (amplitude de campo = 3,5 mm);

A Figura 3 C é uma micrografia de varredura eletrônica dasparedes do poro do esqueleto polimérico da Figura 3A;

A Figura 4A é um diagrama que ilustra a curvatensão/resistência dos esqueletos poliméricos quando submetidos a um testede compressão a uma vazão de 1% de deformação por segundo;

A Figura 4B é um diagrama que ilustra o efeito daconcentração de polímero sobre as propriedades mecânicas dos esqueletospoliméricos. O Módulo de Young da primeira região elástica é chamado deY1 e o Módulo de Young da segunda região elástica é chamado de Y2;

A Figura 5 é uma micrografia de varredura eletrônica daestrutura da parede porosa de um esqueleto preparado com uma concentraçãode 0,05 g/ml de PLGA 75:25 em DMSO;

A Figura 6 é uma micrografia de varredura eletrônica daestrutura da parede porosa de um esqueleto preparado com uma concentraçãode 0,2 g/ml de PLGA 75:25 em DMSO;

A Figura 7A é uma micrografia de varredura eletrônica deesqueletos de PLGA 75/25 obtidos usando-se partículas menores do que 0,35mm;A Figura 7B é uma micrografia de varredura eletrônica deesqueletos de PLGA 75/25 obtidos usando-se partículas que variam de 0,54 a0,8 mm;

A Figura 7C é uma micrografia de varredura eletrônica deesqueletos de PLGA 75/25 obtidos usando-se partículas que variam de 0,8 a2,0 mm;

A Figura 8 é uma micrografia de varredura eletrônica de umamembrana de PLGA 75/25 preparada na ausência de partículas;

A Figura 9A é uma micrografia de varredura eletrônica de umaespuma de PLGA 75/25 obtida a uma Tmix = 11°C e Tnão solvente = 0 °C;

A Figura 9B é uma micrografia de varredura eletrônica deuma espuma de PLGA 75/25 obtida a uma Tmix = -20°C e Tnão solvente =0°C;

A Figura 9C é uma micrografia de varredura eletrônica deuma espuma de PLGA 75/25 obtida a uma Tmix = -20°C e Tnão solvente =40 °C;

A Figura 10 é uma micrografia de varredura eletrônica de umafolha pequena de CaP revestindo um esqueleto de PLGA 75/25;

A Figura 11 é uma micrografia confocal de um esqueletoDex+ cultivado durante 42 dias (amplitude de campo =1,8 mm);

A Figura 12 é uma micrografia luminosa iluminada por luzUV de um esqueleto Dex+ corado com tetraciclina (amplitude de campo = 2,0 cm);

A Figura 13 é uma micrografia luminosa de um esqueleto deosteocalcina imunorrotulado (amplitude de campo =1,1 cm);

A Figura 14 é uma micrografia luminosa de um corte deesqueleto cultivado em Dex+ corado com hematoxilina e eosina (amplitudede campo = 0,8 cm);

A Figura 15 é uma micrografia luminosa de um corte deesqueleto cultivado em Dex- corado com Hematoxilina e eosina (amplitudede campo = 0,6 cm);

A Figura 16A é uma micrografia de varredura eletrônica deum esqueleto membranoso de PLGA 75/25 da técnica anterior criado compartículas menores do que 0,35 mm;

A Figura 16B é uma micrografia de varredura eletrônica deum esqueleto membranoso de PLGA 75/25 da técnica anterior criado compartículas variando no tamanho de 0,54 a 0,8 mm;

A Figura 16C é uma micrografia de varredura eletrônica deum esqueleto membranoso de PLGA 75/25 da técnica anterior criado compartículas variando no tamanho de 0,8 a 2,0 mm;

A Figura 16D é uma micrografia de varredura eletrônica deum esqueleto intermediário de PLGA 75/25 criado com partículas menoresdo que 0,35 mm;

A Figura 16E é uma micrografia de varredura eletrônica deum esqueleto intermediário de PLGA 75/25 criado com partículas variandono tamanho de 0,54 a 0,8 mm;

A Figura 16F é uma micrografia de varredura eletrônica de umesqueleto intermediário de PLGA 75/25 criado com partículas variando notamanho de 0,8 a 2,0 mm;

A Figura 16G é uma micrografia de varredura eletrônica deum esqueleto semelhante a osso de PLGA 75/25 criado com partículasmenores do que 0,35 mm;

A Figura 16H é uma micrografia de varredura eletrônica deum esqueleto semelhante a osso de PLGA 75/25 criado com partículasvariando no tamanho de 0,54 a 0,8 mm; e

A Figura 161 é uma micrografia de varredura eletrônica de umesqueleto semelhante a osso de PLGA 75/25 criado com partículas variandono tamanho de 0,8 a 2,0 mm.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A Figura 1 é uma representação em diagrama dè uma porçãode um esqueleto polimérico mostrando dois macroporos interconectados umao outro por uma interconexão macroporosa. Os dois macroporos tambémestão conectados aos macroporos circundantes por passagens microporosas(também chamados de microporos). Este e vários outros termos usados nadescrição do esqueleto polimérico produzido de acordo com a presenteinvenção são definidos abaixo.

Esqueleto: dispositivo designado como um carregador decélula para engendrar tecidos ou aplicações relacionadas. Este dispositivotem preferivelmente uma morfologia porosa para ser colonizada por células.No nosso caso específico, o esqueleto tem uma morfologia de poro aberto.

Macroporos: vazios dentro do esqueleto polimérico,delineados por paredes poliméricas. Os macroporos têm tipicamente umdiâmetro entre 0,5 e 3,5 mm.

Paredes porosas: suportes poliméricos que delineiam osmacroporos. Quando os suportes poliméricos formam feixes anisotrópicos,em que as interconexões microporosas separam os suportes uns dos outros nomesmo feixe, o suporte da parede porosa é definido como "lamelar". Quandoos suportes são isotrópicos, não formam feixes e são amplamente separadosuns dos outros por interconexões macroporosas, na maioria, a parede porosaé definida como "semelhante a suporte". As estruturas de parede porosa tantolamelar quanto semelhantes a suporte apresentam nanoporos quandoseccionadas.

Interconexões microporosas (também chamadas microporosou passagens microporosas): vazios encontrados em parede de poro lamelar.Cada suporte ou lamelas do polímero são separados um dos outros porestruturas de poro alongadas, paralelas, chamadas de microporos. O tamanhodestes poros é menor do que 200 μπι. Os microporos contribuem para ainterconectividade total dos esqueletos.

Interconexões macroporosas: passagens entre C.ispõ$içõeslamelares de paredes de poro ou entre suportes poliméricos. Contribuem, namaioria, para a interconectividade dos macroporos e variam no tamanho entre200 μm e 2 mm.

Nanoporos: vazios encontrados no corpo do polímero. Asseções transversais do corpo do material polimérico, dos suportes da paredede poro ou das estruturas lamelares da parede de poro, apresentam comcavidades redondas que podem ou não perfurar completamente o corpo dematerial polimérico. Estes nanoporos podem resultar de não solventeenclausurado dentro do corpo do polímero ou da degradação autocatalítica docorpo do polímero. Os nanoporos são distribuídos nas paredes do esqueleto.Contribuem apenas para a interconectividade total dos macroporos quandovão através do material do corpo como um todo.

Interconexões: passagens de fluxo que conectam osmacroporos uns com os outros. As interconexões compreendem asinterconexões macroporosas (passagens), as interconexões microporosas(passagens) e os nanoporos que perfuram o material de corpo definido acimacomo um todo.

A presente invenção fornece um esqueleto poliméricomacroporoso que compreende macroporos e interconexões. Os macroporostêm um diâmetro na faixa de 0,5 a 3,5 mm e interconexões como vistas noosso trabecular. A morfologia dos esqueletos poliméricos (também chamadade estruturas de espuma) divulgadas aqui está fundamentada na do osso trabecular.

O osso trabecular demonstrou ser metabolicamente o sítiomais ativo no osso (como descrito por Rodan G. A., em Bone 13, S3-S6,1992). A geometria específica de poro aberto do osso trabecularfavoravelmente afeta a formação e reabsorção óssea e é portanto de interesseconsiderável no contexto do engendramento do tecido ósseo: de fato, oprojeto de um esqueleto ideal para o engendramento· de; tecido ósseo devepermitir também a formação e a reabsorção óssea rápida. A morfologia dostrabéculos ósseos têm servido portanto como um modelo para criar as novas estruturas de esqueleto polimérico divulgadas aqui.

A arquitetura das trabéculas do osso depende do sítioanatômico onde o osso é encontrado e em uma extensão menor da idade dopaciente.

Martin R. B. (no CRC Criticai Reviews in BiomedicalEngineering, 10(3), 179 a 222, 1984) descreveu as trabéculas do osso como"um sistema complexo de paredes e suportes interrompidos". Os vaziosencontrados entre as trabéculas são chamados "espaços de medula". Asdireções das trabéculas são irregulares; entretanto, uma organização global nageometria trabecular é algumas vezes visível e segue as forças que atuamsobre o osso. As áreas onde as trabéculas seguem uma dada direção sãoanisotrópicas, ao passo que as áreas onde as trabéculas estão dispostasaleatoriamente são isotrópicas (conforme a Figura 2).

Whitehouse e Dyson (acima) bem como Martin (acima)descreveram a porosidade dos ossos trabeculares no fêmur em maioresdetalhes. A Tabela 1.1 indica as diferentes porosidades e largurastrabeculares determinadas por Whitehouse e Dyson para todas as áreas do fêmur.

TABELA 1.1: POROSIDADE E LARGURA DE TRABÉCULAS DOOSSO TRABECULAR DO FÊMUR

<table>table see original document page 12</column></row><table>

A estrutura do osso trabecular foi investigada quanto a larguratrabecular, porosidade, anisotropia e padrões gerais como conectividade evolume de estrela. AS micrografias luminosas e dé varredura · eletrônica'publicadas sobre o osso trabecular indicam que os espaços de meduladelineados pelas trabéculas (isto é, poros) variam de 1 a alguns milímetros notamanho e são interconectados com furos que variam de aproximadamente0,3 a um milímetro.

Quando o uso das trabéculas produzidas de polímero queformam a presente invenção é para aplicações fisiológicas, o esqueletopolimérico é preferivelmente preparado de qualquer polímero biocompatível.

O termo "biocompatível" como é usado aqui pretende abranger polímerosque não sejam tóxicos às células e que permitam que as células formemcolônias sobre eles. Os exemplos de polímeros adequados incluempoli(lactídeo), poli(lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA) de proporções variadas,poliestireno, poli(glicolídeo), poli(acrilato)s, poli(metacrilato de metila),poli(metacrilato de hidroxietila), poli(álcool vinílico), poli(carbonato),poli(etileno-co-acetato de vinila), poli(anidrido), poli(etileno),poli(propileno), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxivalerato), poli(uretano)s,poli(uretano etérico), poli(uretano éster), poli(arilato), poli(imida),poli(anidrido-co-imida), poli(aminoácidos) e poli(fosfazeno). Os poliésteresbiodegradáveis, alifáticos tais como o ácido polilático e os polímerosderivados deste, representam uma classe particularmente utilizável depolímeros nas aplicações dos esqueletos presentes, que dizem respeito aotransplante de célula devido ao fato de que foram sempre aprovados para ouso clínico humano. A este respeito, um polímero preferido para o uso comoo esqueleto e o PLGA, particularmente misturas que compreendam mais doque 50% de poli(DL-lactídeo) tal como o PLGA 85:15 e o PLGA 75:25.

As aplicações adequadas para os esqueletos presentes variarãocom a composição e a estrutura do polímero. Por exemplo, os esqueletospoliméricos biodegradáveis são adequados para o uso em aplicações in vitroe/ou transplante de célula in vivo. As matrizes podem servir depois comosuportes ou esqueletos para permitir que o cultivo celular o;orra in vitroantes do implante in vivo. Os esqueletos também podem ser usadosdiretamente in vivo, sem que sejam pré semeados com células. Em ambas asaplicações (com ou sem semeadura anterior de célula), as matrizes depolímero biodegradável de acordo com a presente invenção sãoparticularmente utilizáveis para o desenvolvimento de tecido tridimensional epode ser usado no desenvolvimento de tecidos conectivos, como osso,cartilagem, tecido paradontal, bem como tecidos dentários e outros órgãos,tais como tecido do fígado ou da mama.

Uma característica significante do esqueleto poliméricopresente é a presença de macroporos em pelo menos 50%, os quais têm umdiâmetro dentro da faixa de 0,5 a 3,5 mm, uma faixa representativa daquelaencontrada no osso trabecular humano. Preferivelmente, os macroporos têmum diâmetro de pelo menos 1,0 mm e mais preferivelmente, os macroporostêm um diâmetro entre cerca de 1,0 mm e 3,5 mm.

Além da sua estrutura macroporosa, o esqueleto também écaracterizado por um alto nível de interconectividade que intensifica tanto apenetração do esqueleto pelas células quanto o fluxo de nutrientes para ascélulas. As inteconecções macroporosas de pelo menos 0,35 mm fornecemum ambiente de "célula aberta" no esqueleto polimérico, que é importantepara encorajar o desenvolvimento do tecido por todo o esqueleto, isto é odesenvolvimento tridimensional do tecido.

Os macroporos são delineados por paredes poliméricasporosas que podem ou não apresentar uma estrutura lamelar. A espessuratotal das paredes do poro não é maior do que cerca de 0,4 mm epreferivelmente não maior do que cerca de 0,3 mm. O grau deinterconectividade nas paredes do poro é dependente, entre outros fatores,das temperaturas de processamento.Um resultado surpreendente e inesperado é que cadamacroporo está em comunicação de fluxo com um número significante deimacroporos vizinhos tanto por intermédio das interconexões macroporosasquanto pelas microporosas.

Os esqueletos com estruturas de parede de poro diferentesobtidos em temperaturas de processamento diferentes usando este novoprocesso de inversão de fase de lixívia de particulado estão descritos nopresente documento.

A porosidade do esqueleto polimérico é de pelo menos umnível de 50% para todos os esqueletos obtidos, como estimado usando-se osoftware de análise de imagem Northern Eclipse e preferivelmente em umnível maior do que 50%. O nível de porosidade do presente esqueletopolimérico também contribui para sua natureza de "célula aberta", resultandoem significante sobreposição entre os macroporos (dando aumento àspassagens macroporosas) que define a natureza altamente interconectada dopresente esqueleto e ainda intensifica a sua utilidade como um esqueleto parao cultivo de células. A este respeito, o nível de porosidade é preferivelmentemaior do que cerca de 75%, embora o nível mais preferível de porosidadeseja maior do que cerca de 85%.

As características do presente esqueleto o tornaparticularmente adequado para o uso no engendramento de tecidos e maisnotavelmente, no transplante de célula, porque fornece um esqueletobiocompatível que as células podem colonizar de uma maneira tridimensionalpela rede macroporosa interconectada do esqueleto. Isto é significantequando se considera o transplante de quaisquer das células que produzemtecidos, especialmente aquelas que requerem neoangiogênese tais como otecido ósseo. Além disso, quando usado para o transplante de célula, oesqueleto é biodegradável, a degradação do qual pode ser controlada tal que odesenvolvimento celular possa ser simultâneo com a degradação doesqueleto.

Deve ser entendido por aqueles de habilidade na técnica que opresente esqueleto polimérico pode ser modificado de modo a melhorar aindasuas propriedades para o uso como um esqueleto para o desenvolvimentocelular. As modificações típicas que afetem as estruturas usadas comosuporte para o desenvolvimento celular também podem ser adequados paramodificar o presente esqueleto polimérico. Tais modificações funcionam paramelhorar a resposta biológica e incluem, por exemplo, modificações desuperfície com colágeno, fosfato de cálcio, proteoglicanos, proteínas,peptídeos, carboidratos e polissacarídeos ou pelo tratamento com ácido/base.Adicionalmente, o esqueleto polimérico pode servir como um reservatóriopara a transferência de moléculas ativas, tais como proteínas, fatores decrescimento, etc. que intensifique a função celular.

O presente esqueleto polimérico pode ser fabricado usando-seum novo processo que combina a metodologia de lixívia de particulado coma metodologia de inversão de fase. Em uma etapa inicial, o esqueletopolimérico selecionado é preparado como um polímero líquido. Como usadoaqui, o termo polímero em um meio líquido inclui um polímero liqüefeitoformado por fundir o polímero até a sua forma líquida por aquecimento até oseu ponto de fusão, sozinho ou misturado com outro líquido, ou uma soluçãopolimérica pode ser formada misturando-se o polímero em um solvente paraformar uma solução polimérica. Qualquer solvente geralmente utilizado parapreparar uma solução polimérica pode ser usado para este propósito,incluindo sulfóxido de dimetila (DMSO), cloreto de metileno, acetato deetila, clorofórmio, acetona, benzeno, 2-butanona, tetracloreto de carbono,clorofórmio, n-heptano, n-hexano e n-pentano. Como uma pessoa dehabilidade na técnica avaliará, os solventes não citotóxicos tais como DMSOsão preferivelmente usados para se preparar a solução de modo a não afetaradversamente o desenvolvimento celular. A concentração do polímero nasolução polimérica variará com as características do polímero usado parafabricar o esqueleto.

O polímero líquido é então misturado com partículas de umtamanho apropriado em conexão com a fase de lixívia de particulado doprocesso. As partículas que tenham um diâmetro que corresponda aodiâmetro desejado dos macroporos no esqueleto polimérico são adequadas,especialmente partículas que tenham um diâmetro na faixa de 0,5 a 3,5 mm. Mais preferivelmente, as partículas têm um diâmetro maior do que 1,0 mm emais preferivelmente, as partículas têm um diâmetro entre 1,0 e 2,0 mm. Osexemplos de partículas adequadas para a mistura com o polímero incluempolissacarídeos (tais como glicose), sais orgânicos e inorgânicos, proteínas elipídeos de um tamanho apropriado que possam ser dissolvidos em umsolvente outro que não um solvente para o polímero (isto é, um não solventedo polímero). A quantidade de partículas misturadas com a soluçãopolimérica novamente variará com as características do polímero usado parafabricar o presente esqueleto.

Uma vez as partículas tenham sido cuidadosamentemisturadas como o polímero líquido para formar uma mistura poliméricaparticulada, o polímero é submetido a uma etapa de inversão de fase em que éconvertido de um líquido para um sólido, esta etapa é obtida submergindo-sea mistura polimérica particulada em um não solvente de polímero, umsolvente em que o polímero não seja solúvel. Tal não solvente de polímeroinclui, por exemplo, água, álcool, 1,4-dioxana e anilina.

De modo a se obter um esqueleto polimérico sólido em umaforma particulada, a mistura polimérica pode ser colocada em um moldedurante a etapa de inversão de fase. Preferivelmente, o polímero líquido podeser estabilizado em torno dos particulados, por exemplo, por congelamento dapasta polímero-particulado. Deste modo, nenhum molde é usado e o processode inversão de fase ocorre simultaneamente em todas as superfíciesexternas. Quando o solvente do polímero é DMSO, por exemplo, a misturapolimérica é esfriada a uma temperatura maior ou igual a 12 0C5 que é ',aitemperatura de congelamento do DMSO. As temperaturas mais frias, taiscomo as temperaturas de menos do que 0 0C também podem ser usadas. Umaconseqüência de se usar temperaturas baixas (por exemplo, menos 20 0C ou -80 °C) durante este estágio do processo é a formação subsequente de umesqueleto polimérico com uma morfologia diferente (conforme o Exemplo 4),como uma estrutura de pele mais grossa que possa ser removida antes do usocomo um esqueleto para o cultivo tridimensional de célula, como descrito noExemplo 1. Além do esfriamento, outros processos de estabilizar a mistura depolímero-particulado podem ser usados, por exemplo gelificação (aumentoda viscosidade).

Seguindo-se a conversão da mistura polimérica da fase líquidapara sólida, o polímero é submetido à lixívia do particulado. Nesta etapa doprocesso, o polímero é imerso em um solvente do particulado, isto é, umsolvente que funciona para dissolver as partículas dispersas por todo opolímero mas que não dissolva o próprio polímero. Os solventes departiculado apropriados dependerão, é claro, da natureza das partículas e dopolímero. Os exemplos de solventes de particulado apropriados incluemágua, álcool, 1,4-dioxana e anilina. A temperatura do solvente de particuladopode ser variada com efeito mínimo no esqueleto polimérico resultante.Entretanto, a temperatura será, no geral, entre o ponto de congelamento dosolvente de particulado e a temperatura de transição vítrea do polímero, demodo que o esqueleto polimérico não funda ou torne-se viscoso sob o efeitoda temperatura do não solvente. Em um exemplo, uma temperatura desolvente de particulado entre cerca de 0 0C e 45 0C é aplicada quando osolvente de particulado é a água e o polímero é o PLGA 75:25.

O polímero é submergido no solvente de particulado por umaquantidade de tempo apropriada para permitir a dissolução completa daspartículas dispersadas por todo o esqueleto polimérico. No geral, um períodode pelo menos 24 horas é requerido para se obter a dissolução completa doparticulado no esqueleto polimérico, embora um período de pelo menos 48horas seja preferido. De modo a acelerar eficientemente a dissolução daspartículas, é desejável imergir o polímero em solvente fresco em intervalosfreqüentes durante o período de dissolução, por exemplo em intervalos deaproximadamente 8 a 9 horas ou pelo uso de um banho circulante desolvente.

Os processos de inversão de fase e de lixívia de particuladopodem ocorrer em uma etapa com um solvente que seja simultaneamente umnão solvente para o polímero e um solvente para o particulado. Em umexemplo, água duplamente destilada (ddH20) foi usada.

O esqueleto polimérico é removido do solvente de particuladoa seguir de um período apropriado de dissolução de particulado e pode sersecado a vácuo antes do uso ou desinfetado em álcool (tal como etanol a70%), enxaguado e condicionado no meio de cultura para o uso subsequente.Se o esqueleto polimérico não é requerido para o uso imediato édesejavelmente armazenado seco em um dessecador para impedir a retençãode umidade e a possível degradação do polímero.

O presente processo vantajosamente produz um esqueletopolimérico tendo características únicas e em particular, produz um esqueletopolimérico tendo uma rede macroporosa interconectada. Uma outra vantagemsignificante do presente processo de 2 estágios é que fornece meiosampliados para controlar a morfologia do esqueleto polimérico resultante.

Em outras palavras, o processo fornece 2 níveis, a lixívia do particulado e ainversão de fase, pelos quais afeta a morfologia do esqueleto polimérico. Porexemplo, o tamanho e a distribuição do macroporo podem ser alterados tantodurante o estágio de lixívia do particulado quanto durante o estágio deinversão de fase do processo e são dirigidos pelo tamanho e pela distribuiçãodo particulado e em uma extensão menor pelas temperaturas deprocessamento do esqueleto. Além disso, a formação e o tamanho dainterconexão podem ser influenciados variando-se a razão da inversão defase. A razão da inversão de fase pode ser alterada alterando-se váriasvariáveis incluindo a temperatura, o tipo de não solvente de polímero e aconcentração do polímero. Assim, a morfologia final do esqueleto pode sercontrolada. Preferivelmente, a morfologia resultante assemelha-se àquela doosso trabecular humano.

Em um outro aspecto da presente invenção, um processo paracultivar células para o desenvolvimento tridimensional é fornecidoutilizando-se o esqueleto polimérico aqui descrito. A nova estruturamacroporosa interconectada do presente esqueleto polimérico éespecialmente adequado para engendrar tecidos e notavelmente engendrartecidos ósseos, uma alternativa intrigante para as terapias de reparo ósseo correntemente disponíveis. A este respeito, a semeadura do esqueletopolimérico com células derivadas da medula óssea é realizada usando-seprocessos convencionais, que são bem conhecidos por aqueles de habilidadena técnica (como descrito em Maniatopoulos et al., em Cell Tissue Res. 254,317 a 330, 1988). As células são semeadas sobre o esqueleto polimérico e cultivadas sob condições de crescimento adequadas. As culturas sãoalimentadas com meio apropriado para estabelecer o seu crescimento.

Como apresentado acima, as células de vários tipos podem sercultivadas por todo o presente esqueleto polimérico. Portanto, o esqueletopolimérico da presente invenção é particularmente adequado para o cultivode células osteogênicas, especialmente as células que elaboram a matrizóssea. Para engendrar tecidos, as células podem ser de qualquer origem. Ascélulas são vantajosamente de origem humana. O presente processo decultivar células em um esqueleto polimérico tridimensional de acordo com ainvenção permite às células osteogênicas semeadas, por exemplo, penetrar oesqueleto polimérico para elaborar a matriz óssea, durante o estágio in vitro,com distribuição penetrante na estrutura do esqueleto polimérico eparticularmente a uma profundidade de pelo menos 2,5 vezes a profundidadedo tamanho médio do macroporo. A penetração das célula osteogênica e,como um resultado, a elaboração da matriz óssea pode ser melhorada pormeios mecânicos, ultrassônicos, de campo elétrico ou eletrônicos.

As modalidades da presente invenção estão descritas nosseguintes exemplos específicos que são apenas como exemplos e não paraserem interpretados como limitantes.

EXEMPLO 1 - PREPARAÇÃO DE UM ESQUELETO POLIMÉRICO DE PLGA 75:25

Um esqueleto polimérico de PLGA 75:25 de acordo com apresente invenção foi preparado usando-se PLGA 75:25 (obtido daBirmingham Polymer Inc.), tendo uma viscosidade inerente de 0,87 dL/g.Um ml de PLGA 75:25 a 0,1 g/ml em DMSO foi misturado com 2 g decristais de glicose (tamanho de partícula variando de 0,8 mm a 2 mm) em ummolde de alumínio. A mistura de PLGA 75:25 e DMSO foi esfriada a -20 °C.Esta temperatura da mistura de PLGA 75:25 e de DMSO é denominada Tmix.

Os blocos congelados de PLGA 75:25 foram então imersos em uma lama degelo e água de ddH20 a 0°C, que é um não solvente para o não polímero.Esta temperatura da água é denominada de Tnã0 solvente. Os blocospermaneceram na ddH20 por 48 horas durante o que a ddH20 foi trocadaaproximadamente a cada 8 horas. Os esqueletos obtidos foram entãoremovidos da água, secados a vácuo por 72 horas a 0,01 mm Hg earmazenados a 4°C em um dessecador sob vácuo até o uso. Os esqueletosobtidos usado as condições mencionadas acima foram depois completamenteanalisados.

A estrutura macroporosa das secções do esqueleto poliméricode 2 mm de espessura foi observada em uma ampliação baixa (16X) usando-se um microscópio de dissecação como mostrado na Figura 3A, Umadistribuição uniforme dos macroporos interconectados variando no tamanhiode cerca de 0,8 a 1,5 mm foi observada por todo o esqueleto polimérico. Osmacroporos apresentaram morfologias elípticas e paredes porosas espessas(cerca de 300 μιη de espessura) contendo microporos.

O esqueleto polimérico foi depois embebido em meio deembebeção Tissue-Tek (Milles #4583) e seccionado em um criostato a -20 °Cum conjunto em série de secções de 20 μm de espessura (50 secções) foramcoletadas em lâminas de vidro (VWR Canlab). As secções foramfotografadas em ampliação baixa (16X) usando-se um microscópio dedissecação e submetidas à varredura. A Figura 3B é uma secção do esqueletopolimérico que identifica os componentes porosos do esqueleto, osmacroporos, as interconexões macroporosas (passagens) e as interconexõesmicroporosas (passagens). Uma película fina de polímero (isto é uma camadade pele) foi observada na superfície externa do esqueleto polimérico. Asimagens foram convertidas para arquivos TIFF e analisadas em umcomputador PC usando-se software de análise de imagem Northern Eclipse.O cardápio de "medição única" foi usado para medir os tamanhos da parededo poro "área, perímetro, diâmetro, etc.) para cada secção submetida àvarredura. As "medidas de dados" rotineiramente computaram a área e onúmero de suportes de parede de poro por lâmina submetida à varredura.

Estas medições foram convertidas de unidades pixel paramilímetros pela calibração do sistema, usando a ampliação mencionadaacima das imagens submetidas à varredura para determinar a relaçãopixel/mm. O tamanho do macroporo foi determinado desenhando-semanualmente uma linha com uma ferramenta do software na imagemdigitalizada da secção do esqueleto polimérico de uma parede de poro para aparede de poro adjacente. As características do esqueleto poliméricoresultante como determinar usando-se o software de análise de imagemNorthern Eclipse foram como segue:

Tamanho do Macroporo 1,79 ± 0,42 mmInterconexões Macroporosas 0,37 ± 0,15 mm

Espessura da parede do poro 0,29 ± 0,13 mm

Microporos 0,10 ± 0,05 mm

Porosidade 86,7 ± 2,43%

A porosidade das matrizes poliméricas também foramestimadas pela porisimetria de mercúrio (Quantachrome Autoscan 60). Umpenetrômetro sólido com 5 cm3 de volume de haste celular foi usado paraamostras na faixa de 0,015 a 0,020 g. Os valores do volume de vazio foramcalculados a partir do volume de penetração de mercúrio. A porosidade foicalculada do volume de penetração do mercúrio como sendo de 89,6%. Aporosidade estimada usando-se o software de análise de imagem NorthernEclipse (~ 87%) é substancialmente equivalente àquela de ~ 90% comomedido pela porosimetria de mercúrio dado que o processo de porosimetriade mercúrio não é preciso quando se analisa esqueletos poliméricos comdiâmetros de poro maiores do que ~ 75 μm.

O esqueleto polimérico também foi preparado para análiseusando-se um microscópio de varredura eletrônica (SEM). O esqueleto foitransversalmente seccionado em uma espessura de aproximadamente 2 mm erevestido por borrifação com ouro sob atmosfera de argônio (PolaronInstrument Inc., Doylestown, PA). As micrografias de varredura eletrônicaforam tomadas em um Hitachi 2500 SEM a 15 kV de voltagem emaceleração. O diâmetro dos macroporos foi confirmado usando-se asmicrografias de SEM como sendo de cerca de 1 a 1,5 mm, embora umaseparação nítida entre cada macroporo não foi sempre observada o que ilustraa estrutura interconectada muito aberta destes esqueletos poliméricos.

A natureza dos microporos das paredes de poro, comoobservado sob o microscópio ótico foi confirmado por SEM, como mostradona Figura 3C.

O esqueleto polimérico foi mecanicamente testado còniosegue. Um esqueleto polimérico na forma de um cilindro com um diâmetro euma altura de 1,5 cm foi preparado e testado usando um testador InstronMechanical. Os experimentos mecânicos foram realizados em uma máquinade teste servoidráulica uniaxial (Instron Modelo 1331, estrutura de carga comcontrolador Série 2150). Uma célula de carga de 1 kg (Sensotec, Modelo31/4680) foi usada para todos os testes de compressão. A deflexão do atuadorfoi medida por um transformador diferencial DC linearmente variável(LVDT, Intertechnology modelo SE 374). Os sinais da célula de carga e doLVDT foram mostrados durante o teste em um osciloscópio de armazenagemdigital (Gould, modelo 1425). Os sinais também foram introduzidos em umconversor de 16 canais, 12 bit análogo para digital (A/D) em um computadorApple IIe acelerado. A razão de aquisição de dados para estes experimentosfoi de 430 pares de pontos de dados por segundo. A compressão do esqueletopolimérico ocorreu a uma razão de 0,1 mm/s. como mostrado na Figura 4A,um ponto de resistência à compressão versus a deformação em porcentagemdo esqueleto polimérico apresentou dois módulos. Os módulos de Youngpara a primeira região elástica (chamada de Y1) foi de 0,76 ±0,12 MPa e parasegunda região elástica (chamada de Y2) foi de 0,18 ± 0,016 MPa.

EXEMPLO 2 - EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE POLÍMERO NAESTRUTURA DO ESQUELETO POLIMÉRICO

O efeito da concentração do PLGA 75:25 em DMSO naestrutura do esqueleto polimérico resultante foi determinada usando-se oprotocolo esboçado em detalhes no Exemplo 1. Três concentrações diferentesde PLGA 75:25 em DMSO (0,05 g/ml, 0,1 g/ml e 0,2 g/ml) foram usadaspara elaborar matrizes poliméricas, enquanto todas as outras condições forammantidas constantes como descritas no Exemplo 1.

Cada um dos esqueletos poliméricos preparados foramcortados ao meio usando-se uma lâmina de barbear. Uma estrutura de pele foiobservada em cada um, independentemente da concentração de partida dePLGA 75:25 em DMSO. As propriedades mecânicas dos 3 esqueletospoliméricos diferentes foram avaliados e estão ilustrados na Figura 4B. Umadiminuição significante no módulo de Young foi observada no esqueletopolimérico preparado usando-se o PLGA em DMSO de 0,05 mg/ml,enquanto o esqueleto mais duro foi obtido com uma concentração de PLGA75:25 de 0,02 g/ml.

Estes esqueletos também foram observados sob microscopiade luz e SEM. Nenhuma diferença na estrutura pôde ser detectada entre ostrês esqueletos poliméricos sob o microscópio de luz. Entretanto quandoobservados sob a SEM, os esqueletos criados com 0,05 g/ml de PLGA emDMSO apresentaram mais de uma estrutura de parede lamelar com maisinterconexões microporosas (ver Figura 5), do que aqueles elaborados com0,2 g/ml de PLGA em DMSO, onde poucas interconexões de poromicroporoso foram observadas (ver Figura 6).

EXEMPLO 3 - EFEITO DAS PARTÍCULAS NA ESTRUTURA DEESQUELETO POLIMÉRICO

O efeito sobre a estrutura de esqueleto polimérico variando-setanto a quantidade quanto o tamanho das partículas de glicose misturadascom o polímero de PLGA foi determinado como segue. Quantidadesdiferentes de partículas de glicose (0,5 g, 1 g e 2 g) foram separadamentemisturadas com 1 ml de solução do polímero, mantendo-se todas outrascondições como descritas no Exemplo 1 constantes. O efeito do tamanho dapartícula na morfologia final do esqueleto também foi avaliada usando-se asseguintes partículas separadas por peneiramento: (peneiras de teste padrão,VWR, West Chester, PA): 1) cristais de NaCl (< 0,35 mm), 2) cristais desacarose (0,54 mm < tamanho do cristal < 0,8 mm) e 3) cristais de glicose(0,8 mm < tamanho do cristal < 2 mm). Os esqueletos poliméricos resultantesforam observados por microscopia de luz. Quando, .da. mistura da soluçãopolimérica com os particulados, foi observado que para quantidadespequenas de particulados (isto é, 0,5 g/ml), a solução polimérica não foitotalmente imersa no leito particulado. Esta camada de solução poliméricaresultou após a inversão de fase em uma estrutura membranosa, similaràquela observada quando nenhum particulados é usado. Densidades desolução maiores de particulados (isto é, 2,0 g/ml) infiltraram completamentena solução polimérica de modo que o esqueleto resultante conteve umadistribuição de macroporos sem esta estrutura membranosa.

O tamanho dos macroporos foi diretamente proporcional aotamanho das partículas usadas, por exemplo, o tamanho do macroporo foi de~ 0,33 mm quando as partículas < 0,35 mm foram usadas (conforme a Figura7 A) e de ~ 0,75 mm quando as partículas que variam de 0,54 a 0,8 mm foramusadas (conforme a Figura 7B). Finalmente, para partículas maiores que 0,8 mm, os macroporos observados foram de ~ 1,4 mm (conforme a Figura 7C).Quando nenhuma das partículas foram misturadas à solução de polímero eDMSO, a estrutura polimérica resultante foi um cilindro oco composto deuma pele espessa contendo microporos, como ilustrado na Figura 8. Esta peleassemelha-se estreitamente à estrutura de membrana que resulta de umprocesso normal de inversão de fase.

EXEMPLO 4 - EFEITO DAS TEMPERATURAS DE PROCESSAMENTONA ESTRUTURA DE ESQUELETO POLIMÉRICO

Os efeitos de três Tmix diferentes (11 °C, - 20 0C e -80 °C) emTnj0 solvente (0 °C) foram estudados. Duas estruturas principais de esqueletos diferentes foram obtidas: 1) com Tmix = 11 0C e 2) com Tmix = -20 0C e Tmix =-80 °C. Os esqueletos obtidos com uma Tmix = 11 0C e uma Tnao solvente = 0 0Cforam isentos de pele e apresentaram uma estrutura muito aberta. Comomostrado na Figura 9A. Os tamanhos de macroporo pareceram expandidos eforam avaliados por SEM em até ~ 2,72 mm. As paredes porosas tiverammenos microporos porém mais interconexões macroporosas, fornecendo.aosesqueletos uma estrutura, no geral, mais aberta, os esqueletos obtidos comTmix= -20 °C r -80 °C tiveram ambos uma estrutura de pele. Quanto à Tmix20 °C os macroporos pareceram menores do que nos esqueletos obtidos emTmix mais altas e seus tamanhos foram avaliados por SEM em ~ 1,8 mm. Asparedes do poro foram lamelares, com poucas interconexões macroporosasporém mais interconexões microporosas (conforme a Figura 9B). Foiobservado que o tamanho de macroporo diminuiu com Tmix mais baixas. Asdiferenças nos tamanhos de macroporo foram particularmente importantesentre os esqueletos elaborados em Tmix = 11 °C e Tmix = -20 °C, ao passo quediferenças menores no tamanho de macroporo foram observadas entre osesqueletos elaborados em Tmix = -20 °C e Tmix = -80 °C. Enquanto ostamanhos do macroporo diminuíram com a Tmix, a estrutura da parede do porotambém mudou como descrito acima. As diferenças na Tmix podem terafetado a taxa de precipitação do polímero e portanto, a complexidade daestrutura da parede do poro.

Diferentes Tn5o solvente (40 °C, 20 °C e 0 °C) também foramestudadas, com uma Tmix constante de -20 °C. Neste caso, a principaldiferença entre todos os esqueletos foi a espessura de sua parede de poro. Tnã0solvente menores originaram paredes de poro mais espessas e mais complexas,ao passo que Tnã0 solvente maiores originaram paredes de poro finas ecompactas, comparáveis aos suportes poliméricos que delineiam cadamacroporo. As Figuras 9B e 9C mostram as diferentes morfologias dasestruturas de esqueleto em Tnã0 solvente = 0 °C e 40 °C respectivamente. Amaioria das diferenças estruturais foram observadas entre os esqueletoselaborados em Tn5osolvente = 0°C e Tn3osolvente = 20 °C. Poucas diferenças foramobservadas entre os esqueletos obtidos em Tnao solvente = 20 °C ou 40 °C.Enquanto as Tnã0 so)vente menores (0 °C) forneceram paredes de poro lamelares(conforme a Figura 9B), as Tnã0 solvente maiores (40 °C) fornecerammorfologias de parede de poro semelhantes a estruturas (conforme a Figura9C).

A espessura das paredes de poro dos esqueletos elaborados emT„ão solvente diferentes foi avaliada por SEM. Na Tnãosoivente = 0 °C, as paredes deporo foram estimadas em 0,29 mm, ao passo que na Tnã0 solvente = 20 °C, otamanho das paredes de poro foi de ~ 0,10 mm e nenhuma diferençasignificante pôde ser medida entre a Tnã0 S0lvente = 20 0C e 40 °C. todos osesqueletos elaborados com as várias temperaturas como mencionadas acimaforam seccionados e o tamanho de poro e a espessura da parede de poroforam medidos. A sua porosidade também foi avaliada usando-se o softwarede análise de imagem Northern Eclipse. Os seguintes resultados foramobtidos:

<table>table see original document page 28</column></row><table>

EXEMPLO 5 - MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL DO ESQUELETOPOLIMÉRICO

Os esqueletos obtidos como descrito no Exemplo 1 foramainda superficialmente modificados por tratamento com ácido/base,deposição de colágeno e deposição de fosfato de cálcio. Os procedimentos eresultados foram como segue:

O tratamento com ácido/base foi desenvolvido paraintensificar a carga de superfície e para alterar a topografia de superfície. Osesqueletos foram mantidos em várias concentrações de ácido acético (0,1 M,1 M e 5 M) durante 24 horas. Os esqueletos também foram mantidos emvárias concentrações de NaOH durante 24 horas para. se. observar a hidróliseda cadeia polimérica de superfície. Sob SEM, os esqueletos tratados comácido acético 5 M ou com NaOH 0,1 M por 24 horas apresentaram mudançasna topografia de superfície com o aparecimento de nanoporos.

Um experimento de deposição de colágeno foi projetado paraintensificar a adesão celular nas superfícies do polímero. Os esqueletos forammantidos em colágeno a 0,1% durante 1 hora, 5 horas, 8 horas e 24 horas.

Um experimento de deposição de fosfato de cálcio foi testadopara intensificar a adesão celular na superfície dos esqueletos. Estes forammantidos por 1 semana em meio totalmente suplementado (como descrito noExemplo 6) a 37 °C. Os cristais de fosfato de cálcio nas superfície dosesqueletos foram visualizados por coloração de Von Kossa.

Outros experimentos de deposição de CaP foram conduzidos,nos quais os esqueletos foram mergulhados em Na2HPO4 por duas horas natemperatura ambiente e ainda equilibrados em uma solução saturada de Ca2+,durante a noite. Os esqueletos foram depois observados sob SEM e cristaiscom morfologia de pequenas folhas foram observados na estrutura doesqueleto, (conforme a Figura 10).

EXEMPLO 6 - CULTURA DE CÉLULA DERIVADA DE MEDULAÓSSEA SOBRE OS ESQUELETOS POLIMÉRICOS

Esqueletos poliméricos de PLGA 75:25 foram preparadoscomo anteriormente descritos: 2 g/ml de cristais de glicose foram dispersadosem uma solução de PLGA 75:25 a 0,1 g/ml em sulfóxido de dimetila(DMSO, BDH3 Toronto, ON). A pasta polimérica foi esfriada a 11 °C. opolímero foi então precipitado e os cristais de glicose foram extraídos dopolímero precipitado em ddH20 a 40 °C. Os esqueletos foram secados a umamassa constante (10 μπι Hg, 72 horas), desinfetados em EtOH a 70% por 1/2hora, enxaguados 3X com α-MEM e equilibrados em α-MEM estéril a 37 0Cpor 6 dias.A primeira passagem de células primárias, derivadas damedula óssea foi semeada em esqueletos de 0,25 cm4 usando-se protocolos emeios descritos em detalhes em outro lugar (como descrito porManiatopoulos et al., acima e Davies et aL, em Cells and Materials, 1: 3 a 15,1991). Resumidamente, as células derivadas da medula óssea foram coletadasde ambos os ossos femorais de ratos Wistar jovens adultos(aproximadamente 150 g) em um meio completamente suplementado (FSM):α-MEM suplementado com 15% de soro fetal bovino, 50 mg/ml de ácidoascórbico, 10 mM de β-glicerofosfato e antibióticos (0,1 mg/ml de penicilinaG, 0,05 mg/ml de gentamicina e 0,3 mg/ml de fungizona); IO"8 M deDexametazona (Dex) foram adicionados ao FSM de apenas culturas Dex+.

As células foram mantidas em cultura por 6 dias erealimentadas nos dias 2 e 5 com FSM. No dia 6, as células Dex- foramtripisinizadas com tripsina a 0,01% em PBS, ao passo que as culturas Dex+,nas quais os sinais de calcificação foram visíveis, foram tripsinizadas comtripsina a 0,01% e 10 μπι de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) emPBS. As células de Dex+ e Dex- foram depois semeadas em esqueletosseparados pré umedecidos a uma concentração de 7,5 χ IO5 células/esqueleto.As culturas foram mantidas por 42 dias a 37 0C e 5% de CO2 e realimentadasa cada 2 ou 3 dias com FSM. Dex foi adicionado ao FSM das culturas decélula Dex+ a uma concentração de IO 8 M para cada realimentação.

Pó de tetraciclina*HCl (Sigma, St. Louis, MO) foi dissolvidoem α-MEM para preparar uma solução de estoque de 90 mg/ml. Um novomeio totalmente suplementado contendo tetraciclina (TFSM) foi preparadodo α-MEM contendo 15% de soro fetal bovino, 50 mg/ml de ácido ascórbico,10 mM de α-glicerofosfato e 9 mg/ml de tetraciclina. O TFSM foi usado paraa última realimentação no dia 40. No dia 42, as culturas foram lavadas em a-MEM (10 vezes, ~ 3 minutos cada uma) e fixadas em fixador de Karnovsky(2,0% de paraformaldeído, 2,5% de glutaraldeído e 0,1 M de tampão decacodilato de sódio, pH 7,2 a 7,4) durante a noite. Umas poucas culturasforam mantidas para observações em SEM e foram desidratadas em umasérie de soluções alcóolicas graduadas (70%, 100%) e secadas porcongelamento a 0,01 mm Hg por dois dias. Todas as outras culturas forammantidas em tampão de cacodilato a 0,1 M para observações histológicas econfocais.

As observações confocais foram realizadas como segue: asamostras foram colocadas em câmaras feitas de encomenda em tampão decacodilato a 0,1 M (obtido da BDH). As câmaras foram seladas com umacobertura deslizante de vidro. Os sinais fluorescentes foram detectados porseccionamento ótico em um microscópio confocal a laser Bio-Rad, usando-seo filtro BHS. O esqueleto semeado com células Dex(+) apresentou um rótulofluorescente até uma profundidade de aproximadamente 1 mm como visto naFigura 11. A fluorescência não pôde ser observada mais profundamentedentro dos esqueletos porque a profundidade do campo do microscópioconfocal não foi suficiente. Os esqueletos foram portanto seccionados a umaespessura de aproximadamente 2 mm e analisados pelo microscópio confocalde ambos os lados. A fluorescência foi observada por todo o esqueleto. Orótulo fluorescente também foi visto usando-se secções dos esqueletos semeados com célula, semeados com células Dex(+) (ver a Figura 12). Assecções transversais do esqueleto polimérico semeado com células Dex(-) eDex(+) foram observadas sob luz UV. Um sinal fluorescente brilhante foivisto apenas nas secções de Dex(+) por todo o esqueleto. Especificamente, amatriz óssea elaborada, como observada pelo sinal fluorescente, foi visualizada por toda a profundidade de um esqueleto polimérico de 0,5 cmque foi utilizado na cultura. O fator limitante neste teste foi a profundidadedo esqueleto polimérico e assim aumentando-se a profundidade de esqueletopolimérico pode-se aumentar a profundidade na qual a penetração de célulase assim a formação de matriz óssea, pode ser alcançada neste esqueletopolimérico.

Os esqueletos poliméricos também foram imanorrotulados porosteocalcina. A expressão da osteocalcina tanto nas culturas de Dex+ quantonas de Dex- foram avaliadas por processos imunoistoquímicos usando-se umantisoro de osteocalcina de cabra anti-rato (Biomedical Technologies Inc.,Stoughton, MA) em uma diluição final de 1:6000. O teste foi terminado porrotulação anticorpo com IgG de asno anti-cabra conjugado com antisoro derábano peroxidase, a uma concentração de 1:250. Um conjunto de substratode 3,3-diaminobenzidina para peroxidase (Vector laboratories, BurlingameCA) foi usado suplementado com cloreto de níquel para desenvolver acoloração. A Figura 13 mostra um esqueleto rotulado com osteocalcinasemeado com células Dex+ e mantido em cultura por 6 semanas. As secçõeshistológicas dos esqueletos foram obtidas como seguem: as amostras foramembebidas em Tissue Tek e seccionadas verticalmente a uma espessura de 6mm. O desenvolvimento das células dentro dos esqueletos também foramobservadas a partir das secções histológicas. Em ampliação baixa, a secçãototal do esqueleto pode ser visualizada por LM. Tanto na cultura Dex+quando Dex-, a cobertura celular foi encontrada por toda a estrutura doesqueleto. A coloração com hematoxilina e eosina foi visível junto com todosos macroporos, nas superfícies externas bem como no meio dos esqueletos.As Figuras 14 e 15 mostram espumas cultivadas com Dex+ e Dex- emampliação baixa. A quantidade de matriz elaborada nas culturas Dex- foimuito mais abundante do que nas culturas Dex+ como visto na ampliaçãomaior. Nas culturas Dex+, apenas umas poucas camadas de célula foramobservadas revestindo as paredes de poro e produzindo matriz emjustaposição íntima às paredes de poro, ao passo que nas culturas Dex-, osvolumes totais de macroporo foram preenchidos com a matriz.

EXEMPLO 7 - SEMEADURA DE CÉLULAS DE MEDULAHUMANA

SOBRE ESQUELETO POLIMÉRICOAs matrizes de PLGA 75:25 foram preparadas como descritas,no Exemplo 1. Estes esqueletos foram desinfetados em etanol a 70% por 30minutos antes de serem semeados com células estrômicas de medula ósseahumana, de doadores jovens, usando-se os protocolos e meios contendodexametazona (Dex) descritos em detalhes por Parker et ai., (J. of Bone Min.Res., 12(1), S300:F298, 1997).

EXEMPLO 8 - EFEITO DO TAMANHO DO MACROPORO E DAINTERCONECTIVIDADE NA INVASÃO CELULAR

Três morfologias diferentes de esqueleto foram criadas: 1)esqueletos obtidos apenas por lixívia de particulado, referidos comoesqueletos membranosos que formam parte da técnica anterior e mostradosnas Figuras 16A, 16B e 16C debatidos resumidamente abaixo, 2) esqueletosobtidos pela inversão de fase e lixívia de particulado usando-se baixastemperaturas de processamento, como descrito no Exemplo 1, referidos comoesqueletos intermediários e 3) esqueletos obtidos pela inversão de fase elixívia de particulado usando-se temperaturas de processamento mais altas,como descrito no Exemplo 4, referidos como esqueletos semelhantes a osso.

Para cada uma destas três rotas básicas de processamento, as três estruturasde esqueleto foram elaboradas com diferentes tamanhos de macroporo, demodo que um total de nove estruturas de esqueletos diferentes foram obtidos.Estas nove estruturas estão ilustradas nas Figuras de 16A até 161.

Os esqueletos membranosos foram elaborados usando-seapenas a técnica de lixívia de particulado (como descrito por Mikos et al., emBiomaterials 14, 323 a 330, 1993), ver a técnica anterior mostrada nasFiguras 16A, 16B e 16C. Resumidamente, uma solução de PLGA 75/25(Birmingham Polymers) em clorofórmio foi vertida sobre partículaspeneiradas, de 1) NaCl (tamanho < 0,35 mm), 2) cristais de sacarose(tamanho variando de 0,54 a 0,8 mm) ou 3) cristais de glicose (tamanhovariando de 0,8 a 2 mm). As estruturas poliméricas foram deixadas natemperatura ambiente para permitir a evaporação do clorofôrmio, após o queas partículas foram dissolvidas em ddH20.

Os esqueletos intermediários e os semelhantes a osso foramproduzidos como descrito nos Exemplos 1 e 4 pela extração das mesmas partículasdiferentes como descrito acima do polímero precipitado. Os esqueletos intermediáriosforam produzidos em uma temperatura da solução polimérica de -20°C e um nãosolvente na temperatura ambiente, ao passo que os esqueletos semelhantes a ossoforam produzidos com uma temperatura de solução polimérica de 11°C e um nãosolvente na temperatura ambiente. Os esqueletos obtidos foram desinfetados emetanol a 70% por 30 minutos antes de serem semeados com as células.

A colonização de célula dos esqueletos foi confirmada pormicroscopia confocal e a diferenciação celular por toda a estrutura doesqueleto foi confirmada usando-se o teste de rotulação com osteocalcinadescrito no Exemplo 6. Os seguintes resultados foram observados:

TABELA 2: TAMANHOS DE ESQUELETO E PADRÕES DECOLINIZAÇÃO DE CÉLULA

<table>table see original document page 34</column></row><table>

A colonização de célula dos esqueletos, como relatado naTabele 2, requereu um tamanho de interconexão mínimo de 0,35 ,mm e,tamanho de macroporo de 0,7 mm.

Neste Exemplo, os esqueletos membranosos com tamanho demacroporo de 1,1 mm não foram colonizados pelas células ao passo que osesqueletos semelhantes a osso com tamanhos de macroporo de 0,7 mm foramtotalmente colonizados pelas células. Em conclusão, este Exemplo demonstraque os esqueletos obtidos pela técnica de inversão de fase e lixívia departiculado permitiu a colonização de célula por toda a morfologia total doesqueleto, ao passo que os esqueletos previamente publicados foram apenascolonizados pelas células dentro de sua camada superficial de poro. Adescrição anterior das modalidades preferidas da invenção foramapresentadas para ilustrar os princípios da invenção e não para limitar ainvenção às modalidades particulares ilustradas. É intencionado que o escopoda invenção seja definido por todas as modalidades abrangidas dentro dasreivindicações que seguem e seus equivalentes.

Claims (33)

1. Esqueleto polimérico macroporoso, caracterizado pelo fatode compreender:suportes poliméricos alongados definindo macroporos queestão interconectados por passagens macroporosas, incluindo passagensmicroporosas se estendendo através de dito suporte polimérico de modo queos macroporos em cada lado de dito suporte polimérico alongado estão emcomunicação através de dito suporte polimérico dado, ditos macroporostendo um diâmetro médio na faixa de 0,5 a 3,5 mm, ditas passagensmacroporosas tendo um diâmetro médio na faixa de 200μm a 2 mm, e ditaspassagens microporosas tendo um diâmetro médio maior que 50 μm e menorque 200 um.

2. Esqueleto polimérico de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que dito esqueleto polimérico separando osmacroporos tem uma espessura menor que 0,4 mm.

3. Esqueleto polimérico de acordo com as reivindicações 1 ou-2, caracterizado pelo fato de que é biocompatível.

4. Esqueleto polimérico de acordo com as reivindicações 1, 2,ou 3, caracterizado pelo fato de que é biodegradável.

5. Esqueleto polimérico de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que o polímero é derivado do poli(lactídeo-co-glicolídeo).

6. Esqueleto polimérico de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que o polímero compreende poli(lactídeo-co-glicolídeo) em uma proporção de 75% de polilactídeo e 25% depoliglicolídeo.

7. Esqueleto polimérico de acordo com as reivindicações 1, 2,-3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que tem uma porosidade de pelomenos 85%.

8. Esqueleto polimérico de acordo com as reivindicações 1, 2,- 3, 4, 5, 6, ou 7, caracterizado pelo fato de que o dito suporte polimérico temuma espessura menor que 0,4 mm, e em que o dito polímero é biocompatívele biodegradável, e tem uma porosidade de pelo menos 85%.

9. Processo para fabricar um esqueleto poliméricomacroporoso com suportes poliméricos microporosos definindo macroporosinterconectados, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:misturar polímero líquido com partículas para formar umamistura de polímero líquido e partículas;submergir a mistura em um não solvente para polímero líquidopara precipitar dito polímero líquido produzindo uma mistura sólida; esubmergir a mistura sólida em um solvente que dissolve aspartículas por um tempo suficiente para dissolver as partículas para obter odito esqueleto polimérico macroporoso com suportes poliméricosmicroporosos definindo macroporos interconectados.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que dito polímero líquido é formado pela dissolução do polímeroem um solvente de polímero.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que dito solvente de polímero é dimetilsulfóxido.

12. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que as partículas têm um diâmetro na faixa de 0,5 a 3,5 mm.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que as partículas têm um diâmetro médio na faixa de 1,0 mm a 2,0 mm.

14. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que as partículas têm um diâmetro na faixa de 0,5 a 3,5 mm.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que as partículas têm um diâmetro médio na faixa de 1,0 mm a-2,0 mm.

16. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que ditas partículas são selecionadas do grupo consistindo depolissacarídeos, sais orgânicos, sais inorgânicos, proteínas, lipídeos ecombinações destes.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que o polissacarídeo é glicose.

18. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que ditas partículas são partículas de açúcar.

19. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que adicionalmente compreende a etapa de modificar a superfíciedo esqueleto polimérico.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a superfície do esqueleto polimérico é modificada usando-se um tratamento selecionado dentre o grupo consistindo de tratamento ácido,tratamento básico, deposição de colágeno e deposição de fosfato de cálcio.

21. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que inclui estabilizar dita mistura antes de precipitar ditopolímero líquido.

22. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que dita mistura é estabilizada pelo resfriamento desta a umatemperatura adequada.

23. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que dito polímero líquido é formado pelo aquecimento dopolímero até o seu ponto de fusão para liqüefazer o dito polímero.

24. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que dito não solvente para o polímero é selecionado de um grupoconsistindo de água, álcool, 1,4-dioxano e anilina.

25. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que dito polímero é derivado de poli(lactídeo-co-glicolídeo).

26. Processo para cultivar tecido com distribuição penetranteno esqueleto polimérico macroporoso, como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, com uma morfologia trabecular, a uma profundidade depelo menos 2,5 vezes o tamanho médio do macroporo no esqueleto,caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:semear o esqueleto polimérico com células de tecido; ecultivar as ditas células de tecido.

27. Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que adicionalmente compreende a etapa de modificar a superfíciedo esqueleto polimérico.

28. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a superfície do esqueleto polimérico é modificada usando-seum tratamento selecionado dentre o grupo consistindo de tratamento ácido,tratamento básico, deposição de colágeno e deposição de fosfato de cálcio.

29. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-26, 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que as ditas células de tecido sãocélulas osteogênicas.

30. Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que as ditas células de tecido são matriz óssea elaborada.

31. Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que as ditas células de tecido são de origem humana.

32. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-26, 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que as ditas células de tecido sãoselecionadas do grupo consistindo de células de tecido paradontal, células detecido de cartilagem, células de tecido dentário, células de tecido do fígado ecélulas de tecido das mamas.

33. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-26, 27, 28, 29, 30, 31, ou 32, caracterizado pelo fato de que as ditas célulassão mantidas para aplicações in vitro e in vivo.